CN111094273B

CN111094273B - 催产素受体抑制剂的晶型及其制备方法

Info

Publication number: CN111094273B
Application number: CN201980004494.1A
Authority: CN
Inventors: 邵启云; 杨俊然; 徐超; 杜振兴; 王捷
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd; Chengdu Suncadia Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2039-06-19
Also published as: TW202016092A; WO2019242646A1; CN111094273A

Abstract

提供催产素受体(OTR)抑制剂化合物5‑(3‑(3‑(6‑氟萘‑1‑基)氮杂环丁烷‑1‑基)5‑(甲氧基甲基)‑4H‑1,2,4‑三氮唑‑4‑基)‑2‑甲氧基吡啶的多晶型及其制备方法。相对于无定型而言，所述多晶型的OTR抑制剂具有更高的纯度，更优异的化学稳定性，对开发适合工业生产且生物活性良好的药物具有重要意义。

Description

催产素受体抑制剂的晶型及其制备方法

技术领域

本披露中提供了化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的晶型及其制备方法。

背景技术

PCT/CN2017/117421(申请日2017.12.20)描述了一种化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶，药效实验显示了该化合物对0TR具有高选择性抑制作用，且具有较好的脑通透性，可有效阻断催产素所介导的催产素受体的下游功能。

多晶型现象是指固态物质存在两种或两种以上不同的空间排列方式，从而具有不同物理、化学性质。同种药物不同晶型之间由于排列方式的不同，其生物利用度也可能会存在差别。同时，鉴于固体药物晶型及其稳定性对其在临床治疗中的重要性，深入进行化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的多晶型研究，获得纯度高且化学性质稳定的晶型，对开发适合工业生产且生物活性良好的药物具有重要意义。

发明内容

本披露中提供了化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的A晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在11.06，14.38，21.81，22.98，24.38，24.80，26.88处有特征峰。

在可选实施方案中，所述的A晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在11.06，12.10，14.38，18.94，21.09，21.81，22.98，24.38，24.80，26.88处有特征峰。

在一些实施方案中，所述的A晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在7.16，10.44，11.06，12.10，14.38，17.00，17.67，18.94，21.09，21.81，22.98，24.38，24.80，26.88处有特征峰。

在另一些实施方案中所述的A晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图1所示。

本披露中还提供了制备化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的A晶型的方法。

制备A晶型的方法一，包括：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(I)中，搅拌溶解或加热溶解

(b)挥发；

本法所述溶剂(I)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～100倍，可以为1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100倍；所述溶剂(I)选自丙酮、环己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、2-丁酮、二甲基亚砜、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、正丙醇、甲基异丁酮、1，4-二氧六环、丙二醇甲醚、异戊醇、N，N-二甲基甲酰胺中的至少一种，优选乙酸乙酯、丙酮、甲基叔丁基醚/四氢呋喃、四氢呋喃、丙酮/环己烷、正丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮、二甲基亚砜、甲基异丁酮、1，4-二氧六环、丙二醇甲醚、异戊醇、水/异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸丁酯。

制备A晶型的方法二，包括：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(II)中，

(b)打浆，过滤；

本法所述溶剂(II)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～40倍，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40倍；所述溶剂(II)选自异丙醚、正庚烷、正己烷、甲基叔丁基醚、甲醇、乙腈、1，4-二氧六环、异丙醇、环己烷、乙酸乙酯、水中的至少一种，优选异丙醇/水、正庚烷、乙腈/环己烷、1，4-二氧六环/环己烷、二氯甲烷/正己烷、乙酸乙酯/正己烷、甲基叔丁基醚、甲醇/水、乙酸乙酯/正庚烷。

制备A晶型的方法三，包括：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(III)中，搅拌溶解或加热溶解，

(b)搅拌析晶，过滤；

本法所述溶剂(II)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～20倍，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍；所述溶剂(III)选自丙酮、环己烷、异丙醇、水、四氢呋喃、正庚烷、二氯甲烷、乙醇、1，4-二氧六环、乙酸乙酯中的至少一种，优选异丙醚/四氢呋喃、异丙醇、丙酮/环己烷、异丙醇/水、正庚烷/四氢呋喃、二氯甲烷/正己烷、乙醇/水、1，4-二氧六环/环己烷、乙酸乙酯/正己烷。

本披露中提供了化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的B晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在5.54，11.33，16.54，17.10，20.12，21.26，22.44处有特征峰。

在可选实施方案中，所述的B晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在5.54，11.33，15.67，16.54，17.10，20.12，21.26，22.44，25.53处有特征峰。

在另一些实施方案中，所述的B晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图2所示。

本披露中还提供了制备化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的B晶型的方法。

制备B晶型的方法一，包括：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(IV)中，搅拌溶解或加热溶解，

(b)挥发；

本法所述溶剂(IV)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～20倍，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍；所述溶剂(IV)优选乙腈。

制备B晶型的方法二，包括：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(V)中，搅拌溶解或加热溶解，

(b)搅拌析晶，过滤；

本法所述溶剂(V)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～20倍，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍；所述溶剂(V)优选异丙醇/水，两者体积比为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。

制备B晶型的方法三，包括：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(VI)中，搅拌溶解或加热溶解，

(b)搅拌析晶，过滤；

本法所述溶剂(VI)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～20倍，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍；所述溶剂(VI)优选水、四氢呋喃/正己烷，所述四氢呋喃/正己烷两者体积比为0.2～5，可以为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0。

本披露中还提供了化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的C晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在5.63，16.01，17.41，19.02，21.00，23.02，23.84，24.28处有特征峰。

在可选实施方案中，所述的C晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在5.63，11.55，16.01，17.41，19.02，21.00，23.02，23.84，24.28，25.22处有特征峰。

在另一些实施方案中，所述的C晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图3所示。

制备C晶型的方法，包括：

(b)挥发，过滤，真空干燥。

本披露中还提供了化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的D晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在7.78，12.14，12.62，17.25，18.34，19.69，25.01处有特征峰。

在可选实施方案中，所述的D晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在7.78，8.91，12.14，12.62，17.25，18.34，19.69，21.26，25.01，26.75处有特征峰。

在另一些实施方案中，所述的D晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图4所示。

本披露中还提供了制备化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的D晶型的方法。

制备D晶型的方法，包括：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(VII)中，搅拌溶解或加热溶解，

(b)挥发，过滤。

本法所述溶剂(VII)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～20倍，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍；所述溶剂(VII)选自水、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醇、乙腈中的至少一种，优选10％水/丙酮、甲醇、乙醇、10％水/甲醇、乙酸乙酯/乙醇、乙腈/甲醇。

本披露中还提供了一种由前述A、B、C或D任意一种晶型制备而成的药物组合物。

本披露中还提供了一种药物组合物，其含有前述可药用盐的晶型和任选自药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的药用辅料。

本披露中还提供了前述A、B、C或D任意一种晶型在制备用于治疗或预防己知或可显示抑制催产素会产生有益效应的疾病或病症的药物的用途，所述疾病或病症选自性功能障碍、性欲减退障碍、性唤起障碍、性高潮障碍、性交疼痛障碍、早泄、预产前分娩、分娩并发症、食欲和进食疾病、良性前列腺增生、早产、痛经、充血性心力衰竭、动脉高血压、肝硬化、肾性高血压、高眼压、强迫观念与行为障碍和神经精神疾病，优选地选自性功能障碍、性唤起障碍、性高潮障碍、性交疼痛障碍和早泄。

本披露中还提供了前述A、B、C或D任意一种晶型在制备用于拮抗催产素的药物中的用途。

依据《中国药典》2015年版四部中“9103药物引湿性指导原则”中引湿性特征描述与引湿性增重的界定，

潮解：吸收足量水分形成液体；

极具引湿性：引湿增重不小于15％；

有引湿性：引湿增重小于15％但不小于2％；

略有引湿性：引湿增重小于2％但不小于0.2％；

无或几乎无引湿性：引湿增重小于0.2％。

本披露中所述5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的A晶型在20.0％RH-80％RH条件下，引湿增重0.1493％，无或几乎无引湿性。

本披露中所述的“X-射线粉末衍射图谱”为使用Cu-Kα辐射测量得到。

本披露中所述的“X-射线粉末衍射图谱或XRPD”是指根据布拉格公式2d sinθ＝nλ(式中，λ为X射线的波长，

衍射的级数n为任何正整数，一般取一级衍射峰，n＝1)，当X射线以掠角θ(入射角的余角，又称为布拉格角)入射到晶体或部分晶体样品的某一具有d点阵平面间距的原子面上时，就能满足布拉格方程，从而测得了这组X射线粉末衍射图。

本披露中所述的“2θ或2θ角度”是指衍射角，θ为布拉格角，单位为°或度；每个特征峰2θ的误差范围为±0.30，可以为-0.30、-0.29、-0.28、-0.27、-0.26、-0.25、-0.24、-0.23、-0.22、-0.21、-0.20、-0.19、-0.18、-0.17、-0.16、-0.15、-0.14、-0.13、-0.12、-0.11、-0.10、-0.09、-0.08、-0.07、-0.06、-0.05、-0.04、-0.03、-0.02、-0.01、0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30，优选为±0.20。

本披露中所述的“晶面间距或晶面间距(d值)”是指空间点阵选择3个不相平行的连结相邻两个点阵点的单位矢量a，b，c，它们将点阵划分成并置的平行六面体单位，称为晶面间距。空间点阵按照确定的平行六面体单位连线划分，获得一套直线网格，称为空间格子或晶格。点阵和晶格是分别用几何的点和线反映晶体结构的周期性，不同的晶面，其面间距(即相邻的两个平行晶面之间的距离)各不相同；单位为

或埃。

本披露中所述的“差示扫描量热分析或DSC”是指在样品升温或恒温过程中，测量样品与参考物之间的温度差、热流差，以表征所有与热效应有关的物理变化和化学变化，得到样品的相变信息。

本披露中所述干燥温度一般为20℃～100℃，优选25℃～70℃，可以为，可以常压干燥，也可以减压干燥(真空干燥)。优选的，干燥在减压下干燥。

本披露中所用化学试剂、生物试剂可通过商业途径获得获得。

本披露中实验所用仪器的测试条件：

1、差示扫描量热仪(Differential Scanning Calorimeter，DSC)

仪器型号：Mettler Toledo DSC 3⁺STAR^e System

吹扫气：氮气

升温速率：10.0℃/min

温度范围：25-250

2、X-射线粉末衍射谱(X-ray Powder Diffraction，XRPD)

(1)仪器型号：Bruker D8 Discover A25 X-射线粉末衍射仪

射线：单色Cu-Kα射线(λ＝1.5406)

扫描方式：θ/2θ，扫描范围：10-48°

电压：40KV，电流：40mA

3、热重分析仪(Thermogravimetric Analysis，TGA)

仪器型号：Mettler Toledo TGA2

吹扫气：氮气

升温速率：10.0℃/min

温度范围：25-250

4、DVS为动态水分吸附

检测采用SMS DVA Advantage，，在25℃，湿度从0-90％，步进为10％，判断标准为每个梯度质量变化dM/dT小于0.002，T_MAX小于360min，循环两圈。

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。

附图说明

图1：化合物的A晶型的XRPD图谱。

图2：化合物的B晶型的XRPD图谱。

图3：化合物的C晶型的XRPD图谱。

图4：化合物的D晶型的XRPD图谱。

图5：化合物的A晶型的DVS谱图。

图6：化合物的A晶型的DVS前后X-射线粉末衍射对比图。

具体实施方式

以下将结合实施例或实验例更详细地解释本披露，本披露中的实施例或实验例仅用于说明本披露中的技术方案，并非限定本披露的实质和范围。

实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：石油醚/乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。

实施例1：化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的制备

第一步：3-(6-氟-3，4-二氢萘-1-基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯1c

将3-碘氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯1b(1134.58mg，4.01mmol，采用公知的方法“Organic Letters，2014，16(23)，6160-6163”制备而得)、碘(39.12mg，0.15mmol)、锌(604.65mg，9.25mmol)加入反应瓶中，氩气保护，反应0.5小时，将双(二亚芐基丙酮)钯(141.15mg，0.15mmol)、2-二环己基膦-2′，4′，6′-三异丙基联苯(73.48mg，0.15mmol)和4-溴-7-氟-1，2-二氢萘1a(700mg，3.08mmol，采用公知的方法“Chemistry-A EuropeanJournal，2015，21(14)，5561-5583”制备而得)加入上述反应液，加毕，50℃条件下，加热搅拌反应3小时。冷却至，反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物1c(700mg)，产率：74.8％。

MS m/z(ESI)：304.1[M+1]。

第二步：3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯1d

将2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌(336.72mg，1.48mmol)和1c(300mg，0.99mmol)溶于30mL甲苯溶液，加毕，80℃条件下，反应12小时。冷却至室温，减压蒸馏，旋除溶剂，用薄层色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物1d(180mg)，产率：60.4％。

MS m/z(ESI)：302.2[M+1]。

第三步：3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷盐酸盐1e

将1d(180mg，0.60mmol)和0.5mL的4M氯化氢的1，4-二氧六环溶液溶于30mL二氯甲烷，加毕，反应2小时。上述反应液减压浓缩，得到粗品标题产物1e(120mg，褐色固体)，产物不经纯化直接进行下一步反应。

MS m/z(ESI)：202.1[M+1]。

第四步：3-(6-氟萘-1-基)-N-(6-甲氧基吡啶-3-基)氮杂环丁烷-1-硫代酰胺1g

将粗品1e(120mg，0.6)和1f(99.11mg，0.60mmol，采用公知的方法“Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2010，20(2)，516-520”制备而得)加至50mL四氢呋喃溶液，加毕，反应液搅拌2小时。得到含标题产物1g的反应液不经纯化直接用于下步反应。

MS m/z(ESI)：368.1[M+1]。

第五步：(E)-3-(6-氟萘-1-基)-N-(6-甲氧基吡啶-3-基)氮杂环丁烷-1-硫代亚氨酸甲酯1h

将粗品1g(200mg，0.54mmol)溶于50mL四氢呋喃溶液中，冷却至0℃，将叔丁醇钾(183.23mg，1.63mmol)溶于上述溶液，加毕，反应1小时。上述反应液中加入4-甲基苯磺酸甲酯(101.37mg，0.54mmol)，室温搅拌12小时。向反应液中加入50mL乙酸乙酯，用水洗涤(20mL×3)，合并有机相，有机相减压蒸馏，旋除溶剂，用薄层色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物1h(100mg)，产率：48.2％。

MS m/z(ESI)：382.1[M+1]。

第六步：5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶1

将1h(100mg，0.26mmol)、三氟乙酸(0.1mL，0.13mmol)和2-甲氧基乙酰肼(27.29mg，0.26mmol)溶于50mL四氢呋喃，加毕，回流条件下，反应3小时。冷却至室温，减压旋除溶剂，用薄层色谱法以展开剂体系A纯化纯化所得残余物，得到标题产物(30mg)，产率：26.7％。

MS m/z(ESI)：420.1[M+1]。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ8.32(s，1H)，7.75-7.84(m，3H)，7.51-7.55(m，2H)，7.43(d，1H)，7.25-7.32(m，1H)，7.00(d，1H)，4.51-4.66(m，1H)，4.35(t，4H)，4.10(t，2H)，4.00(s，3H)，3.26(s，3H)。

测试例1：对人源OTR抑制活性的测定

一、实验材料及仪器

1.Fluo-4 NW钙分析试剂盒(F36206，invitrogen)

2.MEM(Hyclone，SH30024.01B)

3.G418硫酸盐(Enzo，ALX-380-013-G005)

4.胎牛血清(GIBCO，10099)

5.丙酮酸钠溶液(sigma，S8636-100ML)

6.MEM非必需氨基酸溶液(100×)(sigma，M7145-100ML)

7.Flexstation 3多功能酶标仪(Molecular Devices)

8.多聚-D-赖氨酸96孔板，黑色/干净(356692，BD)

9.催产素(吉尔生化有限公司合成)

10.pcDNA3.1(invitrogen，V79020)

11.pcDNA3.1-hOTR(NM-000706)(金唯智生物技术有限公司合成并构建入pcDNA3.1质粒)

12.HEK293细胞(货号GNHu18，中科院细胞库)

二、实验步骤

将pcDNA3.1-hOTR质粒，用

3000转染试剂转入HEK293细胞；隔天开始加G418筛选，挑选单克隆细胞系。

提前一天将HEK293/人源OTR稳转株细胞以25000个/孔的密度种于96孔板中。第二天，先使用Fluo-4NW钙分析试剂盒中的试剂配制含Fluo-4染料的上样缓冲液，再去除培养基，每孔加入100μl含Fluo-4染料的上样缓冲液，37℃，孵育30分钟。到时间后，把板子移至室温环境平衡10分钟。将化合物配成10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹nM，每孔加入1μl，室温孵育10分钟。用flexstation 3酶标仪进行检测，由机器自动加入3nM的催产素多肽50μl，立刻在494/516nM处读值。化合物的IC50值可采用不同浓度对应的荧光值，经Graphpad Prism计算得到IC₅₀＝2nM，表明化合物对人源OTR活性具有明显的抑制效果。

测试例2：对人源V1aR抑制活性的测定

一、实验材料及仪器

1.Fluo-4 NW钙分析试剂盒(F36206，invitrogen)

2.MEM(Hyclone，SH30024.01B)

3.G418硫酸盐(Enzo，ALX-380-013-G005)

4.胎牛血清(GIBCO，10099)

5.丙酮酸钠溶液(sigma，S8636-100ML)

6.MEM非必需氨基酸溶液(100×)(sigma，M7145-100ML)

7.Flexstation 3多功能酶标仪(Molecular Devices)

8.多聚-D-赖氨酸96孔板，黑色/干净(356692，BD)

9.加压素(Tocris，2935)

10.pcDNA3.1(invitrogen，V79020)

11.pcDNA3.1-V1aR(NM-000706)(金唯智生物技术有限公司合成并构建入pcDNA3.1质粒)

12.HEK293细胞(货号GNHu18，中科院细胞库)

二、实验步骤

将pcDNA3.1-V1aR质粒，用

提前一天将HEK293/人源V1aR稳转株细胞以25000个/孔的密度种于96孔板中。第二天，先使用Fluo-4NW钙分析试剂盒中的试剂配制含Fluo-4染料的上样缓冲液，再去除培养基，每孔加入100μl含Fluo-4染料的上样缓冲液，37℃，孵育30分钟。到时间后，把板子移至室温环境平衡10分钟。将化合物配成10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹nM，每孔加入1μl，室温孵育10分钟。用flexstation 3酶标仪进行检测，由机器自动加入3nM的加压素多肽50μl，立刻在494/516nM处读值。化合物的IC₅₀值可采用不同浓度对应的荧光值，经Graphpad Prism计算得到IC₅₀＝4.5nM，说明化合物对人源V1aR活性抑制弱，说明对OTR活性具有选择性抑制作用。

测试例3：化合物对人源V1bR抑制活性的测定

本披露中化合物对HEK293/人源V1bR细胞中所表达人源的V1bR蛋白活性的抑制作用采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.Fluo-4 NW钙分析试剂盒(F36206，invitrogen)

2.MEM(Hyclone，SH30024.01B)

3.G418硫酸盐(Enzo，ALX-380-013-G005)

4.胎牛血清(GIBCO，10099)

5.丙酮酸钠溶液(sigma，S8636-100ML)

6.MEM非必需氨基酸溶液(100×)(sigma，M7145-100ML)

7.Flexstation 3多功能酶标仪(Molecular Devices)

8.多聚-D-赖氨酸96孔板，黑色/干净(356692，BD)

9.加压素(Tocris，2935)

10.pcDNA3.1(invitrogen，V79020)

11.pcDNA3.1-V1bR(NM-000706)(金唯智生物技术有限公司合成并构建入pcDNA3.1质粒)

12.HEK293细胞(货号GNHu18，中科院细胞库)

二、实验步骤

将pcDNA3.1-V1bR质粒，用

3000转染试剂转入HEK293细胞；隔天开始加G418，得到HEK293/人源V1bR pool细胞系。

提前一天将HEK293/人源V1bR pool细胞以25000个/孔的密度种于96孔板中。第二天，先使用Fluo-4NW钙分析试剂盒中的试剂配制含Fluo-4染料的上样缓冲液，再去除培养基，每孔加入100μl含Fluo-4染料的上样缓冲液，37℃，孵育30分钟。到时间后，把板子移至室温环境平衡10分钟。将化合物配成10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹nM，每孔加入1μl，室温孵育10分钟。用flexstation 3酶标仪进行检测，由机器自动加入3nM的加压素多肽50μl，立刻在494/516nM处读值。化合物的IC₅₀值可采用不同浓度对应的荧光值，经Graphpad Prism软件计算得到IC₅₀＝26μM，表明化合物对人源V1bR活性没有明显抑制效果，说明对OTR活性具有选择性抑制作用。

测试例4：化合物对人源V2R抑制活性的测定

本披露中化合物对HEK293/人源V2R细胞中所表达人源的V2R蛋白活性的抑制作用采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.cAMP动态2试剂盒-1,000次实验(62AM4PEB，Cisbio)

2.MEM(Hyclone，SH30024.01B)

3.G418硫酸盐(Enzo，ALX-380-013-G005)

4.胎牛血清(GIBCO，10099)

5.丙酮酸钠溶液(sigma，S8636-100ML)

6.MEM非必需氨基酸溶液(100×)(sigma，M7145-100ML)

7.PheraStar多功能酶标仪(BMG)

8.Corning/Costar 384孔无吸附微孔板-黑色NBS板(4514，Corning)

9.细胞解离液，不含酶，PBS(13151014-100ml，Thermo Fisher Scientific)

10.HBSS，钙，镁，不含酚红(14025-092，Invitrogen)

11.HEPES，1M缓冲液(15630-080，GIBCO)

12.BSA(0219989725，MP Biomedicals)

13.IBMX(I7018-250MG，sigma)

14.加压素(Tocris，2935)

15.pcDNA3.1(invitrogen，V79020)

16.pcDNA3.1-V2R(NM-000054)(金唯智生物技术有限公司合成并构建入pcDNA3.1质粒)

17.HEK293细胞(货号GNHu18，中科院细胞库)

二、实验步骤

将pcDNA3.1-V2R质粒，用

3000转染试剂转入HEK293细胞；隔天开始加G418，得到HEK293/人源V2R pool细胞系。

1)解离细胞：

使用细胞解离液不含酶解离HEK293/人源V2R pool细胞从细胞培养皿中解离，将细胞解离成单个，终止后吹打均匀，离心，去除上清用实验缓冲液1(1x HBSS+20mM HEPES+0.1％BSA)重悬细胞并计数，将细胞密度调整为1250个细胞/5μl，即2.5*10⁵/ml。

2)配药

化合物用纯DMSO配制化合物成20mM、6.67mM、2.22mM、0.74mM、0.25mM、0.08mM、27.4μM、9.14μM、3.05μM、1.02μM、0.34μM和0μM(DMSO)一系列的浓度。然后使用实验缓冲液2(实验缓冲液1+1mM IBMX)将化合物配成4倍使用浓度。

激动剂：以460μM的加压素母液，先用DMSO配成2μM，再用实验缓冲液2稀释成0.5nM浓度。

标准品：第一个点为20：第的储备原液(2848nM)，从第二个点开始按4倍依次用实验缓冲液1进行稀释，共11个浓度。

3)加药孵育：

1.将混匀的细胞加入到384孔板中，5μl/孔，不用更换枪头。

2.加入配好的待测化合物和阳性化合物2.5μl/孔，需要更换枪头。

3. 1000rpm离心1min，震荡30sec混匀，室温静置孵育30min。

4.标准曲线孔需要加5μl/孔的实验缓冲液2。

5.加入配好的激动剂每孔2.5μl，需要更换枪头，1000rpm离心1min，震荡30sec混匀，室温静置孵育30min。

6.避光配制cAMP-d2(cAMP动态2试剂盒中的组份)和Anti-cAMP-Eu-Cryptate(cAMP动态2试剂盒中的组份)，按照1∶4的比例与cAMP裂解液(cAMP动态2试剂盒中的组份)混匀。每孔加入配好的cAMP-d2液体5μl/孔，再加Anti-cAMP-Eu-Cryptate 5μl/孔，震荡30sec混匀，室温避光孵育1h。

4)读板：PheraStar多功能酶标仪进行HTRF的信号读取。

5)数据处理

本实验的数据使用数据处理软件Graphpad Prism处理得到IC₅₀＝4.9μM，表明化合物对人源V2R活性没有明显的抑制效果，说明对OTR活性具有选择性抑制作用。

测试例5：化合物对大鼠脑通透活性的测定

本披露中化合物对大鼠脑通透活性采用如下实验方法测定：

1.实验材料与仪器

1.RED装置插入(Device Inserts)(Thermo Scientific，QL21291110)

2.API 4000 Q-trap线性离子阱质谱仪(Applied Biosystems)

3.LC-30A超高压液相色谱系统(岛津)

4.pH7.4 PBS(100mM，4℃冰箱保存)

5.SD大鼠，由杰思捷实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(沪)2013-0006。

2.实验动物操作

SD大鼠4只，雌雄各半，12/12小时光/暗调节，温度24±3℃恒温，湿度50-60％，自由进食饮水。禁食一夜后分别灌胃给药。给药剂量10mg/kg，给药组于给药后0.5h～2h采血后处死(采血量0.5ml)，血样置于肝素化试管中，3500rpm离心10min分离血浆，记为血浆1，于20℃保存；处死后的动物断头，取脑组织，滤纸吸干残留的血液，记为脑组织1，10min后于0℃保存。另取3只动物取空白血浆和脑组织2，处理方法同给药组。

3.血浆蛋白结合平衡透析过程

3.1样品制备

用DMSO稀释药物化合物至50mM，得到储备液I；移取适量储备液I，用甲醇稀释得到200μM稀释储备液II；移取10μl储备液II于1.5ml Eppendorf管中，加入990μl空白血浆，混匀得到2μM血浆样品2(DMSO含量≤0.2％)，用于该浓度血浆蛋白结合率的测定。移取上述配好的50μl血浆样品，记为T₀，置于-80℃冰箱保存待测。

3.2实验过程

取RED装置插入平衡透析管插至于96孔的底板中。取上述配制好的含待测物血浆样品2及相应空白血浆样品300μl，置于红色标记的孔中(plasma chamber)。取500μl pH7.4磷酸缓冲盐溶液，置于并排红色标记的另一孔中(buffer chamber)。按上述步骤处理方法，每个化合物每一个浓度为2-3个样本。完毕用封条(sealing tape)覆盖96孔底板，并将整块底板放至热混仪中，以400rpm转速，于37℃平衡4h。孵化结束后，从热混仪中取出96孔底板装置，完成平衡透析。取50μl平衡后的血浆样品或透析液样品，加入50μl相对应的未平衡的不含药的空白磷酸盐缓冲液或不含药的空白血浆，加入内标(乙腈配制)300μl，涡旋混合5min，离心10min(4000rpm)，取上清液进行LC/MS/MS分析。T₀样品不经孵化，直接采用上述建立的LC/MS/MS法分别测定总药物(plasma chamber)及游离药物(buffer chamber)与内标物色谱峰面积比，计算游离百分率(f_{u plasma}％)。

4.脑组织蛋白结合平衡透析过程

脑组织蛋白结合平衡透析过程：空白脑组织2按照稀释因子＝11的比例用pH7.4PBS将脑组织制成空白脑匀浆，加入化合物配制成2μM脑匀浆，其余与血浆蛋白结合的操作相同，采用建立的LC/MS/MS法分别测定总药物(brain homo chamber)及游离药物(buffer chamber)与内标物色谱峰面积比，计算游离百分率(f_{u brain hom}％)。

5.脑通透试验方法

1)采用建立的LC/MS/MS法分别测定大鼠给药后0.5h的血浆1和脑组织1中的药物浓度，此为总浓度(C_total，p和C_total，b)；

2)采用RED Device Inserts装置，用平衡透析法分别测定化合物在大鼠血浆和脑组织中的蛋白结合率，从而计算出游离百分率(f_{u plasma}％，f_{u brain}％)；

血浆游离百分率(f_{u plasma}％)＝C_buffer/C_plasma×100％；

脑匀浆游离百分率(f_{u brain hom}％)＝C_buffer/C_{brain hom}×100％；

脑组织游离百分率(f_{u brain}％)＝f_{u brain hom}/(Df-(Df-1)*f_{u brain hom})×100％；此处Df＝11

3)采用以下公式计算血脑通透指数Kp-unbound。

6.试验结果与讨论

化合物的脑通透指数

编号	Kp-unbound	Brain ti ssue(ng/g)
			1	0.199	435±257

结论：本披露中化合物具有较好的脑通透性。

测试例6：化合物的药代动力学测试

1、摘要

以SD雄性大鼠为受试动物，应用LC/MS/MS法测定了大鼠灌胃给予实施例2化合物、实施例17化合物、实施例34化合物、实施例37化合物、实施例38化合物、实施例39化合物、实施例42化合物和实施例43化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究本披露中化合物在大鼠体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。

2、试验方案

2.1试验药品

实施例2化合物、实施例17化合物、实施例34化合物、实施例37化合物、实施例38化合物、实施例39化合物、实施例42化合物和实施例43化合物。

2.2试验动物

健康成年SD大鼠24只，雄性平均分成8组，每组3只，购自上海杰思捷实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0006。

2.3药物配制

称取一定量药物，加2.5％体积的DMSO和97.5％体积的10％solutol HS-15配制成0.2mg/mL的无色澄清透明液体。

2.4给药

SD大鼠禁食过夜后灌胃给药，给药剂量均为30.0mg/kg，给药体积均为10.0mL/kg。

3.操作

大鼠灌胃给药实施例2化合物、实施例17化合物、实施例34化合物、实施例37化合物、实施例38化合物、实施例39化合物、实施例42化合物和实施例43化合物，于给药前及给药后0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，11.0，24.0小时由眼眶采血0.2mL，置于肝素化试管中，4℃、3500转/分钟离心10分钟分离血浆，于-20℃保存，给药后2小时进食。

测定不同浓度的药物灌胃给药后大鼠血浆中的待测化合物含量：取给药后各时刻的大鼠血浆50μL，加入内标溶液喜树碱50μL(100ng/mL)，乙腈150μL，涡旋混合5分钟，离心10分钟(4000转/分钟)，血浆样品取上清液3μL进行LC/MS/MS分析。

4、药代动力学参数结果

本披露中化合物的药代动力学参数如下：

结论：本披露中化合物的药代吸收较好，具有药代动力学优势。

实施例2：A晶型

将100mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入2ml甲醇和水(V/V，1∶1)中，室温打浆，过滤，真空干燥，得到产物。该结晶样品的XRPD图谱见图1，其熔点在117.03℃附近，起始熔化温度为115.18℃，其特征峰位置如下表1所示：

表1

实施例3：A晶型

将1.2g化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入8ml乙酸乙酯、24ml正己烷中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(985mg，产率：82.1％)。

实施例4：A晶型

将100mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入0.5ml丙酮，搅拌溶解，加入2ml环己烷后，自然挥发析出固体，过滤，真空干燥，得到产物(50mg，产率：50％)。

实施例5：A晶型

将20mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入0.5ml乙酸乙酯，搅拌溶解，自然挥发析出固体，过滤，真空干燥，得到产物(14mg，产率：70％)。

实施例6：A晶型

将20mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入2ml甲基叔丁基醚/四氢呋喃(V/V，1∶1)丙酮，搅拌溶解，自然挥发析出固体，过滤，真空干燥，得到产物(15mg，产率：75％)。

实施例7：A晶型

将100mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml异丙醚、0.5ml四氢呋喃中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(62mg，产率：62％)。

实施例8：A晶型

将100mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml异丙醇中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(73mg，产率：73％)。

实施例9：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml丙酮/环己烷(V/V，1∶5)中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(28mg，产率：56％)。

实施例10：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml异丙醇/水(V/V，5∶1)中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(32mg，产率：64％)。

实施例11：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml正庚烷/四氢呋喃(V/V，5∶1)中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(31mg，产率：62％)。

实施例12：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml二氯甲烷/正己烷(V/V，1∶5)中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(35mg，产率：70％)。

实施例13：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml乙醇/水(V/V，5∶1)中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(27mg，产率：54％)。

实施例14：A晶型

将1g化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入5ml 1，4-二氧六环/环己烷(V/V，1∶5)中，加热搅拌溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(876mg，产率：87.6％)。

实施例15：A晶型

将100mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml乙酸乙酯/正己烷(V/V，1∶1)中，打浆，过滤，真空干燥，得到产物(63mg，产率：63％)。

实施例16：A晶型

将100mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml异丙醚中，打浆，过滤，真空干燥，得到产物(73mg，产率：73％)。

实施例17：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入0.3ml异丙醇/水(V/V，3∶1)中，打浆，过滤，真空干燥，得到产物(27mg，产率：54％)。

实施例18：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入0.3ml正庚烷中，打浆，过滤，真空干燥，得到产物(33mg，产率：66％)。

实施例19：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入0.3ml乙腈/环己烷(V/V，1∶5)中，打浆，过滤，真空干燥，得到产物(33mg，产率：66％)。

实施例20：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入0.3ml 1，4-二氧六环/环己烷(V/V，1∶5)中，打浆，过滤，过滤，真空干燥，得到产物(31mg，产率：62％)。

实施例21：A晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入0.3ml二氯甲烷/正己烷(V/V，1∶5)中，打浆，得到产物(36mg，产率：72％)。

实施例22：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入60μL正丙醇中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例23：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入60μL丙酮中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例24：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入180μL乙酸异丙酯中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例25：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入500μL甲基叔丁基醚中，室温下未溶清，加热至50℃溶清后搅拌30min后冷却析出白色固体，真空干燥，得到产物。

实施例26：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入40μL 2-丁酮中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例27：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入60μL二甲基亚砜中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例28：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入60μL甲基异丁基酮中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例29：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入40μL 1，4-二氧六环中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例30：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入40μL丙二醇甲醚中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例31：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入60μL异戊醇中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例32：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入120μL水和异丙醇(V/V，1∶9)中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例33：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入500μL乙酸乙酯和正庚烷(V/V，1∶1)中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例34：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入40μL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例35：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入60μL乙酸丁酯中，室温搅拌溶清，挥发析晶，真空干燥，得到产物。

实施例36：A晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入500μL环己烷中，室温下未溶清，加热至50℃搅拌60min后冷却，打浆，真空干燥，得到产物。

实施例37：B晶型

将100mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml异丙醇/水(V/V，10∶1)中，加热溶解，搅拌冷却析晶，过滤，真空干燥，得到产物(63mg，产率：63％)。该结晶样品的XRPD图谱见图2，其特征峰位置如下表2所示：

表2

实施例38：B晶型

将200mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入3ml乙腈，搅拌溶解，自然挥发析出固体，过滤，真空干燥，得到产物(136mg，产率：68％)。

实施例39：B晶型

将50mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入0.3ml四氢呋喃/环己烷(V/V，1∶2)中，打浆，过滤，真空干燥，得到产物(63mg，产率：63％)。

实施例40：C晶型

将实施例22所得固体置于干燥箱干燥8小时，得固体。该结晶样品的XRPD图谱见图3，其特征峰位置如下表3所示：

表3

实施例41：D晶型

将100mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入1ml丙酮和水(V/V，9∶1)中溶解，室温挥发析晶，干燥得固体。该结晶样品的XRPD图谱见图4，熔点在86.60℃附近，起始熔化温度为79.69℃，其特征峰位置如下表4所示：-

表4

实施例42：D晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入10％水/甲醇60μl中溶解，室温挥发析晶，干燥得固体。

实施例43：D晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入甲醇50μl中溶解，室温挥发析晶，干燥得固体。

实施例44：D晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入乙醇70μl中溶解，室温挥发析晶，干燥得固体。

实施例45：D晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入乙酸乙酯/乙醇(V/V，1∶1)60μl中溶解，室温挥发析晶，干燥得固体。

实施例46：D晶型

将5mg化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1，2，4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入乙腈/甲醇(V/V，1∶1)40μl中溶解，室温挥发析晶，干燥得固体。

实施例47：A晶型的引湿性研究

采用Surface Measurement Systems advantage，在25℃，湿度从50％起，考察湿度范围为0％-95％，步进为10％，判断标准为每个梯度质量变化dM/dT小于0.002，TMAX小于360min，循环两圈。

表5

实验结论：

由表5可知，本披露中化合物的A晶型样品在25℃的条件下，在20.0％RH-80.0％RH之间，随着湿度的增加吸水量也在增加，重量变化为0.1493％，增重小于0.2％，该样品无或几乎无引湿性。在正常储存条件(即25℃湿度60％)，吸水约为0.0809％；在加速试验条件(即湿度70％)，吸水约为0.1119％；在极端条件(即湿度90％)，吸水约为0.2379％。

在0％-95％的湿度变化过程中，该样品的解吸附过程与吸附过程基本重合；DVS谱图见图5，DVS前后X-射线粉末衍射对比图显示DVS前后晶型未发生转变见图6(a为DVS检测后XRPD图谱，b为DVS检测前XRPD图谱)。

实施例48：A晶型稳定性研究

实验例1：影响因素考察

将A晶型(实施例3)敞口平摊放置，考察在光照(4500Lux)、高温(40℃、60℃)、高湿(RH75％、RH 90％)条件下样品的稳定性，取样考察期为20天。

表6

影响因素实验表明：在光照、高温40℃和60℃、高湿75％和90％条件下，晶型A的物理、化学稳定性好。

实验例2：长期/加速稳定性

将A晶型(实施例3)分别放置25℃，60％RH和40℃，75％RH条件考察其稳定性

表7

长期/加速稳定性实验显示：晶型A长期加速稳定性条件下放置长达6个月，其晶型未发生变化，具有好的物理稳定性，同时，有关物质方面也没有任何增长，具有优异的化学稳定性。

实施例49：B晶型转变为A晶型

将实施例21得到B晶型样品(60mg)室温放置两周后将样品检测X-射线粉末衍射，X-射线粉末衍射谱图显示为A晶型。

实施例50：B晶型转变为C晶型

将实施例21得到B晶型样品(136mg)在室温(20-30℃)、0.06pa，真空干燥8小时，将样品检测X-射线粉末衍射，X-射线粉末衍射谱图显示为C晶型。

Claims

1.化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的A晶型，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在11.06,14.38,21.81,22.98,24.38,24.80,26.88处有特征峰。

2.根据权利要求1所述的A晶型，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在11.06,12.10,14.38,18.94,21.09,21.81,22.98,24.38,24.80,26.88处有特征峰。

3.根据权利要求1或2所述的A晶型，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在7.16,10.44,11.06,12.10,14.38,17.00,17.67,18.94,21.09,21.81,22.98,24.38,24.80,26.88处有特征峰。

4.根据权利要求1所述的A晶型，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图1所示。

5.制备权利要求1-4任意一项所述的A晶型的方法，选自：

方法1：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(I)中，搅拌溶解或加热溶解，所述溶剂(I)选自丙酮、环己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、2-丁酮、二甲基亚砜、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、正丙醇、甲基异丁酮、1,4-二氧六环、丙二醇甲醚、异戊醇、N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种，

(b)挥发；

或者，方法2：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(II)中，所述溶剂(II)选自异丙醚、正庚烷、正己烷、乙腈、1,4-二氧六环、异丙醇、环己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲醇或水中的至少一种，

(b)打浆，过滤；

或者，方法3：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(III)中，搅拌溶解或加热溶解，所述溶剂(III)选自丙酮、环己烷、异丙醇、水、四氢呋喃、正庚烷、二氯甲烷、乙醇、1,4-二氧六环、乙酸乙酯中的至少一种，

(b)搅拌析晶，过滤。

6.化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的B晶型，其特征在于：以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在5.54,11.33,16.54,17.10,20.12,21.26,22.44处有特征峰。

7.制备权利要求6所述的B晶型的方法，选自：

方法1：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(IV)中，搅拌溶解或加热溶解，所述溶剂(IV)选自乙腈，

(b)挥发；

或者，方法2：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(V)中，搅拌溶解或加热溶解，所述溶剂(V)选自异丙醇/水；

(b)搅拌析晶，过滤；

或者，方法3：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(VI)中，所述溶剂(VI)选自四氢呋喃/正己烷、水，

(b)打浆，过滤。

8.化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的C晶型，其特征在于：以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在5.63,16.01,17.41,19.02,21.00,23.02,23.84,24.28处有特征峰。

9.化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶的D晶型，其特征在于：以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在7.78,12.14,12.62,17.25,18.34,19.69,25.01处有特征峰。

10.制备权利要求9所述的D晶型的方法，包括：

(a)将化合物5-(3-(3-(6-氟萘-1-基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三氮唑-4-基)-2-甲氧基吡啶加入溶剂(VII)中，所述溶剂(VII)选自水、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醇、乙腈中的至少一种，

(b)挥发，过滤。

11.根据权利要求1所述的A晶型，其特征在于，其在20.0％RH-80％RH条件下，无或几乎无引湿性。

12.根据权利要求1、6、8或9任意一项所述的晶型，其特征在于，所述2θ角误差范围为±0.30。

13.根据权利要求1、6、8或9任意一项所述的晶型，其特征在于，所述2θ角误差范围为±0.20。

14.一种药物组合物，含有权利要求1、6、8或9任意一项所述的的晶型和任选自药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

15.一种由权利要求1、6、8或9任意一项所述的晶型的化合物制备的药物组合物。

16.权利要求1、6、8或9任意一项所述的晶型的化合物在制备用于治疗或预防已知或可显示抑制催产素会产生有益效应的疾病或病症的药物的用途，所述疾病或病症选自性功能障碍、性欲减退障碍、性唤起障碍、性高潮障碍、性交疼痛障碍、早泄、预产前分娩、分娩并发症、食欲和进食疾病、良性前列腺增生、早产、痛经、充血性心力衰竭、动脉高血压、肝硬化、肾性高血压、高眼压、强迫观念与行为障碍和神经精神疾病。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述疾病或病症选自性功能障碍、性唤起障碍、性高潮障碍、性交疼痛障碍和早泄。

18.权利要求1、6、8或9任意一项所述的晶型的化合物在制备用于拮抗催产素的药物中的用途。