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CN111077311B - 一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN111077311B CN201911403515.5A CN201911403515A CN111077311B CN 111077311 B CN111077311 B CN 111077311B CN 201911403515 A CN201911403515 A CN 201911403515A CN 111077311 B CN111077311 B CN 111077311B
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Abstract

本发明公开的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，多肽，细胞悬液；阴性对照：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，DMSO，细胞悬液；阳性对照：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，PMA+Ionomycin，细胞悬液；标准曲线：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，各浓度anti‑CD3，细胞悬液。其优点在于，提高酶联免疫斑点检测方法的灵敏度，并确保能够得到稳定可靠的检测结果。

Description

一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于酶联免疫斑点检测技术领域，具体为一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
酶联免疫斑点检测ELISpot(Enzyme-Linked ImmunoSpot assay)是目前应用最为广泛的单细胞功能检测方法之一。在肿瘤疫苗研制上，功能性免疫学检测是疫苗研制和临床试验的基本组成部分，ELISpot检测作为一种强有力的实验技术，主要应用于新的免疫原性靶点的鉴定、验证抗原特异性T细胞的存在、评价疫苗诱导的免疫应答，有助于了解疫苗的免疫原性、效力和有效性。
ELISpot只需要相对较低数量的T细胞就能够简单快速地检测肽特异性T细胞反应。ELISpot分析通常被认为是一种高度敏感的方法，可以检测10000个细胞中的一个。尽管ELISpot检测具有很高的敏感性，但检测患者或健康供体外周血单个核细胞中新抗原特异性T细胞的免疫应答仍然非常困难，因为这些T细胞的频率可能非常低。
ELISpot分析将产生潜在的重要数据，对进行纵向随访的免疫反应监测而言，在所有检测中获得可比结果极其重要，目前市面上的ELISpot试剂盒无法解决此问题。
发明内容
为解决现有技术中酶联免疫斑点检测试剂盒无法更为有效刺激T细胞，从而无法获得更高灵敏度，以及检测数据结果不能达到较佳地稳定可靠的问题，本发明提供了一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法，实现的目的为采用抗体和细胞因子等共同刺激T细胞，提高酶联免疫斑点检测方法的灵敏度，缩短体外刺激时间，并确保能够得到稳定可靠的检测结果。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案，本发明提供的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，多肽中每条肽浓度为1-10μg/ml，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；
阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；
阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；
含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.001-0.005μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。
进一步的，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-21，此培养基含有anti-CD28、IL-2、以及IL-21时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-21为10-50ng/ml。
进一步的，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-7，此培养基含有anti-CD28、IL-2、以及IL-7时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-7为1-30ng/ml。
进一步的，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-7、IL-15，此培养基含有anti-CD28、IL-2、IL-7、以及IL-15时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-7为1-30ng/ml、IL-15为1-50ng/ml。
本发明还提供了采用所述试剂盒酶联免疫斑点检测的方法，包括如下步骤：
(1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，在安全柜中打开，每孔加入PBS洗涤；
(2)向每孔中加入待测PBMC细胞的培养基，室温下孵育；
(3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线对照孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；各标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL；
(4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养12-48小时；
(5)12-48小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μLPBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次；
(11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；
(12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点；
(13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。
进一步的，所述步骤(1)之前还包括步骤(0)体外刺激：
(01)用培养基将待测PBMC细胞浓度调整为2-8×106/ml；
(02)在96孔U底细胞培养板中依次加入如下：实验孔：100μL待测PBMC细胞培养基、0.4μL多肽、多肽中每条肽浓度为1-10μg/ml，100μL浓度为2-8×106/ml待测PBMC细胞悬液，阴性孔：100μL待测PBMC细胞培养基、100μL浓度为2-8×106/ml待测PBMC细胞悬液；
(03)将步骤(02)制备好的96孔U底细胞培养板放在CO2培养箱中37℃培养5天。
本发明采用上述技术方案，有益效果包括：1、ELISpot结果的主观判断是ELISpot全球标准化过程的最大障碍之一。anti-CD3内参标准曲线的建立，增强各单次实验结果间的一致性，提高ELISpot结果的可靠性和可比性，减少样本随访时间点之间的分析变化。
2、在ELISpot铺板时，用anti-CD28和IL-2(或anti-CD28、IL-2和IL-7；或anti-CD28、IL-2、IL-7和IL-15；或anti-CD28、IL-2和IL-21)共同刺激T细胞，这种方法可以比传统ELISpot提高灵敏度。
3、体外用抗原预刺激PBMC 5天，与传统体外预刺激10天以上的方法相比，可达到相同实验效果并有效节约时间，减少长时间培养和繁复操作带来的干扰。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。所用的原料或试剂都是市售可得。本发明中提到的待测PBMC细胞浓度都是用培养其的培养基进行调整的。本发明的检测抗体为试剂盒自带的anti-IFN-γ-biotin或anti-Granzyme B-biotin或anti-IL-2-biotin。
实施例一：本发明提供的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1U/ml；
阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1U/ml；
阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1U/ml；
含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1U/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.001μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。
本发明还提供了采用所述试剂盒酶联免疫斑点检测的方法，包括如下步骤：
(1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，在安全柜中打开，每孔加入200μL PBS洗涤5次；
(2)向每孔中加入200μL培养基，室温下孵育30min；
(3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线对照孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL；
(4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养12小时；
(5)12小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS，洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次；
(11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；
(12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点；
(13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。
采用上述检测方法，本实施例检测抗体为anti-IFN-γ-biotin，所使用多肽为包含CMV、Influenza A和EBV的肽，每条肽浓度为1μg/ml，以下列举部分对比试验，用以说明本发明所选择的细胞因子组合，以及细胞因子所使用的量能够帮助本发明检测方法提高敏感度，实验结果见下表：
Figure BDA0002348032990000071
由此可见当我们用包含CMV、Influenza A和EBV的肽刺激PBMC时，IFN-γ斑点的数目比现有技术不加细胞因子或单独使用某种细胞因子或组合使用某些细胞因子增加了2-5倍。
实施例二：本发明提供的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，以及100μL浓度为5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-21，anti-CD28在该培养基中的浓度为5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为30U/ml，IL-21在该培养基中的浓度为10ng/ml；
阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-21，anti-CD28在该培养基中的浓度为5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为30U/ml，IL-21在该培养基中的浓度为10ng/ml；
阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-21，anti-CD28在该培养基中的浓度为5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为30U/ml，IL-21在该培养基中的浓度为10ng/ml；
含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为5×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-21，anti-CD28在该培养基中的浓度为5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为30U/ml，IL-21在该培养基中的浓度为10ng/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.005μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。
本发明还提供了采用所述试剂盒酶联免疫斑点检测的方法，包括如下步骤：
(1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，在安全柜中打开，每孔加入200μL PBS洗涤5次；
(2)向每孔中加入200μL培养基，室温下孵育30min；
(3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线对照孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL；
(4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养48小时；
(5)48小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS，洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次；
(11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；
(12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点；
(13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。
进一步的，所述步骤(1)之前还包括步骤(0)体外刺激：
(01)用培养基将PBMC细胞浓度调整为8×106/ml；
(02)在96孔U底细胞培养板中依次加入如下：实验孔：100μL待测PBMC细胞培养基、0.4μL多肽、100μL浓度为8×106/ml待测PBMC细胞悬液，阴性孔：100μL待测PBMC细胞培养基、100μL浓度为8×106/ml待测PBMC细胞悬液；
(03)将96孔U底细胞培养板放在CO2培养箱中37℃培养5天。
采用上述检测方法，本实施例检测抗体为anti-Granzyme B-biotin，所使用多肽为包含CMV、Influenza A和EBV的肽，每条肽浓度为5μg/ml，体外5天刺激所使用的多肽与检测方法中的多肽一致，以下列举部分对比试验，用以说明本发明所选择的细胞因子组合，以及细胞因子所使用的量能够帮助本发明检测方法提高敏感度，实验结果见下表：
Figure BDA0002348032990000091
Figure BDA0002348032990000101
由此可见，当我们用包含CMV、Influenza A和EBV的肽刺激PBMC时，Granzyme B斑点的数目比现有技术不加细胞因子或单独使用一种细胞因子或使用某两种细胞因子增加了3-6倍。
实施例三：本发明提供的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，以及100μL浓度为3×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-21，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为5U/ml，IL-21在该培养基中的浓度为50ng/ml；
阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为3×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-21，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为5U/ml，IL-21在该培养基中的浓度为50ng/ml；
阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为3×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-21，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为5U/ml，IL-21在该培养基中的浓度为50ng/ml；
含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为3×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-21，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为5U/ml，IL-21在该培养基中的浓度为50ng/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.003μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。
本发明还提供了采用所述试剂盒酶联免疫斑点检测的方法，包括如下步骤：
(1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，在安全柜中打开，每孔加入200μL PBS洗涤5次；
(2)向每孔中加入200μL培养基，室温下孵育30mi n；
(3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线对照孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL；
(4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养24小时；
(5)24小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS，洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次；
(11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；
(12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点；
(13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。
进一步的，所述步骤(1)之前还包括步骤(0)体外刺激：
(01)用培养基将PBMC细胞浓度调整为8×106/ml；
(02)在96孔U底细胞培养板中依次加入如下：实验孔：100μL待测PBMC细胞培养基、0.4μL多肽、100μL浓度为8×106/ml待测PBMC细胞悬液，阴性孔：100μL待测PBMC细胞培养基、100μL浓度为8×106/ml待测PBMC细胞悬液；
(03)将96孔U底细胞培养板放在CO2培养箱中37℃培养5天。
采用上述检测方法，本实施例检测抗体为anti-IL-2-biotin，所使用多肽为包含CMV、Influenza A和EBV的肽，每条肽浓度为10μg/ml，体外5天刺激所使用的多肽与检测方法中的多肽一致，以下列举部分对比试验，用以说明本发明所选择的细胞因子组合，以及细胞因子所使用的量能够帮助本发明检测方法提高敏感度，实验结果见下表：
Figure BDA0002348032990000121
由此可见，当我们用包含CMV、Influenza A和EBV的肽刺激PBMC时，IL-2斑点的数目比现有技术不加细胞因子或单独使用一种细胞因子或使用某两种细胞因子增加了1.5-2.4倍。
实施例四：以下实施例检测抗体都是以常见的anti-Granzyme B-biotin抗体为例，本发明提供的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，anti-CD28在该培养基中的浓度为1μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为10U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为1ng/ml；
阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，anti-CD28在该培养基中的浓度为1μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为10U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为1ng/ml；
阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，anti-CD28在该培养基中的浓度为1μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为10U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为1ng/ml；
含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，anti-CD28在该培养基中的浓度为1μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为10U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为1ng/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.002μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。
本发明还提供了采用所述试剂盒酶联免疫斑点检测的方法，包括如下步骤：
(1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，在安全柜中打开，每孔加入200μL PBS洗涤5次；
(2)向每孔中加入200μL培养基，室温下孵育30min；
(3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线对照孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL；
(4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养12小时；
(5)12小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS，洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次；
(11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；
(12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点；
(13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。
进一步的，所述步骤(1)之前还包括步骤(0)体外刺激：
(01)用培养基将PBMC细胞浓度调整为5×106/ml；
(02)在96孔U底细胞培养板中依次加入如下：实验孔：100μL待测PBMC细胞培养基、0.4μL多肽、100μL浓度为5×106/ml待测PBMC细胞悬液，阴性孔：100μL待测PBMC细胞培养基、100μL浓度为5×106/ml待测PBMC细胞悬液；
(03)将96孔U底细胞培养板放在CO2培养箱中37℃培养5天。
实施例五：本发明提供的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，以及IL-15，anti-CD28在该培养基中的浓度为2μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为15U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为30ng/ml，IL-15在该培养基中的浓度为1ng/ml；
阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，以及IL-15，anti-CD28在该培养基中的浓度为2μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为15U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为30ng/ml，IL-15在该培养基中的浓度为1ng/ml；
阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，以及IL-15，anti-CD28在该培养基中的浓度为2μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为15U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为30ng/ml，IL-15在该培养基中的浓度为1ng/ml；
含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，以及IL-15，anti-CD28在该培养基中的浓度为2μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为15U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为30ng/ml，IL-15在该培养基中的浓度为1ng/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.001μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。
本发明还提供了采用所述试剂盒酶联免疫斑点检测的方法，包括如下步骤：
(1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，，在安全柜中打开，每孔加入200μL PBS洗涤5次；
(2)向每孔中加入200μL培养基，室温下孵育30min；
(3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线对照孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL；
(4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养12小时；
(5)12小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS，洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次；
(11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；
(12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点；
(13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。
进一步的，所述步骤(1)之前还包括步骤(0)体外刺激：
(01)用培养基将PBMC细胞浓度调整为8×106/ml；
(02)在96孔U底细胞培养板中依次加入如下：实验孔：100μL待测PBMC细胞培养基、0.4μL多肽、100μL浓度为8×106/ml待测PBMC细胞悬液，阴性孔：100μL待测PBMC细胞培养基、100μL浓度为8×106/ml待测PBMC细胞悬液；
(03)将96孔U底细胞培养板放在CO2培养箱中37℃培养5天。
实施例六：本发明提供的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，以及IL-15，anti-CD28在该培养基中的浓度为4μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为20U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为15ng/ml，IL-15在该培养基中的浓度为50ng/ml；
阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，以及IL-15，anti-CD28在该培养基中的浓度为4μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为20U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为15ng/ml，IL-15在该培养基中的浓度为50ng/ml；
阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，以及IL-15，anti-CD28在该培养基中的浓度为4μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为20U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为15ng/ml，IL-15在该培养基中的浓度为50ng/ml；
含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为1×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2、IL-7，以及IL-15，anti-CD28在该培养基中的浓度为4μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为20U/ml，IL-7在该培养基中的浓度为15ng/ml，IL-15在该培养基中的浓度为50ng/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.001μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。
本发明还提供了采用所述试剂盒酶联免疫斑点检测的方法，包括如下步骤：
(1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，，在安全柜中打开，每孔加入200μL PBS洗涤5次；
(2)向每孔中加入200μL培养基，室温下孵育30min；
(3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线对照孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL；
(4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养48小时；
(5)48小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS，洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤5次，最后一次在吸水纸上扣干；
(10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次；
(11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；
(12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点；
(13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。
进一步的，所述步骤(1)之前还包括步骤(0)体外刺激：
(01)用培养基将PBMC细胞浓度调整为8×106/ml；
(02)在96孔U底细胞培养板中依次加入如下：实验孔：100μL待测PBMC细胞培养基、0.4μL多肽、100μL浓度为8×106/ml待测PBMC细胞悬液，阴性孔：100μL待测PBMC细胞培养基、100μL浓度为8×106/ml待测PBMC细胞悬液；
(03)将96孔U底细胞培养板放在CO2培养箱中37℃培养5天。
采用上述检测方法，实施例四至实施例六都是采用的常用的抗体anti-GranzymeB-biotin，所使用多肽均为包含CMV、Influenza A和EBV的肽，每条肽浓度为10μg/ml，5天体外刺激所使用的多肽与检测方法所使用的多肽一致，以下列举部分对比试验，用以说明本发明所选择的细胞因子组合，以及细胞因子所使用的量能够帮助本发明检测方法提高敏感度，实验结果见下表：
Figure BDA0002348032990000201
由此可见，当我们用包含CMV、Influenza A和EBV的肽刺激PBMC时，斑点的数目比现有技术不加细胞因子或单独使用一种细胞因子或使用某两种细胞因子增加了1.6-3.6倍。
为了节约篇幅，减少不必不要的重复，不再一一列举具体的试验数据，本发明方法可以用在现有技术中ELISpot试剂盒各种检测抗体使用，采用本发明方法与现有技术检测方法相比，灵敏度提高了1.5-6倍，故采用本发明的检测方法与传统ELISpot方法具有更高的灵敏度。
本发明建立anti-CD3内参，可以修订当次实验的结果，确保结果的可靠性。现有技术没有建立内参，是直接用加入的细胞数做分母，但细胞的反应性还受不同样品，不同批次操作等因素影响。使用相同样品制作标准曲线，如果当次实验导致整体反应过高，本底过高，这都不是真实的细胞反应结果，通过实验孔与标准曲线不同浓度反应孔的对比，可以修正结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种酶联免疫斑点检测试剂盒，其特征在于，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，多肽中每条肽浓度为1-10μg/ml，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml，所使用多肽为包含CMV、Influenza A和EBV的肽；
阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；
阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；
含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为1-5×106/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.001-0.005μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫斑点检测试剂盒，其特征在于，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-21，此培养基含有anti-CD28、IL-2、以及IL-21时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-21为10-50ng/ml。
3.根据权利要求1所述的酶联免疫斑点检测试剂盒，其特征在于，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-7，此培养基含有anti-CD28、IL-2、以及IL-7时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-7为1-30ng/ml。
4.根据权利要求1所述的酶联免疫斑点检测试剂盒，其特征在于，所述实验孔、阴性对照、阳性对照、标准曲线用到的待测PBMC细胞的培养基中还包含有IL-7、IL-15，此培养基含有anti-CD28、IL-2、IL-7、以及IL-15时，各成分在此培养基中的浓度为，anti-CD28为0.1-5μg/ml、IL-2为1-30U/ml、IL-7为1-30ng/ml、IL-15为1-50ng/ml。
5.一种采用权利要求1-4任意一项所述酶联免疫斑点检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
(1)将事先包被检测抗体的96孔ELISpot板从冰箱中取出，在安全柜中打开，每孔加入PBS洗涤；
(2)向每孔中加入待测PBMC细胞的培养基，室温下孵育；
(3)弃去96孔ELISpot板中的培养基，分别向实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、标准曲线孔加入所述试剂盒成分，即实验孔依次加入所述培养基、所述多肽、所述细胞悬液，终体积200μL；阴性对照孔依次加入所述培养基、所述DMSO、所述细胞悬液，终体积200μL；阳性对照孔中依次加入所述培养基，所述PMA+Ionomycin、所述细胞悬液，终体积200μL；各标准曲线孔依次加入所述培养基,所述各浓度anti-CD3、所述细胞悬液，终体积200μL；
(4)将步骤(3)制备好的96孔ELISpot板放在CO2培养箱中37℃培养12-48小时；
(5)12-48小时后将ELISpot板从培养箱中取出，倾倒孔内培养基，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(6)将检测抗体用PBS、FBS混合溶液稀释到1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(7)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(8)将酶标亲和素用PBS、FBS混合溶液按体积比1：1000稀释后，每孔加100μL，37℃孵育1小时，所述PBS在PBS、FBS混合溶液中的体积百分比为99.5％，余下为FBS；
(9)倾倒孔内液体，每孔加入200μL PBS洗涤，最后一次在吸水纸上扣干；
(10)将显色液用0.45μm的滤膜过滤除杂质，然后每孔中加入100μL，室温避光孵育，每隔3-5min观察一次；
(11)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座，终止显色，将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；
(12)在酶联斑点图像分析仪上读取孔板膜片上的斑点；
(13)根据各浓度anti-CD3读数制作标准曲线并拟合，将样本读数代入标准曲线求得修正后结果。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)之前还包括步骤(0)体外刺激：
(01)用培养基将待测PBMC细胞浓度调整为2-8×106/ml；
(02)在96孔U底细胞培养板中依次加入如下：实验孔：100μL待测PBMC细胞培养基、0.4μL多肽，多肽中每条肽浓度为1-10μg/ml、100μL浓度为2-8×106/ml待测PBMC细胞悬液，阴性孔：100μL待测PBMC细胞培养基、100μL浓度为2-8×106/ml待测PBMC细胞悬液；
(03)将步骤(02)制备好的96孔U底细胞培养板放在CO2培养箱中37℃培养5天。
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