CN111067007A - 一种光动力杀灭沙门氏菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，所述方法是以核黄素为光敏剂，采用蓝光光源，光动力杀灭沙门氏菌的方法，属于杀灭食源性致病菌沙门氏菌的杀菌技术领域。本发明所采用的光敏剂是人体必需维生素之一，核黄素，属于食品级光敏剂，安全无毒，且对杀灭沙门氏菌效果显著，并且本发明能够控制沙门氏菌病的风险，处理时间短，操作简便，可彻底杀灭沙门氏菌，并有一定的控制和预防效果。本发明提供了一种有效杀灭食品中沙门氏菌的方法，成本低廉，操作简单，应用广泛，很好的促进了食品杀菌技术的发展。

Description

一种光动力杀灭沙门氏菌的方法

技术领域

本发明涉及食源性致病菌沙门氏菌的杀菌技术，具体涉及一种光动力杀灭沙门氏菌的方法。

背景技术

随着近年来世界范围内食品安全恶性事件的屡屡发生，食品污染与食源性疾病问题构成了一个巨大的世界性公共卫生难题，也成为阻碍国际食品贸易发展的重要因素。沙门氏菌是全球食源性疾病的主要病原体，其具有侵袭性，裂解后可释放耐热力很强的内毒素，近年来由沙门氏菌引起的食物中毒病例在在各种中毒事件中居于前列。并且，沙门氏菌对外界不同环境抵抗力较强，在水、牛奶及肉制品中可生存数月，同时，沙门氏菌细胞具有冷休克蛋白(CspH)，能够在低于食品冷藏温度5℃的条件下存活。因此，沙门氏菌引起的细菌性食物中毒给人类生命健康和财产安全带来了极大的不良后果，也给食源性疾病的控制和预防带来新的挑战。

目前食品行业的杀菌手段主要分为两类，即传统的热杀菌技术和新型的非热杀菌技术(如超高压、脉冲电场、脉冲强光、辐照和微波等技术)。传统的热杀菌技术在食品行业中应用早、技术成熟且杀菌较彻底，能保证食品在微生物方面的安全，但会破坏食品的营养成分、组织结构、色泽和食品产品的风味。虽然现有的一些非热杀菌技术满足了消费者对食品安全与品质的双重要求，但它们往往存在着设备投入和运行成本高、能源消耗过大以及对冷链运输条件要求较高等缺点。

光动力杀菌(photodynamic inactivation，PDI)是一种可选择性灭活恶性肿瘤细胞和致病性微生物及病毒的新方法。该方法的主要原理是利用特定波长的激光照射使无毒的光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单线态氧。单线态氧是具有强氧化作用的活性氧物质，能破坏细胞大分子结构，导致细胞受损甚至死亡，从而达到杀灭恶性肿瘤细胞和致病性微生物的目的。研发具有经济环保、绿色安全、广谱高效，并且能最大限度保持食品营养成分、组织结构和产品色泽等特性的光动力杀菌技术正逐渐成为食品工业研究热点。

然而有研究认为光动力作用的效果与菌种有很大关系，革兰氏阴性菌对光动力作用普遍不敏感。例如，唐蕾等人以叶绿素的降解产物叶绿酸酯为光敏剂进行光动力杀菌，研究结果表明其对革兰氏阳性菌白葡萄球菌有显著的光动力杀伤作用，而对革兰氏阴性菌大肠杆菌的生长没有影响(唐蕾,曹建平,吴亢,邵蔚蓝,胡慧中,张高峰.叶绿酸酯的光敏杀菌作用[J].无锡轻工大学学报(2):58-61.)。Yeshayahu等人的研究结果也表明，以低剂量卟啉化合物为光敏剂的光动力杀菌对69株革兰氏阳性菌中的60株有明显抑制作用，而只对247株革兰氏阴性菌中的150株有较弱的抑制作用。因此，对于不同的微生物，尤其是革兰氏阴性菌，开发出杀菌效果更好更安全的光敏剂是光动力杀菌技术研究的难点。而现有的光动力杀菌技术对食品中沙门氏菌的杀菌效果不理想，或使用的光敏剂不属于食品添加剂。例如，Buchovec等人以5-氨基酮戊酸(ALA)为光敏剂，以400nm波长的LED灯为光源，在使用20mw/cm²的辐照度提供24J/cm²的剂量时，观察到沙门氏菌种群减少了4到6log CFU/mL。(Buchovec I,Vaitonis Z,Luksiene Z.Novel approach to control Salmonellaenterica by modern biophotonic technology:Photosensitization[J].Journal ofApplied Microbiology,2009,106(3):748-754.)然而，ALA不属于食品添加剂，不可用于食品中。除此之外，其使用的光能量剂量过大对人体有很大的伤害。

1899年，英国化学家Wynter Blyth从牛奶中提取出一种亮黄色的色素，并将其命名为乳黄素，即核黄素。核黄素是一类B族维生素，也是人体必需的维生素，对改善生物体的新陈代谢以及促进人体的生长发育发挥着重要的作用。

近年来，许多研究已证实核黄素作为光敏剂在杀灭肿瘤、癌细胞、病虫害等领域的应用情况，如王志勇等研究发现在紫外灯照射下，300μmol/L核黄素作用10min就可将水泡性口腔炎病毒杀死(王志勇,张循善,王明丽,et al.维生素B₂作为光敏剂灭活病毒的实验研究[J].安徽医科大学学报,2006(01):75-77.)。然而到目前为止，核黄素作为光敏剂的光动力杀菌技术在食品安全领域的应用报道极为少见。因此，基于核黄素的功能及其在医学上的应用，有望通过核黄素介导的光动力技术应用于食品安全领域，进而加强食品的安全性。

因此，利用光动力杀菌技术杀灭革兰氏阴性菌，尤其是食品中的沙门氏菌，亟需采用可应用于食品中的光敏剂，如核黄素，而现有技术中并没有以核黄素作为光敏剂杀灭沙门氏菌的光动力方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种光动力杀灭沙门氏菌方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)以核黄素作为光敏剂与待处理样品混合；

(2)将上述混合处理后的样品在黑暗条件下孵育；

(3)将上述黑暗孵育后的样品用蓝光光源照射。

所述黑暗孵育是指将光敏剂核黄素溶液与待处理样品进行混合后，在黑暗条件下进行孵育，以便于核黄素与待处理样品中的沙门氏菌更好地结合。

所述蓝光光源波长为455～460nm。

所述核黄素在待处理样品混合体系中的浓度为100～300μmol/L。

优选地，所述核黄素在待处理样品混合体系中的浓度为150～200μmol/L。

所述蓝光光源照射的光能量密度为6～16J/cm²。

优选地，所述蓝光光源照射的光能量密度为9.36～15.6J/cm²。

优选地，所述蓝光光源照射的光能量密度为12.48～15.6J/cm²。

所述蓝光光源照射时间≥20min。

优选地，所述蓝光光源照射时间为20～50min。

进一步，所述蓝光光源照射时间为30～50min。

步骤(3)中，用蓝光光源照射时，仅有蓝光光源且防止其他光源照射。

所述蓝光光源为LED蓝光光源。

步骤(2)中，所述黑暗孵育时间为35～50min，

优选地，所述黑暗孵育时间为40～45min，更优选为40min。

优选地，步骤(3)中，所述蓝光光源的光辐照强度为5.2mW/cm²，所述蓝光光源与待处理样品之间距离为5cm。

优选方案，所述核黄素在待处理样品混合体系中的浓度为150～200μmol/L、黑暗孵育时间为30～50min、蓝光光源照射的光能量密度为9.36～15.6J/cm²。

本发明中涉及的一种光动力杀灭沙门氏菌方法，是一种使用蓝光光源复合核黄素的特异性杀灭沙门氏菌的杀菌方法。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本方法创新地将人体必需维生素—核黄素与455～460nm蓝光光源相结合，构建了一种新的以核黄素介导的杀灭沙门氏菌的光动力杀菌方法，该方法具有操作简单，成本低廉且无污染的优点。

2、光敏剂采用的核黄素是人体必需维生素之一，属于食品级光敏剂，安全无毒，且对杀灭沙门氏菌效果显著。

3、本发明能够控制沙门氏菌病的风险，处理时间短，照射剂量小，操作简便安全，可彻底杀灭沙门氏菌，并有一定的控制和预防效果，适用于食品中沙门氏菌的杀灭与调控，为降低沙门氏菌的患病风险，维护公共卫生提供强有力的技术支持。

附图说明

图1为：455～460nm LED照明系统的设备结构示意图。

其中：1-LED拍摄灯箱，2-升降台，3-24孔板，4-LED蓝光光源。

图2为：不同核黄素浓度对光动力杀灭沙门氏菌的效果影响。

图3为：不同蓝光光源照射时间对光动力杀灭沙门氏菌的效果影响。

图4为：不同黑暗孵育时间对光动力杀灭沙门氏菌的效果影响。

图5为：光动力杀灭沙门氏菌方法处理新鲜鸡蛋的实验效果。

图6为：核黄素介导的光动力灭活对沙门氏菌外膜的影响效果图。

其中，6A-阴性对照组；6B-单纯光照组；6C-单纯光敏剂组；6D-光动力实验组I；6E-光动力实验组II；6F-光动力实验组III。放大倍数为：A1～F1 10000倍，A2～F2 20000倍。

具体实施方式

沙门氏菌菌液的制备

实施例中使用的沙门氏菌菌种分别是伤寒沙门氏菌CICC 21484和肠炎沙门氏菌CMCC 50041。其中鼠伤寒沙门氏菌CICC 21484购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)；肠炎沙门氏菌CMCC 50041，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心(China Medical Culture Collection，CMCC)。

沙门氏菌菌液制备方法：取-80℃保存下甘油管中标准菌株CICC 21484和CMCC50041划线接种于亚硫酸铋琼脂平板，37℃静置培养24～48h。分别挑取单菌落于9mL TSB试管中，在37℃转速为180r/min的摇床中培养13h，获得稳定初期的菌体培养液。将等量的两种沙门氏菌培养液混合于离心管中，离心5min(4℃，4000g)，用0.85％无菌生理盐水溶液对菌体进行重悬，调整菌体浓度为～1×10⁷CFU/mL。

核黄素溶液的制备

实施例中的核黄素来源于核黄素生工生物工程股份有限公司，USP级别。

核黄素溶液的制备方法为：将核黄素用0.85％无菌生理盐水，制成核黄素溶液，现配现用，常温黑暗保存。

蓝光光源

实施例中的蓝光光源是LED蓝光光源(455～460nm，30cm，5W)，是从中国深圳(格田光电有限公司，中国)购买。蓝光光源照射处理的装置结构如图1所示，LED系统包括LED拍照摄影灯箱，升降台，LED蓝光光源，所述LED系统被LED拍照摄影灯箱包围，可防止外部光线进入。LED蓝光光源置于LED拍照摄影灯箱顶部内侧，24孔板置于升降台上，将LED蓝光光源与24孔板(直径14mm)中样品溶液之间的距离用升降台调整为5.0cm。LED蓝光光源的光辐照强度是5.2mW/cm²，使用装有光电二极管功率传感器(S130C)(美国牛顿)的能量计控制台(PM100D)测量。使用以下公式计算获得的每个样品的剂量：

E＝Pt

其中E＝剂量(能量密度)，单位为J/cm²，p＝辐照度(功率密度)，单位为W/cm²，t＝时间，单位为s。

如图1所示，升降台2设置在LED拍摄灯箱1内部，且并未使用虚线表示升降台2，但不影响本领域技术人员理解蓝光光源照射处理装置的具体结构。

光动力方法处理沙门氏菌：

将核黄素溶液与菌液混合于5mL离心管中，使体系中菌液浓度约为1×10⁶CFU/mL，核黄素浓度分别为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L。在PTR-60多功能垂直旋转混合器中以2r/min的转速黑暗(温度为室温：22～25℃)孵育一定时间。吸取500μL混合菌液于24孔板中，用波长为455～460nm的LED蓝色光源照射一定时间。然后用0.85％无菌生理盐水进行稀释，选择合适稀释度，取100μL的稀释液进行涂布，将平板在37℃条件下培养24～48h，计算菌落数。每个处理均做3个平行样本，每个稀释度重复3次。

其中，所述PTR-60多功能垂直旋转混合器Grant-bio；9272隔水式恒温培养箱来自上海一恒科技有限公司。

数据分析：

运用OriginPro 9.1、SPSS17.0软件包(SPSS Inc.,Chicago,USA)对实验数据进行处理和分析。采用最小显著极差法(LSD)对数据间的显著性进行比较(p＝0.05)。

图2-4中的abcde是SPSS软件在分析数据时自动生成的，用于表达显著性差异。

以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，达成技术效果的实现过程进行充分解释，并据以实施。

实施例1

不同核黄素浓度对光动力杀灭沙门氏菌的效果影响实验

按照上述光动力处理沙门氏菌的方法进行实验，其中：核黄素溶液在待处理样品混合体系中的浓度分别为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L；黑暗孵育时间为40min；LED蓝光光源照射时间为30min。图2中显示了不同浓度核黄素处理后沙门氏菌的失活情况。

体系中沙门氏菌的最初接种量约为4.5×10⁶CFU/mL，在孵育时间为40min，光照时间为30min时，核黄素浓度为100、150、200μmol/L时，分别能将沙门氏菌量减少1.12、6.14和6.21Log CFU/mL，其中核黄素浓度为150μmol/L和200μmol/L时，沙门氏菌的致死率分别达到99.99993％和99.99995％。核黄素浓度较低时，随着浓度的增加，光动力对沙门氏菌的致死率提高，当浓度达到200μmol/L时，致死率达到最大。当继续提高核黄素浓度时，对沙门氏菌的致死率明显下降，可能原因为溶液中过剩的光敏剂吸收了大部分的光，从而减少了结合在菌体表面那部分光敏剂的有效光照，因此细菌的致死率降低。说明，选择合适的核黄素浓度可提高沙门氏菌的杀灭效果。

按照上述光动力处理沙门氏菌的方法设置了两组对照实验。其中一组LED蓝光光源照射时间为0min，混合体系中核黄素浓度为0μmol/L，黑暗孵育时间为40min；另一组LED蓝光光源照射时间为0min，混合体系中核黄素浓度为150μmol/L，黑暗孵育时间为40min。如图2所示，在不加入核黄素和不进行蓝光照射且只进行黑暗孵育处理样品时，或者，在仅加入核黄素并且进行黑暗孵育、不进行蓝光照射样品时，沙门氏菌的致死率都是极低的，杀菌效果不显著。

实施例2

不同孵育时间对光动力杀灭沙门氏菌的效果影响实验

按照上述光动力处理沙门氏菌的方法进行实验，其中：混合体系中核黄素浓度为150μmol/L，孵育时间分别为0min、20min、40min、60min；LED蓝光光源照射时间为30min。如图3所示，随着孵育时间的增加，对沙门氏菌的杀灭效果也增加，其中孵育时间为40min时，沙门氏菌的致死率为99.99993％。而孵育时间过长也会对杀菌效果有影响。因此，要选择合适的孵育时间使其对沙门氏菌有较好的杀灭效果。

按照上述光动力处理沙门氏菌的方法设置了两组对照实验。其中一组LED蓝光光源照射时间为0min，混合体系中核黄素浓度为0μmol/L，黑暗孵育时间为40min；另一组LED蓝光光源照射时间为0min，混合体系中核黄素浓度为150μmol/L，黑暗孵育时间为40min。如图3所示，在不加入核黄素和不进行蓝光照射且只进行黑暗孵育处理样品时，或者，在加入核黄素并且仅进行黑暗孵育、不进行蓝光照射样品时，沙门氏菌的致死率都是极低的，杀菌效果不显著。

实施例3

不同照射时间对光动力杀灭沙门氏菌的效果影响实验

按照上述光动力处理沙门氏菌的方法进行实验，其中：在待处理样品混合体系中核黄素浓度为150μmol/L；黑暗孵育时间为40min；LED蓝光光源照射时间分别为0min、10min、20min、30min、40min、50min。不同照射时间处理后沙门氏菌的失活情况如图4所示。随着照射时间的增加，对沙门氏菌的杀灭效果也显著增加。体系中沙门氏菌的最初接种量约为6.75Log CFU/mL。在核黄素浓度为150μmol/L，孵育时间为40min时，在照射时间20、30、40、50min下分别能减少沙门氏菌量为2.23、6.21、6.75和6.75LogCFU/mL，其中40min开始，沙门氏菌致死率高达99.99995％。

按照上述光动力处理沙门氏菌的方法设置了两组对照实验。其中一组LED蓝光光源照射时间为0min，混合体系中核黄素浓度为0μmol/L，黑暗孵育时间为40min；另一组LED蓝光光源照射时间为0min，混合体系中核黄素浓度为150μmol/L，黑暗孵育时间为40min。如图4所示，在不加入核黄素和不进行蓝光照射且只进行黑暗孵育处理样品时，或者，在加入核黄素并且进行黑暗孵育仅不进行蓝光照射样品时，沙门氏菌的致死率都是极低的，杀菌效果不显著。

实施例4

对新鲜鸡蛋壳的沙门氏菌杀灭实验

将无菌鸡蛋壳与沙门氏菌菌液混合进行染菌处理，分成三组，分别为：1、单纯光敏剂组，加入核黄素溶液使体系中的核黄素浓度达到150μmol/L，黑暗孵育40mim，不进行蓝光光源照射；2、光动力实验组，加入核黄素溶液使体系中的核黄素浓度达到150μmol/L，黑暗孵育40mim，蓝光光源照射40min；3、空白对照组，加入与核黄素溶液等体积的生理盐水。每组设置两个平行。

细菌培养：在无菌条件下，将每组鸡蛋壳用生理盐水稀释2倍后用无菌的匀浆器进行匀浆并稀释，在合适的稀释度取100μL稀释液接种到TSA固体培养基中，37℃恒温培养箱中培养24～48h，统计各组菌落数目。

如图5所示，结果表明，空白对照组蛋壳中沙门氏菌菌落数为7.4×10⁵CFU/g，光动力杀菌处理后蛋壳中的菌落数为8.4×10²CFU/g，单纯光敏剂组蛋壳中的菌落数为7.0×10⁵CFU/g，通过多次实验发现，使用核黄素为光敏剂的光动力杀灭沙门氏菌方法对蛋壳表面的杀菌率能达到99.88％，其杀菌效果明显。

实施例5

核黄素介导的光动力杀菌方法对沙门氏菌外膜的影响

用不同条件处理菌液，如图6所示，图6A为阴性对照组，该组为纯菌液且菌液不做任何处理；图6B为单纯光照组，菌液中不添加核黄素溶液，不进行黑暗孵育，仅进行蓝光光源照射，蓝光光源照射的光能量密度为15.6J/cm²；图6C为单纯光敏剂组，菌液中添加浓度为150μmol/L的核黄素溶液，黑暗孵育40min，不进行蓝光光源照射；图6D为光动力实验组I，菌液中添加浓度为50μmol/L的核黄素溶液，黑暗孵育20min，蓝光光源照射的光能量密度为3.12J/cm²；图6E为光动力实验组II，菌液中添加浓度为150μmol/L的核黄素溶液，黑暗孵育40min，蓝光光源照射的光能量密度为9.63J/cm²；图6F为光动力实验组III，菌液中添加浓度为150μmol/L的核黄素溶液，黑暗孵育40min，蓝光光源照射的光能量密度为15.6J/cm²。

将包含500μL处理后的细菌悬液样品以10000×g的转速离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀物与500μL戊二醛(2.5％)和甲醛(4％)在0.1M Cacodylate缓冲液中的混合物在4℃下混合过夜。然后，通过连续的30％～100％乙醇溶液逐级将样品脱水。用双透明胶带将样品分别放在支架上，并涂上金。使用高分辨率台式SEM(SNE-4500M，JEOL，日本)进行扫描，结果如图6所示。

利用扫描电镜(SEM)对细菌细胞的外部形态变化进行了表征。与阴性对照组(图6A)相比，单纯光照组(图6B)和单纯光敏剂组(图6C)中沙门氏菌的细胞形态无明显改变，如图6B-C所示，细胞呈丰满杆状。如图6D所示，光动力实验组I中的细胞表面出现轻微的形态变形和沟槽；如图6E所示，光动力实验组II中可观察到细胞明显的变形形态和皱褶细胞；如图6F所示，光动力实验组III中，沙门氏菌细胞的形态学变形发生显著变化，大量细胞破裂。因此，可以得出核黄素介导的PDI可能是通过攻击细胞壁和细胞膜进而杀灭沙门氏菌。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)以核黄素作为光敏剂与待处理样品混合；

(2)将上述混合处理后的样品在黑暗条件下孵育；

(3)将上述黑暗孵育后的样品用蓝光光源照射。

2.根据权利要求1所述的一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于：所述第(3)步的蓝光光源波长为455～460nm。

3.根据权利要求1所述的一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于：所述第(1)步中，核黄素在待处理样品混合体系中的浓度为100～300μmol/L。

4.根据权利要求1所述的一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于：所述第(1)步中，核黄素在待处理样品混合体系中的浓度为150～200μmol/L。

5.根据权利要求1所述的一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于：所述第(3)步蓝光光源照射时,仅有蓝光光源且防止其他光源照射。

6.根据权利要求1所述的一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于：所述第(3)步蓝光光源照射的光能量密度为6～16J/cm²。

7.根据权利要求1所述的一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于：所述第(3)步蓝光光源照射的光能量密度为9.36～15.6J/cm²。

8.根据权利要求1所述的一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于：所述第(3)步蓝光光源照射的光能量密度为12.48～15.6J/cm²。

9.根据权利要求1所述的一种光动力杀灭沙门氏菌的方法，其特征在于：所述第(2)步黑暗孵育时间为35～45min。

10.核黄素作为光敏剂应用于杀灭沙门氏菌。

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