CN111051518B

CN111051518B - 肌醇衍生物的制造方法

Info

Publication number: CN111051518B
Application number: CN201880055804.8A
Authority: CN
Inventors: 藤田一郎; 山木进二
Original assignee: Resonac Corp
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2023-11-03
Anticipated expiration: 2038-09-04
Also published as: JP7199358B2; CN111051518A; EP3680342A1; WO2019045112A1; JPWO2019045112A1; US20200248219A1; US11384372B2; EP3680342A4

Abstract

一种肌醇衍生物的制造方法，其特征在于，包含下述工序：使肌醇与糊精在环糊精葡聚糖转移酶的存在下反应，而使糖与上述肌醇结合而成的肌醇衍生物生成，获得包含上述肌醇衍生物和上述环糊精葡聚糖转移酶的溶液的工序；以及使用超滤膜将上述溶液中的上述环糊精葡聚糖转移酶除去的工序，不进行上述溶液中的上述环糊精葡聚糖转移酶的失活处理。

Description

肌醇衍生物的制造方法

技术领域

本发明涉及肌醇衍生物的制造方法。

本申请基于2017年9月4日在日本申请的特愿2017-169773号主张优先权，将其内容援用到本文中。

背景技术

已知糖类与肌醇结合了的肌醇衍生物具有使肌肤湿润，使皮肤保持健康的效果(专利文献1)。作为这样的肌醇衍生物的合成方法，已知使肌醇与作为寡糖的一种的环糊精在环糊精葡聚糖转移酶(以下，也称为“CGTase”。)的存在下反应，获得结合了肌醇残基的糖或寡糖的方法(专利文献2)。

在使用了CGTase的酶反应中，作为在反应结束后使酶失活的方法，一般为将反应液加热的方法、添加酸、碱等药剂的方法。例如，在专利文献1和专利文献2中，通过使肌醇与环糊精在CGTase存在下反应后，使反应液沸腾来使酶失活。

另一方面，也已知在使用了CGTase的酶反应中，不使酶失活而回收生成物的方法。例如，在专利文献3中，记载了在使CGTase与淀粉作用而制造环糊精的方法中，通过超滤法从反应体系分离环糊精。此外，在专利文献4中，记载了使CGTase与包含淀粉和蔗糖的混合液的底物作用，将生成的麦芽低聚蔗糖利用超滤膜分离。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4624831号公报

专利文献2：日本特开昭63-196596号公报

专利文献3：日本特开昭63-133998号公报

专利文献4：日本特开平1-179698号公报

发明内容

发明所要解决的课题

然而，在通过加热、药剂添加使酶失活的情况下，有时发生酶成分的变性物的混入、作为生成物的肌醇衍生物的着色、变质。此外，如专利文献3和专利文献4那样，通过超滤膜将活性酶分离的方法仅仅以从反应液中除去酶的目的而进行，并未考虑到生成物的精制度的提高。进一步，也有发生由活性酶引起的反应过度的风险。

因此，本发明的目的是提供能够不使作为生成物的肌醇衍生物变质地将活性酶除去而使肌醇衍生物的精制度提高、获得高品质的肌醇衍生物的肌醇衍生物的制造方法。

用于解决课题的方法

本发明包含以下方式。

(1)一种肌醇衍生物的制造方法，其包含下述工序：使肌醇与糊精在环糊精葡聚糖转移酶的存在下反应，而使糖与上述肌醇结合而成的肌醇衍生物生成，获得包含上述肌醇衍生物和上述环糊精葡聚糖转移酶的溶液的工序；以及使用超滤膜将上述溶液中的上述环糊精葡聚糖转移酶除去的工序，其中，不进行上述溶液中的上述环糊精葡聚糖转移酶的失活处理。

(2)根据(1)所述的肌醇衍生物的制造方法，上述超滤膜的截留分子量为1000～100000。

(3)根据(1)或(2)所述的肌醇衍生物的制造方法，在0～60℃的温度条件下进行使用上述超滤膜的上述环糊精葡聚糖转移酶的除去。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的肌醇衍生物的制造方法，通过交叉流型的超滤进行使用上述超滤膜的上述环糊精葡聚糖转移酶的除去。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的肌醇衍生物的制造方法，在温度为20～80℃、并且pH为3～9的条件下进行使上述肌醇与上述糊精反应的反应。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的肌醇衍生物的制造方法，上述糊精为β-环糊精。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的肌醇衍生物的制造方法，上述肌醇为肌-肌醇。

发明的效果

通过本发明，提供能够获得精制度高并且高品质的肌醇衍生物的肌醇衍生物的制造方法。

具体实施方式

在一实施方式中，本发明提供一种肌醇衍生物的制造方法，其特征在于，包含下述工序：使肌醇与糊精在环糊精葡聚糖转移酶的存在下反应，而使糖与上述肌醇结合而成的肌醇衍生物生成，获得包含上述肌醇衍生物和上述环糊精葡聚糖转移酶的溶液的工序(以下，称为“工序I”)；以及使用超滤膜将上述溶液中的上述环糊精葡聚糖转移酶除去的工序(以下，称为“工序II”)，其中，不进行上述溶液中的上述环糊精葡聚糖转移酶的失活处理。以下，对各工序进行说明。

[工序I]

工序I为使肌醇与糊精在环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)的存在下反应，而使糖与上述肌醇结合而成的肌醇衍生物生成，获得包含上述肌醇衍生物和上述CGTase的溶液的工序。

(肌醇)

所谓肌醇，为C₆H₆(OH)₆所示的环状六元醇。在肌醇中存在顺式-肌醇(cis-inositol)、表-肌醇(epi-inositol)、异-肌醇(allo-inositol)、肌-肌醇(myo-inositol)、粘-肌醇(muco-inositol)、新-肌醇(neo-inositol)、手性-肌醇(chiro-inositol，存在D体和L体)、青蟹-肌醇(scyllo-inositol)这9个立体异构体。

在本工序中使用的肌醇优选为上述异构体之中的、具有生理活性的肌-肌醇。肌醇可以通过从米糠提取的方法、化学合成法、和发酵法等合成。此外，可以使用市售品。以下显示肌-肌醇的结构式。

(糊精)

糊精为将淀粉通过化学法或酶法进行了低分子化的物质的总称。

在本工序中使用的糊精没有特别限定，从肌醇衍生物的生成效率的观点考虑，可以使用例如，聚合度7以上的糊精的含有率为85质量％以上，优选为90质量％以上，更优选为98质量％以上的物质。

此外，从肌醇衍生物的生成效率的观点考虑，糊精优选为环糊精。环糊精为D-葡萄糖通过α-1,4-糖苷键结合而采取环状结构的环状寡糖。作为环糊精，没有特别限定，可以举出α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等。它们之中，从工业上廉价且能够稳定供给考虑，优选使用β-环糊精。

糊精可以通过将淀粉通过化学法或酶法进行低分子化而获得。此外，环糊精可以通过使环糊精葡聚糖转移酶与淀粉作用而获得。糊精或环糊精可以使用市售品。

(肌醇衍生物)

通过本实施方式的制造方法制造的肌醇衍生物为糖与肌醇结合而成的肌醇衍生物。在肌醇衍生物中，糖与肌醇的羟基结合。糖可以与在肌醇分子内存在6个羟基的任1个结合，也可以与任2个以上结合。

在通过本实施方式的制造方法制造的肌醇衍生物中，与肌醇结合的糖为葡萄糖或包含葡萄糖作为结构单元的寡糖。例如，可以1个或多个葡萄糖与1分子肌醇结合，也可以1个或多个寡糖与1分子肌醇结合，也可以1个或多个葡萄糖和1个或多个寡糖与1分子肌醇结合。在肌醇衍生物中，与1分子肌醇结合的葡萄糖或寡糖的合计换算成单糖单元为1以上，可以为例如2以上，也可以为例如3以上，也可以为例如4以上。

在本说明书中，所谓单糖，是指不能被进一步水解的糖类，是指成为形成多糖时的构成要素的化合物。单糖也可以指糖类的最小结构单元。此外，在本说明书中，所谓“单糖单元”，是指相当于单糖的化学结构。“单糖单元”也可以指来源于单糖的化学结构。例如如果将二糖换算成单糖单元则为2，如果将三糖换算成单糖单元则为3。例如，如果将α-环糊精换算成单糖单元则为6，如果将β-环糊精换算成单糖单元则为7，如果将γ-环糊精换算成单糖单元则为8。

通过本实施方式的制造方法制造的肌醇衍生物可以为结合了换算成单糖单元不同数的糖的肌醇衍生物的混合物。例如，肌醇衍生物可以为每1分子肌醇结合了1个单糖单元的糖的物质、结合了2个单糖单元的糖的物质、结合了3个单糖单元的糖的物质、结合了4个单糖单元的糖的物质、和结合了5个以上单糖单元的糖的物质的混合物。

(环糊精葡聚糖转移酶：CGTase)

CGTase为催化通过α-1,4-葡糖苷键的形成而将α-1,4-葡聚糖链环状化的反应的酶。CGTase与淀粉等具有α-1,4-葡聚糖链的底物作用，生成环糊精。作为CGTase，迄今为止，已知来源于芽梭菌(Bacillus)属、短杆菌(Brevibacterium)属、梭菌(Clostridium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、微球菌(Micrococcus)属、高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)属、嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium)属等的细菌的CGTase。

如果使肌醇与糊精在CGTase的存在下反应，则CGTase与糊精作用，以肌醇作为受体而发生葡萄糖残基的转移，生成肌醇衍生物。

在本工序中使用的CGTase只要是能够由肌醇和糊精生成上述肌醇衍生物的物质，就没有特别限定。可以使用来源于上述那样的细菌的CGTase，也可以使用将这些天然CGTase改变了的物质。作为CGTase，可以例示例如，日本特开昭63-196596号公报、和国际公开公报第96/33267号所记载的物质等，但不限定于此。CGTase可以使用市售品。

(肌醇衍生物生成反应)

使肌醇与糊精在CGTase的存在下反应，使糖与肌醇结合而成的肌醇衍生物生成的反应(以下，称为“肌醇衍生物生成反应”)可以没有特别限制地使用在一般的酶反应中使用的方法而进行。具体而言，可以通过将肌醇、糊精和CGTase在适当的溶剂下混合，使其经过一定时间，来进行肌醇衍生物生成反应。

在肌醇衍生物生成反应中，用于将底物和CGTase混合的溶剂可以没有特别限制地使用一般的酶反应所使用的缓冲液等。作为这样的缓冲液，可以举出例如，柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液等，但不限定于此。

肌醇与糊精的混合比率没有特别限定，只要根据想要制造的肌醇衍生物的种类而适当设定即可。越使肌醇的比率高，则与每1分子肌醇结合的糖的单糖单元数越小。相反，越使糊精的比率高，则与每1分子肌醇结合的糖的单糖单元数越大。

例如，作为糊精相对于肌醇的质量比(糊精/肌醇)，可以例示1～12，优选为2～6，更优选为3～5。

肌醇在反应溶液中的浓度没有特别限定，但从分批生产量的提高和反应的长时间化的避免的观点考虑，可以例示1～400g/L，优选为10～300g/L，更优选为50～200g/L。

糊精的反应溶液中的浓度没有特别限定，但从反应效率的保持和生产成本的抑制的观点考虑，可以例示10～1500g/L，优选为100～1000g/L，更优选为200～800g/L。

糊精的加入方法可以为一并加入，也可以在最初加入后补充添加。在补充添加糊精的情况下，补充添加的时机没有特别限定，可以例示例如从反应开始起4小时后、8小时后、11小时后等。优选将糊精一并加入为好。

CGTase在反应溶液中的浓度没有特别限定，可以例示0.01～100g-SS/L，优选为0.05～50g-SS/L，更优选为0.1～10g-SS/L。

肌醇衍生物生成反应时的反应条件只要根据CGTase的种类而适当设定即可。在使用市售的CGTase的情况下，可以按照制造者的推荐条件，设定反应条件。例如，作为反应温度，可以例示20～80℃，优选为30～70℃，更优选为40～60℃。此外，作为反应pH，可以例示pH3～9，优选为pH4～8，更优选为pH5～7。如果反应温度和pH为该范围内，则能够维持在CGTase的酶活性高的状态。

肌醇衍生物生成反应的反应时间没有特别限定，只要根据CGTase的种类、反应液的量等而适当设定即可。从肌醇衍生物的生成效率和未反应物的残存抑制的观点考虑，反应时间可以例示5～300小时，优选为30～70小时，更优选为40～60小时。此外，例如，可以通过HPLC、LC-MS等测定反应液中的糊精浓度，进行反应直到可以确认糊精的消失为止。

通过这样操作而进行肌醇衍生物生成反应，可以在反应液中生成肌醇衍生物，获得包含肌醇衍生物和CGTase的溶液(以下，也称为“肌醇衍生物/CGTase溶液”)。通过本工序生成的肌醇衍生物通常为结合了换算成单糖单元而彼此不同数的糖的肌醇衍生物的混合物。

[工序II]

工序II为使用超滤膜将在上述工序I中获得的包含肌醇衍生物和CGTase的溶液中的上述CGTase除去的工序。

在本工序中，以在上述工序I中获得的肌醇衍生物/CGTase溶液作为供给液，进行超滤。此外，在本实施方式的制造方法中，在工序I之后，不进行CGTase的失活处理。在肌醇衍生物生成反应后，通过不进行CGTase的失活处理地，使用超滤膜在浓缩液中除去CGTase，从而可以不使滤液中回收的肌醇衍生物变质地，获得精制度高的高品质的肌醇衍生物。在本说明书中，所谓“供给液”，是指供于超滤的液体，所谓“滤液”，是指通过了超滤膜的液体，所谓“浓缩液”，是指未通过超滤膜的液体。

本工序中使用的超滤膜没有特别限定，但优选为能够使用于交叉流型的超滤的超滤膜。在交叉流型的超滤中，使过滤对象的供给液相对于超滤膜的膜表面平行流动。由此，比超滤膜的孔径小的溶质分子、供给液的一部分成为滤液，比膜的孔径大的分子被浓缩。能够使用于交叉流型的超滤的超滤膜有各种市售品，因此只要适当选择它们而使用即可。

在本工序中使用的超滤膜的截留分子量可以为1000～100000的范围内。如果截留分子量小于1000，则过滤速度变慢，肌醇衍生物的精制效率和生产性降低。此外，如果截留分子量超过100000，则在滤液中来源于CGTase的杂质混入的可能性变高。超滤膜的截留分子量优选为1000～100000，更优选为1000～70000，进一步优选为3000～20000，特别优选为4000～15000。

本工序中的超滤的方法没有特别限定，但优选为交叉流型的超滤。通过以交叉流型进行超滤，可以降低杂质向超滤膜表面的附着，抑制堵塞的发生。

超滤时的温度条件可以为例如0～60℃，优选为比工序I的反应温度低的温度。如果为上述温度条件的下限以上，则可以保持供给液的流动性，效率好地进行过滤。此外，如果为上述温度条件的上限以下，则可以抑制由供给液中的CGTase引起的反应过度。超滤时的温度条件优选为0～50℃，更优选为0～40℃。

本实施方式的制造方法中，由于在上述工序I之后，不进行CGTase的失活处理，因此不需要在反应后的溶液中添加酸、碱等药剂。因此，超滤时的供给液的pH不会与上述工序I中的反应液的pH大不相同。例如，作为超滤时的供给液的pH，可以例示pH3～9。

如上述那样使用超滤膜，以通过上述工序I获得的包含肌醇衍生物和CGTase的溶液作为供给液进行超滤，从而CGTase和来源于CGTase的杂质留在浓缩液中，另一方面，肌醇衍生物移动到滤液中。

因此，通过回收滤液，可以获得不包含CGTase和来源于CGTase的杂质的精制度高的肌醇衍生物。

本工序中获得的超滤的滤液优选检测不到CGTase活性。上述滤液中的CGTase活性的检测例如可以如下进行：采取上述滤液的一部分，将肌醇(例如，肌-肌醇)以最终浓度为10g/L的方式添加，在50℃下反应1小时以上，然后，测定液体中的肌醇含量，从而进行。

肌醇含量的测定可以使用例如高效液相色谱。在上述反应的前后，在肌醇含量没有实质差别的情况下，可以判定为检测不到CGTase活性。另外，所谓“没有实质差别”，例如，是指在上述反应前后检测到的肌醇含量的差相对于上述反应前检测到的肌醇含量(100％)为5％以下左右。优选为3％以下，更优选为2％以下，进一步优选为1％以下。

在本工序之后获得的肌醇衍生物精制物中的CGTase和来源于CGTase的杂质(可溶肽)的合计含量例如可以为3质量％以下。优选可以为1质量％以下，更优选可以为0.5质量％以下。

在本实施方式的制造方法中，以不进行上述工序I中获得的肌醇衍生物/CGTase溶液中的CGTase的失活处理作为特征。在本说明书中，所谓“失活处理”，是指通过加热或药剂处理，使CGTase变性，使CGTase的酶活性丧失的处理。失活处理后的酶活性优选为失活处理前的酶活性的30％以下，更优选为20％以下，进一步优选为10％以下，特别优选为5％以下。作为失活处理，可举出加热处理(例如，70℃以上)、酸处理(例如，pH2以下)、碱处理(例如，pH10以上)、有机溶剂处理(例如，苯酚、氯仿)。在本实施方式的制造方法中，通过不进行CGTase的失活处理，能够抑制肌醇衍生物/CGTase溶液中的肌醇衍生物的变质。

通过不进行CGTase的失活处理，以肌醇衍生物/CGTase溶液作为供给液进行超滤，可以在本工序中，获得几乎没有浑浊和着色的透明的滤液。例如，滤液的OD660、OD440、和OD280分别能够成为浑浊、着色、和可溶肽含量的指标。本工序中的超滤的滤液的OD660相对于滤液中的每1g固体成分能够为0.01以下，优选为0.008以下。此外，上述滤液的OD440相对于滤液中的每1g固体成分能够为0.02以下，优选为0.019以下，更优选为0.016以下，进一步优选为0.015以下。此外，上述滤液的OD280相对于滤液中的每1g固体成分能够为4.0以下，优选为3.8以下，更优选为3.7以下，进一步优选为3.6以下。

相对于滤液的每1g固体成分的各OD值可以通过测定660nm、440nm、和280nm下的滤液的各吸光度，将该测定值除以滤液的固体成分浓度而求出。另外，关于OD440和OD280，将超滤的滤液用0.45μm的膜滤器进行过滤，测定所得的滤液的吸光度。超滤的滤液的固体成分浓度可以通过例如使用ケット式水分计，在105℃、60分钟的条件下，测定上述滤液的蒸发残余成分而求出。

[其它工序]

本实施方式的制造方法除了上述工序I和工序II以外，还可以包含其它工序。作为其它工序，可举出例如，作为化学物质的精制手段而一般使用的各种工序、分析肌醇衍生物的种类的工序、按照各个结合的糖的单糖单元数都分离肌醇衍生物的工序等。这些其它工序可以使用公知的方法进行。例如，可以通过在上述工序II之后，进行所得的滤液的冷冻干燥、喷雾干燥来获得肌醇衍生物的白色粉末。

另外，在本实施方式的制造方法中，可以在上述工序I和工序II之间包含其它工序，但从防止CGTase的反应过度的观点考虑，优选在工序I之后立即进行工序II。此外，本实施方式的制造方法即使在包含其它工序的情况下，作为其它工序，也不包含进行CGTase的失活处理的工序。

在本实施方式的制造方法中，由于不进行CGTase的失活处理，因此可以防止起因于失活处理的肌醇衍生物的变质。此外，通过在肌醇衍生物生成反应后，使用超滤膜在浓缩液中将CGTase除去，可以获得在滤液中不包含CGTase和来源于CGTas的杂质的精制度高的肌醇衍生物。

通过本实施方式的制造方法制造的肌醇衍生物由于精制度高并且为高品质，因此可以用于化妆料、药品、食品等各种用途。

实施例

以下，通过实验例说明本发明，但本发明不限定于以下实验例。

[分析方法]

(吸光度)

试样的每1g固体成分的OD660、OD440、和OD280的测定通过以下方法进行。另外，OD660、OD440、和OD280分别成为试样的浑浊、着色、和可溶肽含量的指标。

使用ケット式水分计(卤素水分计HG63-P，メトラートレド社制)，在105℃、60分钟的条件下，测定试样的蒸发残余成分(＝100％-含水率％)。将其作为试样的固体成分浓度(w/w％)。

关于OD660，通过在1cm见方石英比色杯中，加入试样3mL以上，用分光光度计(型号U-1800，日立制作所制)测定660nm的吸光度来求出。

关于OD440和OD280，通过将试样用0.45μm的膜滤器进行过滤，将所得的滤液3mL加入到1cm见方石英比色杯中，用分光光度计(型号U-1800，日立制作所制)分别测定440nm和280nm的吸光度从而求出。

通过将如上述那样求出的各吸光度除以试样的固体成分浓度，从而分别算出试样的相对于单位固体成分的OD660、OD440、和OD280。

(残存CGTase活性)

在试样中将肌-肌醇以成为终浓度10g/L的方式添加，在50℃下使其反应1小时以上，在肌-肌醇添加后的反应前后(反应前：肌-肌醇刚添加后；反应后：在50℃下反应1小时后)的生成物用高效液相色谱进行分析。分析使用Shodex高效液相色谱，在以下分析条件进行。在反应后的肌-肌醇的峰与反应前相比没有变化的情况下将CGTase残存活性判定为“无”，在峰减少的情况下将CGTase残存活性判定为“有”。

＜分析条件＞

柱：ShodexKS802

洗脱液：水

流速：0.5mL/分钟

烘箱温度：75℃

检测：RI(差示折射率)

(主成分分析)

使用Shodex高效液相色谱，在以下分析条件下，进行试样的主成分分析。

＜分析条件＞

柱：Shodex HILICPak VN-50 4D×1

洗脱液：CH₃CN:水＝60:40(V:V)

流速：0.3mL/分钟

烘箱温度：40℃

检测：RI(差示折射率)

[实施例1～7]

在表1所示的条件下，使用5L培养槽(型号MD-300，株式会社丸菱バイオエンジ制)，使肌-肌醇(築野ライスファインケミカルズ制)与β-环糊精(塩水港精糖制)在CGTase(ノボザイム社制)的存在下反应，使肌醇衍生物生成。表1中的“反应液组成”显示终浓度。

表1

在反应结束后，不进行CGTase的失活处理，使用超滤膜(截留分子量6000：SIP-1013，截留分子量13000:ACP-1010D，截留分子量50000：AHP-1010，旭化成株式会社制)，在表2所示的各条件下进行交叉流型的超滤。超滤的方法如下所述。将在反应液2.2L中加入了水3.0L的稀释液加入到放置了超滤膜的膜装置的原液罐中。一边开动循环泵使原液循环一边浓缩直到成为1.1L，回收滤液。然后，在原液罐中添加1L水而进一步回收滤液，将该工序重复5次。将全部滤液混合，获得了9.1L回收滤液。由此在滤液中回收肌醇衍生物，CGTase残留在浓缩液侧从而被分离除去。

超滤后，确认了滤液中的CGTase的残存活性。

此外，对于超滤后的滤液，为了评价作为反应生成物的肌醇衍生物的着色和变质、以及来源于CGTase的可溶肽的存在，测定了滤液的每1g固体成分的OD660、OD440、和OD280。对于超滤前的反应液，也同样地测定了反应液的每1g固体成分的OD660、OD440、和OD280。

此外，对于超滤前的反应液和超滤后的滤液，进行主成分分析，评价了作为主成分的肌醇衍生物的组成变化。将通过液相色谱检测到的峰数、各峰的保留时间、和各峰的面积比率在上述两试样间进行比较，在峰数和各峰的保留时间在两试样间一致、并且两试样间的各峰的面积比率的差相对于在超滤前的反应液中检测到的值(100％)为10％以内的情况下，将主成分的组成变化判断为“无变化”。

将结果示于表2和表3中。在表2和表3中，“反应液”表示肌醇衍生物生成反应后超滤前的反应液，“滤液”表示超滤后的滤液。“处理时间”表示直到获得混合了全部滤液的回收滤液的时间。

表2

表3

由表2和表3所示的结果确认了，通过在肌醇衍生物生成反应后进行超滤，可以使滤液中的CGTase活性消失。此外，由主成分分析、和吸光度测定的结果确认了，不使肌醇衍生物变质，可获得精制度高的肌醇衍生物。

[比较例1～8]

在上述表1所示的条件下，使肌-肌醇与β-环糊精在CGTase的存在下反应，使肌醇衍生物生成。

在反应结束后，在表4和表5所记载的各条件下，进行了CGTase的失活处理/分离处理。关于表4和5中的各分离处理，使用了超滤膜的处理与实施例1～7同样地进行。离心过滤使用滤材使用了滤布的篮型的离心过滤机(小型离心分离机H-110A，滤布型号：コットン26，株式会社コクサン社制)进行。精密过滤使用旭化成社制的精密过滤膜(PSP-113)进行。

然后，与实施例1～7同样地，进行了失活处理/分离处理后的滤液中的残存CGTase活性的测定。

此外，进行了分离处理后的滤液的相对于单位固体成分的OD660、OD440、和OD280的测定。对于失活处理/分离处理前的反应液，也同样地测定了相对于反应液的每1g固体成分的OD660、OD440、和OD280。

此外，对于失活/分离处理前的反应液和失活/分离处理后的滤液，进行主成分分析，评价了作为主成分的肌醇衍生物的组成变化。主成分的组成变化为“无变化”的判断基准与上述实施例1～7同样。

将结果示于表4和表5中。在表4和表5中，“MW”表示截留分子量。“反应液”对于比较例1～6，表示失活处理后分离处理前的反应液，对于比较例7和8，表示肌醇衍生物生成反应后分离处理前的反应液。“滤液”表示分离处理后的滤液。

表4

表5

如表4和表5所示那样，比较例1～8都在失活/分离处理后确认到主成分的组成变化。此外，比较例1～8与实施例1～7相比，OD440的值(着色)都增大了。在比较例2、4、6和7中OD660的值(浑浊)与实施例1～7相比也增大了，在比较例2、4～8中，OD280的值(可溶肽)与实施例1～7相比也增大了。此外，在代替超滤，进行了离心过滤或微滤的情况下(比较例7、8)，滤液中的CGTase活性残存。由以上结果确认了超滤以外的过滤方法不能将CGTase除去。此外，在进行了失活处理的情况下，显示出肌醇衍生物发生变质，即使进行分离处理也不能将着色等除去。

产业可利用性

Claims

1.一种肌醇衍生物的制造方法，其包含下述工序：

使肌醇与环糊精在环糊精葡聚糖转移酶的存在下反应，而使糖与所述肌醇结合而成的肌醇衍生物生成，获得包含所述肌醇衍生物和所述环糊精葡聚糖转移酶的溶液的工序；以及

使用超滤膜将所述溶液中的所述环糊精葡聚糖转移酶除去的工序，

其中，不进行所述溶液中的所述环糊精葡聚糖转移酶的失活处理。

2.根据权利要求1所述的肌醇衍生物的制造方法，所述超滤膜的截留分子量为1000～100000。

3.根据权利要求1或2所述的肌醇衍生物的制造方法，在0～60℃的温度条件下进行使用所述超滤膜的所述环糊精葡聚糖转移酶的除去。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的肌醇衍生物的制造方法，通过交叉流型的超滤进行使用所述超滤膜的所述环糊精葡聚糖转移酶的除去。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的肌醇衍生物的制造方法，在温度为20～80℃、并且pH为3～9的条件下进行使所述肌醇与所述环糊精反应的反应。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的肌醇衍生物的制造方法，所述环糊精为β-环糊精。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的肌醇衍生物的制造方法，所述肌醇为肌-肌醇。