CN111019888A - 一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：分离出鲟鱼鳍软骨组织，用眼科剪刀将软骨组织剪成1mm3的组织碎块，加入Ⅱ型胶原酶消化1h，再加入胰蛋白酶消化20min，再次加入Ⅱ型胶原酶消化1h，培养基终止消化，并转移至培养瓶中，24℃恒温培养，得到鲟鱼原代软骨细胞。本发明主要在于将鲟鱼的原代软骨细胞高效地提取出来，经实验验证所得为软骨细胞，并且形态良好，增殖快。
Description
技术领域
本发明属于原代软骨细胞提取领域，具体涉及一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法。
背景技术
鲟鱼，具有极高的药用价值和科学价值，素有“鲨鱼翅，鲟鱼骨”的说法，鲟鱼几乎通体软骨，软骨主要由软骨细胞和含有胶原纤维及蛋白聚糖的细胞外基质组成。众多研究表明软骨组织中具有抑制新血管形成与抑制肿瘤生长的活性因子等。
目前，国内外的应用主要集中在利用鲨鱼软骨粉或软骨中的硫酸软骨素等物质对疾病进行治疗，如抗肿瘤、治疗骨关节炎等。这些治疗方法确有成效，但是造成了资源的巨大浪费。因此，研究者们将目光投向软骨细胞的大规模的培养，同样能获得软骨内含有的大量活性因子。
然而，我国鱼类细胞培养研究起步较晚，与常规的人、猪、鼠等哺乳动物的软骨细胞相比，鱼类软骨细胞的研究甚少，尤其是鲟科鱼类软骨细胞的提取及培养。因此，研究鲟鱼原代软骨细胞的提取方法很有必要。
发明内容
针对现有技术以上缺陷或改进需求中的至少一种，本发明提供了一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，本发明方法可以将鲟鱼的原代软骨细胞高效地提取出来，经实验验证所得为软骨细胞，并且形态良好，增殖快。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，包括如下步骤：
S1、分离出鲟鱼鳍软骨组织；
S2、将鲟鱼鳍软骨组织剪成组织碎块；
S3、加入Ⅱ型胶原酶消化预定时长；
S4、再加入胰蛋白酶消化预定时长；
S5、再次加入Ⅱ型胶原酶消化预定时长，收集沉淀；
S6、沉淀培养基终止消化，并转移至培养瓶中，加入收集细胞培养基，恒温培养，得到鲟鱼原代软骨细胞。
优选地，步骤S1具体包括：
S1.1、新鲜鲟鱼处死后，用酒精擦拭消毒，剪下鳍，放入含有双抗的PBS的培养皿中，转移至超净工作台，再用含双抗的PBS漂洗若干次；
S1.2、将鱼鳍中的软骨取出，用无血清的DMEM漂洗若干次。
优选地，步骤S2具体包括：
先将鲟鱼鳍软骨组织转移至含有FBS的DMEM培养基中，再将组织剪成组织碎块。
优选地，步骤S3具体包括：
用无血清的DMEM冲洗软骨组织碎块若干次，将组织碎块转移至离心管中，加入Ⅱ型胶原酶，恒温消化预定时长，离心预定时长，收集沉淀。
优选地，步骤S4具体包括：
向步骤S3的产物中加入胰蛋白酶，恒温消化预定时长，离心预定时长，收集沉淀。
优选地，步骤S5具体包括：
向步骤S4的产物中再加入Ⅱ型胶原酶，恒温消化预定时长，离心预定时长，收集沉淀。
优选地，步骤S6具体包括：
向沉淀中加入含FBS的DMEM培养基终止消化，转移至培养瓶中，使沉淀均匀平铺于瓶底，倒置干贴，再加入含FBS的DMEM培养基，恒温在CO2条件下正置培养，得到鲟鱼原代软骨细胞。
优选地，步骤S1、S2、S3、S4、S6中，所述DMEM均为高糖DMEM。
优选地，步骤S3中，Ⅱ型胶原酶消化时长内，每隔预定时长震荡摇匀一次。
具体地，本发明所采取的技术方案如下：一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞的提取方法，包括以下步骤：
步骤(1)：选取500g左右新鲜鲟鱼处死后，用75％酒精擦拭消毒，剪下鳍，放入含有5％双抗的PBS的培养皿中，转移至超净工作台中，再用含5％双抗的PBS漂洗3次；
步骤(2)：用剪刀和镊子将鱼鳍中的软骨取出，用无血清的DMEM漂洗3次；
步骤(3)：将软骨组织转移至含有10％FBS的DMEM培养基中，用眼科剪刀将组织剪成1mm3的组织碎块；
步骤(4)：用无血清的DMEM冲洗软骨组织碎块2次，将组织碎块转移至10mL离心管中，加入0.2％Ⅱ型胶原酶，24℃消化1h，500rpm离心5min，收集沉淀；
步骤(5)：向沉淀中加入0.25％胰蛋白酶，24℃消化20min，500rpm离心5min，收集沉淀；
步骤(6)：向沉淀中再加入0.2％Ⅱ型胶原酶，24℃消化1h，500rpm离心5min，收集沉淀；
步骤(7)：向沉淀中加入少量含10％FBS的DMEM培养基终止消化，按每瓶1-2mL转移至T25培养瓶中，使沉淀均匀平铺于瓶底，倒置干贴4-6h，再加入10％～20％FBS的DMEM培养基，于24℃，5％CO2条件下正置培养，得到鲟鱼原代软骨细胞。
步骤(2)～(7)所述的DMEM均为高糖DMEM。
步骤(4)所述的0.2％Ⅱ型胶原酶为不含血清的高糖DMEM培养基配制得到。
步骤(4)和(6)所述的0.2％Ⅱ型胶原酶消化1h，具体为每隔15min震荡摇匀一次。
步骤(7)所述的培养基优选为20％FBS的DMEM。
上述优选技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，可以将鲟鱼的原代软骨细胞高效地提取出来，经实验验证所得为软骨细胞，并且形态良好，增殖快。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的原代软骨细胞的光镜图之一。
图2为本发明实施例1中制备的原代软骨细胞的光镜图之二。
图3为本发明实施例1中制备的原代软骨细胞的甲苯胺蓝染色图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下面结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。
实施例1
本发明提供一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，包括如下步骤：
1.选取500g左右新鲜鲟鱼处死后，用75％酒精擦拭消毒，剪下鳍，放入含有5％双抗(购自YEASEN)的PBS(购自Hyclone)的培养皿中，转移至超净工作台中，再用含5％双抗的PBS漂洗3次。5％双抗的PBS缓冲液的配制：取25mL的双抗溶液加入475mL的PBS缓冲液中。
2.用剪刀和镊子将鱼鳍中的软骨取出，用无血清的高糖DMEM(购自Gibco)漂洗3次。
3.将软骨组织转移至含有10％FBS(购自Gibco)的高糖DMEM培养基中，用眼科剪刀将组织剪成1mm3的组织碎块。
4.用无血清的高糖DMEM冲洗软骨组织碎块2次，将组织碎块转移至10mL离心管中，加入0.2％Ⅱ型胶原酶(购自Sigma-Aldrich)，24℃消化1h，每隔15min震荡摇匀一次，500rpm离心5min，收集沉淀。0.2％Ⅱ型胶原酶的制备，称量40mg的Ⅱ型胶原酶粉末溶解于20mL的无血清的高糖DMEM中。
5.向沉淀中加入0.25％胰蛋白酶(购自Cyagen)，24℃消化20min，500rpm离心5min，收集沉淀。
6.向沉淀中再加入0.2％Ⅱ型胶原酶，24℃消化1h，每隔15min震荡摇匀一次，500rpm离心5min，收集沉淀。
7.向沉淀中加入少量10％FBS的DMEM培养基终止消化，按每瓶1-2mL转移至T25培养瓶中，使沉淀均匀平铺于瓶底，倒置干贴4-6h，再加入含20％FBS的DMEM培养基，于24℃，5％CO2条件下正置培养，得到鲟鱼原代软骨细胞。24h后，光镜下可见细胞在软骨碎片中迁出，且有少量细胞贴壁(见图1-2)。细胞增殖活跃，形态好，培养5天后，细胞汇合度达80％-90％。将细胞接种在24孔板中，待细胞贴壁，达到80％汇合度后，用甲苯胺蓝(购自Sigma-Aldrich)对细胞进行染色，细胞核被染成深蓝色(见图3)。实验表明，通过此方法提取的为鲟鱼的软骨细胞。
实施例2
本发明提供一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，包括如下步骤：
1.500g新鲜鲟鱼处死后，用75％酒精擦拭消毒，剪下鳍，放入含有5％双抗(购自YEASEN)的PBS(购自Hyclone)的培养皿中，转移至超净工作台中，再用含5％双抗的PBS漂洗3次。5％双抗的PBS缓冲液的配制：取25mL的双抗溶液加入475mL的PBS缓冲液中。
2.用剪刀和镊子将鱼鳍中的软骨取出，用无血清的高糖DMEM(购自Gibco)漂洗3次。
3.将软骨组织转移至含有10％FBS(购自Gibco)的高糖DMEM培养基中，用眼科剪刀将组织剪成1mm3的组织碎块。
4.用无血清的高糖DMEM冲洗软骨组织碎块2次，将组织碎块转移至10mL离心管中，加入0.2％Ⅱ型胶原酶(购自Sigma-Aldrich)，24℃消化1h，每隔15min震荡摇匀一次，500rpm离心5min，收集沉淀。0.2％Ⅱ型胶原酶的制备，称量40mg的Ⅱ型胶原酶粉末溶解于20mL的无血清的高糖DMEM中。
5.向沉淀中加入0.25％胰蛋白酶(购自Cyagen)，24℃消化20min，500rpm离心5min，收集沉淀。
6.向沉淀中再加入0.2％Ⅱ型胶原酶，24℃消化1h，每隔15min震荡摇匀一次，500rpm离心5min，收集沉淀。
7.向沉淀中加入少量含10％FBS的DMEM培养基终止消化，按每瓶1-2mL转移至T25培养瓶中，使沉淀均匀平铺于瓶底，倒置干贴4-6h，再加入含10％FBS的DMEM培养基，于24℃，5％CO2条件下正置培养，得到鲟鱼原代软骨细胞。24h后，光镜下可见细胞在软骨碎片中迁出，且有少量细胞贴壁。细胞增殖活跃，形态好，培养5天后，细胞汇合度达80％-90％。将细胞接种在24孔板中，待细胞贴壁，达到80％汇合度后，用甲苯胺蓝(购自Sigma-Aldrich)对细胞进行染色，细胞核被染成深蓝色。实验表明，通过此方法提取的为鲟鱼的软骨细胞。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、分离出鲟鱼鳍软骨组织；
S2、将鲟鱼鳍软骨组织剪成组织碎块；
S3、加入Ⅱ型胶原酶消化预定时长；
S4、再加入胰蛋白酶消化预定时长；
S5、再次加入Ⅱ型胶原酶消化预定时长，收集沉淀；
S6、沉淀经培养基终止消化，并转移至培养瓶中，加入培养基，恒温培养，得到鲟鱼原代软骨细胞。
2.如权利要求1所述的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于：
步骤S1具体包括：
S1.1、新鲜鲟鱼处死后，用酒精擦拭消毒，剪下鳍，放入含有双抗的PBS的培养皿中，转移至超净工作台，再用含双抗的PBS漂洗若干次；
S1.2、将鱼鳍中的软骨取出，用无血清的DMEM漂洗若干次。
3.如权利要求1所述的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于：
步骤S2具体包括：
先将鲟鱼鳍软骨组织转移至含有FBS的DMEM培养基中，再将组织剪成组织碎块。
4.如权利要求1所述的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于：
步骤S3具体包括：
用无血清的DMEM冲洗软骨组织碎块若干次，将组织碎块转移至离心管中，加入Ⅱ型胶原酶，恒温消化预定时长，离心预定时长，收集沉淀。
5.如权利要求1所述的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于：
步骤S4具体包括：
向步骤S3的产物中加入胰蛋白酶，恒温消化预定时长，离心预定时长，收集沉淀。
6.如权利要求1所述的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于：
步骤S5具体包括：
向步骤S4的产物中再加入Ⅱ型胶原酶，恒温消化预定时长，离心预定时长，收集沉淀。
7.如权利要求1所述的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于：
步骤S6具体包括：
向沉淀中加入含FBS的DMEM培养基终止消化，转移至培养瓶中，使沉淀均匀平铺于瓶底，倒置干贴，再加入含FBS的DMEM培养基，恒温在CO2条件下正置培养，得到鲟鱼原代软骨细胞。
8.如权利要求2-4、7任一项所述的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于：
步骤S1、S2、S3、S4、S6中，所述DMEM均为高糖DMEM。
9.如权利要求4所述的基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法，其特征在于：
步骤S3中，Ⅱ型胶原酶消化时长内，每隔预定时长震荡摇匀一次。
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| JP2001293081A (ja) * | 2000-02-07 | 2001-10-23 | Mitsuo Ochi | 軟骨移植用材料及びその製造方法 |
| CN104911145A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-09-16 | 上海中医药大学附属曙光医院 | 一种高活力原代软骨细胞的制备方法 |
| CN106011055A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-10-12 | 广东省第二中医院 | 一种高得率人原代软骨细胞制备方法 |
| CN106701667A (zh) * | 2017-03-17 | 2017-05-24 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种软骨细胞的分离培养方法 |
-
2020
- 2020-01-10 CN CN202010028152.8A patent/CN111019888A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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