CN111019853A - 一种解磷菌ymk-wsw01及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种解磷菌YMK‑WSW01，属于微生物领域。该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，菌株号为YMK‑WSW01，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学生物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2019877，保藏日期为2019年10月31日。所述菌株能够降解难溶性无机磷和有机磷为水体生物提供可以直接吸收的活性磷。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种解磷菌YMK-WSW01及其应用。
背景技术
磷是养殖水体中浮游植物生长和鱼类生长、发育、繁殖的必需营养元素之一，也是养殖水体中限制初级生产力的营养元素之一。水体中的磷有活性磷DIP、有机磷OP、不溶性无机磷ISIP等多种存在形式。其中，活性磷是最为重要的，它可直接被生物直接吸收利用，有机磷和不溶性无机磷通常不能直接被生物利用，而需要通过物理、化学或生物过程转化为溶解态。在水产养殖过程中，为获得养殖高产和营造优良的藻相，通常需不断施加磷肥和含磷饲料以促进浮游植物和鱼类生长。但在实际养殖生产中，大量的磷肥和含磷饲料进入养殖池塘后，磷元素多沉积于底泥中，转化为难溶性磷，养殖水体中可供水体生物利用的活性磷DIP含量低，而底泥沉积物总磷TP含量高。大量的磷沉积不仅增加了施加磷所需的生产成本，还会污染池底环境，增加内源污染。水体中的活性磷相对缺乏，致使水体中的磷养分利用率低，形成磷限制潜在性富营养化。除水体中无机磷沉积于底泥形成难溶性磷外，来源于农药、生物代谢植磷酸和生物体腐烂有机质等的有机磷也不能直接被生物所利用，大量的有机磷沉积在水底被厌氧细菌发酵分解释放出硫化氢，引起水体发臭、变色，使水质变差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种解磷菌YMK-WSW01，所述菌株能够降解难溶性无机磷和有机磷为水体生物提供可以直接吸收的活性磷。
本发明采用的技术方案如下：
一种解磷菌YMK-WSW01，经鉴定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，菌株号为YMK-WSW01，其性质为溶解难溶性无机磷和有机磷，已保藏于中国典型微生物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学生物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2019877，保藏日期为2019年10月31日。
本发明还提供上述解磷菌的应用。
本发明还提供包含有权利要求1所述解磷菌YMK-WSW01的生物制剂。
本发明与现有技术相比的有益效果在于：
本发明所述的菌株是通过平板筛选得到一种具有既能解难溶性无机磷又能解有机磷的菌株，经鉴定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌，菌株号为YMK-WSW01，并且该菌株经过5次传代培养仍可稳定保持解磷能力。
附图说明
图1为本发明的解磷菌在LB培养基上菌落形态；
图2为本发明的解磷菌在筛选培养基上的溶磷圈；
图3为本发明的解磷菌系统发育树；
图4为本发明的解磷菌在池塘水体试验中的活性磷含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明提供了一种解磷菌，经鉴定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，菌株号为YMK-WSW01，其性质为溶解难溶性无机磷和有机磷，已保藏于中国典型微生物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学生物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2019877，邮编430072，保藏日期为2019年10月31日。本发明所用池塘泥样和池塘水样均取自浏阳工业园池塘。
实施例1：解磷菌的筛选
筛选培养基的制备：无机磷筛选固体培养基：Ca3(PO4)2 5.0g、葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O0.03g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。无机磷液体培养基：除不添加琼脂外，其余成分与无机磷筛选固体培养基相同。有机磷筛选固体培养基：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、酵母浸粉0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、卵磷脂0.2g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。有机磷液体培养基：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 0.1g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.25g、MgCl2·6H2O 5.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。灭菌后冷却到60℃左右加入6mL/100mL的蛋黄液(生理盐水和蛋黄液1:1)。
准确称取10.0g泥样，置于装有90mL无菌生理盐水和适量玻璃珠的250mL三角瓶中，摇床200r/min震荡30min后，将混合液进行十倍梯度稀释，取合适的稀释度分别涂布到无机磷筛选平板和有机磷筛选平板，30℃培养5d。选取有溶磷圈的菌落，获得一个既能解难溶性无机磷又能解有机磷的菌落，将该菌落进行划线纯化后接种于营养琼脂斜面，4℃保存备用。该菌株在LB平板上培养18-24h时，形成近圆形具有乳白色菌膜的菌落，在菌落表面有褶皱，四周有凸起中间略凹陷(图1)，革兰氏染色为阳性，可产芽孢，并且经过5次传代培养仍可稳定保持既能解无机磷又能解有机磷能力(图2)。
实施例2：解磷菌的鉴定
将该菌株进行16S rDNA扩增、测序、拼接后得到基因序列，经与GenBank数据库中的微生物序列进行BLAST分析，发现该菌16S rDNA序列(SEQ NO.1)与解淀粉芽孢杆菌同源性为99％以上，并将该序列上传GenBank数据库，得到登录号为MN121122。利用MEGA邻接法构建系统发育树结果表明其与解淀粉芽孢杆菌聚为一支(图3)。
实施例3：解磷菌的解磷能力测定
将保存的斜面菌种挑取一环接种到装有50mL LB肉汤培养液的250mL三角瓶中，置于转速为160r/min，温度30℃摇床培养24h。取1mL培养液分别接种至装有100mL无机磷液体培养液和装有100mL有机磷液体培养基的250mL三角瓶中，对照组分别接入等量的灭菌LB肉汤培养液，置于转速为160r/min，温度30℃摇床培养5d，实验结束后分别量取25mL培养液经0.45μm微孔滤膜过滤处理，处理后的培养液活性磷酸盐含量按照国家相关标准(GB17378.4-2007)的方法进行测定。测得加菌无机磷培养液中活性磷含量为12.74mg/L-PO4 3-，显著高于对照不加菌无机磷培养液中的活性磷含量0.86mg/L-PO4 3-。加菌有机磷培养液中活性磷含量为3.36mg/L-PO4 3-，显著高于对照不加菌有机磷培养液中的活性磷含量0.59mg/L-PO4 3-。
实施例4：解磷菌的发酵配方优化
将保存的斜面菌种挑取一环接种至装有100mLLB肉汤培养液的250mL三角瓶中，160r/min 32℃培养24h后，按一定的接种量转接到装有LB肉汤培养液的250mL三角瓶中，进行二级种子液培养。160r/min 32℃培养18h后，按一定的接种量转接到装有发酵培养液的250mL具挡板三角瓶中，进行发酵培养。发酵培养基筛选配方中碳源：2％玉米淀粉、2％葡萄糖；氮源：0.5％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％硫酸铵；接种量：3％、5％；无机盐：0.05％硫酸镁、0.5％氯化钠、0.01％硫酸锰；pH稳定缓冲剂：0.1％碳酸钙。发酵液中解淀粉芽孢杆菌芽孢率测定方法为发酵液进行80℃水浴10min后立即冷却到室温的菌存活率。
通过试验，得到优化培养基配方和培养条件为葡萄糖30g/L、酵母浸膏5g/L、蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁0.5g/L、碳酸钙1g/L、硫酸锰0.1g/L，pH 7.0-7.2，转速0-8h时160r/min、8h后180r/min，温度32℃，接种量5％，发酵时间30h，发酵液菌数为3.8×109cfu/mL，芽孢率为93％。
实施例5：解磷菌的池塘水体试验的应用
在500mL的烧杯底部铺设约3cm厚池塘底泥，注入300mL池塘水。试验设置实验组2个及对照组1个，每组2个平行，即共6瓶。其中，对照组不加菌，实验组分别加入105、106cfu/mL的菌，实验过程中静置培养，于试验开始0d、7d、12d、17d时分别取样，按照国家相关标准(GB17378.4-2007)测定水体活性磷含量。测定结果见图4，加菌的实验组水体中的活性磷含量显著高于对照组。
实施例6：解磷菌对辛硫磷的降解试验
(1)将保存的斜面菌种挑取一环接种至装有100mLLB肉汤培养液的250mL三角瓶中，空白组除不接菌外全部操作一致，所有的培养液中均含有100mg/L辛硫磷，每组重复3瓶。接种实验组与空白组均于160r/min摇床32℃培养48小时，培养液经0.45μm滤膜过滤后测定每组培养液中的活性磷含量，测得加菌后培养液中的活性磷含量比空白组高0.943mg/L-P。
(2)向含有5mg/L辛硫磷的500mL水体中加入107cfu/mL解磷菌，对照组加入等量的无菌水，加入7天后，测各组水体中的辛硫磷含量。测得处理中的辛硫磷含量仅为空白中辛硫磷含量的68.6％。
序列表
<110> 岳阳渔美康生物科技有限公司
<120> 一种解磷菌YMK-WSW01及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1365
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac 60
gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg 120
ttgtttgaac cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac 180
ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga 240
cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300
gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360
aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc 420
ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc 540
ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact 600
tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga 660
ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt 720
ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780
ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840
acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct 960
agagatagga cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag 1080
cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140
gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa 1200
gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag 1260
tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgag 1365
Claims (3)
1.一种解磷菌YMK-WSW01，其特征在于该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，菌株号为YMK-WSW01，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学生物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2019877，保藏日期为2019年10月31日。
2.权利要求1所述的一种解磷菌YMK-WSW01的应用。
3.一种包含有权利要求1所述解磷菌YMK-WSW01的生物制剂。
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