CN111000836B - 胸腺醌及其与自噬抑制剂ATG7-siRNA的联合使用在制备治疗食管癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胸腺醌TQ在制备治疗食管癌的组合物中应用。该应用中包括胸腺醌TQ的单独使用、以及胸腺醌TQ与siRNA的联合使用。本发明的发明人发现TQ可以调控食管癌细胞包括ATG7、Bectlin‑1和LC3B在内的几个涉及自噬的关键因子的表达水平，从而实现对食管癌的治疗。进一步的，本发明的发明人还发现了基于食管癌细胞自噬促进剂siRNA与TQ联合使用具有协同抑制食管癌细胞增殖的特性。

Description

胸腺醌及其与自噬抑制剂ATG7-siRNA的联合使用在制备治疗 食管癌的药物中的应用

技术领域

本申请涉及胸腺醌及其与自噬抑制剂ATG7–siRNA的联合使用在制备治疗食管癌的药物中的应用。

背景技术

全世界每年约30万人死于食管癌。我国是食管癌的高发区之一，在全国恶性肿瘤死亡总数中占22.34％，仅次于胃癌，居第二位。在我国以华北地区发病率最高，河南省林县占首位。我国食管癌发病率男性高于女性，但高发区男女比例接近，发病年龄多在40岁以上。食管癌多发生于食管中段，约占50％以上；食管癌是指发生于食管的癌病。是发生于食管黏膜上皮的恶性肿瘤。研究表明，胸腺醌(TQ，如下所示。)是一种生物活性化合物，是紫花奈氏菌种子的主要成分，具有多抗生物活性。通过调节凋亡活性抑制肿瘤生长，然而，很少有研究报道其对食管癌的影响；一般治疗食管癌的药物存在耐药性和药物毒副作用，也是治疗食管癌失败的主要原因，所以就推动了天然，低毒，高效的生物药物的研究。

siRNA通常是一段长20～24bp的双股RNA(dsRNA)，其两股分别在 RNA的两端超出另一端2个核苷酸，每一股各有一个5’磷酸基末端与一个3’羟基末端。此结构是利用一种称为dicer的酶处理而得，这种酶可以将较长的双股RNA或小发夹RNA(small hairpin RNA)切成siRNA。此外， siRNA也可经由多种不同转染(transfection)技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的敲弱(knockdown)效果。因此可利用经过适当剪裁的 siRNA之互补性，来对已知序列的基因进行标定，这种现象使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。

对于肿瘤的治疗而言，抑制肿瘤细胞的增殖是常见的治疗途径。对于抑制肿瘤细胞增值，主要有以下几种途径。

细胞凋亡(apoptosis)，是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡过程。细胞凋亡受到多个基因严格调控，包括Caspase 家族，Bcl2家族，癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。

细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。目前对自噬在学术界存在三种不同的观点：①自噬可作为始因诱导凋亡的发生，阻断自噬将延缓凋亡，而广谱Caspase抑制剂虽能有效抑制凋亡的发生，但对自噬却不产生影响；②低程度的自噬可拮抗凋亡的发生，在此时若阻断自噬则会增加细胞对凋亡信号的敏感性；③自噬与凋亡相互独立存在，抑制其中任何一条途径都会将细胞推向另一程序性死亡。综上所述，自噬是维持细胞的内平衡，协助维持细胞回归正常状态的重要机制。

由于自噬是维持细胞的内平衡，协助维持细胞回归正常状态的重要机制。因此，如果能够提供新的治疗组合物，通过诱导癌细胞自噬，可以做为癌症治疗，特别是食管癌治疗的备选方案之一。

发明内容

所要解决的技术问题

目前食管癌治疗药物的报道很少，本发明发现TQ能够抑制食管癌细胞的增殖，同时对于食管癌细胞的凋亡和自噬两个抑制食管癌细胞增殖途径中同时具有促进作用。因此可以在预防或者治疗食管癌的药物中添加 TQ的成分达到目的。

解决技术问题的手段

本发明的一个方式为胸腺醌TQ在制备治疗癌症的药物组合物中应用。本发明的胸腺醌TQ对于癌细胞具有明显的

本发明的另一个方式中，所述癌症为食管癌。出人意料的，本发明的发明人发现胸腺醌TQ对于癌细胞的凋亡和自噬两个抑制食管癌细胞增殖途径中同时具有促进作用。因此可以在预防或者治疗食管癌的药物中添加 TQ的成分达到目的。

本发明的另一个方式中，所述胸腺醌TQ在诱导食管癌细胞凋亡和/ 或促进食管癌细胞自噬相中的应用。

本发明的另一个方式中，为了进一步促进食管癌的治疗作用，所述胸腺醌TQ与癌细胞自噬促进剂联合使用。

本发明的另一个方式中，所述癌细胞自噬促进剂选自siRNA。本发明的发明人发现胸腺醌TQ对于癌细胞的凋亡和自噬两个抑制食管癌细胞增殖途径中同时具有促进作用。

本发明的另一个方式中，所述癌细胞自噬促进剂与所述胸腺醌TQ的配合比例为：1:1～5。

本发明中，所述胸腺醌TQ与所述自噬抑制剂ATG7–siRNA的联合使用诱导食管癌细胞凋亡和/或促进食管癌细胞自噬相中的应用。

本发明的另一个方式中，所述组合物为口服制剂、注射制剂。

另外，关于使用TQ或联合使用TQ和siRNA时的浓度，可以设定为每次10-500mg/kg体重。该剂量可以单次或者分成多次使用。

本发明中的食管癌治疗用组合物也可以包含一种或多种辅料。辅料没有限定，例如溶剂、等张剂、赋形剂、pH调整剂、抗氧化剂、崩解剂、调味剂、香料、保存剂等本领域常用的辅料。

作为溶剂可以列举：注射用蒸馏水、生理盐水、植物油，丙二醇、聚乙二醇、乙醇、甘油之类的醇类等。

作为等张剂可以列举：山梨醇、氯化钠、葡萄糖等本领域常用的等张剂。

作为赋形剂可以列举：乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉等。

作为pH调整剂可以列举：盐酸、枸橼酸、氢氧化钠、强氧化钾、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等。

作为抗氧化剂可以列举：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸等。

作为崩解剂可以列举：马铃薯淀粉。

作为调味剂可以列举：蔗糖、单糖浆等甜味剂，等。

作为香料可以列举：薄荷油，橙皮油等。

作为保存剂可以列举：尼泊金类、山梨酸及其盐等本领域常用的保存剂。

本发明中的食管癌治疗用组合物可以为任何一种剂型，例如口服液、贴剂、片剂、胶囊、注射剂等，优选为注射剂，最优选为骨骼肌注射剂。

本发明的发明人发现TQ可以调控食管癌细胞包括ATG7、Bectlin-1 和LC3B在内的几个涉及自噬的关键因子的表达水平，从而实现对食管癌的治疗。进一步的，本发明的发明人还发现了基于食管癌细胞自噬促进剂 siRNA与TQ联合使用具有协同抑制食管癌细胞增殖的特性。

附图说明

图1是示出在TQ处理24h和48h之后，ECA-109细胞抑制率随时间推移的关系的图。

图2是示出在加药处理24h时，TQ浓度达到36μM时促进细胞的凋亡率的图。

图3是示出TQ对ECA-109细胞分裂周期的阻滞作用的图。

图4是示出对照组和TQ处理试验组中，随着TQ浓度升高，食管癌细胞的运动能力受到抑制的图。

图5是示出ECA-109细胞在TQ处理24h时，随着TQ浓度的增加， ATG7与Lc3B的主条带与剪切条带表现出增强趋势的图。

图6是示出TQ单独使用、siRNA单独使用、联合使用TQ和siRNA、联合使用siRNA和ATG7、以及联合使用siRNA-ATG7和TQ时，各自的对 ECA-109细胞抑制作用的图。

图7是示出TQ与ATG7-siRNA联合的主条带与剪切条带表现出减弱趋势的图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

一、TQ对食管癌细胞ECA-109增殖的影响

1、食管癌细胞株体外培养

1.1细胞来源

人食管癌细胞ECA-109；

1.2细胞培养与传代

ECA-109使用1640培养基(Gibco)。在细胞培养时向培养基中添加 10％胎牛血清(Capricorn)。上述细胞株均在37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90％时，使用0.25％胰酶-EDTA消化并传代。

2、TQ对细胞增殖能力的影响

主要试验材料：百里香醌(TQ)(#03416)由Sigma-Aldrich Chemie GmbH(Taufkirchen,Germany)溶解于无水乙醇中，配制成10mM浓缩液， -20℃保存，使用时分别稀释为0、6、12、18、24、30、36、42、48、 54、60和66μM，即配即用；CCK-8(beyotime)；胰酶(Gibco)；PBS； 96孔板(Nunc)。

试验方法：将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以5×103/ 孔的密度种植于96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有0、6、12、18、24、30、36、 42、48、54、60和66μM TQ的培养液继续培养，分别于培养的24h,48h终止培养，向每孔加入10μL CCK-8，再重新置于37℃，5％CO₂培养箱中培养2h后在酶标仪OD450nm处检测各孔的吸光值。每个浓度设置三个重复组。

试验结果：

TQ对ECA-109细胞的作用没有明显的剂量依赖现象，但随着处理时间的延长，细胞增殖的抑制率呈上升趋势：在TQ处理48h之后，抑制率随时间推移逐步升高，其中，ECA-109在TQ处理48h时处理浓度30μM 抑制率可超过50％；ECA-109在TQ作用48h后，处理浓度大于40μM 的试验组抑制率均可超过80％(图1)。

二、TQ对食管癌细胞凋亡的诱导作用

1、细胞培养与传代

本试验使用人食管癌细胞系ECA-109，培养基为添加10％FBS的1640 培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部 80～90％时，使用0.25％胰酶-EDTA消化并传代。

2、TQ对食管癌细胞凋亡的影响

主要试验材料：TQ溶解于无水乙醇中，配制成10mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为36μM，即配即用；Annexin V-kFluor647细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物)；PBS；30mm培养皿，流式专用上样管。

试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于30mm培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育，待细胞生长至占培养皿底部50％左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，含有36μM TQ的培养液继续培养。培养24h后小心收集上清液并使用不含有EDTA的胰酶消化细胞，将细胞悬液与上清液混合离心，将收集到的细胞用PBS洗涤一次，离心并重悬浮于500μLBinding Buffer，调节细胞密度为1-5×105个/mL。吸取100μL细胞悬液至上样管中，加入5μL AnnexinⅤ–kFluor647和 5μL Propidium Iodide(PI)，混匀后避光室温反应15min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

试验结果：TQ具有诱导食管癌细胞凋亡的能力。在加药处理24h时，药物浓度达到36μM时，细胞的凋亡率伴随加药浓度而升高(图2)。

	TQ	AnnexinV(％)
			空白对照组	-	5.64％
组1	36μM	5.8％
			组2	36μM	12.38％
组3	36μM	8.28％

三、TQ对食管癌细胞周期的抑制作用

1、细胞培养与传代

本试验使用人食管癌细胞系ECA-109，培养基为添加10％FBS的1640 培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部 80～90％时，使用0.25％胰酶EDTA消化并传代。

2、TQ对食管癌细胞周期的影响

主要试验材料：TQ溶解于无水乙醇中，配制成10mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为36μM，即配即用；细胞周期检测试剂盒(凯基生物)；PBS；30mm培养皿，流式专用上样管。

试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于30mm培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育，待细胞生长至占培养皿底部50％左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有36μM TQ的培养液继续培养。培养24h后小心收集上清液并使用不含有EDTA的胰酶消化细胞，将细胞悬液与上清液混合离心，将收集到的细胞用PBS洗涤一次，调节细胞密度为1×106个/mL。吸取1mL细胞悬液加入70％冷乙醇500μL 中固定过夜，染前用PBS洗去固定液，加入500μLRNase/PI染色工作液中，混匀后避光室温反应30min，使用流式细胞仪检测细胞周期情况。

试验结果：关于TQ诱导食管癌细胞周期的能力，TQ具有对ECA-109 细胞分裂周期的阻滞作用，从而使细胞不能顺利分裂增殖。其周期的阻滞作用则主要发生在G0/G1期(图3)。

四、TQ对食管癌细胞运动功能的影响

1、细胞培养与传代

本试验使用人食管癌细胞系ECA-109，培养基为添加10％FBS的1640 培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部 80～90％时，使用0.25％胰酶-EDTA消化并传代。

2、细胞迁移试验

主要试验材料：TQ溶解于无水乙醇中，配制成10mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为36μM，即配即用；

试验方法：将细胞消化，离心，重悬浮后以1×105个/孔的密度接种于24孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞生长至融合状态，用枪头在六孔板上做一条笔直的划痕，划痕完毕后，小心吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药(0， 2.5,5,10,20μM)。在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养24h后终止培养，于倒置显微镜下观察划痕愈合的程度并拍照。

试验结果：由细胞划痕图片可以看出，在未经

药物处理的对照组，划痕24h时已经有一定数量的细胞迁徙至划痕处；而经TQ处理过的试验组，随着药物的浓度升高，其中食管癌细胞的运动能力越来越受到明显的抑制，处理后24h迁移入划痕区的细胞明显少于对照组(图4)。

五、TQ对食管癌细胞自噬相关因子表达Werstern Blotting检测

1、细胞培养与传代

本试验使用人食管癌细胞系ECA-109，培养基为添加10％FBS的1640 培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部 80～90％时，使用0.25％胰酶-EDTA消化并传代。

2、细胞自噬相关因子的表达检测

主要试验材料：TQ溶解于无水乙醇中，配制成10mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为10,20,30和40μM，即配即用；RIPA裂解液； PMSF；BCA蛋白浓度测定试剂盒，一抗PI3K(#4292)、ATG-7(#8558)、 GAPDH(#2118)、ACTIN(#4970)、Beclin-1(#3495)、LC3B(#3868)购自Cell Signaling Technology(Beverly,MA)，免疫印迹的二级抗体是来自细胞信号技术的过氧化物酶山羊抗小鼠IgG(#7076)和过氧化物酶山羊抗兔 IgG(#7074)；丙烯酰胺，SDS，亚硫酸铵，Tris-Base，PVDF膜，ECL发光液(GE Healthcare)。

试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于60mm培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育约24h，待细胞生长至占培养皿底部60％左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有10,20,30 和40μM TQ的培养液继续培养，以不加TQ的培养液为对照组。在加入 TQ后24h终止培养，移除培养液并用PBS洗涤两次，加入含有1％PMSF 的RIPA裂解液裂解细胞。将裂解液4℃，12000×g/min离心8min，收集上清，测定蛋白浓度后，等蛋白量上样，10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭，TBST(含1％Tween 20)洗涤后一抗(actin,ATG7,gapdh,beclin-1,lc3b)4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次8min，二抗室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次8min，使用ECL发光液化学发光并在暗室曝光，分析相关蛋白表达趋势。

试验结果：

ECA-109细胞在TQ处理24h时，随着TQ浓度的增加，ATG7，与Lc3B 的主条带与剪切条带均表现出增强趋势；Beclin-1的表达无明显变化 (图5)。

六、TQ联合应用siRNA评价增殖活率

1、细胞培养与传代

本试验使用人食管癌细胞系ECA-109，培养基为添加10％FBS的1640 培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部 80～90％时，使用0.25％胰酶-EDTA消化并传代。

2、TQ联合ATG7-siRNA对细胞增殖能力的影响

主要试验材料：百里香醌(TQ)溶解于无水乙醇中，配制成10mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为36μM，即配即用；CCK-8(beyotime)；胰酶(Gibco)；PBS；6孔板(Nunc)。siRNA(Bio-Rad)，30mm培养皿；

试验方法：将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，分别种植在 30mm培养皿里，分别加转染液，ATG7,AGT7-siRNA，培养24H后以5×103/ 孔的密度种植于96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，移除原培养液，加入新鲜配制的，含有36μM TQ的培养液继续培养，分别于培养的24h终止培养，向每孔加入10μL无血清CCK-8，再重新置于37℃，5％CO₂培养箱中培养2h后在酶标仪OD450nm处检测各孔的吸光值。

试验结果：ATG7-siRNA可以通过干扰ATG7而抑制细胞自噬,数据显示,相比于TQ单独干预,联合12μM的siRNA增加了TQ对ECA-109细胞的抑制作用，即增殖活性更低且凋亡率更高；联合ATG7-siRNA降低TQ对ECA-109细胞抑制作用,即增殖活性高且凋亡率低；(图6)

为了进一步说明本发明的TQ与siRNA的协同作用，本发明采用金正均q值法。q值由以下的公式求得：q＝P_A+B/(P_A+P_B-P_A*P_B)。式中，P_A、P_B和P_A+B分别为A药组、B药组和两药联用组治疗率。q＜1说明两药合用后产生拮抗作用；q＞1说明两药合用后产生协同作用；q＝1说明两药合用后产生相加作用。

具体而言，本发明的P_A+B＝92％、P_A＝52％、P_B＝4％，由此得出q＝92％/ (52％+4％-52％*4％)＝1.7。由此可见，本发明的TQ与siRNA具有非常明显的协同作用，这一效果是出人意料的。

七、TQ联合应用自噬抑制剂ATG7-siRNA表达Werstern Blotting检测

1、细胞培养与传代

本试验使用人食管癌细胞系ECA-109，培养基为添加10％FBS的1640 培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部 80～90％时，使用0.25％胰酶-EDTA消化并传代。

2、TQ联合ATG7-siRNA的表达检测

主要试验材料：TQ溶解于无水乙醇中，配制成10mM浓缩液，-20℃保存，使用时稀释为36μM，即配即用；RIPA裂解液；PMSF；BCA蛋白浓度测定试剂盒，一抗PI3K(#4292)、ATG-7(#8558)、GAPDH(#2118)、 ACTIN(#4970)、Beclin-1(#3495)、LC3B(#3868)购自CellSignaling Technology(Beverly,MA)，免疫印迹的二级抗体是来自细胞信号技术的过氧化物酶山羊抗小鼠IgG(#7076)和过氧化物酶山羊抗兔IgG(#7074)；丙烯酰胺，SDS，亚硫酸铵，Tris-Base，PVDF膜，ECL发光液(GE Healthcare)，siRNA(Bio-Rad)。

试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于六孔板中，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育，待细胞生长至占培养皿底部30％-40％左右时，移除原培养液，分别加转染液，ATG7,AGT7-siRNA，培养24H后，加入新鲜配制的36μM TQ的培养液继续培养，以不加TQ的培养液为对照组。在加入TQ后24h终止培养，移除培养液并用PBS洗涤两次，加入含有1％PMSF的RIPA裂解液裂解细胞。将裂解液4℃，12000×g/min离心 8min，收集上清，测定蛋白浓度后，等蛋白量上样，10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭，TBST(含1％Tween 20) 洗涤后一抗(actin,ATG7)4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次8min，二抗室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次8min，使用ECL发光液化学发光并在暗室曝光，分析相关蛋白表达趋势。

试验结果：

siRNA干扰ATG7能显著抑制细胞自噬的发生，TQ与ATG7-siRNA联合表现出减弱趋势；抑制了癌细胞自噬(图7)。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (3)

1.胸腺醌与自噬抑制剂ATG7 –siRNA联合使用在制备治疗癌症的药物组合物中应用；所述自噬抑制剂ATG7 –siRNA是指特异性地抑制 ATG7表达的小干扰RNA；所述胸腺醌与自噬抑制剂ATG7–siRNA的施用摩尔比例为1~5：1；所述癌症为食管癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述胸腺醌用于诱导食管癌细胞凋亡和/或促进食管癌细胞自噬。

3.根据权利要求1所述的应用，所述组合物为口服液、贴剂、片剂、胶囊或注射剂。

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