CN111004818B - 一个lgi 1基因突变及其在制备颞叶癫痫共病抑郁动物模型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及人群中新发现的导致颞叶癫痫(TLE)的一个新的LGI1基因突变及应用。本发明公开了LGI 1基因第1外显子第152位基因位点A152G突变在制备颞叶癫痫共病抑郁动物模型中的应用、在筛选抗颞叶癫痫共病抑郁药物中的应用。本发明发现该基因突变的纯合模型小鼠表现出致死性癫痫，杂合小鼠脑电图可记录到癫痫波形，行为学显示共病抑郁，可作为癫痫共病抑郁的新动物模型，用于癫痫发病、癫痫共病抑郁的机制研究以及抗癫痫合并抑郁药物的研发。

Description

一个LGI 1基因突变及其在制备颞叶癫痫共病抑郁动物模型 中的应用

技术领域

本发明涉及人群中新发现的导致颞叶癫痫(TLE)的一个新的LGI1基因突变，该基因突变的纯合模型小鼠表现出致死性癫痫，杂合小鼠脑电图可记录到癫痫波形，行为学显示共病抑郁，可作为癫痫共病抑郁的新动物模型，用于癫痫发病、癫痫共病抑郁的机制研究以及抗癫痫合并抑郁药物的研发。

背景技术

颞叶癫痫(TLE)是最常见的局灶性癫痫综合症，常伴有海马硬化、神经元丢失、胶质细胞增生和苔藓纤维发芽等病理异常异常癫痫放电起源于大脑颞叶，属于部分性发作癫痫的一种。颞叶癫痫根据致痫灶部位的不同，又分为外侧颞叶癫痫(Lateral temporallobeepilepsy，L17LE)和内侧颞叶癫痫(medial temporallobe epilepsy，MTLE)【1】。外侧颞叶癫痫指致痫灶位于颞叶外侧新皮层，包括颞上回、颞中回、颞下回、梭状回；内侧颞叶癫痫指致痫灶位于颞叶内侧结构，包括海马，杏仁核以及海马旁回。

临床研究发现约三分之一癫痫患者合并情绪障碍，称为癫痫共患病，上世纪70年代Trimble and Reynolds首次提出了抗癫痫药和情绪认知障碍等行为学表现的关系【2】。近期一项meta分析的结果显示二者的相关性达到23.1％【3】。临床报道颞叶癫痫患者中高达55％比例的患者深受合并的抑郁症困扰，且伴随抑郁症的颞叶癫痫患者自杀死亡率比普通癫痫患者高25倍【4】。癫痫共患病患者除癫痫发作带来的痛苦之外，异常的精神状态也使患者承受了巨大的压力。

癫痫相关的抑郁受到越来越多的关注，但临床诊断或者治疗仍没有统一标准。抑郁症状的多样性导致了癫痫共病抑郁诊断困难。Kanner等发现难治性癫痫共患抑郁患者，只有29％的患者的抑郁症状符合精神障碍诊断与统计IV(Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders，DSM)诊断标准，抑郁症的诊断需要专业的心理量表的评定，而目前还没有专门用于评定癫痫相关抑郁的评定方法。加之服用抗癫痫药物副作用的干扰，癫痫患者的抑郁常无法明确，在控制癫痫发作的主要目标前，改善抑郁症状成了被忽视的需求。因此研究颞叶癫痫共患抑郁的发病机制及诊断治疗就具有特别重要的临床意义。

一些临床研究经过长期观察证实癫痫发作后抑郁增加【5】，而另外一方面的研究则表明抑郁个体有发展成癫痫患者的风险【6】。这种双向相关关系支持癫痫和抑郁存在重叠机制的假设，并且可能是由遗传易感性介导的。所以遗传因素在癫痫发作中的作用需要进一步深入研究。

到目前为止，只有一个基因对TLE的遗传易感性有重要影响——富含亮氨酸的胶质瘤失活1基因(LGI1)。LGI1的突变在有听觉功能的常染色体显性部分癫痫(ADPEAF)家族中被鉴定为大约50％，其外显率约为67％【7】。截止到2019年，在ADTLE患病家族中被报道的LGI1突变位点共有42个【8】。ADTLE是一种特发性局灶性癫痫综合征，以听觉症状或接受性相作为主要的黄疸表现。这些症状强烈提示颞叶外侧的位置，因此该综合征也被称为颞叶外侧癫痫。一个有LGI1两种突变位点的ADPEAF家族报告中显示其中LGI1c.431+1G＞A突变家族第二代有三人存在抑郁和自杀在内的精神症状【9】。

颞叶癫痫是神经系统的一类重要疾病，需要开发有效的抗痫药物。在设计和开发抗癫痫新药时，必须利用动物癫痫模型。实验性癫痫动物模型与人类癫痫发作存在有相似性，其机理也接近人类发作时的病理生理状态。利用电刺激或化学致痫剂复制动物模型时，一般使用当时已知的临床有效的抗癫痫药物来证明模型的有效价值，然后再用这些模型来评价新抗痫药物，因此选择合适的动物模型很关键。具有理想的颞叶癫痫模型应具备以下条件：①在症状学上，海马、杏仁核和其它边缘结构占有中心地位；②病理上，特异的海马损伤与颞叶癫痫的海马硬化相关；③有自发抽搐；④与人类颞叶癫痫一样，对大部分抗癫痫药物耐受。理想的颞叶癫痫模型为研究癫痫共病抑郁相关的神经生物学机制提供了极佳的前提条件。截至目前尚无特异遗传动物模型广泛用于研究颞叶癫痫共病。所以研究lgi1基因在癫痫共病抑郁发生发展过程的作用就具有特别重要的临床意义，对于癫痫共病抑郁的药物研发也提供了新的模型工具。

参考文献

【1】Hesdorffer DC，Hauser WA，Annegers JF，Cascino G.Major depression isa risk factor for seizures inolder adults.Ann.Neurol.2000；47：246-249

【2】Trimble MR，Reynolds EH.Anticonvulsant drugs and mental symptoms：areview.PsycholMed1976；6：169-78.

【3】Kobau R，Gilliam F，Thurman DJ.Prevalence of self-reportedepilepsyor seizure disorder and its associations with self-reporteddepressionand anxiety：results from the2004HealthStyles Survey.Epilepsia2006；47：1915-1921.

【4】Mazza M.OrsucciF，DeRS，BriaP，MazzaS.Epilepsy and depression：riskfactors for suicide？Clin Ter 2004；155；425-7

【5】Jacoby A，Baker GA，Steen N，Potts P，Chadwick DW.The clinical courseof epilepsy and itspsychosocial correlates：findings from a U.K.Communitystudy.Epilepsia.1996；37：148-161

【6】Hesdorffer DC，Hauser WA，Annegers JF，Cascino G.Major depression isa risk factor for seizures inolder adults.Ann.Neurol.2000；47：246-249

【7】Rosanoff MJ，Ottman R.Penetrance of LGI 1mutations in autosomaldominant partial epilepsy with auditory features.Neurology.2008；71：567-571

【8】Atsushi Yamagata，Yuri Miyazaki et al.Structural basis of epilepsy-related ligand-receptor complex LGI 1-ADAM22.Nature communications.2019

【9】Chabrol E，Popescu C，Gourfinkel-An I，Trouillard O，Depienne C，Senechal K，Baulac M，LeGuernE，Baulac S.Two novel epilepsy-linked mutationsleading to a loss of function of LGI1.Arch.Neurol.2007；64：217-222。

发明内容

本发明研究了已知对癫痫风险有强烈影响的一个新基因突变及其对抑郁症状的风险。本发明的目的是以临床发现的LGI1第一个外显子(共8个外显子)区域第152位基因位点突变(A152G)致第51个氨基酸突变(D51G，天冬氨酸突变为甘氨酸)导致癫痫的家系数据作为基础，建立起一种新的癫痫合并抑郁小鼠模型。该基因突变的纯合小鼠表现出早期发作的难治性致死性癫痫特征。突变杂合小鼠虽然无可见发作癫痫，但EEG测试证实了其癫痫波的存在，癫痫发病年龄阶段晚于纯合小鼠，表现为在不同的年龄阶段发病死亡，并且表现出抑郁的表型，初步显示了癫痫和抑郁症的共同遗传易感性假说，为探究癫痫及共病的神经生物学发病机制提供了合适的工具，并为临床癫痫合并抑郁的药物研发同提供了新的思路。

本发明公开了LGI 1基因第1外显子第152位基因位点A152G突变在制备颞叶癫痫共病抑郁动物模型中的应用。

本发明公开了LGI 1基因外显子第152位基因位点A152G突变在筛选抗颞叶癫痫共病抑郁药物中的应用。

本发明还公开了一种颞叶癫痫共病抑郁动物模型，是LGI 1基因第1外显子第152位为ag杂合型。

进一步地，本发明还提供了一种颞叶癫痫共病抑郁动物模型的制备方法，包括以下步骤：设计sgRNA识别序列，构建sgRNA，并根据sgRNA构建相应的donor载体；显微注射载体至受精卵并移植至超排的受体小鼠，得到Founder鼠，通过PCR基因鉴定及测序筛选出阳性Founder鼠，将阳性Founder鼠与背景鼠回交得到F1代，F1代互相配繁后通过PCR引物并测序得到纯合突变鼠，对三个月和六个月的纯合鼠和对照野生鼠进行高架十字迷宫和开场实验，确定其抑郁表型。

本发明的临床数据来源于对一个遗传性癫痫(ADLTE)发作家系所有人员资料整理并绘制系谱图的基础上(数据尚未发表)，抽取成员血液样本提取DNA，扩增LGI1外显子区域，将扩增后片段进行测序，测序序列与GenBank中野生型LGI1基因组外显子区域(ID：56839)序列进行比较，通过比较筛查出一个位于LGI1基因第一个外显子区域第51位氨基酸的错义突变(D51G)。测序验证结果显示，携带该突变的家系人员共在该家系共4代34人，其中8名临床诊断为ADLTE.

本发明的模型制作是通过比对发现人LGI1基因(ID：9211)与小鼠的lgi1基因(ID：56839)具有高度同源性的基础上，利用Cas9/RNA system gene targeting技术构建了Lgi1-D51G位点突变的小鼠，通过配繁得到纯合或者杂合Lgi1基因突变小鼠。采用连续摄像方式观察了lgi1突变纯合小鼠从出生后第20天起开始连续观察15天的生存特点及癫痫发作特征，发作级别以Racine评分法分级。Lgi1基因突变的纯合小鼠在3-5周内出现癫痫发作，发病的高峰期在4周前后，每次发病均达到五级，表现为跳跃，摔倒，全身强直。首次发病至死亡的间隔期间平均约为8个小时，发作频率从3个小时缩短至10分钟，首次发病至死亡前发病次数为3-5次。生存曲线显示相比于lgi1基因敲除小鼠，该基因突变鼠显示出更长的生存期。

本发明对基因突变的杂合小鼠EEG脑电监测数据显示75％杂合小鼠存在脑电波的异常，表现为高频率的棘波。部分小鼠在不同年龄阶段出现死亡。三个月和六个月的小鼠进行高架十字迷宫和开场实验证实，六个月以上的杂合小鼠存在抑郁表型。

综上，本发明首次依据发现癫痫患者人群LGI1基因新的单位点突变制作出相应位点突变小鼠，纯合小鼠存在癫痫发作致死，杂合小鼠表现为癫痫共病抑郁。新突变位点纯合模型小鼠为研究癫痫发病的分子机制提供了良好的模型，杂合突变模型小鼠则可以成为研究癫痫共病抑郁机制的良好选择。

附图说明

图1是Lgi1纯合、杂合及野生小鼠生存曲线。

图2是Lgi1纯合小鼠发病后死亡(28天)。

图3是Lgi1纯合杂合小鼠发病后死亡(344天)。

图4是Lgi1杂合小鼠记录到癫痫发作波形(2个月)。

图5是Lgi1杂合小鼠3个月高架十字迷宫。

图6是Lgi1杂合小鼠6个月高架十字迷宫。

图7是Lgi1杂合小鼠3个月旷场实验。

图8是Lgi1杂合小鼠6个月旷场实验。

具体实施方式

一、小鼠模型制作

1.载体的设计、构建和纯化

(1)本策略选择小鼠Lgi1-207(ENSMUST00000198518.4)制作，使用麻省理工学院的CRISPR Design工具(http：//crispr.mit.edu/)，依据Score的高低设计长度为20bp的针对靶标DNA，DNA序列如SEQ ID NO.1(下划线位置为突变位点a-g。同时为避免cas9蛋白对Donor vector上的敲入序列进行切割，构建Donor vector突变位点同时在exon1上制作一个同义突变位点，双下划线位置突变为在exon1上制作的同义突变c-a，g-t)

的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA序列(sgRNA序列为SEQ ID NO.2：CTGAGCCAACAGTGGTAGTA)，根据sgRNA序列设计一个携带靶位点同源臂以及目的敲入序列的Donor vector，并在该靶区域设计引物用于后续阳性克隆筛选以及小鼠的基因鉴定。

(2)将设计的序列合成PAGE的产物。将合成后的2条单链寡聚核苷酸sgRNA序列退火(95℃5min后自然降至室温)形成双链DNA，在T4 DNA连接酶作用下与pGK1.1linearvector链接，构建sgRNA表达载体将重组质粒转化到DH5a感受态细胞中通过pGK1.1linearvector的卡那霉素抗性以及靶标DNA的测序，对阳性克隆质粒进行筛选及鉴定，挑选正确的菌落克隆，扩大培养后提取质粒用于准备体外转录模板。制作携带靶位点同源臂以及目的敲入序列的Donor vector片段与T-vector连接，构建接，构建Donor vector Donorvector，将重组质粒转化到DH5a感受态细胞中，通过T-vector的氨苄抗性以及插入片段的测序，对阳性克隆质粒进行筛选及鉴定，挑选正确的菌落克隆，扩大培养后提取质粒并纯化，获得的donor片段产物用于注射使用。

2.样品制备及显微注射

(1)样品体外转录：Cas9表达质粒(Addgene No.44758)，经Age I酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板用于体外转录；依照T7 Ultra Kit(Ambion，AM1345)试剂盒，体外利用T7 RNA聚合酶合成Cas 9mRNA。sgRNA的表达载体经DraI酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板用于体外转录，并依照MEGAshortscript Kit(Ambion，AM1354)试剂盒体外经T7 RNA聚合酶合成sgRNA；

(2)Cas9/sgRNA及donor的显微注射：将转录好的Cas9 mRNA，sgRNA和纯化后的donor片段混合并调整浓度为20ng/μl的Cas9 mRNA，10ng/μl的sgRNA和50ng/μl的donor片段，使用TE2000U显微注射仪将混合物显微注射到C57BL/6小鼠受精卵的原-核和细胞质中，再将受精卵移植到假孕的C57BL/6-母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生；三.F0代小鼠出生及鉴定及可遗传检测在F0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠并将剪取鼠尾组织经酚氯仿法提DNA，在靶区域设计的引物(Forward：GACCTGTTCTTAGAGCAAGACAATC(SEQ IDNO.3)；Reverse：TGTTAGTGCTGTCAAATGGTCAGG(SEQ ID NO.4))进行鉴定，选取PCR阳性的样品进行测序。将PCR以及测序正确的F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠进行交配，产生F1代小鼠，依据F0代小鼠的鉴定方法对F1代小鼠进行鉴定，获得的阳性F1代杂合子小鼠即可稳定遗传。

二、小鼠癫痫检测

所有小鼠记录出生时间，测序鉴定及基因型并分笼后持续观察并记录小鼠死亡时间及癫痫发作特点。癫痫发作强度采用Racine分级标准(0级：无反应；1级：面肌抽动，节律性咀嚼；3级：节律性点头；4级：双侧前肢阵挛伴站立；5级：跌倒，全身强直阵挛发作)。麻醉后固定于立体定位仪(512600，Stoelting，USA)。在腹侧海马CA3区(AP.-2.9mm；L.-3.0mm；V.-3.0mm)植入电极用于脑电记录。另外，在感觉运动皮层上方颅骨旋入一枚不锈钢螺丝并连接电极用于记录皮层脑电，在小脑上方颅骨旋入两枚螺丝作为脑电记录时的参考和接地。电极外端焊接于微型插座上，并用牙科水泥固定于颅骨。所有定位坐标均以前囟为原点进行测量，参考Franklin和Paxinos所发表的脑图谱。行为学实验结束后，所有老鼠均需要确认电极植入位置，只有电极位置正确的小鼠才能用于结果分析。用PowerLab系统(ADInstruments)记录自由活动小鼠的脑电，采样率为1kHz，每天记录8小时(早上9：00.下午5：00)，连续记录三天作为基线。脑电记录结束后，用PowerLab系统中的LabChart 7软件对记录到的EEG信号进行离线分析。根据之前的报道，癫痫样脑电被定义为：持续时N＞20s，尖峰频率≥2Hz，振幅之3倍EEG基线的规律性尖峰放电簇。同时2次脑电发作至少间隔10s。在本实验中，统计每天记录的8小时脑电中自发癫痫波。

三、抑郁相关行为学检测

1.高架十字迷宫：高架十字迷宫由十字迷宫部分和支柱部分两部分组成。十字部分由两个开放臂与两个闭合臂以及连接开放臂和闭合臂的中央平台组成，开放臂和闭合臂的长宽分别是30cm×5cm，中央平台的大小是5cm×5cm，闭合臂除了与中央平台连接的边，其余三边都有高15cm不透光的木板，以造成暗区。支撑十字部分的支柱高38.5cm。实验时将高架十字放在平地，监测小鼠运动的摄像头垂直放于高架十字的上方，使小鼠头部正对其中一个开放臂，用摄像头跟踪记录小鼠在高架上的活动。每只小鼠观测5min，进入臂中次数被用于计算：敞开臂次数/(敞开臂次数+密闭臂次数)。计算得出的结果用于统计学分析。

2.旷场实验：实验环境要求密闭安静，最好实验室隔音，这样可以避免外界环境和声音的影响。本实验室用于开场实验的开场箱大小是(50cm×50cm×20cm)长×宽×高，开场箱中间是20cm×20cm的中心区域。中央区域每条边都离箱子边缘10cm。摄像系统垂直放在开场箱上方。实验时，将小鼠轻轻放在开场箱中心，然后打开软件，收集小鼠运动轨迹20min，记录小鼠进入开场中央的次数以及停留的时间。每只小鼠实验结束后都要用75％乙醇擦拭去除其残留气味防止对下只小鼠产生影响。

四、统计方法

采用SPSS19.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为P≤0.05，采用均数±标准差(mean±SD)，用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用T检验(T-test)进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P＜0.05)则用Dunnett’s Test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。

实验结果

Lgi1-D51G突变小鼠的生存曲线及癫痫发作特点

对获取到突变纯合小鼠进行基因鉴定后观察其发病特点，共记录到10只纯合小鼠。Lgi1基因突变的所有纯合小鼠在3-5周内出现癫痫发作，发病的高峰期在4周前后(见图1)，每次发病均达到五级，表现为一侧摔倒后维持5秒左右跳跃，随即摔倒并全身强直痉挛，发病强度达到5级。首次发病至死亡的间隔期间平均约为8个小时，发作频率从3个小时缩短至10分钟，首次发病至死亡前发病次数为3-5次，伴随最后一次发病后猝死，死亡后维持四肢痉挛状态(见图2)。记录期间共观察到7只杂合小鼠死亡，死亡时间在50天至344天不等，其中有一只鼠在换笼时观察到癫痫发作(见图3)，其余死亡小鼠未观察到死亡前的癫痫发作，但四肢呈强直痉挛状态，可确定为癫痫发作死亡。

Lgi1-D51G突变杂合小鼠清醒癫痫样放电

野生型小鼠脑电图主要表现为a波，频率主要表现为7-10HZ，波幅以20uv波形为主，同时存在少量θ波，a波和θ波为基础波，构成脑电的背景活动。连续检测7天的2个月大杂合小鼠可在背景活动基础上出现爆发性棘波和尖波(图4)。

Lgi1-D51G突变杂合小鼠高架十字迷宫

分别对3个月和6个月野生型和基因突变杂合小鼠进入闭合臂频率百分别进行统计分析，结果表明3个月杂合小鼠高架迷宫与野生型之间无统计学差异，突变小鼠进入闭合臂的频率显著高于野生型小鼠，运动总距离显著减少且有统计学意义，表现出焦虑样行为(图5，图6)。

Lgi1-D51G突变杂合小鼠开场实验

对小鼠运动速度，运动总距离和中心区域停留时间进行统计。统计结果表明，杂合小鼠在中心区域的停留时间显著高于正常小鼠。表明Lgi1基因突变小鼠在六个月开始表现出抑郁样行为(图7，图8)。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京市妇幼保健院

争峰, 许

平, 胡

云, 石

<120> 一个LGI 1基因突变及其在制备颞叶癫痫共病抑郁动物模型中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 1

ggatattctc tcgactgcat ggaatcagaa agcagcagaa ggatgggaaa tgcctgcatt 60

cccctgaaaa gaattgccta tttcctatgc ctcttttctg tggttttgct gactgagggg 120

aagaaaccag cgaagccaaa atgccctgca gtttgtactt gtagcaaagg taacgcttta 180

tgtgagaatg cgagatccat tccacgcacc gttcctcctg atgttatctc actgtaaggc 240

ccgtaagcat tttgatatct 260

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 2

ctgagccaac agtggtagta 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 3

gacctgttct tagagcaaga caatc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 4

tgttagtgct gtcaaatggt cagg 24

Claims (2)

1.LGI1基因第1外显子第152位基因位点A152G突变杂合型在制备颞叶癫痫共病抑郁动物模型中的应用。

2.LGI1基因第1外显子第152位基因位点A152G突变杂合型在筛选抗颞叶癫痫共病抑郁药物中的应用。

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