CN111004305B

CN111004305B - 姬松茸小肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111004305B
Application number: CN201911342554.9A
Authority: CN
Inventors: 安丽萍; 杜培革; 卢学春; 冯晴霞; 张倩; 苑广信; 盛瑜; 郭笑; 韩笑; 徐广宇; 孙晶波; 王曼力; 赵南晰
Original assignee: Beihua University
Current assignee: Beihua University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN111004305A

Abstract

本发明涉及一种姬松茸小肽及其制备方法和应用，属于天然活性产物技术领域。该姬松茸小肽包括如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽段。该姬松茸小肽通过酶解和色谱柱纯化得到，其主要肽段序列为RQR(精氨酸‑谷氨酰胺‑精氨酸)；由动物实验中可证明本发明的姬松茸小肽可提高Morris水迷宫中小鼠的学习记忆能力，并且检测小鼠血清中生化指标显示姬松茸小肽可显著改善小鼠体内氧化应激水平，CAT，T‑AOC值明显提高，ROS，MDA含量下降，即该姬松茸小肽能够改善动物记忆障碍、提高学习能力，有明显抗衰老作用。以上实验表明本发明的姬松茸小肽具有较好的改善记忆障碍、提高学习能力，抗衰老作用，且具有肽段短，溶解性好，吸收好的优势，具有广泛的应用前景。

Description

姬松茸小肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及天然活性产物技术领域，特别是涉及一种姬松茸小肽及其制备方法和应用。

背景技术

人体细胞及组织的衰老是指在结构和机能上所出现的退行性变化现象，在过程中神经系统逐步发生衰退进而产生了行为障碍、学习记忆能力减退等现象。机体氧化应激程度加剧是衰老发生的重要原因，而氧化应激的程度取决于氧化与抗氧化体系的平衡。因此，提高机体的抗氧化能力,可以延缓衰老进程。天然产物中含有大量的抗氧化活性物质，用来预防衰老及相关疾病已成为现代生物研究领域的热点。

真菌作为天然产物的重要来源，其活性物质的研究已经显示出广阔的发展前景。姬松茸(Agaricus blazei Murill)又名小松菇、巴西蘑菇，是一种大型真菌，具有浓郁杏仁香味，属担子菌亚门层菌纲伞菌目蘑菇(黑伞)科蘑菇(黑伞)属。姬松茸在当地不仅是一种很受欢迎的食物，也被用于抗癌、抗感染等疾病，是食药兼用的名贵真菌。姬松茸子实体中富含蛋白质、糖类、甾醇、黄酮等多种生物活性物质，具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、降血糖、抗炎、增强免疫力等。姬松茸蛋白具有明显的抗氧化作用，具有提高乙酰胆碱酯酶的活性等。蛋白质经蛋白酶部分水解后，可获得具有生物活性的多肽，与大分子蛋白相比小分子生物多肽具有安全稳定、易溶于水、易吸收等优点。但目前仍无一种来源于姬松茸的小分子肽被确认具有较好的应用前景。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种姬松茸小肽，该姬松茸小肽属于小分子肽段，其能够改善动物记忆障碍、提高学习能力，有明显抗衰老作用。

一种姬松茸小肽，包括如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽段。

上述姬松茸小肽，能够改善动物记忆障碍、提高学习能力，有明显抗衰老作用；在细胞实验中可证明姬松茸小肽可对D-gal诱导的NIH/3T3衰老细胞有名显的保护作用，减少细胞损伤，保持细胞原有形态减少衰老，具体机制可能通过通过调控Nrf2/ARE信号通路减轻氧化反应以产生抗衰老作用。且具有肽段短，溶解性好，吸收好的优势。

在其中一个实施例中，所述SEQ ID No.1所示氨基酸序列肽段的含量以HPLC高效液相色谱的峰面积归一化法计不低于98％。

本发明还公开了上述的姬松茸小肽的制备方法，包括以下步骤：

提取：取姬松茸子实体，匀浆后离心取上清液，沉淀上清液中的可溶性蛋白质；

透析：取上述沉淀，加入水溶解，使用透析膜进行透析，得透析蛋白；

酶解：以胰蛋白酶对上述透析蛋白进行酶解，得到粗多肽级分；

纯化：取上述粗多肽级分，以DEAE-32离子交换色谱柱为固定相，0-0.5M/L的氯化钠溶液为流动相进行层析，按洗脱先后顺序，依次得到DE1、DE2、DE3和DE4四个组份；取DE2组份，以CM-52离子交换色谱柱为固定相，0-0.5M/L的氯化钠溶液为流动相进行层析，按洗脱先后顺序，依次得到CM1和CM2两个组份；取CM1组份，通过Sephadex G25净化脱盐，得到单峰成分，G25成分通过Superdex 30净化脱盐，按洗脱先后顺序，依次得到S1和S2两个组分，S2即得所述姬松茸小肽(ABp)。

通过上述制备方法，提取了姬松茸中的活性小肽，并通过色谱法对肽段进行了分离纯化，最终得到纯度高且活性佳的小分子肽段。

在其中一个实施例中，所述提取步骤中，按照姬松茸子实体：蒸馏水为3g:4-6mL的料液比加入蒸馏水后冰上匀浆，在4000-6000r/min条件下离心2-20min取上清，在质量百分浓度为75-85％的硫酸铵条件下，0-4℃下将上清液中的可溶性蛋白质沉淀8-14h。

在其中一个实施例中，所述提取步骤中，取上述沉淀，加入去离子水溶解，使用30kDa截留分子量的透析膜，在0-4℃下透析12-36h，得透析蛋白。

在其中一个实施例中，所述酶解步骤中，按照透析蛋白：水为1g：15-25mL的料液比加入水，以盐酸调节pH为2-3，按照2500-3500u/g透析蛋白的量加入胰蛋白酶，酶解3-5h，得粗多肽级分。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，将所述粗多肽级分，上样至DEAE-32离子交换色谱柱，并以0.2M/L的氯化钠溶液洗脱1个柱体积，收集0.1-0.6柱体积的洗脱峰，即为DE2组份；

取所述DE2组份，上样至CM-52离子交换色谱柱，并以0.2M/L的氯化钠溶液洗脱1个柱体积，收集0.2-0.6柱体积的洗脱峰，即为CM1组份；

取所述CM1组份，上样至Sephadex G25色谱柱，使用去离子水洗脱1个柱体积，得到单峰成分，即得G25组分。

取所述G25组份，上样至Superdex 30色谱柱，使用去离子水洗脱1个柱体积，收集0.6-0.7柱体积的洗脱峰S2，即得所述姬松茸小肽。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，在DEAE-32离子交换色谱柱分离纯化时，洗脱液的流速为0.5mL/min，检测波长为220nm；在CM-52离子交换色谱柱分离纯化时，洗脱液的流速为0.5mL/min，检测波长为220nm；在Sephadex G25色谱柱纯化时，洗脱液的流速为1mL/min，检测波长为220nm；在Superdex 30色谱柱纯化时，洗脱液的流速为1mL/min，检测波长为220nm。

本发明还公开了上述的姬松茸小肽在用于制备调控Nrf2/ARE信号通路的药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述调控Nrf2/ARE信号通路的药物用于改善记忆障碍、提高学习能力和/或抗衰老。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种姬松茸小肽，通过酶解和色谱柱纯化得到，其主要肽段序列为RQR(精氨酸-谷氨酰胺-精氨酸)；由动物实验中可证明本发明的姬松茸小肽可提高Morris水迷宫中小鼠的学习记忆能力，与模型组相比具有显著性差异，并且检测小鼠血清中生化指标显示姬松茸小肽可显著改善小鼠体内氧化应激水平，CAT，T-AOC值明显提高，ROS，MDA含量下降，即该姬松茸小肽能够改善动物记忆障碍、提高学习能力，有明显抗衰老作用；在细胞实验中可证明姬松茸小肽可对D-gal诱导的NIH/3T3衰老细胞有名显的保护作用，减少细胞损伤，保持细胞原有形态减少衰老，具体机制可能通过通过调控Nrf2/ARE信号通路减轻氧化反应以产生抗衰老作用。

以上实验表明本发明的姬松茸小肽具有较好的改善记忆障碍、提高学习能力，抗衰老作用，且具有肽段短，溶解性好，吸收好的优势，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中DEAE-32柱色谱洗脱图；

图2为实施例1中CM-52柱色谱洗脱图；

图3为实施例1中Sephadex G25柱色谱洗脱图；

图4为实施例1中Superdex 30柱色谱洗脱图；

图5为实施例1中HPLC色谱分析图；

图6为实施例1中MS色谱分析图；

图7为实施例3中β-半乳糖苷酶活性检测结果(x40)；

其中：Con:空白组；Mod：模型组；Pir:阳性药组；ABp-L:姬松茸小肽低剂量组；ABp-M:姬松茸小肽中剂量组；ABp-H:姬松茸小肽高剂量组；

图8为实施例中3Western blot蛋白表达量结果；

其中：Con:空白组；Mod：模型组；Pir:阳性药组；ABp-L:姬松茸小肽低剂量组；ABp-M:姬松茸小肽中剂量组；ABp-H:姬松茸小肽高剂量组。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中所用原料，如非特别说明，均为市售可得。

实施例1

一、姬松茸小肽的制备。

1、提取。

将姬松茸的粉状子实体(约3000g)在5000mL蒸馏水中冰上匀浆，5000r/min离心15min取上清，随后加入硫酸铵((NH₄)2SO₄至其浓度为75-85wt％，4℃下将上清液中的可溶性蛋白质沉淀过夜，离心得到的沉淀A。

2、透析。

取上述沉淀，在去离子水中溶解，并使用30kDa截留分子量的透析膜在4℃下用去离子水透析24h，透析后冷冻干燥，得透析蛋白粉。

3、酶解。

取上述透析蛋白粉，按1:20(g/mL)加入蒸馏水，用0.1mol/L的盐酸(HCl)调pH值至2.5，按照3000u/mg的加酶量加入胰蛋白酶解液，混匀后置于37℃恒温水浴中水解4h，酶解结束100℃10min使酶失活，冻干后初步提取出粗多肽级分。

4、纯化。

利用AKTA Purifier蛋白质层析仪分离上述粗多肽级分。

(1)Preswollen DEAE-32。

将Preswollen DEAE-32填料预处理并装入5mL Bio-Rad中。随后用1.5mM三羟甲基-氨基甲烷/盐酸(Tris-HCl)缓冲液平衡三个柱体积(CV)，流速为0.5mL/min。

将粗多肽级分溶于Tris-HCl缓冲液中加到柱子上，使用0.45μm滤膜过滤后，在Tris-HCl中用梯度0.2-0.5M氯化钠(NaCl)连续洗脱，流速为0.5mL/min。并使用级分收集器收集柱流出物。在洗脱模式中，以220nm为检测波长，收集洗脱液，按照各吸收峰对流出物进行合并并冻干。

上述洗脱过程的流动相梯度洗脱变化如下表所示。

表1.梯度流动相

时间	流动相(氯化钠浓度)
		0-10min	0.2mol/L
10-20min	0.5mol/L

上述洗脱过程的色谱图如图1所示，图1中，横坐标表示洗脱体积，纵坐标表示吸光度，从图中可以看出，随着洗脱过程，依次洗脱得到DE1、DE2、DE3和DE4四个吸收峰。经活性测定，活性最佳吸收峰为DE2，该DE2吸收峰的洗脱体积为1.5-3ml，换算为柱体积为0.3-0.6柱体积。

(2)Cellulose CM-52层析。

使用上述同样的方法安装并平衡Cellulose CM-52柱，将活性级分(DE2)进一步应用于CM-52柱，并用梯度0-0.5M NaCl溶液冲洗，流速为0.5mL/min，检测波长为220nm。

上述洗脱过程的流动相梯度洗脱变化如下表所示。

表2.梯度流动相

时间	流动相(氯化钠浓度)
		0-10min	0.2mol/L
10-20min	0.5mol/L

上述洗脱过程的色谱图如图2所示，图2中，横坐标表示洗脱体积，纵坐标表示吸光度，从图中可以看出，随着洗脱过程，依次洗脱得到CM1和CM2两个吸收峰。经活性测定，活性最佳吸收峰为CM1，CM1吸收峰的洗脱体积为1-3ml，换算为柱体积为0.2-0.6柱体积。

(3)Sephadex G25层析。

将CM1组分冻干成粉末溶于去离子水中，通过Sephadex G25，使用去离子水洗脱1个CV，流速为1.0mL/min，检测波长220nm，最终得到单峰，命名为G25。

上述洗脱过程的色谱图如图3所示，图3中，横坐标表示洗脱体积，，纵坐标表示吸光度，从图中可以看出，经过Superdex 30净化脱盐，得到G25。

(4)Superdex 30层析。

将G25组分冻干成粉末溶于去离子水中，通过Superdex 30净化，使用去离子水洗脱1个CV，流速为1.0mL/min，检测波长220nm，最终得S1和S2两个吸收峰。经活性测定，活性最佳吸收峰为S2。

上述洗脱过程的色谱图如图4所示，图4中，横坐标表示洗脱体积，纵坐标表示吸光度，从图中可以看出，经过Superdex 30依次洗脱得到S1和S2两个吸收峰。经活性测定，活性最佳吸收峰为S2命名为ABp，上述S2吸收峰洗脱体积为20.2-20.5，对应柱体积为0.6-0.7。

二、姬松茸小肽的结构鉴定。

1、MS二级色谱鉴定.

取上述ABp(姬松茸小肽)，以MS二级色谱鉴定其分子量，其质谱图如图5所示，表示，该ABp分子量为458。

2、肽段序列

取上述ABp(姬松茸小肽)，经数据库对比得到ABp的肽段序列为SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽段RQR。

3、含量测定。

采用HPLC高效液相鉴定其含量，以面积均一化法计算。

检测条件为：流动相：90％乙腈；流速：0.7mL/min；柱温：室温；检测波长：220nm。

液相色谱图如图6所示，经计算，其含量≥98％。

实施例2

活性筛选。

一、方法。

取上述制备姬松茸小肽过程中各成分，具体见下表，按照下述方法测定其活性。

DPPH自由基清除能力的测定：

(1)取姬松茸多肽溶液稀释到适当浓度。

(2)称取7.88mg DPPH，用无水乙醇定容于100mL容量瓶中，摇匀待用。

(3)分别取100μL样品加入到96孔板中，再加入DPPH 100μL，样品组，对照组(Axo)，空白组(Ao)分别做3个平行样，充分摇匀后，用锡纸包好进行避光处理，置于25℃恒温箱中静置30min。于517nm处测得吸光度值(Ax)。DPPH清除率计算公式为：

二、结果。

活性结果如下表所示。

表3.活性筛选结果

以上结果表明，随着提取分离纯化过程的进行，所得到的产物纯度越高，其活性越佳，尤以ABp为最优。

实施例3

姬松茸小肽改善D-gal诱导的衰老小鼠的保护作用及机制研究。

一、方法。

1.实验动物分组及给药

选取6w龄雄性ICR小鼠52只，喂养7d，随机分为4组，每组13只：空白对照组(Con)、模型组(Mod)、姬松茸小肽组(ABp)和阳性药(吡拉西坦(Pir))组。除Con组外，其他组小鼠每日固定时间皮下注射D-gal 300mg/kg，Con组小鼠注射相同剂量的生理盐水，Pir组同时每日灌胃800mg/kg的吡拉西坦，ABp组每日灌胃400mg/kg姬松茸小肽。Con组、Mod组每日灌胃给与等量蒸馏水，持续42d。

2.行为学实验

实验给药第36d进行Morris水迷宫实验，检测小鼠的空间学习记忆能力。获得性记忆训练：将各组小鼠定点放入水池，记录每只小鼠在120s内到达隐形平台的时间(潜伏期)，共训练6d，前2d为练习。第7d进行撤去平台以120s内小鼠分别在中心区、中环、目标象限的游泳穿梭次数表示小鼠学习记忆的能力。

3.生化指标检测

末次给药24h后，眼球取血，4℃离心(10000r/min)分离血清，检测血清中总抗氧化能力(T-AOC)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，活性氧(ROS)，指标，具体操作流程按照试剂盒说明书进行。

4.姬松茸小肽改善NIH/3T3衰老细胞的作用及机制研究

4.1 D-gal浓度的筛选及分组给药

D-Gal浓度为50、100、200、300、500mM五个不同浓度备用。设置正常对照组和D-gal组，将浓度为1.07×10⁴个/mL的细胞悬液加入到96孔板中进行MTT实验。损伤组吸光度值与正常对照组的比值即为细胞活力值。

实验分组：空白对照组(Con)、模型组(Mod)、D-gal+5μM ABp组(ABp-L)、D-gal+10μM ABp组(ABp-M)、D-gal+20μM ABp组(ABp-H)。每组给药培养24h，结束后每孔各加20μL MTT(5mg/mL)，4h后将上清液吸出，加入150μL二甲基亚砜，摇匀，37℃放置10min，酶标仪490nm处测定吸光度值。细胞活力计算为其余各组的吸光度值与正常对照组的比值。

4.2生化指标检测

按照4.1药物处理结束后，吸取培养基上清，参照试剂盒说明书测定测定细胞上清液中SOD、MDA、CAT、ROS、T-AOC及IL-1β、IL-6及TNF-α活性。

4.3 β-半乳糖苷酶染色

将NIH/3T3细胞浓度调整为2×10⁵接种于6孔板中，37℃培养箱中培养过夜；参照试剂盒说明书测定测定，次日置光学显微镜下观察变为深蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞并拍照。

4.4 Western Blot

NIH/3T3细胞加入适量体积的RIPA裂解液进行裂解和蛋白抽提，利用Bradford法测定其浓度。将蛋白采用12％浓度SDS胶进行的分离，随后进行转膜处理；转膜结束后，根据目的条带大小剪膜，用5％脱脂奶粉封闭目的条带1h、孵育Nrf2、HO-1、Keap1、NF-κBp65、TLR4(1：500)稀释一抗过夜。第二天于37℃恒温静置孵育lgG二抗(1:2000稀释)1h，经TBS-T溶液清洗3次，孵发光液显色，洗片机曝光目的条带蛋白，扫描仪扫描胶片并保存图片。

二、统计学方法。

采用SPSS 19.0统计软件处理各组数据，其结果用均数±标准差(x±s)表示，选用t检验判断结果的显著性，P＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果。

1.小鼠Morris水迷宫结果

在Morris水迷宫测试中评估记忆功能中见下表。

表4.Morris水迷宫实验上台潜伏期(

n＝13)

注：Con:空白组；Mod：模型组；Pir:阳性药组；ABp:姬松茸小肽组。

^*p＜0.05，^**p＜0.01vs.模型组；^#p＜0.05，^##p＜0.01vs.空白组

从上述结果中可以看出，与Con组比较，Mod组显示在第4～5d期间到达平台的潜伏期明显增加(p＜0.05)。然而，在ABp处理的小鼠的中观察到潜伏时间与Mod组相比显著降低(p＜0.05)。

第7d的空间探索实验结果如下表所示。

表5.Morris水迷宫实验空间探索(

n＝13)

注：Con:空白组；Mod：模型组；Pir:阳性药组；ABp:姬松茸小肽组

^*p＜0.05，^**p＜0.01vs.模型组；^#p＜0.05，^##p＜0.01vs.空白组

从上述实验中可以看出，在第7d的空间探索实验中，Mod组找到平台所用的时间增加(p＜0.05)，穿越中心环和中环的次数减少。而ABp组的小鼠与Mod组的相比，其潜伏期更短在中心环和中环逗留的时间增加，穿越次数增加(p＜0.05)。

2.生化指标检测

生化指标检测结果如下表所示。

表6.生化指标检测(

n＝10)

Con:空白组；Mod：模型组；Pir:阳性药组；ABp:姬松茸小肽组

^*p＜0.05，^**p＜0.01vs.模型组；^#p＜0.05，^##p＜0.01vs.空白组

从上述结果中可以看出，与Con组比较，Mod组小鼠血清中MDA含量(P＜0.05)，ROS含量升高(P＜0.01)，而CAT和T-AOC含量降低(P＜0.01)。与Mod组比较，ABp组小鼠血清中MDA、ROS含量降低(P＜0.05或P＜0.01)，CAT和T-AOC活性明显升高(P＜0.01)。

3.姬松茸小肽对NIH/3T3衰老细胞的改善作用研究结果

3.1 D-gal损伤NIH/3T3细胞存活率测定结果。

结果如下表所示。

表7 D-gal损伤NIH/3T3细胞存活率测定结果

从上述结果中可见D-Gal浓度为300mM、损伤时间为24h时，细胞活力为66.21％，损伤程度适宜，确定为此下一步实验的损伤条件。

3.2 β-半乳糖苷酶活性检测结果

衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence-associated-β-galactose,SA-β-gal)活性检测结果如图7所示，图中染为深蓝色的细胞为SA-β-gal阳性表达的衰老细胞。光学显微镜下观察可见，与Con组相比，D-gal处理组的衰老细胞明显增多，衰老细胞体积较大且形态不规则，而ABp处理组与Mod组相比，SA-β-gal染色阳性的细胞数量则明显减少，衰老细胞数量极少，并呈剂量依赖性。结果提示ABp可延缓D-gal所诱发的细胞老化。

3.3 Western-blot检测Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达影响

应用Western blot方法从蛋白水平观察各组Keap1、Nrf2、HO-1的表达情况。结果如图8所示，其中A表示Western blot胶图，B表示Keap1蛋白表达量对比示意，C表示Nrf2蛋白表达量对比示意，D表示HO-1蛋白表达量对比示意。

从结果中可以看出，与Con组比较，Mod组细胞中Keap1表达量升高(P＜0.05)，Nrf2和HO-1蛋白表达量下降(P＜0.05)。与Mod组比较，ABp各组中Keap1表达量显著下降(P＜0.05)Nrf2和HO-1蛋白表达量上升(P＜0.05)，ABp-L、ABp-M和ABp-H组间呈剂量依赖性。

综上所述，本发明的姬松茸小肽，优化了姬松茸小肽的提取工艺,获得的ABp肽段序列为RQR(≥98％)；由动物实验中可证明本姬松茸小肽可提高Morris水迷宫中小鼠的学习记忆能力，与模型组相比具有显著性差异，并且检测小鼠血清中生化指标显示姬松茸小肽可显著改善小鼠体内氧化应激水平，CAT，T-AOC值明显提高，ROS，MDA含量下降，即该姬松茸小肽能够改善动物记忆障碍、提高学习能力，有明显抗衰老作用；在细胞实验中可证明姬松茸小肽可对D-gal诱导的NIH/3T3衰老细胞有名显的保护作用，减少细胞损伤，保持细胞原有形态减少衰老，具体机制可能通过通过调控Nrf2/ARE信号通路减轻氧化反应以产生抗衰老作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北华大学

<120> 姬松茸小肽及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Gln Arg

1

Claims

1.一种姬松茸小肽，其特征在于，所述姬松茸小肽为如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽段。

2.根据权利要求1所述的姬松茸小肽，其特征在于，所述SEQ ID No.1所示氨基酸序列肽段的含量以HPLC高效液相色谱的峰面积归一化法计不低于98％。

3.权利要求1或2所述的姬松茸小肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取：取姬松茸子实体，按照姬松茸子实体：蒸馏水为3g:4-6mL的料液比加入蒸馏水后冰上匀浆，在4000-6000r/min条件下离心2-20min取上清，在质量百分浓度为75-85％的硫酸铵条件下，0-4℃下将上清液中的可溶性蛋白质沉淀8-14h；

透析：取上述沉淀，加入去离子水溶解，使用30kDa截留分子量的透析膜，在0-4℃下透析12-36h，得透析蛋白；

酶解：按照透析蛋白：水为1g：15-25mL的料液比加入水，以盐酸调节pH为2-3，按照2500-3500u/g透析蛋白的量加入胰蛋白酶，酶解3-5h，得到粗多肽级分；

纯化：将所述粗多肽级分，上样至DEAE-32离子交换色谱柱，并以0.2M/L的氯化钠溶液洗脱1个柱体积，洗脱液的流速为0.5mL/min，检测波长为220nm，收集0.1-0.6柱体积的洗脱峰，即为DE2组份；

取所述DE2组份，上样至CM-52离子交换色谱柱，并以0.2M/L的氯化钠溶液洗脱1个柱体积，洗脱液的流速为0.5mL/min，检测波长为220nm，收集0.2-0.6柱体积的洗脱峰，即为CM1组份；

取所述CM1组份，上样至Sephadex G25色谱柱，使用去离子水洗脱1个柱体积，洗脱液的流速为1mL/min，检测波长为220nm，得到单峰成分，即得G25组分；

取所述G25组份，上样至Superdex 30色谱柱，使用去离子水洗脱1个柱体积，洗脱液的流速为1mL/min，检测波长为220nm，收集0.6-0.7柱体积的洗脱峰S2，即得所述姬松茸小肽。

4.权利要求1或2所述的姬松茸小肽在用于制备改善记忆障碍、提高学习能力和/或抗衰老的药物中的应用。