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CN110996905A - 至少包含人胰岛素a21g和餐时作用胰高血糖素抑制剂的可注射水溶液形式的组合物 - Google Patents

至少包含人胰岛素a21g和餐时作用胰高血糖素抑制剂的可注射水溶液形式的组合物 Download PDF

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CN110996905A CN201880050233.9A CN201880050233A CN110996905A CN 110996905 A CN110996905 A CN 110996905A CN 201880050233 A CN201880050233 A CN 201880050233A CN 110996905 A CN110996905 A CN 110996905A
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Abstract

本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.4，并且至少包含人胰岛素A21G和至少一种餐时作用胰高血糖素抑制剂。在一个实施方案中，所述餐时作用胰高血糖素抑制剂选自胰淀素类似物、或胰淀素受体激动剂、或GLP‑1类似物、或GLP‑1受体激动剂(GLP‑1 RA)。在一个实施方案中，所述餐时作用胰高血糖素抑制剂是胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂。在一个实施方案中，该餐时作用胰高血糖素抑制剂肽是普兰林肽。本发明还涉及用于获得人胰岛素A21G的方法，其至少包括以下步骤：使人胰岛素A21G、B31R、B32R(甘精胰岛素)与大鼠羧肽酶B以500至2000的胰岛素/羧肽酶比值在7.5至8.5的pH和20至30℃的温度下反应10至20小时。

Description

至少包含人胰岛素A21G和餐时作用胰高血糖素抑制剂的可注 射水溶液形式的组合物
本发明涉及通过注射至少包含具有餐时作用的人胰岛素A21G和特别是具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂的组合物来治疗糖尿病并允许改善对餐后高血糖之控制的治疗。
1型糖尿病是一种自身免疫疾病，其导致胰腺β细胞的破坏。已知这些细胞产生胰岛素，其主要作用是调节外周组织中葡萄糖的使用(Gerich 1993Control of glycaemia)。因此，1型糖尿病患者患有慢性高血糖症，并且必须自施用外源胰岛素以限制这种高血糖症。胰岛素治疗已极大地改变了这些患者的期望寿命。
迄今为止，1型糖尿病患者使用两种类型的胰岛素：短效餐时胰岛素用于在进餐时控制血糖，以及长效基础胰岛素用于在整个白天和黑夜控制血糖。存在数种类型的短效胰岛素，其特征在于其起效。例如，与所谓的速效胰岛素类似物(例如赖脯胰岛素(
Figure BDA0002379402770000011
ELI LILLY)或门冬胰岛素(
Figure BDA0002379402770000012
NOVO NORDISK))相比，被称为常规胰岛素的人胰岛素具有延迟的作用。因此，人胰岛素必须在餐前平均30分钟施用，而胰岛素类似物可在餐前15分钟或进餐时施用。此外，胰岛素类似物被认为比人胰岛素能更好地控制餐后血糖，这解释了为什么当今欧洲和美国的绝大多数患者使用作用比人胰岛素短的速效胰岛素类似物。
然而，即使在速效胰岛素类似物的情况下，在进餐后通过这些外源餐时胰岛素确保对血糖控制也不是最佳的。这部分地与以下事实有关：与健康人相比，这些患者在进餐后会产生胰高血糖素，其导致除去了储存在肝脏中的一些葡萄糖。这种由胰高血糖素介导的葡萄糖产生使这些患者的餐后高血糖问题恶化，并导致胰岛素的过度使用。
这种调节餐后血糖的问题与用胰岛素治疗的2型糖尿病患者相当类似，在这种情况下，其疾病已导致其产生胰岛素和胰淀素之能力的非常显著的损失。
已经示出，胰高血糖素抑制剂(特别是肽和/或激素)能够抑制进餐后胰高血糖素的产生，这导致对餐后血糖控制的显著改善。例如，胰淀素在调节餐后血糖中发挥关键作用，胰淀素是由胰岛β细胞产生的一种激素，其在1型糖尿病患者中的产生也缺乏。胰淀素也被称为“胰岛淀粉样蛋白多肽”或IAPP，是与胰岛素共同储存和共同分泌的37个氨基酸的肽(Schmitz 2004Amylin Agonists)。该肽被描述为胰腺α细胞产生胰高血糖素的阻断剂。因此，胰岛素和胰淀素具有互补和协同作用，因为胰岛素使得能够降低血液中的葡萄糖浓度，而胰淀素使得能够通过抑制内源胰高血糖素的产生或分泌来降低内源葡萄糖进入到血液中。
然而，人胰淀素具有在溶解性和稳定性方面与制药学要求不相容的性质(Goldsbury CS，Cooper GJ，Goldie KN，Muller SA，Saafi EL，Gruijters WT，Misur MP，Engel A，Aebi U，Kistler J：Polymorphic fibrillar assembly of human amylin.JStruct Biol 119：17-27，1997)。已知胰淀素形成淀粉样蛋白纤维，导致形成水不溶性斑块。因此，有必要开发类似物来解决这些溶解性问题。
Amylin公司已经开发了胰淀素的类似物普兰林肽(pramlintide)，以补偿人胰淀素的物理稳定性的缺乏。该产品以名称
Figure BDA0002379402770000021
上市销售，于2005年由FDA批准作为胰岛素治疗的补充用于治疗1型和2型糖尿病。考虑到其相对短的数小时的半衰期，其必须通过皮下途径每天三次在进餐前的那个小时中施用，以改善对餐后血糖的控制。该肽在pH 4.0下配制，并且已被描述为当溶液的pH高于5.5时发生原纤化。在专利US5,686,411中描述了该类似物的变体。
被称为“餐时”或“短效”的胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂再现了胰淀素的作用，同时具有更长的半衰期。这些能够在进餐时控制血糖的胰淀素衍生物的半衰期小于8小时。该半衰期是在人中皮下注射之后的表观消除半衰期。这些胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂的半衰期可小于5小时，特别是小于4小时，且甚至小于3小时。
然而，包含胰淀素或胰淀素类似物(且特别是普兰林肽)的组合物可在患者中引起某些不良作用。特别地，这些组合物可在患者中引起恶心。
在抑制进餐后胰高血糖素分泌方面，另一种生理肽GLP-1也被描述为发挥与胰淀素类似的作用。还已知GLP-1作为胰岛素促分泌素的作用，并且其因此在用作胰岛素的补充时(特别是在2型糖尿病患者中)特别有效。这些作用是葡萄糖依赖性的，这使低血糖的风险最小化。迄今为止，GLP-1 RA仅被批准用于2型糖尿病患者。
同样，由于其极短的半衰期，人GLP-1不能用作治疗性治疗。多种GLP-1衍生物、GLP-1受体激动剂(称为GLP-1 RA)或GLP-1类似物再现了GLP-1的作用，同时具有更长的半衰期。这些GLP-1衍生物可根据其各自的半衰期分为三组：具有短效或餐时那些，其用于在进餐时控制血糖(半衰期小于8小时)；具有一天作用的那些，其覆盖一天过程中的需求(半衰期超过8小时或10小时)；以及具有一周作用的那些，其覆盖一周期间的需求(半衰期超过48小时)。对于具有餐时作用的GLP-1 RA，迄今为止批准的两种肽是艾塞那肽(
Figure BDA0002379402770000031
ASTRA-ZENECA，每天施用两次)和利司那肽(
Figure BDA0002379402770000032
SANOFI，每天施用一次)。与普兰林肽一样，这两种GLP-1 RA在接近4的pH下配制，并且必须在进餐前的那个小时中施用。
对于胰岛素依赖性患者，使用这些不同的短效胰高血糖素抑制剂化合物的主要困难之一与额外的注射次数有关，除了胰岛素的2至4次注射之外，其可以是每天1至3次注射。因此，重要的是能够在溶液中将餐时胰岛素与具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂组合，以使得能够使用这些与胰岛素互补的化合物而不会使患者的治疗复杂化。另外，其有可更精细地模仿生理作用，因为这两种激素都响应进餐而分泌，以改善对餐后血糖的控制，特别是对餐后高血糖的更好控制，并因此更好地治疗糖尿病。
但是餐时胰岛素和这些目的肽在水溶液中不相容。实际上，餐时胰岛素在接近7的pH下具有最佳的化学稳定性，而胰淀素或GLP-1的衍生物在接近生理pH的pH下是物理和化学不稳定的。
该困难已导致设计了包含用于保持餐时胰岛素与胰淀素衍生物分开的两个贮存器的泵。ROCHE公司的美国专利US2016/001002描述了这样的泵，以使得能够使用单个医疗器械共施用胰淀素和餐时胰岛素。然而，为了使用更简单和/或故障风险降低的现有医疗器械，能够在水溶液中混合这些激素将是优选的。
针对在水溶液中混合这些激素这个问题的另一解决方案在于用有机溶剂代替水。XERIS公司的专利申请WO2013067022描述了包含在有机溶剂的溶液中的胰淀素和胰岛素的组合物。然而，在治疗例如糖尿病的慢性疾病中，使用有机溶剂(例如DMSO)对患者提出了安全性问题。此外，有机溶剂对于注射装置可以是有问题的，特别是因为它们溶解所述注射装置的某些组件中的一些。因此，期望开发水溶液形式的这些组合。
还通过制备固体混合物绕过了水溶液中的稳定性问题。来自NOVONORDISK的专利申请EP2060268描述了用于经鼻施用的雾化粉末形式的胰岛素和普兰林肽的制剂。然而，迄今为止优选和最常用的施用途径是皮下途径，这需要获得即用水溶液。
另一种方法在于在该胰淀素衍生物在物理上稳定的pH下将餐时胰岛素与胰淀素衍生物组合。Biodel公司的专利申请US20090192075描述了一种pH 4.0的包含人胰岛素、普兰林肽和锌螯合剂的液体组合物。该申请描述了由于锌螯合剂的存在而引起的人胰岛素的快速作用。然而，已知人胰岛素在酸性pH下是化学不稳定的，该技术不能满足EP和/或US药典的标准。
一种替代方法在于修饰餐时胰岛素的结构以改善其在酸性pH下的稳定性。申请WO2007104786举例说明了包含在酸性pH下可溶的速效胰岛素类似物A21G、B28D、desB30和A21G、B28E、desB30的组合物。
申请WO2007104786还提出了中性pH的在表面活性剂(并且特别是甘油磷酸衍生物，更特别是二豆蔻酰磷脂酰甘油(dimyristoyl glycérophosphoglycérol)(DMPG))的存在下的速效胰岛素组合物，特别是B28D(门冬胰岛素)，这导致通过ThT测量的稳定性比酸性pH下的速效胰岛素类似物A21G、B28D、desB30和A21G、B28E、desB30大得多。
包含组合的餐时胰岛素和普兰林肽的现有技术组合物大多数时间描述了不同类型的餐时胰岛素；然而，其实例涉及包含所谓的速效餐时胰岛素类似物的组合物，后者被认为比人胰岛素更有效。
出乎意料地，申请人已经示出了在水溶液中包含pH为3.5至4.4的与具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂组合的人胰岛素A21G的组合物使得能够获得比所谓的速效餐时胰岛素类似物更好的对餐后血糖的控制，所述人胰岛素A21G被称为“常规”，也就是说，该胰岛素与人胰岛素的区别仅在于将A链上第21位的天冬酰胺残基替换为甘氨酸残基，其不如所谓的“速效”胰岛素类似物快速。
此外，申请人出乎意料地证明，所述在水溶液中包含pH为3.5至4.4的与具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂组合的人胰岛素A21G的组合物表现出与药用要求相容并且大于现有技术中提出的溶液的物理和化学稳定性。
与现有技术中描述的那些相比，表现出对餐后高血糖的更好控制和改善的物理和化学稳定性质的可注射水溶液形式的组合物的获得是非凡的，因为本领域技术人员公知的是，在组合的情况下，很难预测组合产品的药动学以及物理和化学稳定性特性。
此外，还寻求使得能够降低和甚至消除可由活性物质产生的全部或一些不良作用的组合物。
本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.4，至少包含所谓的常规人胰岛素A21G和至少一种具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂。
根据一个实施方案，具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂是胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂、GLP-1类似物或GLP-1受体激动剂(也称为GLP-1RA)。
申请人已经观察到，根据本发明的pH为3.5至4.4的制剂具有与在进餐时使用相容的药动学性质，并且使得能够更好地控制餐后血糖。
此外，申请人已经表明这些制剂导致普兰林肽的吸收减慢。与单独施用普兰林肽相比，这特别是以显著延迟的普兰林肽血浆峰值(tmax)和/或显著降低的早期血浆普兰林肽暴露(AUC0-30min)为特征。
这种减慢使得能够降低和甚至消除普兰林肽的不良作用，特别是在恶心方面。
本发明还涉及pH为3.5至4.4的至少包含人胰岛素A21G和特别是具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂的可注射水溶液形式的组合物用于改善餐后血糖控制的用途。
本发明还涉及旨在用于糖尿病治疗方法中的根据本发明的组合物，其特征在于其在餐前推注施用。
本发明还涉及旨在用于糖尿病治疗方法中的根据本发明的组合物，其特征在于其被施用以改善对餐后血糖的控制。
本发明还涉及旨在用于糖尿病治疗方法中的根据本发明的组合物，其特征在于其被施用以改善对餐后血糖的控制并降低普兰林肽的不良作用。
本发明还涉及旨在用于糖尿病治疗方法中的根据本发明的组合物，其特征在于其使得能够降低由胰岛素诱导的摄食。
根据一个实施方案，摄食的降低涉及从注射到注射之后4小时的时间段。
根据一个实施方案，摄食的降低涉及从注射到注射之后3小时的时间段。
根据一个实施方案，摄食的降低涉及从注射到注射之后2小时的时间段。
根据一个实施方案，摄食的降低涉及从注射到注射之后1小时的时间段。
本发明还涉及包含这样的组合物的稳定的药物组合物。
能够获得用于糖尿病治疗的可注射药物制剂的要求特别地是：
-在30℃(多次使用)下至少2周或甚至1个月并且在5℃下至少1年或甚至2年是物理和化学稳定的水性液体制剂，
-与抗微生物防腐剂的相容性。
同样，pH为3.5至4.4的人胰岛素A21G与GLP-1类似物或GLP-1受体激动剂(也称为GLP-1 RA，例如艾塞那肽或利司那肽)的制剂具有物理和化学稳定性，使得能够开发在30℃下稳定至少2周或甚至1个月并且在5℃下稳定至少1年或甚至2年的液体制剂。
关于稳定性，用于测量蛋白质或肽的稳定性的常规方法在于借助于硫磺素T(Thioflavine T，也称为ThT)测量原纤维的形成。该方法使得能够在能够加速该现象的温度和搅拌条件下通过测量荧光的提高来测量原纤维形成之前的滞后时间。根据本发明的组合物在形成原纤维之前的滞后时间明显大于文献中所述的那些。根据本发明的组合物表现出物理和化学稳定性，其比通过使用商业餐时胰岛素的现有技术中描述的那些大得多。
在一个实施方案中，根据本发明的制剂表现出通过ThT测量的等于至少8小时的滞后时间。
在一个实施方案中，根据本发明的制剂表现出通过ThT测量的等于至少10小时的滞后时间。
在一个实施方案中，根据本发明的制剂表现出通过ThT测量的等于至少15小时的滞后时间。
在一个实施方案中，根据本发明的制剂表现出通过ThT测量的等于至少20小时的滞后时间。
在一个实施方案中，根据本发明的制剂表现出通过ThT测量的等于至少25小时的滞后时间。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.4，至少包含人胰岛素A21G和胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物。根据一个实施方案，所述胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物是普兰林肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.2，至少包含人胰岛素A21G和胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物。根据一个实施方案，所述胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物是普兰林肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.8至4.2，至少包含人胰岛素A21G和胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物。根据一个实施方案，所述胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物是普兰林肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为4.0，至少包含人胰岛素A21G和胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物。根据一个实施方案，所述胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物是普兰林肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.4，至少包含人胰岛素A21G和GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物。根据一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是艾塞那肽。根据另一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是利司那肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.2，至少包含人胰岛素A21G和GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物。根据一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是艾塞那肽。根据另一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是利司那肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.8至4.2，至少包含人胰岛素A21G和GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物。根据一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是艾塞那肽。根据另一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是利司那肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为4.0，至少包含人胰岛素A21G和GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物。根据一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是艾塞那肽。根据另一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是利司那肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.4，至少包含人胰岛素A21G、胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物、以及GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物。根据一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是艾塞那肽。根据另一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是利司那肽。根据另一个实施方案，所述胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物是普兰林肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.2，至少包含人胰岛素A21G、至少一种胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物、以及至少一种GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物。根据一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是艾塞那肽。根据另一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是利司那肽。根据另一个实施方案，所述胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物是普兰林肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.8至4.2，至少包含人胰岛素A21G、至少一种胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物、以及至少一种GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物。根据一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是艾塞那肽。根据另一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是利司那肽。根据另一个实施方案，所述胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物是普兰林肽。
在一个实施方案中，本发明涉及可注射水溶液形式的组合物，其pH为4.0，至少包含人胰岛素A21G、至少一种胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物、以及至少一种GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物。根据一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是艾塞那肽。根据另一个实施方案，所述GLP-1受体激动剂是利司那肽。根据另一个实施方案，所述胰淀素受体激动剂或胰淀素类似物是普兰林肽。
特别有利的是在水溶液中将人胰岛素A21G与胰淀素类似物、胰淀素受体激动剂或GLP-1以及GLP-1类似物或GLP-1受体激动剂组合，因为这种所谓的“三重”组合特别地使得能够增强每种激素的作用并降低其每种的剂量。
根据本发明的可注射水溶液形式的组合物是澄清溶液。“澄清溶液”应理解为是指满足美国药典和欧洲药典中关于可注射溶液描述的标准的组合物。在美国药典中，溶液在<1151>部分中进行了定义，是指注射剂(<1>)(参照根据USP 35的<788>，并且在根据USP 35的<788>中规定，以及在根据USP 38的<787>、<788>和<790>USP 38(自2014年8月1日起)中规定)。在欧洲药典中，可注射溶液必须符合2.9.19和2.9.20节中给出的标准。
在本申请中，如上所述，胰淀素是指专利US 5，124,314和US 5,234,906中描述的化合物。当使用术语“类似物”时，其是指其中一级序列的一个或更多个组成氨基酸残基已被其他氨基酸残基替换和/或其中一个或更多个组成氨基酸残基已被消除和/或其中已添加一个或更多个组成氨基酸残基的肽或蛋白质。本类似物定义所接受的同源性百分比为50％。在胰淀素的情况下，类似物可例如通过替换一个或更多个天然或非天然或拟肽氨基酸而来自于胰淀素的一级氨基酸序列。
分别在申请US2004/0023871和WO0104156中描述的艾塞那肽和利司那肽通常被认为是GLP-1受体激动剂。在一个实施方案中，具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂是由ASTRAZENECA AB公司上市销售的普兰林肽
Figure BDA0002379402770000091
在一实施方案中，GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1 RA被称为“短效”或“餐时”。“短效”或“餐时”应理解为意指在人中皮下注射之后表观消除半衰期小于8小时、特别是小于5小时、优选小于4小时、或者小于3小时的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1 RA，例如艾塞那肽或利司那肽。
在一个实施方案中，GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1 RA选自艾塞那肽(
Figure BDA0002379402770000092
ASTRA-ZENECA)、利司那肽(
Figure BDA0002379402770000093
SANOFI)、其类似物或衍生物及其可药用盐。
在一个实施方案中，GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1 RA是艾塞那肽或
Figure BDA0002379402770000094
其类似物或衍生物及其可药用盐。
在一个实施方案中，GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1 RA是利司那肽或
Figure BDA0002379402770000095
其类似物或衍生物及其可药用盐。
在一个实施方案中，人胰岛素A21G的浓度为240至3000μM或40至500U/mL。
在一个实施方案中，人胰岛素A21G的浓度为600μM或100U/mL。
在一个实施方案中，人胰岛素A21G的浓度为1200μM或200U/mL。
在一个实施方案中，人胰岛素A21G的浓度为1800μM或300U/mL。
在一个实施方案中，人胰岛素A21G的浓度为2400μM或400U/mL。
在一个实施方案中，人胰岛素A21G的浓度为3000μM或500U/mL。
在本申请中，100U/mL的人胰岛素A21G对应于3.5mg/mL。
在一个实施方案中，普兰林肽的浓度为0.32至5mg/mL。
在一个实施方案中，普兰林肽的浓度为0.4至3mg/mL。
在一个实施方案中，普兰林肽的浓度为0.5至2mg/mL。
在一个实施方案中，普兰林肽的浓度为0.5至1.5mg/mL。
在一个实施方案中，普兰林肽的浓度为0.6至1mg/mL。
在一个实施方案中，普兰林肽的浓度为1.0mg/mL。
在一个实施方案中，普兰林肽的浓度为0.6mg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为10至1000μg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为10至500μg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为20至400μg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为20至300μg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为30至300μg/mL。在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为30至150μg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为40至150μg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为40至80μg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽的浓度为50μg/mL。
在一个实施方案中，利司那肽的浓度为20至1000μg/mL。
在一个实施方案中，利司那肽的浓度为20至800μg/mL。
在一个实施方案中，利司那肽的浓度为40至600μg/mL。
在一个实施方案中，利司那肽的浓度为60至600μg/mL。
在一个实施方案中，利司那肽的浓度为60至300μg/mL。
在一个实施方案中，利司那肽的浓度为80至300μg/mL。
在一个实施方案中，利司那肽的浓度为80至160μg/mL。
在一个实施方案中，利司那肽的浓度为100μg/mL。
在一个实施方案中，艾塞那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.01至1.0mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，艾塞那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.01至0.5mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，艾塞那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.02至0.4mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，艾塞那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.03至0.3mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，艾塞那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.03至0.2mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，艾塞那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.03至0.15mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，艾塞那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.05mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，利司那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.01至1mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，利司那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.01至0.5mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，利司那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.02至0.4mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，利司那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.03至0.3mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，利司那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.04至0.2mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，利司那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.04至0.15mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，利司那肽、其类似物或衍生物及其可药用盐的浓度为0.1mg/100U胰岛素。
在一个实施方案中，通过将胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂的溶液与GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1受体激动剂RA的溶液以10/90至90/10的体积比混合来制备根据本发明的组合物。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含0至800uM/100U胰岛素浓度的锌盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含0至500μM/100U胰岛素浓度的锌盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含100至500μM/100U胰岛素浓度的锌盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含200至400μM/100U胰岛素浓度的锌盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含300μM/100U胰岛素浓度的锌盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含缓冲剂。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含选自乙酸钠缓冲剂和Tris的缓冲剂。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含防腐剂。
在一个实施方案中，所述防腐剂选自单独的或混合物中的间甲酚和苯酚。
在一个实施方案中，防腐剂的浓度为10至50mM。
在一个实施方案中，防腐剂的浓度为10至40mM。
在一个实施方案中，本发明的组合物还包含表面活性剂。
在一个实施方案中，表面活性剂选自泊洛沙姆188、
Figure BDA0002379402770000121
20(也称为聚山梨酯20)和
Figure BDA0002379402770000122
80(也称为聚山梨酯80)。
在一个实施方案中，
Figure BDA0002379402770000123
20的浓度为5至50μg/mL。
在一个实施方案中，
Figure BDA0002379402770000124
20的浓度为5至25μg/mL。
在一个实施方案中，
Figure BDA0002379402770000125
20的浓度为10μM。
此外，根据本发明的组合物可包含添加剂，例如张度剂(agents detonicité)。
在一个实施方案中，张度剂选自甘油、氯化钠、甘露醇和甘氨酸。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含抗氧化剂。
在一个实施方案中，抗氧化剂是甲硫氨酸。
在一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种吸收促进剂，其选自单独的或混合物中的吸收促进剂、扩散促进剂或血管扩张剂。
吸收促进剂包括但不限于单独的或混合物中的：表面活性剂，例如胆盐、脂肪酸盐或磷脂；烟碱试剂(agents nicotiniques)，例如烟酰胺(nicotinamides)、烟酸(acidesnicotiniques)、烟酸(niacine)、烟酰胺(niacinamide)、维生素B3及其盐；胰腺胰蛋白酶抑制剂；镁盐；多不饱和脂肪酸；磷脂酰胆碱二癸酰基；氨基聚羧酸盐；托美汀(tolmétine)；癸酸钠；水杨酸；油酸；亚油酸；二十碳五烯酸(EPA)；二十二碳六烯酸(DHA)；苯甲酸；一氧化氮供体，例如3-(2-羟基-1-(1-甲基乙基)-2-亚硝基肼基)-1-丙胺、N-乙基-2-(1-乙基羟基-2-1-亚硝基肼基)乙胺、或S-亚硝基-N-乙酰青霉胺；胆汁酸，与胆汁酸缀合形式的甘氨酸；抗坏血酸钠、抗坏血酸钾；水杨酸钠、水杨酸钾、乙酰水杨酸、水杨酰水杨酸、乙酰水杨酸铝、水杨酸胆碱、水杨酰胺、赖氨酸乙酰水杨酸；依沙酰胺；二氟尼柳；乙水杨胺；EDTA。
在一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种扩散促进剂。扩散促进剂的实例包括但不限于糖胺聚糖酶，例如透明质酸酶。
在一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种血管扩张剂。
在一个实施方案中，药物组合物还包括至少一种通过阻断钙离子通道而诱导超极化的血管扩张剂。
在一个实施方案中，通过阻断钙离子通道而诱导超极化的血管扩张剂是腺苷、来源于内皮的超极化剂、5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂、钾通道开放剂或这些药剂的任何组合。
在一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种通过AMPc介导的血管扩张剂。
在一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种通过GMPc介导的血管扩张剂。
在一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种血管扩张剂，其选自包含以下的组：通过阻断钙离子通道诱导超极化而发挥作用的血管扩张剂、通过AMPc介导的血管扩张剂、以及通过GMPc介导的血管扩张剂。
所述至少一种血管扩张剂选自包含单独的或混合中的以下的组：一氧化氮供体，例如硝化甘油、二硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯、硝酸戊酯、赤藓醇四硝酸酯和硝普盐(nitroprussiate)；前列环素及其类似物，例如依前列醇钠、伊洛前列素、依前列醇、曲前列环素或赛乐西帕；组胺、2-甲基组胺、4-甲基组胺；2-(2-吡啶基)乙胺、2-(2-噻唑基)乙胺；罂粟碱、盐酸罂粟碱；米诺地尔；双嘧达莫、肼屈嗪；腺苷、腺苷三磷酸；尿苷三磷酸；GPLC；L-肉碱；精氨酸；前列腺素D2；钾盐；以及在一些情况下，α1和α2受体拮抗剂，例如哌唑嗪、酚苄明、苯妥拉明、双苄胺、盐酸莫西赛利和妥拉唑林；倍他唑、达美酮(dimaprit)；β2受体激动剂，例如异丙肾上腺素、多巴酚丁胺、沙丁胺醇、特布他林、氨茶碱、茶碱、咖啡因；前列地尔、安贝生坦；卡麦角林；二氮嗪；甲磺酸双肼屈嗪；盐酸地尔硫
Figure BDA0002379402770000141
依洛昔酮；盐酸氟桂利嗪；银杏叶提取物(extrait de Ginkgo biloba)；左西孟旦；吗多明；草酸萘呋胺(oxalateacide de naftidrofuryl)；尼可地尔；己酮可可碱；苯盐酸酚苄明；吡贝地尔碱；甲磺酸吡贝地尔；瑞加德松一水合物；利奥西呱(riociguat)；枸橼酸西地那非、他达拉非、三水合盐酸伐地那非；盐酸曲美他嗪；三硝酸甘油酯(trinitrin)；盐酸维拉帕米；内皮素受体拮抗剂，例如阿伐那非(avanafil)和波生坦一水合物(bosentran monohydrae)；以及钙通道抑制剂，例如氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、伊拉地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的3.5mg/mL至10.5mg/mL的人胰岛素A21G、0.6mg/mL至3mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含300至900μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8至10μM，最特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的3.5mg/mL的人胰岛素A21G、0.6至1mg/mL的普兰林肽、25至30mM的间甲酚、150至200mM的甘油。该组合物还可包含300μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8至10μM，最特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的3.5mg/mL的人胰岛素A21G、0.6mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含300μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是10μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的3.5mg/mL的人胰岛素A21G、0.6mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含300μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的3.5mg/mL的人胰岛素A21G、1.0mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含300μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的7.0mg/mL的人胰岛素A21G、1.2至2.0mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、150至200mM的甘油。该组合物还可包含600μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8至10μM，最特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的7.0mg/mL的人胰岛素A21G、1.2mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含600μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是10μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的7.0mg/mL的人胰岛素A21G、1.2mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含600μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的7.0mg/mL的人胰岛素A21G、2.0mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含600μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的10.5mg/mL的人胰岛素A21G、1.8至3mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、150至200mM的甘油。该组合物还可包含900μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8至10μM，最特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的10.5mg/mL的人胰岛素A21G、1.8mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含900μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是10μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的10.5mg/mL的人胰岛素A21G、1.8mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含900μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8μM。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含pH为4.0的10.5mg/mL的人胰岛素A21G、3mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚、184mM的甘油。该组合物还可包含900μM的锌。该组合物还可包含聚山梨酯20，特别是8μM。
本发明的组合物还可包含符合药典(特别是EP和/或US药典)并且与以通常浓度使用的胰岛素相容的所有赋形剂。
根据一个实施方案，组合物可以是固体或冻干形式。然后可以将该组合物用于重构溶液或制剂。
考虑的施用方法是静脉内、皮下、皮内或肌内途径。
根据一个特别的实施方案，施用方法是皮下途径。
还考虑了经皮、经口、经鼻、经阴道、经眼、口含、经肺的施用途径。
本发明还涉及包含根据本发明的组合物的可植入或可运输泵。
本发明还涉及旨在放置在可植入或可运输泵中的根据本发明的组合物的用途。
本发明还涉及单剂量制剂。
在一个实施方案中，所述制剂为可注射溶液的形式。
根据本发明的组合物的制备具有以下优点：其可通过在水溶液中或以冻干形式简单混合胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂和人胰岛素A21G的水溶液来实现。
如果必要的话，在赋形剂(例如甘油、间甲酚、氯化锌和聚山梨酯20
Figure BDA0002379402770000161
20))方面调整混合物的组成。该添加可通过添加所述赋形剂的浓溶液来进行。
在一个实施方案中，所述组合物的特征在于，所述组合物在pH 4.0下的溶解度和通过ThT测量的物理稳定性大于包含胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂和市售餐时胰岛素的参考组合物。
根据一些实施例中描述的方案测量ThT。
在一个实施方案中，所述组合物的特征在于，所述组合物在pH 4.0下的溶解度和通过ThT测量的物理稳定性大于包含GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1受体激动剂和市售餐时胰岛素的参考组合物。
胰岛素和胰岛素类似物可通过重组DNA技术方法使用细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))来获得(参见，例如，G.Walsh Appl.Microbiol.Biotechnol.2005，67，151-159)。通常来说，产生胰岛素原，然后将其用酶(例如胰蛋白酶和羧肽酶B)消化以获得期望的序列。
为了产生人胰岛素A21G，对胰岛素原进行编码，使得甘氨酸位于A21，并且在用胰蛋白酶和羧肽酶B消化后，获得期望的胰岛素。Kohn等人在Peptides 2007，28，935-948中描述了操作程序。
本发明还涉及用于获得人胰岛素A21G的方法，其包括至少一个步骤，该步骤在于使人胰岛素A21G、B31R、B32R(甘精胰岛素)与大鼠羧肽酶B以500至2000的胰岛素/羧肽酶比值在7.5至8.5的pH和20至30℃的温度下反应10至20小时。然后可纯化产物。该纯化可以通过液相色谱进行。
因此，可通过用羧肽酶B消化从甘精胰岛素中去除两个精氨酸来获得人胰岛素A21G。酶消化后，通过色谱法纯化人胰岛素A21G，并随后通过冻干或通过常规方法结晶来分离。
附图说明：
图1：原纤化滞后时间的图示确定。
图1是基于虚拟实例的原纤化滞后时间的图示确定的表示。在横坐标上，时间以分钟为单位出现，并且在纵坐标上，荧光ThT以任意单位(unitéarbitraire，a.u.)出现，并且LT代表滞后时间。
图2：施用制剂A21-8后血浆中普兰林肽和胰岛素的浓度(平均值±标准偏差)
正方形代表胰岛素的浓度，并且三角形代表普兰林肽的浓度。
在横坐标上，注射之后时间以分钟为单位出现；在左侧的纵坐标上，经基线校正的胰岛素浓度以pmol/L为单位出现，并且在纵坐标上，经基线校正的普兰林肽浓度以pmol/L为单位出现。
图3：施用制剂A21-8后的血糖(平均值±标准偏差)。
在横坐标上，注射之后的时间以分钟为单位出现；并且在纵坐标上，血糖以基线水平的％出现。
图4：施用制剂A21-9(用正方形绘制的曲线)和PRAM(用三角形绘制的曲线)后普兰林肽的浓度(平均值±标准偏差)。
在横坐标上，注射之后的时间以分钟为单位出现；并且在纵坐标上，经基线校正的普兰林肽浓度以pmol/L为单位出现(分别减去给药前浓度)。
实施例
实施例1.人胰岛素A21G的制备
将5g的甘精胰岛素(Gan&Lee Pharmaceuticals)与酶羧肽酶B(参考08039852001；Sigma-Aldrich)在pH 8.0(通过添加Tris缓冲剂调节pH)下混合，并将混合物在25℃下静置17小时，甘精胰岛素浓度为约4mg/mL。酶/甘精胰岛素比例为1/500。然后将混合物通过液相色谱纯化，针对0.01N盐酸透析，并随后冻干。所得物是人胰岛素A21G，纯度为98％，且产率为约90％。通过质谱法(Maldi-Tof)测得的胰岛素分子量为5752Da。人胰岛素A21G也可使用如Kohn等人描述的重组技术获得(Peptides 2007，28，935-948)。
实施例2.酸性pH下的餐时胰岛素和普兰林肽、艾塞那肽或利司那肽的组合物。
3.5或4.0的酸性pH下的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和氯化锌(300μM)的人胰岛素A21G 100U/mL(3.5mg/mL)和普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至人胰岛素A21G的浓溶液(pH 3.5下的300U/mL)。将普兰林肽(Ambiopharm)的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)和氯化锌的浓溶液添加至该人胰岛素A21G和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH(即3.5或4.0)调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
4.0的酸性pH下的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和氯化锌(300μM)的人胰岛素A21G 100U/mL和普兰林肽0.6mg/mL的溶液的制备。
以与上述溶液相同的方式制备该溶液。
4.0的酸性pH下的含有间甲酚(25mM)和甘油(184mM)的人胰岛素A21G 100U/mL和普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至人胰岛素A21G的浓溶液(pH 3.5下的800U/mL)。将普兰林肽的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)添加至该人胰岛素和赋形剂浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH(即4.0)调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
pH 4的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和Tween 20(10μg/mL)的人胰岛素A21G100U/mL和普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至人胰岛素A21G的浓溶液(pH 3.5下的300U/mL)。将普兰林的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)和Tween 20的浓溶液添加至该人胰岛素A21G和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
pH 4的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)、氯化锌(300μM)和Tween 20(10μg/mL)的人胰岛素A21G 100U/mL和普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至人胰岛素A21G的浓溶液(pH 3.5下的300U/mL)。将普兰林肽的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)、氯化锌的浓溶液和Tween 20的浓溶液添加至该人胰岛素A21G和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
酸性pH下的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和氯化锌(300μM)的人胰岛素A21G100U/mL和艾塞那肽50μg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至人胰岛素A21G的浓溶液(pH 3.5下的300U/mL)。将艾塞那肽(Bachem)的浓溶液(pH 4下的10.5mg/mL)和氯化锌的浓溶液添加至该人胰岛素A21G和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终的pH 4.0调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
酸性pH下的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和氯化锌(300μM)的人胰岛素A21G100U/mL和利司那肽100μg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至人胰岛素A21G的浓溶液(pH 3.5下的230U/mL)。将利司那肽(Ambiopharm)(pH 4下的10.5mg/mL)的浓溶液和氯化锌的浓溶液添加至该人胰岛素A21G和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终的pH 4.0调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
4.0的酸性pH下的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和Tween 20(10μg/mL)的人胰岛素A21G 100U/mL、艾塞那肽50μg/mL和普兰林肽0.6mg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至人胰岛素A21G的浓溶液(pH 3.5下的300U/mL)。将普兰林肽(Ambiopharm)的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)、艾塞那肽(Bachem)的浓溶液(pH 4下的10.5mg/mL)和Tween 20的浓溶液添加至该人胰岛素A21G和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终的pH 4.0调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行022μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
3.5或4.0的酸性pH下的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和氯化锌(300μM)的人胰岛素100U/mL和普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至人胰岛素(AmphastarPharmaceuticals)的浓溶液(pH 3.5下的800U/mL)。将普兰林肽的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)和氯化锌的浓溶液添加至该人胰岛素和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH(即3.5或4.0)调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
3.5或4.0的酸性pH下的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和氯化锌(300μM)的门冬胰岛素100U/mL和普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至门冬胰岛素(HEC Pharmaceuticals)的浓溶液(pH 3下的500U/mL)。将普兰林肽的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)和氯化锌的浓溶液添加至该门冬胰岛素和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH(即3.5或4.0)调节至期望值。pH调节后，调节至pH 4.0的溶液是混浊的。调节至pH 3.5的溶液是澄清的。对其进行0.22μm过滤并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
3.5或4.0的酸性pH下的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)和氯化锌(300μM)的赖脯胰岛素100U/mL和普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
将赋形剂(间甲酚、甘油)的浓溶液添加至赖脯胰岛素(Gan&LeePharmaceuticals)的浓溶液(pH 3下的650U/mL)。将普兰林肽的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)和氯化锌的浓溶液添加至该赖脯胰岛素和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH(即3.5或4.0)调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤，并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。
3.0、3.5或4.0的酸性pH下的含有商业产品
Figure BDA0002379402770000211
的赋形剂(29mM的甲酚、50mM的Tris、86mM的氯化锌和8.15μM的Tween 20)的谷赖胰岛素100U/mL和普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
通过添加HCl水溶液将商业谷赖胰岛素
Figure BDA0002379402770000212
的溶液的pH调节至pH 2.5。将该溶液添加至粉末形式的普兰林肽以获得包含100U/mL胰岛素和1mg/mL普兰林肽的溶液。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH调节至期望值。调节pH后，调节至pH 3.5和4.0的溶液是混浊的。调节至pH 3.0的溶液是澄清的。对其进行0.22μm过滤并储存在玻璃筒中(每个筒1mL溶液)。储存数小时后，溶液是浑浊且不均匀的。
pH 4.0的含有间甲酚(20mM)、甘露醇(236mM)和乙酸/乙酸钠缓冲液(30mM)的普兰林肽1mg/mL的溶液的制备。
通过溶解购自Ambiopharm的粉末形式的普兰林肽制备10mg/mL的普兰林肽浓溶液。将该溶液添加至赋形剂(间甲酚、甘露醇、乙酸/乙酸钠缓冲液)的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH/HCl将最终pH调节至4.0±0.2。
pH 4的含有间甲酚(25mM)、甘油(184mM)、乙酸/乙酸钠缓冲液(18mM)和Tween 20(8μM)的人胰岛素A21G 100U/mL和普兰林肽0.6mg/mL的溶液的制备。
将甘油和间甲酚的浓溶液添加至人胰岛素A21G在pH 4的乙酸/乙酸钠缓冲液中的浓溶液(pH4下的300U/mL)中。最后将普兰林肽(Ambiopharm)的浓溶液(pH 4下的10mg/mL)和Tween 20的浓溶液添加至该人胰岛素A21G和赋形剂的浓溶液，以获得预期的最终组合物。通过添加NaOH或HCl的水溶液将最终pH调节至期望值。所获得的溶液是澄清且均匀的；对其进行0.22μm过滤。
下表1中列出了以上制备的组合物：
表1：胰岛素和/或胰高血糖素抑制剂的组合物
Figure BDA0002379402770000221
Figure BDA0002379402770000231
Figure BDA0002379402770000241
实施例3.酸性pH下餐时胰岛素与普兰林肽的相容性的研究。
酸性pH下胰岛素和普兰林肽的溶液的目视外观。
在储存在筒中的溶液稳定2至3小时后，在环境温度下进行观察。表2给出了上述胰岛素和普兰林肽溶液的目视外观。
表2.胰岛素和普兰林肽的溶液的目视外观。
组合物 目视外观
A21-1 澄清
A21-2 澄清
A21-3 澄清
RHI-1 澄清
RHI-2 澄清
ASP-1 浑浊
ASP-2 澄清
GLU-1 浑浊
GLU-2 浑浊
GLU-3 浑浊
LIS-1 澄清
LIS-2 澄清
在所评价的胰岛素中，仅人胰岛素、赖脯胰岛素和人胰岛素A21G使得能够在pH 4下与普兰林肽获得均匀且澄清的制剂，表明了物质的溶解性。门冬胰岛素和谷赖胰岛素不适合在pH 4.0下与普兰林肽获得澄清制剂。
实施例4.原纤化滞后时间的研究。
原理
肽的差的稳定性可导致淀粉样蛋白原纤维的形成，所述淀粉样蛋白原纤维被定义为有序的大分子结构。这些原纤维可导致样品内凝胶形成。
监测硫磺素T(ThT)的荧光的测试用于分析制剂的物理稳定性。硫磺素T是一种小的探针分子，当其与淀粉样蛋白原纤维结合时具有特征性的荧光特征(Naiki et al.(1989)Anal.BioChem.177，244-249；LeVine(1999)Methods.Enzymol.309，274-284)。
该方法使得能够在未稀释制剂中在低ThT浓度下监测原纤维的形成。该监测在加速稳定性条件下进行：在搅拌下和在37℃下。
实验条件
在临开始测量之前制备样品。在相关实施例中描述了每种组合物的制备。将硫磺素T添加至来自浓储备溶液的组合物，以使组合物的稀释可以忽略不计。组合物中的硫磺素T浓度为40μM。将150μL体积的组合物引入到96孔板的孔中。在同一板中一式三份地分析每种组合物。将板用透明膜密封以防止组合物蒸发。
然后将该板置于板读取器(EnVision 2104Multilabel，Perkin Elmer)的外壳中。将温度设置为37℃，并且进行960rpm、1mM振幅的横向搅拌。
用442nm的激发波长和482nm的发射波长来进行每个孔中的荧光强度相对于时间的读取。
原纤化过程通过在被称为滞后时间的延迟之后荧光的强烈提高而表现出来。
对于每个孔，该延迟以图示方式确定为荧光信号的基线与荧光对时间曲线的斜坡之间的交点，其在荧光的初始强烈提高期间确定如图1所示。所绘制的滞后时间值对应于3个孔的滞后时间的平均值。
然后在ThT的存在下，对前述实施例的pH 3.5和4.0的普兰林肽和胰岛素的澄清溶液进行原纤化测试。
表3中报道的滞后时间对应于3次测量的平均值；不确定区间对应于这3个结果之间的标准偏差。
表3.胰岛素和普兰林肽的溶液的滞后时间。
组合物 滞后时间(h)
A21-1 13.7+/-0.8
A21-2 10.4+/-1.8
A21-3 15.6+/-5.3
RHI-1 5.0+/-0.7
RHI-2 1.7+/-0
ASP-2 2.0+/-0
LIS-1 1.8+/-0.1
LIS-2 4.3+/-0.4
出乎意料的是，含有人胰岛素A21G的制剂的原纤化滞后时间比在pH 3.5或在pH4.0下测试的市售胰岛素的原纤化滞后时间长得多，特别是长于速效胰岛素类似物赖脯胰岛素和门冬胰岛素。
实施例5.在Tween 20的存在下的原纤化滞后时间的研究
在表4中，给出了在Tween 20的存在下pH 4的人胰岛素A21G和普兰林肽的溶液的滞后时间。
表4.在Tween 20的存在下人胰岛素A21G和普兰林肽的溶液的滞后时间。
组合物 滞后时间(h)
A21-4 38.1+/-8.8
A21-5 48.3+/-9.2
因此在10μg/mL的Tween 20的存在下改善了物理稳定性。
实施例6.制剂在静态条件下在30℃下的物理稳定性
将装有1mL组合物的玻璃筒放入保持在30℃的烘箱中。目视检查这些筒，以检测可见颗粒或浑浊的出现。该检查是根据欧洲药典(EP 2.9.20)的推荐进行的：使筒要经受至少2000lux的光照，并在白色背景和黑色背景下进行观察。这些结果与美国药典(USP<790>)一致。
表5.在静态条件下在30℃下胰岛素和普兰林肽溶液的物理稳定性。
组合物 4周后的目视外观
A21-4 澄清
A21-5 澄清
A21-2 澄清
A21-1 澄清
A21-3 澄清
ASP-2 浑浊
pH 3.5的与普兰林肽配制的门冬胰岛素的稳定性低于pH 3.5或4.0的与普兰林肽配制的人胰岛素A21G的稳定性。
实施例7.人胰岛素A21G与艾塞那肽和利司那肽的物理稳定性的研究。
将制剂A21-6和A21-7放入筒中，并随后在30℃下保持4周。测量了临时配制的制剂的原纤化滞后时间，并在表6中列出。
表6：人胰岛素A21G与艾塞那肽或利司那肽的溶液在静态条件下在30℃下的滞后时间和物理稳定性。
组合物 滞后时间(h) 30℃下4周后的目视外观
A21-6 18.1+/-5.6 澄清
A21-7 33.0+/-9.7 澄清
实施例8.人胰岛素A21G和普兰林肽的制剂的化学稳定性
所有制剂为pH 4.0或pH 3.5，并包含100U/mL的人胰岛素A21G、1mg/mL的普兰林肽、25mM的间甲酚和184mM的甘油。将制剂储存在玻璃筒中，并在静态条件下保持在30℃下。通过反相液相色谱(HPLC)测定人胰岛素A21G和普兰林肽。测量结果示于表7中。
表7：胰岛素的浓度(a)(U/mL)和普兰林肽的浓度(b)(mg/mL)的变化
Figure BDA0002379402770000281
含有人胰岛素A21G和普兰林肽的制剂在30℃下4周后表现出良好的化学稳定性。具有商业胰岛素的普兰林肽制剂在pH 4.0时迅速降解，且在pH 3.5时甚至会更迅速降解。
实施例9.狗中的药动学和药效学研究
由人胰岛素A21G(100U/mL，即3.5mg/mL)和普兰林肽(0.6mg/mL)组成的组合物在狗中的药动学和药效学研究。所测试的制剂为pH 4.0，并且包含25mM的间甲酚和184mM的甘油(制剂A21-8)。
已经禁食约18小时的四只动物以0.2U/kg胰岛素和0.12μg/kg普兰林肽的剂量在颈部接受通过皮下施用的注射。在注射之前一小时，抽取一个或更多个血液样品，以确定葡萄糖、胰岛素和普兰林肽的基础水平。然后在施用制剂后的5小时期间抽取血液样品。通过血糖仪测定血糖。通过ELISA测试确定血浆中胰岛素和普兰林肽的水平。
基于血浆中经基线校正的胰岛素和普兰林肽的浓度评估制剂A21-8的药动学参数。借助软件Phoenix WinNonlin(版本7，Certara)进行标准的非房室分析。参数值(平均值±标准偏差)记录在下表8和9中：
表8：总胰岛素类似物的PK参数
Figure BDA0002379402770000291
表9：普兰林肽的PK参数
Figure BDA0002379402770000292
图2中显示了血浆中总胰岛素(正方形)和普兰林肽(三角形)的平均药动学(PK)谱。
图3中显示了以基线水平的百分比表示的平均血糖谱。
观察到普兰林肽和人胰岛素A21G二者具有餐时吸收动力学，从而引起早期的降血糖活性，然后在施用之后5小时后恢复至接近基线血糖的水平。这些药动学和药效学结果清楚地表明制剂A21-8与进餐时的使用相容。
实施例10：普兰林肽在猪中的药动学研究
由人胰岛素A21G(3.5mg/mL，相当于100U/mL胰岛素)和普兰林肽(0.6mg/mL)组成组合物在猪中的药动学研究。
在实验开始之前，将称重为约50kg的在颈静脉中预先插入导管的家猪禁食2.5小时。在注射胰岛素之前的那个小时期间，抽取3个血液样品以确定葡萄糖和胰岛素的基线水平。
借助于装配有31G针的胰岛素笔(Novo，Sanofi或Eli Lilly)，在动物的胁部皮下进行0.2U/kg胰岛素和1.2μg/kg普兰林肽的剂量的与普兰林肽组合的人胰岛素A21G的制剂(A21-9)或普兰林肽(PRAM)的注射。
为了确定血浆中普兰林肽的浓度，在以下时间抽取血液样品：4、8、12、16、20、30、40、50、60、70、80、100、120、150和180分钟。每次抽取之后，用稀肝素溶液冲洗导管。
人胰岛素A21G和普兰林肽的溶液A21-9以及普兰林肽溶液PRAM在猪中的药动学结果
汇集在同一群猪上进行的3个研究的结果，以比较制剂A21-9与制剂PRAM之间普兰林肽的药动学。基于血浆中经基线校正的普兰林肽浓度评估制剂A21-9和PRAM的药动学参数。借助软件Phoenix WinNonlin(版本7，Certara)进行标准的非房室分析。下表中列出了参数值(平均值±标准偏差)。
表10：组合物A21-9和PRAM的普兰林肽的PK参数
Figure BDA0002379402770000301
其中，tmax＝＝观察到最大血浆浓度所必需的时间；AUC0-30min＝0至注射之后30分钟血浆浓度对时间曲线下面积；AUC0-t＝0至注射之后最后可量化浓度之间的血浆浓度对时间曲线下面积
用制剂A21-9和PRAM获得的普兰林肽的药动学结果示于图4中。对这些谱和参数的分析表明，与单独普兰林肽(制剂PRAM，用三角形绘制的曲线)相比，人胰岛素A21G和普兰林肽的组合(制剂A21-9，以正方形绘制的曲线)导致普兰林肽的吸收显著减慢。与制剂PRAM相比，制剂A21-9导致血浆峰(tmax)显著延迟(约18min，p＜0.05)和普兰林肽的早期血浆暴露(AUC0-30min)显著降低(约43％，p＜0.05)。另一方面，两种制剂之间的普兰林肽的总血浆暴露(AUC0-t)看来类似，表明生物利用度相当。
实施例11.在注射对照组合物之后和在注射包含人胰岛素A21G和/或普兰林肽的组合物之后大鼠中摄食的研究
该研究在40只至少6周龄的雄性Sprague Dawley大鼠的群上进行。
除了在皮下注射下表中所描述的组合物之前的6小时禁食期外，大鼠自由获取食物和水。
表11.大鼠中注射的组合物和治疗的大鼠数
Figure BDA0002379402770000311
对照组合物是盐溶液，即含有150mM NaCl的水溶液。
组合物
Figure BDA0002379402770000312
R是由ELI LILLY上市销售的人胰岛素的市售溶液。该产品是100U/mL的人胰岛素。
Figure BDA0002379402770000313
R的赋形剂是甘油、间甲酚、用于pH调节(pH 7.0-7.8)的氢氧化钠和盐酸和水。
在临注射之前t0时，分配食物(每只大鼠约100g)。摄食(累计平均值)在t0之后的1、2和3小时，或t+1h、t+2h和t+3h进行测量。
结果显示在下表中：
表12：注射之后1、2和3小时的摄食
组合物 对照 Humulin PRAM A21-9
t+1h的摄食(g) 3.8 4.7 1.5 3.2
t+2h的摄食(g) 4.4 5.3 3.3 4.4
t+3h的摄食(g) 5.9 6.9 4.2 5.3
这些结果表明，组合了胰岛素A21G和普兰林肽的组合物A21-9使得能够不仅降低了由注射胰岛素引起的摄食，而且将摄食限制在小于或等于接受对照组合物(盐水溶液)的注射的对照组的水平。

Claims (21)

1.可注射水溶液形式的组合物，其pH为3.5至4.4，至少包含被称为常规的人胰岛素A21G和至少一种具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂选自胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂或者GLP-1类似物或GLP-1受体激动剂(GLP-1 RA)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于所述具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂是胰淀素类似物或胰淀素受体激动剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂肽是普兰林肽。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂肽是艾塞那肽。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂肽是利司那肽。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于人胰岛素A21G的浓度为2至20mg/mL。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于人胰岛素A21G的浓度为3.5mg/mL。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于具有餐时作用的胰高血糖素抑制剂肽的浓度为0.01至10mg/mL。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于所述溶液的pH为3.8至4.2。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于所述溶液的pH为4.0。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于其还包含锌盐。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于其还包含间甲酚。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于其还包含聚山梨酯赋形剂
Figure FDA0002379402760000011
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于其还包含泊洛沙姆188赋形剂。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于其还包含甲硫氨酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其旨在用于糖尿病治疗方法，所述组合物的特征在于其在餐前推注施用。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其旨在用于糖尿病治疗方法，所述组合物的特征在于其被施用以改善对餐后血糖的控制。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其旨在用于糖尿病治疗方法，所述组合物的特征在于其被施用以改善对餐后血糖的控制并降低普兰林肽的不良作用。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其旨在用于糖尿病治疗方法，所述组合物的特征在于其使得能够降低由胰岛素诱导的摄食。
21.用于获得人胰岛素A21G的方法，其包括至少一个由以下组成的步骤：使人胰岛素A21G、B31R、B32R(甘精胰岛素)与大鼠羧肽酶B以500至2000的胰岛素/羧肽酶比值在7.5至8.5的pH和20至30℃的温度下反应10至20小时。
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