CN110974814A - 双硫仑在细菌感染疾病中的潜在应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了双硫仑或其可接受的盐在制备细菌感染性疾病药物或制备抗生素增效剂中的应用。本发明还公开了两种组合物，所述组合物包括双硫仑或其可接受的盐和抗生素美罗培南；或双硫仑或其可接受的盐和多粘菌素。本发明阐明了双硫仑可以有效增强美罗培南和多粘菌素对多重耐药细菌的体内外抗菌活性，为临床感染性疾病的治疗提供了新的解决方案。

Description

双硫仑在细菌感染疾病中的潜在应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，涉及双硫仑的新用途，具体涉及双硫仑在细菌感染疾病中的潜在应用，具体涉及双硫仑和抗生素在体内外的协同抗菌作用。

背景技术

近年来，多重耐药细菌的产生、传播和快速扩散给人类健康和畜禽养殖带来了巨大的威胁。单独使用一种抗生素去治疗细菌感染性疾病已很难取得较好的疗效。因此，迫切需要新型的抗菌策略如抗生素与抗生素增效剂的联合使用去应对日益严重的细菌耐药性。

双硫仑是最早只是橡胶工业的一种催化剂。1948年发现双硫仑被人体吸收后会引起头痛、出汗和心悸等不良症状，且饮酒后症状明显加重，这种表现被命名为“双硫仑样反应”。进一步研究发现双硫仑在与乙醇联用时可抑制肝脏中的乙醛脱氢酶，使乙醇在体内氧化为乙醛后，不能再继续分解氧化，导致体内乙醛蓄积而产生一系列反应。基于此，双硫仑在临床中作为一种戒酒药物被广泛使用。此外，2007年，双硫仑被发现是一种潜在的抗白内障药物。2012年，发现双硫仑可以和化疗药物联合使用杀死胶质瘤细胞。尽管如此，双硫仑在细菌感染性疾病的应用还未见相关报道，特别是在革兰氏阴性细菌感染性疾病治疗中的应用更未见报道。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术存在的问题，本发明通过从已批准上市且非抗菌用途的化合物中筛选抗生素的增效剂，发现已批准作为戒酒药物的双硫仑是碳青霉烯类抗生素和多粘菌素的新型抗生素增效剂，可以有效恢复这两类抗生素对耐药细菌的体内外抗菌活性。

特别地，本发明的双硫仑可以作为碳青霉烯类抗生素如美罗培南和多粘菌素的潜在增效剂，进而增强这两类抗生素的体内外抗菌活性。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了双硫仑或其可接受的盐在制备细菌感染性疾病药物或制备抗生素增效剂中的应用。

作为优选地，所述的细菌为革兰氏阴性细菌，特别是大肠杆菌。

其中，所述细菌感染性疾病药物或抗生素增效剂为单组分或复方制剂。

本发明内容还包括一种组合物，所述组合物包括双硫仑或其可接受的盐和抗生素。

其中，所述抗生素包括但不仅限于美罗培南和多粘菌素，其他碳青霉烯类抗生素，例如亚胺培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南和多尼培南也在本发明的保护范围之内。

其中，所述组合物包括双硫仑和多粘菌素、双硫仑和美罗培南。

其中，所述双硫仑或其可接受的盐和多粘菌素的质量比为0.97～4000:1。

其中，所述双硫仑或其可接受的盐和美罗培南的质量比为0.24～1000:1。

其中，所述双硫仑或其可接受的盐中的双硫仑浓度为15.63～1000μg/mL。

其中，所述多粘菌素的浓度为0.25-16μg/mL；美罗培南的浓度为1-64μg/mL

本发明内容还包括所述的组合物在制备细菌感染性疾病的药物或抗生素增效剂中的应用。

其中，所述细菌感染性疾病的药物或抗生素增效剂的剂型为片剂、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型、冻干粉针剂型中的一种。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

1)本发明首次发现双硫仑可以用于细菌感染性疾病中的治疗，特别是革兰氏阴性细菌感染性疾病中的治疗，属于双硫仑的新用途。

2)本发明阐明了双硫仑可以恢复耐药细菌对美罗培南和多粘菌素的敏感性，并系统评价了两者联合使用在体内外的有效性，有助于开发出一类新型的抗生素增效剂，缓解危害日趋严重的细菌耐药性问题。

附图说明

图1为双硫仑与不同抗生素对多重耐药大肠杆菌的协同抗菌作用；

图2为多粘菌素或美罗培南和双硫仑联合使用的时间杀菌曲线；Colistin，多粘菌素 (2μg/mL)；Meropenem，美罗培南(8μg/mL)；Disulfiram，双硫仑(125μg/mL)；Colistin +Disulfiram，多粘菌素+双硫仑(2+125μg/mL)；Meropenem+Disulfiram，美罗培南+ 双硫仑(8+125μg/mL)；

图3为多粘菌素(10mg/kg)或/和美罗培南(20mg/kg)或/和双硫仑(20mg/kg) 单独和联合使用在治疗BALB/c小鼠耐药细菌感染模型中的有效性。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

MHB肉汤培养基为含牛肉粉6.0g/L、可溶性淀粉1.5g/L和酸水解酪蛋白17.5g/L的水溶液。

PBS缓冲液：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，NaH₂PO₄ 1.44g和KH₂PO₄ 0.24g溶解于800 mL蒸馏水中，用HCl调节pH值至7.2，蒸馏水定容至1L即可。121℃高压灭菌15分钟于室温下保存。

实施例1双硫仑和多粘菌素组合物

组合物1：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物1，其中，双硫仑终浓度为15.63μg/mL、多粘菌素终浓度为16μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为0.97:1；

组合物2，按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物2，其中，双硫仑终浓度为31.25μg/mL、多粘菌素终浓度为8μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为3.90:1；

组合物3：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物3，其中，双硫仑终浓度为62.5 μg/mL、多粘菌素终浓度为8μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为7.81:1；

组合物4：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物4，其中，双硫仑终浓度为62.5 μg/mL、多粘菌素终浓度为4μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为15.625:1；

组合物5：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物5，其中，双硫仑终浓度为125 μg/mL、多粘菌素终浓度为4μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为31.25:1；

组合物6：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物6，其中，双硫仑终浓度为125 μg/mL、多粘菌素终浓度为2μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为62.5:1；

组合物7：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物7，其中，双硫仑终浓度为250 μg/mL、多粘菌素终浓度为2μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为125:1；

组合物8：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物8，其中，双硫仑终浓度为250 μg/mL、多粘菌素终浓度为1μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为250:1；

组合物9，按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物9，其中，双硫仑终浓度为500 μg/mL、多粘菌素终浓度为1μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为500:1；

组合物10，按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物10，其中，双硫仑终浓度为500μg/mL、多粘菌素终浓度为0.5μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为1000:1；

组合物11：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物11，其中，双硫仑终浓度为1000μg/mL、多粘菌素终浓度为0.5μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为2000:1；

组合物12：按照双硫仑与多粘菌素母液配制组合物12，其中，双硫仑终浓度为1000μg/mL、多粘菌素终浓度为0.25μg/mL；双硫仑和多粘菌素浓度比为4000:1。

实施例2双硫仑和美罗培南组合物

组合物1：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物1，其中，双硫仑终浓度为15.63μg/mL、美罗培南终浓度为64μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为0.24:1；

组合物2，按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物2，其中，双硫仑终浓度为31.25μg/mL、美罗培南终浓度为32μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为0.97:1；

组合物3：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物3，其中，双硫仑终浓度为62.5 μg/mL、美罗培南终浓度为32μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为1.95:1；

组合物4：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物4，其中，双硫仑终浓度为62.5 μg/mL、美罗培南终浓度为16μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为3.90:1；

组合物5：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物5，其中，双硫仑终浓度为125 μg/mL、美罗培南终浓度为16μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为7.81:1；

组合物6：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物6，其中，双硫仑终浓度为125 μg/mL、美罗培南终浓度为8μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为15.625:1；

组合物7：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物7，其中，双硫仑终浓度为250 μg/mL、美罗培南终浓度为8μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为31.25:1；

组合物8：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物8，其中，双硫仑终浓度为250 μg/mL、美罗培南终浓度为4μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为62.5:1；

组合物9，按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物9，其中，双硫仑终浓度为500 μg/mL、美罗培南终浓度为4μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为125:1；

组合物10，按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物10，其中，双硫仑终浓度为500μg/mL、美罗培南终浓度为2μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为250:1；

组合物11：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物11，其中，双硫仑终浓度为1000μg/mL、美罗培南终浓度为2μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为500:1；

组合物12：按照双硫仑与美罗培南母液配制组合物12，其中，双硫仑终浓度为1000μg/mL、美罗培南终浓度为1μg/mL；双硫仑和美罗培南浓度比为1000:1。

实施例3多粘菌素或美罗培南和双硫仑的协同抗菌活性

采用棋盘分析法进一步评价双硫仑和抗生素对耐药细菌的协同抗菌活性，测试菌株为多重耐药的大肠杆菌E.coli B2。菌株来源：Repurposing peptidomimetic aspotential inhibitor of New Delhi Metallo-β-lactamases in Gram-Negativebacteria.ACS Infectious Diseases,2019.DOI:10.1021/acsinfecdis.9b00364.

棋盘分析法具体步骤如下：

1)用MHB肉汤培养基悬浮测试菌株，得到菌浓度为1×10⁶CFU/mL的菌悬液。

2)取双硫仑，用DMSO溶解并用MHB肉汤培养基稀释，得到浓度为8mg/mL的双硫仑溶液。

3)取抗生素，用水溶解并用MHB肉汤培养基稀释，得到浓度为128μg/mL的环丙沙星、256μg/mL的万古霉素溶液、32μg/mL的替加环素、64μg/mL的多西环素、128 μg/mL的美罗培南和32μg/mL的多粘菌素。

4)取96孔板，每孔加入100μL MHB肉汤培养基，最后一行每孔加入100μL步骤 2)制备的双硫仑溶液，自第八行倍比稀释至第二行；第一列每孔加入步骤3)制备的抗生素溶液(每孔100μL)，倍比稀释至第十列，之后每孔加入100μL步骤1)制备的菌悬液，37℃静置培养16h～20h后，测定每个培养孔的OD₆₀₀(600nm的吸光值)，绘制细菌量热图。并计算两者联合使用的分级抑菌浓度(FIC指数)。

分级抑菌浓度FIC指数按照以下公式进行计算：

FIC＝MIC(A联合应用)/MIC(A单用)+MIC(B联合应用)/MIC(B单用)；A为替加环素，B为双硫仑；

FIC指数判读标准：当FIC指数小于0.5时，两种药为协同作用；当FIC指数为0.5～1时，两种药为相加作用；当FIC指数大于l且小于等于2时，两种药为无关作用；当FIC 指数大于2时，两种药为拮抗作用。

试验结果见图1。计算结果表明双硫仑和环丙沙星、万古霉素和替加环素的FIC值都为2.0，为无关作用；双硫仑和多西环素的FIC值为0.75，为相加作用；双硫仑和美罗培南和多粘菌素的FIC值为0.094和0.061，均小于0.5，表明说明双硫仑与美罗培南及多粘菌素具有显著的协同抗菌活性。

实施例4多粘菌素或美罗培南与双硫仑联合使用的时间杀菌曲线

MHA培养基配制：牛肉粉6.0g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，琼脂17.0g，加入900mL蒸馏水，调节pH至7.3，定容至1000mL。121℃高压灭菌15分钟，待冷至50℃时倾入无菌平皿，晾干备用。

分别在大肠杆菌E.coli B2于BHI肉汤中培养5小时后加入等体积的0.01mol/LPBS (pH＝7.2)、多粘菌素、美罗培南、双硫仑、多粘菌素和双硫仑混合液，美罗培南和双硫仑混合液，使得药物终浓度为多粘菌素(2μg/mL)、美罗培南(8μg/mL)、双硫仑(125 μg/mL)和混合浓度(2μg/mL多粘菌素+125μg/mL双硫仑、8μg/mL美罗培南+125 μg/mL双硫仑)。而后，分别于4h、8h、12h和24h取菌液100μL涂布于MHA培养基上，培养过夜后进行菌落计数。

实验结果见图2。结果表明，与多粘菌素、美罗培南和双硫仑单独相比，多粘菌素和双硫仑以及美罗培南和双硫仑的加入显著降低的细菌数目，在24小时后细菌数降低了超过3log₁₀ CFU/mL。

实施例5多粘菌素或美罗培南与双硫仑联合使用的体内有效性

大肠杆菌悬浮液：用PBS缓冲液重悬大肠杆菌(Escherichia coli)B2，得到大肠杆菌悬浮液；在小鼠中，大肠杆菌(Escherichia coli)B2的浓度为1.5×10⁶CFUs/只。

取36只6-8周龄BALB/c雌性小鼠(约20g)，随机分成Control组、多粘菌素治疗组、双硫仑治疗组和协同治疗组(每组6只)。为了避免小鼠自身免疫力对实验的影响，所有小鼠在感染前4天和前1天分别预先分别给予环磷酰胺(150mg/kg和100mg/kg) 造成小鼠中性粒细胞减少及免疫缺陷。

Control组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射大肠杆菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射200μL PBS缓冲液；

多粘菌素治疗组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射大肠杆菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射200μL多粘菌素药液(1mg/mL)；剂量：10mg/kg；

美罗培南治疗组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射大肠杆菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射200μL美罗培南药液(2mg/mL)；剂量：20mg/kg；

双硫仑治疗组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射大肠杆菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射200μL双硫仑药液(2mg/mL)；剂量：20mg/kg；

协同治疗组：小鼠腹腔右侧大腿肌肉注射大肠杆菌悬浮液0.1mL；1小时后小鼠腹腔注射200μL多粘菌素(1mg/mL)或美罗培南(2mg/mL)和双硫仑(2mg/mL)的混合药液。剂量：多粘菌素加双硫仑，10mg/kg+20mg/kg；美罗培南加双硫仑，10mg/kg +20mg/kg。

感染后24小时，所有小鼠进行安乐死后取小鼠右侧大腿肌肉于3mL PBS溶液中，组织破碎仪破碎后，取100μL破碎液涂板进行菌落计数。

实验结果见图3。PBS、多粘菌素、美罗培南和双硫仑单独治疗组中小鼠大腿肌肉的载菌量相当，无显著差异。该结果表明三种药物单独治疗并不能有效控制细菌的感染。而相较于多粘菌素单独组，多粘菌素和双硫仑的联合给药显著降低了细菌的载量(P＝0.0001)；相较于美罗培南单独组，美罗培南和双硫仑的联合给药同样显著降低了细菌的载量(P＝0.0003)。这些结果表明了双硫仑可以有效增强多粘菌素和美罗培南在体内的有效性，为耐药性细菌引起的感染性疾病提供了新的治疗方案。

Claims (10)

1.双硫仑或其可接受的盐在制备细菌感染性疾病药物或制备抗生素增效剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌感染性疾病药物或抗生素增效剂为单组分或复方制剂。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括双硫仑或其可接受的盐和抗生素。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抗生素为多粘菌素或美罗培南中的一种或两种。

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物为双硫仑和多粘菌素；或双硫仑和美罗培南。

6.根据权利要求3~5任一项所述的组合物，其特征在于，所述双硫仑或其可接受的盐和多粘菌素的质量比为 0.97~4000:1；所述双硫仑或其可接受的盐和美罗培南的质量比为0.24~1000:1。

7.根据权利要求3~5任一项所述的组合物，其特征在于，所述双硫仑或其可接受的盐中的双硫仑浓度为 15.63~1000 μg/mL。

8.根据权利要求3~5任一项所述的组合物，其特征在于，所述多粘菌素的浓度为0.25-16 μg/mL，美罗培南的浓度为1-64 μg/mL。

9.权利要求3~8任一项所述的组合物在制备细菌感染性疾病的药物或抗生素增效剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细菌感染性疾病的药物或抗生素增效剂的剂型为片剂、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型、冻干粉针剂型。

Images