CN110903998B - 一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株THCT14A3，分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii，保藏编号为CCTCC NO：M 2019363，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。该菌株的16SrRNA基因序列具体如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了一段可用于鉴定具核梭杆菌文氏亚种的特异性DNA序列及其对应的引物序列。结直肠癌细胞系与THCT14A3共培养的结果显示THCT14A3可显著促进结直肠癌细胞增殖。因此，本发明提供的THCT14A3将有助于结直肠癌肠道的微生态研究。

Description

一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株及其应用

技术领域

本发明涉及具核梭杆菌领域，具体涉及一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株及其在结直肠癌肠道微生态研究中的应用。

背景技术

结直肠癌不仅是世界第三大高发癌症，而且高居全球癌症死因第四位，紧跟在肺癌、肝癌和胃癌之后。结直肠癌发生是遗传和环境双重打击下引起的细胞恶性增殖。肠道微生物和结直肠癌关联的发现推动了研究者们对微生物致癌机制的研究。目前已陆续发现多种与结直肠癌相关联的微生物，包括柠檬酸杆菌、牛链球菌、多杀巴斯德菌、幽门螺杆菌、人乳头瘤病毒、产肠毒素脆弱杆菌、致病性大肠杆菌和具核梭杆菌等。

其中，具核梭杆菌是口腔共生菌中引起口腔外感染的最常见的条件致病菌，具有感染多种真核细胞的强大侵袭能力，与牙龈炎、牙周炎、扁桃体炎、肝脓肿、急性阑尾炎等密切相关。随着研究的深入，越来越多的证据支持具核梭杆菌与结直肠癌的发生发展相关。具核梭杆菌表面的黏附素FadA可结合E钙粘蛋白(E-cadherin)细胞外重复结构域EC5，诱导炎症因子介导的E-cadherin内摄，激活细胞内的β-catenin信号，上调Wnt通路，引起肠上皮细胞癌变。

具核梭杆菌包括四个亚种：具核、多形、文氏和动物亚种。但结直肠癌研究中仅用属于具核亚种的ATCC 25586和ATCC 23726作为研究对象；且二者并非来自肠道，而是分别为分离自口腔(ATCC 25586)和阴道(ATCC 23726)。肠道菌群组成多样，肠道中具核梭杆菌的亚种组成尚不明确，单一标准株难以具有足够代表性，而分离自肿瘤微环境中的不同亚种分离株尚不多见。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株及其在结直肠癌肠道微生态研究中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株，命名为THCT14A3，该菌株的16SrRNA基因序列具体如下所示：

>16S_rRNA_gene THCT14A3

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGACAGAATGCTTAACACATGCAAGTCAACTTGAATTTGGGTTTTTAACTTAGGTTTGGGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTCACAGCTAGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCTAATATTATGATAATAGGGCATCCTATAATTATGAAAGCTATAAGCGCTGTGAGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTAGTTGGAGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGCCACAAGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCAAGAGTCTGATCCAGCAATTCTGTGTGCACGATGAAGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTTGGGAAGAAAGAAATGACGGTACCAACAGAAGAAGTGACGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGTCACGAGCGTTATCTGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGTCTAGGTGGTTATGTAAGTCTGATGTGAAAATACAGGGCTCAACTCTGTATTGCGTTGGAAACTGTATAACTAGAGTACTGGAGAGGTAAGCGGAACTACAAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTTGTAGGAATGCCGATGGGGAAGCCAGCTTACTGGACAGATACTGACGCTGAAGCGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATTACTAGGTGTTGGGGGTCGAACCTCAGCGCCCAAGCAAACGCGATAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGTACGCAAGTATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAGGAACCTTACCAGCGTTTGACATCTTAGGAATGAGACAGAGATGTTTCAGTGTCCCTTCGGGGAAACCTAAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTTTCGTATGTTACCATCATTAAGTTGGGGACTCATGCGATACTGCCTACGATGAGTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATACGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGTAGAACAGAGAGTTGCAAAGCTGTGAAGTGGAGCTAATCTCAGAAAACTATTCTTAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGTTGCACCTGAAGTAGCAGGCCTAACCGTAAGGAGGGATGCTCCGAGGGTGTGATTAGCGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTATCCGTACGGGAACGTGCGGATGGATCACCT(SEQID NO:1)。

进一步地，该菌株分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019363，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。

进一步地，该菌株分离自新鲜的乙状结肠隆起型腺癌手术切除标本。

进一步地，该菌株在哥伦比亚培养基上培养7天后，形成相对较大、边缘不规则圆形、扁平状、半透明白色菌落。

进一步地，该菌株经革兰染色后镜下呈红色、梭杆状。

本发明的第二方面是提供该菌株在结直肠癌肠道微生态研究中的应用。

本发明的第三方面是提供用于鉴定具核梭杆菌文氏亚种的特异性DNA序列，包含如SEQ ID NO:2所示的序列及与SEQ ID NO:2中任一段序列具有BLASTn相似性的片段。

>vincentii_specific_region

GGCAAGCACAAGATAGGGCATAATTATTAATTAAACAATTAAAAATAAAATATAAAAAATGGAGGAAAAATGAAAAAAAAATTTTTATTAATGGTTGTTTTAGGAATGTTGATAGTTC(SEQ ID NO:2)。

进一步地，用于检测和鉴定文氏亚种的DNA扩增引物的序列如下：

Vin-F：5’-GGCAAGYACAAGATAGGGCA-3’(SEQ ID NO:3)；

Vin-R：5’-GAACTATCAACATTCCTAAAACAACCA-3’(SEQ ID NO:4)。

进一步地，该对引物可应用于普通PCR和实时定量PCR。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明提供的具核梭杆菌文氏亚种THCT14A3直接来源于结肠肿瘤组织，在模拟肠道实验条件下(如共培养)更具代表性，有助于结直肠癌肠道微生态的研究。此外，本发明在THCT14A3基础上，结合比较基因组学，首次提出具核梭杆菌文氏亚种的分子检测和鉴定方法，提供的特异性DNA序列及对应引物适用于单一菌体样本或含混合菌体的样本。

附图说明

本发明的公开的一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株THCT14A3，其已进行保藏，分类命名为Fusobacterium nucleatumsubsp.vincentii，其保藏编号为CCTCC NO：M2019363，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。

图1为本发明一实施例中HCT116细胞系与THCT14A3共培养后的增殖情况表示图(其中，左图为HCT116细胞生长曲线；右图为共培养72小时增殖情况比较(双尾t检验p<0.01))；

图2为本发明一实施例中LoVo细胞系与THCT14A3共培养后的增殖情况表示图(其中，左图为LoVo细胞生长曲线；右图为共培养72小时增殖情况比较(双尾t检验p<0.01))；

图3为本发明一实施例中使用Vin-F/Vin-R引物在梭杆菌菌株中鉴定具核梭杆菌文氏亚种菌株的琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一

本实施例提供一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株THCT14A3，该菌株的分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019363，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

该菌株的16SrRNA基因序列具体如SEQ ID NO:1所示，其与F.nucleatumsubsp.vincentii菌株ATCC 51190的16S rRNA基因序列(NCBI登录号NR_113040.1)有99.59％一致性，与F.nucleatum subsp.nucleatum菌株ATCC25586的16S rRNA基因序列(NCBI登录号NR_114702.1)有98.58％％一致性。

测定THCT14A3完整基因组，发现THCT14A3基因组包含一条环状染色体，大小为2052554bp，GC含量为27.46％，含有1,898个蛋白编码基因、63个非编码基因(46个tRNA基因、5套5S-16S-23SrRNA基因和2个sRNA基因)。该菌株的全基因组经Jspecies软件分析后，发现相对F.nucleatum subsp.nucleatum菌株ATCC 25586(NCBI基因组登录号：GCA_003019295.1)的全基因组ANIb值为92.13，相对F.nucleatum subsp.vincentii菌株3_1_36A2(NCBI基因组登录号：GCA_000162235.2)的全基因组ANIb值为97.83。ANIb，即averagenucleotide identity using BLAST(基于BLAST的平均核苷酸序列一致性)，是一种评价菌株亲缘性的指标，一般认为≥95即同属一种。说明该菌株属于动物(vincentii)亚种。

实施例二

本实施例在THCT14A3的序列的基础上，结合比较基因组学，提供一段可用于鉴定具核梭杆菌文氏亚种的特异性DNA序列及对应引物序列。具体的方法如下：

在THCT14A3基因组基础上，结合从NCBI下载的具核梭杆菌基因组；按ANIb值进行亚种分类后；通过BLASTn分析在文氏亚种基因组中保守存在的序列；将这些保守序列再与其它亚种基因组进行BlASTn比较，在其中筛选获得在其它亚种基因组中不存在的区域，即文氏亚种特异性DNA序列(如下)。(由于DNA序列存在不可避免的多态性，因无法穷举，此处所指的DNA特征序列包含以下序列及与下列任一段序列具有BLASTn相似性的未列的出片段)

>vincentii_specific_region

GGCAAGCACAAGATAGGGCATAATTATTAATTAAACAATTAAAAATAAAATATAAAAAATGGAGGAAAAATGAAAAAAAAATTTTTATTAATGGTTGTTTTAGGAATGTTGATAGTTC(SEQ ID NO:2)。

在SEQ ID NO:2所示序列的基础上，设计用于检测和鉴定文氏亚种的DNA扩增引物，其序列如下：

Vin-F：5’-GGCAAGYACAAGATAGGGCA-3’(SEQ ID NO:3)；

Vin-R：5’-GAACTATCAACATTCCTAAAACAACCA-3’(SEQ ID NO:4)。

该对引物可应用于普通PCR和实时定量PCR。此外，本实施例提供的特异性DNA序列及对应引物适用于单一菌体样本或含混合菌体的样本。

验证实验一

以下通过结直肠癌细胞系与THCT14E2共培养，验证从结直肠癌肿瘤组织中获取的具核梭杆菌THCT14E2可促进结直肠癌细胞系增殖。

1.THCT14A3与结直肠癌HCT116细胞系共培养，具体的操作步骤如下：

取新鲜制备的HCT116细胞悬液，接种至24孔板(1×10⁵个细胞/孔)。培养12-24小时至细胞贴壁后用PBS洗涤并更换无抗培养基。取新鲜制备的THCT14A3细菌悬浮液(使用PBS悬浮细菌)，与HCT116细胞共培养(1×10⁸CFU/孔)；以等体积PBS作为空白对照，各做3个重复孔。于正常条件下培养，至6小时、24小时、48小时、72小时时用CCK8法检测细胞增殖活性(按说明书给定步骤进行)。其中每24更换新鲜制备的细菌悬浮液。

由图1可知HCT116细胞在72小时的增殖活性显著高于对照组(p<0.01)，说明THCT14A3可显著促进HCT116细胞增殖。

2.THCT14A3与结直肠癌LoVo细胞系共培养，具体的操作步骤如下：

取新鲜制备的LoVo细胞悬液，接种至24孔板(1×10⁵个细胞/孔)。培养12-24小时至细胞贴壁后用PBS洗涤并更换无抗培养基。取新鲜制备的THCT14A3细菌悬浮液(使用PBS悬浮细菌)，与LoVo细胞共培养(1×10⁸CFU/孔)；以等体积PBS作为空白对照。各做3个重复孔。于正常条件下培养，至6小时、24小时、48小时、72小时时用CCK8法检测细胞增殖活性(按说明书给定步骤进行)。其中每24更换新鲜制备的细菌悬浮液。

由图2可知LoVo细胞在72小时的增殖活性显著高于对照组(p<0.01)，说明THCT14A3可显著促进LoVo细胞增殖。

由以上验证实验可知具核梭杆菌文氏亚种菌株THCT14A3可促进结直肠癌细胞的增殖，因此THCT14A3可用于结直肠癌的研究。

验证实验二

本验证实验来验证实施例二中的文氏亚种鉴定引物Vin-F/Vin-R的特异性。

具体操作步骤如下：

制备表1中所列菌株的总DNA，使用Vin-F/Vin-R引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。

表1.实验所用梭杆菌菌株

菌株	菌种
		1Fn2①	F.varium
1Fn2②	F.varium
		4FN2②	F.varium
4FN2④	F.varium
		5CB④	F.nucleatumsubsp.animalis
5CB⑤	F.nucleatumsubsp.animalis
		6CVE②	F.mortiferum
6CB3	F.nucleatumsubsp.animalis
		7Fn2②	F.nucleatumsubsp.polymorphum
7CB②	F.nucleatumsubsp.animalis
		13Fn2①	F.varium
THCT14A3	F.nucleatumsubsp.vincentii
		14CVE③	F.nucleatumsubsp.vincentii
14Fn2②	F.nucleatum
		15Fn2①	F.nucleatumsubsp.polymorphum
18Fn2①	F.periodonticum
		23CVE①	F.varium
23Fn2①	F.varium
		23Fn2③	F.varium
ATCC 26686	F.nucleatumsubsp.nucleatum

由图3可知该对引物只在具核梭杆菌文氏亚种的菌株中在对应位置(118bp)有阳性扩增，在其它梭杆菌菌种中无扩增。说明引物特异性良好，无非特异性扩增。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海市第十人民医院

<120> 一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1507

<212> DNA

<213> 16S_rRNA_gene THCT14A3 [CCTCC M 2019363]

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct gacagaatgc ttaacacatg caagtcaact 60

tgaatttggg tttttaactt aggtttgggt ggcggacggg tgagtaacgc gtaaagaact 120

tgcctcacag ctagggacaa catttggaaa cgaatgctaa tacctaatat tatgataata 180

gggcatccta taattatgaa agctataagc gctgtgagag agctttgcgt cccattagct 240

agttggagag gtaacggctc accaaggcga tgatgggtag ccggcctgag agggtgatcg 300

gccacaaggg gactgagaca cggcccttac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360

gacaatggac caagagtctg atccagcaat tctgtgtgca cgatgaagtt tttcggaatg 420

taaagtgctt tcagttggga agaaagaaat gacggtacca acagaagaag tgacggctaa 480

atacgtgcca gcagccgcgg taatacgtat gtcacgagcg ttatctggat ttattgggcg 540

taaagcgcgt ctaggtggtt atgtaagtct gatgtgaaaa tacagggctc aactctgtat 600

tgcgttggaa actgtataac tagagtactg gagaggtaag cggaactaca agtgtagagg 660

tgaaattcgt agatatttgt aggaatgccg atggggaagc cagcttactg gacagatact 720

gacgctgaag cgcgaaagcg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg attactaggt gttgggggtc gaacctcagc gcccaagcaa acgcgataag 840

taatccgcct ggggagtacg tacgcaagta tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc 900

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga cgcaacgcga ggaaccttac cagcgtttga 960

catcttagga atgagacaga gatgtttcag tgtcccttcg gggaaaccta aagacaggtg 1020

gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccctttcg tatgttacca tcattaagtt ggggactcat gcgatactgc ctacgatgag 1140

taggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatgcccct tatacgctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg ggtagaacag agagttgcaa agctgtgaag tggagctaat ctcagaaaac 1260

tattcttagt tcggattgta ctctgcaact cgagtacatg aagttggaat cgctagtaat 1320

cgcgaatcag caatgtcgcg gtgaatacgt tctcgggtct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt tggttgcacc tgaagtagca ggcctaaccg taaggaggga tgctccgagg 1440

gtgtgattag cgattggggt gaagtcgtaa caaggtatcc gtacgggaac gtgcggatgg 1500

atcacct 1507

<210> 2

<211> 118

<212> DNA

<213> vincentii_specific_region

<400> 2

ggcaagcaca agatagggca taattattaa ttaaacaatt aaaaataaaa tataaaaaat 60

ggaggaaaaa tgaaaaaaaa atttttatta atggttgttt taggaatgtt gatagttc 118

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 检测和鉴定文氏亚种的DNA扩增引物（正向）

<400> 3

ggcaagyaca agatagggca 20

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 检测和鉴定文氏亚种的DNA扩增引物（反向）

<400> 4

gaactatcaa cattcctaaa acaacca 27

Claims (4)

1.一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种（Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii）THCT14A3，其特征在于，所述具核梭杆菌文氏亚种THCT14A3的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述具核梭杆菌文氏亚种THCT14A3的保藏编号为CCTCC NO：M2019363，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

2.一种如权利要求1所述的肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种THCT14A3在结直肠癌微生态研究中的应用。

3.用于鉴定如权利要求1所述的肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种THCT14A3的特异性DNA序列，其特征在于，为如SEQ ID NO:2所示的序列。

4.用于扩增权利要求3所述的特异性DNA序列的引物序列，其特征在于，如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

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