CN110903388B - 一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法，包括以下步骤：1)提供针对特定脑膜炎球菌血清群的抗血清，其中该抗血清中包含针对所述特定脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖的所需抗体和针对其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖的干扰抗体；2)向所述抗血清中加入至少一种所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖；3)当所述抗血清开始由清澈变浑浊时，停止加入所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖，并去除浑浊物。本发明的方法能够有效去除交叉反应，获得特异性的纯化的脑膜炎球菌抗血清，所获得的抗血清质量稳定、基本无交叉反应、效价较高，可用于脑膜炎球菌疫苗的所有免疫学检测。

Description

一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法。

背景技术

流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是由脑膜炎球菌感染引起的一种呼吸道传染病。脑膜炎球菌为革兰阴性细菌，根据其荚膜多糖的化学结构，可将该细菌分为A、B、C、D等13个血清群，其中A、B、C、Y和W135群为主要流行菌群。据统计报道，全世界每年发生流脑病例约50万，其中以儿童为主，对人类健康造成严重威胁。脑膜炎球菌疫苗的接种对于中国预防和控制流脑流行发挥了重要作用，根据制备工艺不同，脑膜炎球菌疫苗包括脑膜炎球菌多糖疫苗(MPV)、脑膜炎球菌多糖结合疫苗(MCV)及联合疫苗。

多糖抗原是脑膜炎球菌疫苗的主要抗原成分，多糖含量测定在疫苗的质量控制中尤为重要，在实际工作中常采用化学或免疫学方法测定疫苗多糖含量。化学法只能检测单价脑膜炎球菌疫苗(如MPV-A)，多价脑膜炎球菌疫苗(如MPV-AC、MPV-ACYW、MCV-AC、MCV-ACYW135、MCV-AC-Hib)群间存在严重交叉干扰，只能借助于高度特异性的免疫学检测手段，如火箭电泳法、速率比浊法等。但这些方法对抗原性的分析完全依赖于血清中的抗体，供试品中存在多种多糖抗原或/和载体蛋白的干扰，要求血清具备高度的特异性；某些长期试验(如稳定性试验、相容性试验)开展时间长达3年或以上，要求血清具备良好的稳定性。因此，需要对现有抗血清纯化技术进行改进，以使得脑膜炎球菌疫苗的多糖含量检测更加简便、高效。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法，包括以下步骤：

1)提供针对特定脑膜炎球菌血清群的抗血清，其中该抗血清中包含针对所述特定脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖的所需抗体和针对其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖的干扰抗体；

2)向所述抗血清中加入至少一种所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖；

3)当所述抗血清开始由清澈变浑浊时，停止加入所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖，并去除浑浊物。

(2)根据(1)所述的方法，其中在步骤2)中，以逐滴的方式加入至少一种所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖

(3)根据(1)所述的方法，其中在步骤2)中，所加入的其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖的浓度为大于或等于5mg/mL。

(4)根据(1)所述的方法，其中重复步骤2)和步骤3)，直至加入至少一种所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖后，抗血清不再变浑浊。

(5)根据(1)所述的方法，其中在步骤3)中，通过离心去除所述浑浊物。

(6)根据(1)所述的方法，其中在步骤2)中，所加入的其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖为精制荚膜多糖。

(7)根据(1)所述的方法，其中所述特定脑膜炎球菌血清群为脑膜炎球菌W135血清群和脑膜炎球菌Y血清群中的一者，所述其他脑膜炎球菌血清群为脑膜炎球菌W135血清群和脑膜炎球菌Y血清群中的另一者。

(8)根据(1)-(7)中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：4)对去除所述浑浊物的脑膜炎球菌抗血清进行除菌过滤。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本法明提出通过加入其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖来将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应，从而得到特异性的脑膜炎球菌抗血清，进而解决脑膜炎球菌疫苗多糖含量检测的问题。本发明的方法能够有效去除交叉反应，获得特异性的纯化的脑膜炎球菌抗血清，所获得的抗血清质量稳定、基本无交叉反应、效价较高，可用于脑膜炎球菌疫苗的所有免疫学检测。

相比于传统的添加菌液去交叉反应的方法，本发明的方法高效、稳定、可控性强、简便。特别地，可实现更有效的添加，而且稳定性更强，脑膜炎球菌菌液以混悬液的形式4℃保存，批间差异大且稳定性只有数月，而所添加的荚膜多糖可以抽真空冻干的形式-70℃储存，稳定性长达5年以上。

另外，本发明进一步提出以逐滴的方式添加荚膜多糖，可以出乎意料地获得非常优异的吸收纯化/去交叉反应效果，抗血清的交叉反应可以被全部去除，血清特异性大幅度增强，由此具备更加优良的应用价值，可用于脑膜炎球菌疫苗的所有免疫学检测。而且更易控制多糖的添加量，荚膜多糖以逐滴加入的方式能够刚好去除非特异性成分而不过分添加。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

为了解决上述现有技术中的问题，本发明的发明人提出制备稳定、无交叉反应的脑膜炎球菌抗血清是控制脑膜炎球菌疫苗质量的关键因素。然而，脑膜炎球菌抗血清吸收纯化/去交叉反应的方法少有报道，其他致病菌抗血清吸收纯化/去交叉反应的方法虽有诸多报道和研究，但仍存在一些不足。例如，文献“LUND E,HENRICHSEN J.Laboratorydiagnosis,serology and epidemiology of Streptococcus pneumonia[M]//BERGAN T,NORRIS JR.Methods in microbiology.New York:Academic Press,1978:242-261”中描述了一种经典的肺炎球菌抗血清吸收纯化/去交叉反应的方法，即在存在交叉反应的肺炎球菌血清中，按经验不等体积适量加入对应型别的肺炎球菌菌液来吸收血清中的非特异性成分。该方法本身并不繁琐，但添加物肺炎球菌菌液的制备过程却相当耗时耗力：将肺炎球菌菌株传种于固体培养基上，然后刮取菌苔经液体培养基培养，待生长至适宜的OD时收获，灭活处理后离心弃上清，生理盐水洗涤收集的菌体两次，再以比浊法将菌体浓度稀释至适宜浓度。此外，添加物肺炎球菌菌液的制备不可避免的存在批间差异，且菌液在4℃保存，稳定性较差。

本发明的发明人通过充分地研究和试验以及巧妙地构思，创新性地提出通过加入荚膜多糖的方式来将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应。

由此，本发明提供了一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法，该方法包括以下步骤：

1)提供针对特定脑膜炎球菌血清群的抗血清，其中该抗血清中包含针对所述特定脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖的所需抗体和针对其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖的干扰抗体；

2)向所述抗血清中加入至少一种所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖；

3)当所述抗血清开始由清澈变浑浊时，停止加入所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖，并去除浑浊物。

相比于用菌液来吸收血清中的非特异性成分，本发明的方法高效、稳定、可控性强、简便，特别地，可实现①更有效的添加，添加物荚膜多糖为脑膜炎球菌毒力的必须条件和主要因素；②稳定性更强，脑膜炎球菌菌液以混悬液的形式4℃保存，批间差异大且稳定性只有数月，而多糖(如精制多糖)以抽真空冻干的形式-70℃储存，稳定性长达5年以上。

在吸收纯化/去交叉反应的效果上，本发明的方法能够有效去除交叉反应，获得特异性的脑膜炎球菌抗血清，所获得的抗血清质量稳定、基本无交叉反应、效价较高，可用于脑膜炎球菌疫苗的所有免疫学检测。

本发明所述针对特定脑膜炎球菌血清群的抗血清可以采用本领域已知的技术获得，或者可以通过市售途径获得。所用各血清群的脑膜炎球菌的荚膜多糖也可以采用本领域已知的技术获得，或者可以通过市售途径获得。

本发明可以不限制所加入的荚膜多糖的形式，其可以为固体或液体的形式。本发明也可以不限制所加入的荚膜多糖的浓度。

然而，进一步地，本发明提出以逐滴的方式添加荚膜多糖。通过逐滴加入荚膜多糖，本发明出乎意料地发现这样可以实现优异的纯化效果，抗血清的交叉反应可以被全部去除，血清特异性大幅度增强，由此具备优良的应用价值，可用于脑膜炎球菌疫苗的所有免疫学检测。而且更易控制多糖的添加量，以逐滴加入的方式能够刚好去除非特异性成分而不过分添加。

因此，更优选的是，在步骤2)中，以逐滴的方式加入至少一种所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖。

本发明所用术语“逐滴”在本领域中具有普遍公认的含义，通常一滴为大约50μl。

优选地，所添加的其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖的浓度为大于或等于5mg/mL。当所添加的其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖低于该浓度时，获得的抗血清将被稀释更多，效价更低。

优选地，所加入的其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖为精制多糖。精制多糖是细菌菌种在适宜培养基中培养后杀菌，通过提取荚膜多糖抗原，经纯化后冻干制备得来。不同于粗糖，精糖各项生化检定结果和分子大小均符合中华人民共和国药典和欧洲药典现行版对相应型别多糖的相关要求，是多糖疫苗的原材料。

本发明不受理论的束缚，但是认为当将其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖加入抗血清中时，其与抗血清中存在交叉反应的相应的抗体发生抗原抗体反应，形成沉淀，因此可立即观察到抗血清由清澈变为浑浊。本发明有利地采取少量多次的方式进行荚膜多糖的添加，当出现浑浊时，停止加入所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖，去除浑浊物；如此反复多次。

在本发明的方法中，优选重复步骤2)和步骤3)，直至加入至少一种所述其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖后，脑膜炎球菌抗血清不再变浑浊。

已知脑膜炎球菌分为A、B、C、D、Y、W135等13个血清群。已知，例如，针对Y和针对W135血清群的抗血清之间存在交叉反应，而它们不与其他血清群发生交叉反应。

因此，在本发明一个实施方案中，当所述抗血清为针对W135血清群的抗血清时，该抗血清存在与Y血清群的交叉反应，需要向该抗血清中加入Y血清群的荚膜多糖；反之亦然。根据本发明的精神，本领域技术人员可以理解，当抗血清中存在除所针对的血清群以外的其他血清群时，需要向抗血清中加入其他血清群的荚膜多糖。

根据本发明的精神，本领域技术人员能够理解，当所述针对特定脑膜炎球菌血清群的抗血清中存在与多种其他脑膜炎球菌血清群的交叉反应时，需要向该抗血清中加入相应的多种其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖。例如，同时加入相应的多种其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖，然后去除所产生的浑浊物。

在步骤3)中，可以通过离心去除所述浑浊物。可以根据实际需要采用合适的离心转速和时间。

优选地，所加入的其他脑膜炎球菌血清群的荚膜多糖为精制多糖。

在本发明一个特定的实施方案中，所述特定脑膜炎球菌血清群为脑膜炎球菌W135血清群和脑膜炎球菌Y血清群中的一者，所述其他脑膜炎球菌血清群为脑膜炎球菌W135血清群和脑膜炎球菌Y血清群中的另一者。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法还包括：4)对去除所述浑浊物的脑膜炎球菌抗血清进行除菌过滤。例如，采用0.2μm的滤膜进行除菌过滤。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

实施例

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。实施例中所涉及的抗血清和荚膜多糖(以下也简称为多糖)均来源于兰州生物制品研究所有限责任公司，所涉及的检测方法(速率比浊法)为常规操作，具体为将阳性对照(5.0μg/mL的X价多糖混合溶液)和阴性对照(不含本血清群多糖的阳性对照)与处理前、后的抗血清放入速率比浊仪进行检测，检测结束得到相应的反应浊度值。血清交叉率＝阴性对照/阳性对照×100％。

实施例1：W135群脑膜炎抗血清吸收纯化/去交叉反应的方法

向50mL存在交叉反应的W135群脑膜炎球菌抗血清中，逐滴(每滴约50μL)加入5mg/mL的Y群脑膜炎多糖溶液，混匀后1844g离心10分钟，收取上清液。重复上述步骤，直至上清液澄清透明。将所得上清液用0.2μm的膜进行除菌过滤，分装后保存于-70～-80℃冰箱。

脑膜炎球菌抗血清吸收纯化/去交叉反应前、后经速率比浊法鉴定，结果为：W135群脑膜炎球菌抗血清在用上述方法处理前，抗血清交叉率高达56.10％；处理后抗血清交叉率降为1.46％。可认定经过上述方法处理后，W135群脑膜炎球菌抗血清的交叉反应已全部被去除，血清特异性大幅度增强(效价为16)。即，W135群脑膜炎球菌抗血清只与W135群多糖特异性反应，不与其他群别的多糖发生交叉反应。

实施例2：Y群脑膜炎抗血清吸收纯化/去交叉反应的方法

向50mL存在交叉反应的Y群脑膜炎球菌抗血清中，逐滴(每滴约50μL)加入5mg/mL的W135群脑膜炎多糖溶液，混匀后1844g离心10分钟，收取上清液。重复上述步骤，直至上清液澄清透明。将所得上清液用0.2μm的膜进行除菌过滤，分装后保存于-70～-80℃冰箱。

脑膜炎球菌抗血清吸收纯化/去交叉反应前、后经速率比浊法鉴定，结果为：Y群脑膜炎球菌抗血清在用上述方法处理前，抗血清交叉率高达61.98％；处理后抗血清交叉率降为0.96％。可认定经过上述方法处理后，Y群脑膜炎球菌抗血清的交叉反应已全部被去除，血清特异性大幅度增强(效价为20)。即，Y群脑膜炎球菌血清只与Y群多糖特异性反应，不与其他群别多糖发生交叉反应。

实施例3：Y群脑膜炎抗血清吸收纯化/去交叉反应(非逐滴方式加入多糖)的方法

向两份10mL存在交叉反应的Y群脑膜炎球菌抗血清中，分别以非逐滴的方式加入5mg/mL的W135群脑膜炎多糖溶液0.5mL和1.0mL，混匀后1844g离心10分钟，收取上清液，分别将所得上清液用0.2μm的膜进行除菌过滤。

脑膜炎球菌抗血清吸收纯化/去交叉反应前、后经速率比浊法鉴定，结果为：Y群脑膜炎球菌抗血清在用上述方法处理前，抗血清交叉率高达61.98％；加入0.5mL多糖溶液处理后的抗血清交叉率降为28.33％，说明该次添加并未完全去除交叉反应；加入1mL多糖溶液处理后抗血清交叉率降为0.88％，但Y群脑膜炎球菌血清与Y群多糖特异性反应也显著降低(效价仅为4)。

Claims (10)

1.一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法，包括以下步骤：

1)提供针对脑膜炎球菌W135血清群的抗血清，其中该抗血清中包含针对所述脑膜炎球菌W135血清群的荚膜多糖的所需抗体和针对脑膜炎球菌Y血清群的荚膜多糖的干扰抗体；

2)向所述抗血清中仅加入所述脑膜炎球菌Y血清群的荚膜多糖以去除交叉反应；

3)当所述抗血清开始由清澈变浑浊时，停止加入所述脑膜炎球菌Y血清群的荚膜多糖，并去除浑浊物；

其中在步骤2)中，以逐滴的方式加入所述脑膜炎球菌Y血清群的荚膜多糖，每滴为50μL；

其中在步骤2)之前、以及在步骤2)之后且步骤3)之前利用速率比浊仪检测所述抗血清的浊度值；

其中在步骤2)中，所加入的脑膜炎球菌Y血清群的荚膜多糖的浓度为大于或等于5mg/mL；

其中用所述方法去交叉反应得到的脑膜炎球菌抗血清的抗血清交叉率为1.46％，效价为16。

2.根据权利要求1所述的方法，其中重复步骤2)和步骤3)，直至加入所述脑膜炎球菌Y血清群的荚膜多糖后，抗血清不再变浑浊。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤3)中，通过离心去除所述浑浊物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤2)中，所加入的脑膜炎球菌Y血清群的荚膜多糖为精制荚膜多糖。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：4)对去除所述浑浊物的脑膜炎球菌抗血清进行除菌过滤。

6.一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法，包括以下步骤：

1)提供针对脑膜炎球菌Y血清群的抗血清，其中该抗血清中包含针对所述脑膜炎球菌Y血清群的荚膜多糖的所需抗体和针对脑膜炎球菌W135血清群的荚膜多糖的干扰抗体；

2)向所述抗血清中仅加入所述脑膜炎球菌W135血清群的荚膜多糖以去除交叉反应；

3)当所述抗血清开始由清澈变浑浊时，停止加入所述脑膜炎球菌W135血清群的荚膜多糖，并去除浑浊物；

其中在步骤2)中，以逐滴的方式加入所述脑膜炎球菌W135血清群的荚膜多糖，每滴为50μL；

其中在步骤2)之前、以及在步骤2)之后且步骤3)之前利用速率比浊仪检测所述抗血清的浊度值；

其中在步骤2)中，所加入的脑膜炎球菌W135血清群的荚膜多糖的浓度为大于或等于5mg/mL；

其中用所述方法去交叉反应得到的脑膜炎球菌抗血清的抗血清交叉率为0.96％，效价为20。

7.根据权利要求6所述的方法，其中重复步骤2)和步骤3)，直至加入所述脑膜炎球菌W135血清群的荚膜多糖后，抗血清不再变浑浊。

8.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤3)中，通过离心去除所述浑浊物。

9.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤2)中，所加入的脑膜炎球菌W135血清群的荚膜多糖为精制荚膜多糖。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：4)对去除所述浑浊物的脑膜炎球菌抗血清进行除菌过滤。