CN110836800B - 对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法，属于环境微界面化学成像研究技术领域。该方法具体为：采用径迹蚀刻膜、聚醚砜滤膜和PZ‑DGT吸附膜，依次与植物根际土壤接触，放置一段时间后，取出聚醚砜滤膜和PZ‑DGT吸附膜，分析PZ‑DGT吸附膜上硅累积量的分布特征，通过数据处理实现植物根际有效性硅分布的二维可视化。该方法对植物根际有效性硅分布进行二维可视化，实现微米至亚毫米级的分辨率。

Description

对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法

技术领域

本发明属于环境微界面化学成像研究技术领域，具体涉及一种对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法。

背景技术

硅素对作物生长、发育、产量及抗病性方面具有有益作用，尤其是对于禾本科的水稻和甘蔗以及部分莎草科植物。对禾本科和莎草科等嗜硅类植物而言，硅是必需元素，对非嗜硅性植物如番茄、黄瓜等，则是有益元素。研究表明，硅在提高光能利用率、提高作物产量和品质、增强作物抗逆性(抗倒伏、抗病虫害、抗旱)以及调节养分吸收和利用等方面发挥显著作用。据测定，每亩高产水稻，一个生长季可以从土壤中吸收硅素的量约为75-135kg(以二氧化硅计)，随着集约化种植和作物产量的提高，加上淋溶流失，土壤硅素的丰缺也引起人们的注意。因此，测定土壤中硅的含量，用以确定硅肥的施用量从而合理施肥，对农业生产以及土壤硅的可持续利用尤为重要。

有效性硅是自然水体和土壤中能够被植物和微生物等生物体直接吸收的硅的形态。直接利用植物体检测水体和土壤中有效性硅含量比较复杂，因此，针对土壤，学术界通常用弱酸或弱碱等浸提剂提取的硅含量作为有效性硅含量(化学提取法)。但是，不同的浸提剂提取硅元素的能力不同，所提取的硅形态不同，致使化学提取结果差别很大，往往不能较好地预测植物吸收硅的能力。

与化学提取方法相比，梯度扩散薄膜(DGT)技术测定的磷和金属浓度与植物体内的浓度相关性更好，更能代表磷和金属的有效性浓度。因此，DGT测定的硅浓度有望更能代表土壤中有效性硅的浓度，但目前还没有这方面的报道。DGT技术是1994年英国兰卡斯特大学William Davison和Hao Zhang(张昊)教授发明的(Davison,W.,Zhang,H.,1994.In situspeciation measurements of trace components in natural waters using thin-filmgels.Nature 367,546-548.)。DGT技术核心组成是扩散层(扩散膜)和吸附层(吸附膜)，待测物质在扩散层形成扩散梯度，随之被吸附层捕获而固定下来。根据实验目的选择吸附材质，制备吸附性能优良的吸附层。如果吸附材质在吸附层分布均匀且颗粒尺寸足够小，该吸附层有望用于待测物质的高空间分辨的化学成像。

植物根系-土壤相互作用强烈的区域通常在根系周围几毫米的范围内，在微米至亚毫米级分辨率测定根际硅分布将极大地促进对植物吸收硅过程的理解。目前现有的研究是将植物生长的土壤或沉积物简单区分为根际土和非根际土，分别取样进行分析，比较根际土和非根际土中硅含量和土壤其他指标的差异。这种方法只能得到根际土中硅含量单点的信息。即使有研究通过采集离根不同距离的土壤样品进行分析，也只能得到毫米至厘米级根际土中硅的一维分布信息。而且，现有的方法为破坏性分析方法，采样过程扰动了植物根际土壤状态，结果的可靠性还有待于进一步验证。将高空间分辨的DGT技术用于植物根际化学成像，有望在非破坏性采样条件下获得亚毫米级空间分辨率的有效性硅图像，该原位分析方法将有利于大幅提升认识植物吸收硅机制，为提出新的农艺措施奠定基础。但是要实现植物根际有效性硅成像仍需要技术创新，目前还没有这方面的报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法，该方法对植物根际有效性硅分布进行二维可视化，实现微米至亚毫米级的分辨率。

本发明采用如下技术方案：一种对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法，包括如下步骤：

步骤一：制备PZ-DGT吸附膜；

步骤二：切割PZ-DGT吸附膜为矩形条状或正方条状，采用径迹蚀刻膜、聚醚砜滤膜和PZ-DGT吸附膜，依次与植物根际土壤接触，放置一段时间后，取出PZ-DGT吸附膜，分析PZ-DGT吸附膜上硅累积量的分布特征，通过数据处理实现植物根际有效性硅分布的二维可视化。

其中一些实施例中，步骤一中制备的PZ-DGT吸附膜为表面均匀分布有粒径≤0.2微米的二氧化锆颗粒的聚丙烯酰胺水凝胶薄膜。

其中一些实施例中，步骤二具体包括如下步骤：

a：组装植物培养箱；

b：将植物幼苗转移至植物培养箱中，使植物根系靠近径迹蚀刻膜，并将植物培养箱倾斜25°～30°；

c：放置PZ-DGT吸附膜：在待考察的植物生长阶段，将聚醚砜滤膜、矩形条状或正方条状PZ-DGT吸附膜，依次放置在植物根际区域的径迹蚀刻膜上，使PZ-DGT吸附膜上边沿呈水平状态，并标记PZ-DGT吸附膜左上角对应的根际位置为坐标原点(0，0)，放置一段时间后取出聚醚砜滤膜和PZ-DGT吸附膜；

d：干胶处理：将取出的PZ-DGT吸附膜放在聚醚砜滤膜上，对吸附膜与聚醚砜滤膜进行预干燥，之后再对已预干燥的吸附膜和聚醚砜滤膜进行干燥处理，使吸附膜完全干燥并与聚醚砜滤膜紧密贴合；

e：仪器分析：利用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱分析干胶处理后的PZ-DGT吸附膜上不同位置的硅累积量，即²⁹Si计数值(cps)，并同步获取¹³C计数值(cps)用于校准硅测定结果，计算硅碳计数值比值(²⁹Si/¹³C，cps/cps)；

f：数据可视化处理：将PZ-DGT吸附膜、聚醚砜滤膜依次叠加组装成DGT装置，暴露在已知浓度(C_sol)、充分搅拌的硅酸溶液中，4h后回收DGT装置，取出PZ-DGT吸附膜，该吸附膜上硅累积通量记为F，F＝C_sol·D/Δg；对已知硅累积通量的PZ-DGT吸附膜按照步骤d和e进行处理和分析，建立硅累积通量(F)与硅碳计数值比值(²⁹Si:¹³C，cps/cps)之间的线性关系，换算出步骤e中PZ-DGT吸附膜上硅累积通量，F；利用数据处理软件将PZ-DGT吸附膜上硅累积通量进行二维可视化呈现，设置图片左上角坐标点为步骤c中的原点(0，0)，横向向右和纵向向下的坐标数值逐渐增大，分别为植物根际有效性硅分布点位距离原点的横向距离和纵向距离，PZ-DGT吸附膜与植物根际的空间信息即对应起来，得到植物根际有效性硅分布图。

其中一些实施例中，步骤a具体为：采集湿润土壤装入U型的有机玻璃槽，附上径迹蚀刻膜并将其固定在有机玻璃槽上，保持有机玻璃槽站立后顶部敞开，并在土壤上部加入适量的纯水。

其中一些实施例中，步骤a中所述径迹蚀刻膜为聚碳酸酯膜，孔径0.1～0.4μm、厚度、6～11μm。

其中一些实施例中，步骤c所述矩形条状或正方条状PZ-DGT吸附膜长1～5cm，宽0.5～5cm，厚0.1～0.5mm，放置过程控制温度为20±1℃；所述聚醚砜滤膜的孔径为0.45μm，厚度为0.014cm，长宽值或直径大小与PZ-DGT吸附膜相同。

其中一些实施例中，步骤d中干胶仪对已预干燥的吸附膜和聚醚砜滤膜进行干燥处理，干胶仪的温度50～60℃，干胶的时间为6～12h。

其中一些实施例中，步骤f中所述硅酸溶液已知浓度C_sol为0～2.5mg L^-1；所述D为硅酸在径迹蚀刻膜中的扩散系数即5.89×10^-6cm² s^-1,20℃；所述Δg为聚醚砜滤膜的厚度，为0.014cm；所述PZ-DGT吸附膜在植物培养箱中放置的时间为4h。。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明采用PZ-DGT吸附膜与根际箱技术对植物根际有效性硅分布进行二维可视化，可以原位获得亚毫米级空间分辨率的有效性硅图像，识别根际根际硅的热区。该方法不会破坏或者扰动植物根际的原有环境，能够更好地反应真实环境条件下硅的有效性。

附图说明

图1为PZ-DGT吸附膜的扫描电子显微镜图；

图2为PZ-DGT吸附膜吸收硅酸的动力学图；

图3为植物培养箱示意图，其中1、U型有机玻璃槽；2、植株；3、水；4、土壤或沉积物；5、植物根系；6、聚醚砜滤膜和PZ-DGT吸附膜，左上角坐标为(0，0)横向向右(x轴)和纵向向下(y轴)的坐标数值逐渐增大；

图4为植物培养箱侧视图；

图5为图4曲线框中的部分；其中7、径迹蚀刻膜；8、有机玻璃挡板；

图6为硅累积通量(F,ng cm^-2s^-1)与硅碳计数值比值(²⁹Si/¹³C，cps/cps)之间的线性关系图；

图7为水稻根际有效性硅分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等效形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

以下结合具体实施例对本发明做详细说明。

实施例1

一种对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法，具体步骤为：

步骤一、PZ-DGT吸附膜的制备和性能测试：

(1)制备制胶溶液：利用购买自英国DGT研究有限公司的浓度为2％的交联剂DGTgel cross-linker、Milli-Q纯水机制备的纯水和通用电气医疗集团(GE Healthcare)生产的质量百分比浓度为40％的丙烯酰胺溶液，将三种溶液按照体积比为15:47.5:37.5的比例混合制备制胶溶液。

(2)将体积为步骤(1)制备得到的制胶溶液的7/1000的四甲基二乙胺溶液和体积为所述制胶溶液体积的1/400的质量百分比浓度为10％的过硫酸铵溶液分别加入上述制胶溶液中，混合均匀，制得混合溶液。

(3)将步骤(2)制备得到的混合溶液以5mL/min的速率注入夹有0.25mm厚的U形塑料隔间片的两片玻璃板空隙中，赶尽玻璃板间气泡后，将玻璃板在42℃的烘箱中水平放置1h使溶液完全凝胶成膜。

(4)撬开玻璃板，取出凝胶薄膜，在纯水中浸泡12h，在浸泡期间更换纯水4次，得到厚度为0.4mm的聚丙烯酰胺水凝胶薄膜。

(5)将步骤(4)制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶薄膜放入0.3mol/L的氧氯化锆溶液中，静置2h。

(6)用纯水冲洗步骤(5)得到的薄膜后，再转移到0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，该2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液用氢氧化钠溶液调节pH至6.5，震荡40min后取出，用纯水冲洗3遍，去除多余的化学试剂，放入纯水中浸泡6h后切成所需形状，即制得所述PZ-DGT吸附膜(参照申请号为201310689076.5的中国发明专利申请)。

(7)利用扫描电子显微镜测试步骤(6)制备得到的吸附膜上吸附材料的分布情况(图1)，发现二氧化锆颗粒在吸附膜上分布均匀，且颗粒尺寸≤0.2μm，说明该PZ-DGT吸附膜有望在微米至亚毫米级的分辨率表征有效性硅含量的分布。利用50mL离心管开展吸附动力学批试验，每个离心管中放入10mL 5μg cm^-3的硅酸(有效性硅)溶液和1片PZ-DGT吸附膜(圆片装，直径2.5cm，厚度0.4mm)，反应0.5、1、2、5、10、20、30、60、90、120和1440min后分别取出PZ-DGT吸附膜，实验设置3个平行，测试反应前后离心管中硅酸浓度的变化，计算PZ-DGT吸附膜吸收硅酸的动力学，见图2。由图2可知，前30min对PZ-DGT吸附膜硅酸的吸收呈线性增加的趋势，前60min溶液中的硅酸几乎全部被吸收，说明PZ-DGT吸附膜对硅酸具有较快的吸收速率和较高的吸附容量。总之，PZ-DGT吸附膜适合在微米至亚毫米级的分辨率表征有效性硅含量的分布。

步骤二、植物培养箱的组装：

将采集自江苏的某湿润土壤装入U型的有机玻璃槽(图3，内部尺寸，高×宽×深＝20×10×2cm)中，附上径迹蚀刻膜(聚碳酸酯膜，孔径0.2μm、厚度10μm；Nuclepore,Whatman)和有机玻璃挡板并将其固定在有机玻璃槽上，使湿润土壤、径迹蚀刻膜和有机玻璃挡板紧密贴合，保持有机玻璃槽站立后顶部敞开，并在土壤上部加入适量的纯水。图3所示的植物培养箱具有以下优点：(1)密封性良好；(2)空间较大，可为水稻整个营养生长阶段(幼苗期、分蘖期和拔节期)提供充足的生长空间，保证根系能够舒展生长，减少根系之间的重叠；(3)易于拆卸，便于后期放置PZ-DGT吸附膜。

步骤三、植物的培养：

将水稻幼苗转移至已植物培养箱中，尽量使水稻根系靠近径迹蚀刻膜，并将植物培养箱倾斜30°使根系更易贴着径迹蚀刻膜生长。

步骤四、PZ-DGT吸附膜的放置：

在水稻生长的分蘖期，取下植物培养箱中的有机玻璃挡板，将聚醚砜滤膜和步骤一制备得到的矩形条状PZ-DGT吸附膜(长×宽×厚＝～3cm×～1cm×～0.4cm)依次放置在植物根际区域的径迹蚀刻膜上(图4和图5)，使PZ-DGT吸附膜上边沿呈水平状态，并标记PZ-DGT吸附膜左上角对应的根际位置为坐标原点(0，0)，横向向右(x轴)和纵向向下(y轴)的坐标数值逐渐增大，放置过程控制温度为20±1℃，4h后取出聚醚砜滤膜和PZ-DGT吸附膜。图4为植物培养箱(图3)的侧视图，曲线框中标出了成像的关键区域，详细分解见图5。图5中，标记4为土壤，标记6为聚醚砜滤膜和PZ-DGT吸附膜，标记7为径迹蚀刻膜，标记8为有机玻璃挡板。

步骤五、干胶处理：

将回收的矩形条状PZ-DGT吸附膜放在聚醚砜滤膜上，通过轻压对吸附膜与聚醚砜滤膜进行预干燥，之后采用干胶仪在60℃对已预干燥的吸附膜和滤膜干燥处理8h，使吸附膜完全干燥并与滤膜紧密贴合。

步骤六、PZ-DGT吸附膜上硅累积量分析：

利用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)分析干胶处理后的PZ-DGT吸附膜上不同位置的硅累积量，即²⁹Si计数值(cps)，并同步获取¹³C计数值(cps)用于校准硅测定结果，计算硅碳计数值比值(²⁹Si:¹³C，cps/cps)。

步骤七、数据可视化处理：

将PZ-DGT吸附膜、聚醚砜滤膜依次叠加组装成DGT装置，分别暴露在浓度(C_sol)为0、0.8或1.6mg L^-1且充分搅拌的硅酸溶液中，放置过程控制温度为20±1℃，4h后回收DGT装置，取出PZ-DGT吸附膜，吸附膜上硅累积通量记为F，可通过公式F＝C_sol·D/Δg进行计算。对这些已知硅累积通量的PZ-DGT吸附膜按照步骤五和六进行处理和分析，建立硅累积通量(F,ng cm^-2s^-1)与硅碳计数值比值(²⁹Si/¹³C，cps/cps)之间的线性关系图，见图6。由图6可知，在硅累积通量F为0.06～0.67ng cm^-2s^-1的范围内，硅碳计数值比值(²⁹Si/¹³C，cps/cps)与F呈线性增加，说明PZ-DGT吸附膜对硅具有优良的吸附性能，且该线性关系可用于换算已知硅碳计数值比值的样品中硅累积通量。换算出步骤六中PZ-DGT吸附膜上硅累积通量，F，之后，利用Sigmaplot(版本12.5)数据处理软件将PZ-DGT吸附膜上硅累积通量进行二维可视化呈现(Contour图)，设置图片左上角坐标点为步骤c中的原点(0，0)，横向向右(x轴)和纵向向下(y轴)的坐标数值逐渐增大，分别为植物根际有效性硅分布点位距离原点的横向距离和纵向距离，这样做，PZ-DGT吸附膜与植物根际的空间信息(图3中的坐标系)即对应起来，得到植物根际有效性硅分布图，见图7。图7中有效性硅浓度的单位为ng cm^-2s^-1，有效性硅分布的分辨率73.4μm(纵向)×150μm(横向)。此外，还可以利用MATLAB和ImageJ软件进行数据的二维可视化呈现。由图7可知，PZ-DGT吸附膜跟根际箱技术相结合，可以获得植物根际有效性硅含量的亚毫米空间分辨率特征，同时还发现水稻根际存在硅的热区，表明此处硅的有效性或活性较高。

上述实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (3)

1.一种对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：制备PZ-DGT吸附膜；

步骤二：组装植物培养箱：采集湿润土壤装入U型的有机玻璃槽，附上径迹蚀刻膜并将其固定在有机玻璃槽上，保持有机玻璃槽站立后顶部敞开，并在土壤上部加入适量的纯水；

步骤三：将植物幼苗转移至植物培养箱中，使植物根系靠近径迹蚀刻膜，并将植物培养箱倾斜25°～30°；

步骤四：放置PZ-DGT吸附膜：在待考察的植物生长阶段，将聚醚砜滤膜、矩形条状或正方条状PZ-DGT吸附膜，依次放置在植物根际区域的径迹蚀刻膜上，使PZ-DGT吸附膜上边沿呈水平状态，并标记PZ-DGT吸附膜左上角对应的根际位置为坐标原点(0，0)，放置一段时间后取出聚醚砜滤膜和PZ-DGT吸附膜；

步骤五：干胶处理：将取出的PZ-DGT吸附膜放在聚醚砜滤膜上，对吸附膜与聚醚砜滤膜进行预干燥，之后再对已预干燥的吸附膜和聚醚砜滤膜进行干燥处理，使吸附膜完全干燥并与聚醚砜滤膜紧密贴合；

步骤六：仪器分析：利用分析仪器分析干胶处理后的PZ-DGT吸附膜上不同位置的硅累积量，即²⁹Si计数值，并同步获取¹³C计数值用于校准硅测定结果，计算硅碳计数值比值；

步骤七：数据可视化处理：将PZ-DGT吸附膜、聚醚砜滤膜依次叠加组装成DGT装置，暴露在已知浓度、充分搅拌的硅酸溶液中，4h后回收DGT装置，取出PZ-DGT吸附膜，该吸附膜上硅累积通量记为F，F＝C_sol·D/Δg；对已知硅累积通量的PZ-DGT吸附膜按照步骤五和六进行处理和分析，建立硅累积通量与硅碳计数值比值之间的线性关系，换算出步骤六中PZ-DGT吸附膜上硅累积通量，利用数据处理软件将PZ-DGT吸附膜上硅累积通量进行二维可视化呈现，设置图片左上角坐标点为步骤四中的原点(0，0)，横向向右和纵向向下的坐标数值逐渐增大，分别为植物根际有效性硅分布点位距离原点的横向距离和纵向距离，PZ-DGT吸附膜与植物根际的空间信息即对应起来，得到植物根际有效性硅分布图；

其中，步骤二中所述径迹蚀刻膜为聚碳酸酯膜，孔径0.1～0.4μm、厚度6～11μm；

步骤四所述矩形条状或正方条状PZ-DGT吸附膜长1～5cm，宽0.5～5cm，厚度0.1～0.5mm，放置过程控制温度为20±1℃；所述聚醚砜滤膜的孔径为0.45μm，厚度为0.014cm，长宽值与PZ-DGT吸附膜相同；

步骤七所述硅酸溶液已知浓度C_sol为0～2.5mg L^-1；所述D为硅酸在径迹蚀刻膜中的扩散系数即5.89×10^-6cm² s^-1,20℃；所述Δg为聚醚砜滤膜的厚度，为0.014cm。

2.根据权利要求1所述的对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法，其特征在于，步骤一中制备的PZ-DGT吸附膜为表面均匀分布有粒径≤0.2微米的二氧化锆颗粒的聚丙烯酰胺水凝胶薄膜。

3.根据权利要求1所述的对植物根际有效性硅分布进行二维可视化的方法，其特征在于，步骤五中干胶仪对已预干燥的吸附膜和聚醚砜滤膜进行干燥处理，干胶仪的温度50～60℃，干胶的时间为6～12h。

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