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CN110835303A - 一类双响应荧光染料分子 - Google Patents

一类双响应荧光染料分子 Download PDF

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CN110835303A CN201911056897.9A CN201911056897A CN110835303A CN 110835303 A CN110835303 A CN 110835303A CN 201911056897 A CN201911056897 A CN 201911056897A CN 110835303 A CN110835303 A CN 110835303A
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Abstract

一类双响应荧光染料分子,具有通式I的结构。该分子对生物体内硝基还原酶(NTR)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)具有双线响应的特性。可以对着两种酶含量水平进行特异性检测。同时这类探针具有良好的水溶性，良好的光稳定性，较低的光毒性、光漂白性以及优良的生物毒性。其在生物学检测方面具有良好的应用前景。

Description

一类双响应荧光染料分子
技术领域
本发明涉及一例用于检测体内硝基还原酶有机染料分子的设计、合成及其在生物分析中的应用，尤其是对硝基还原酶(NTR)与还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)具有双响应的有机荧光染料。
背景技术
细胞缺氧现象是由于细胞内氧气供应不足而引起的，缺氧状态下会引发一系列疾病，如心脏局部缺血、中风和炎症等。此外，缺氧状态也是恶性肿瘤生长过程中普遍存在的现象。恶性肿瘤不易治愈是肿瘤细胞的易转移性所造成的，同时会增加对化疗、放疗的抗性，从而使治疗效果降低。因此，探究细胞缺氧，发展细胞缺氧状态的检测办法，对于疾病诊断、临床治疗及增强机体适应能力等研究具有及其重要的意义。肿瘤细胞由于恶性增殖会导致细胞缺氧，而缺氧又会导致细胞内硝基还原酶(NTR)活性升高。在缺氧状态下，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为电子供体，细胞内的NTR可将含硝基的芳香族化合物还原为响应羟胺或者氨基化合物。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是细胞内许多脱氢酶的辅酶，在细胞内以NADH和NAD+两种形式存在。主要形式是氧化型的NAD+在热力学上是更稳定的。近些年的研究表明，NADH参与了许多生物学过程，在细胞能量代谢、抗氧化、基因表达、细胞凋亡及癌变等生物过程中有着极其重要的作用。正常生理状态下及不同的病理情况下，NAD+/NADH的含量是不同的。通过检测细胞内NAD+/NADH的变化可以对生物体内的生理过程进行评估。
荧光成像是一种极具前景的检测活体系统中生物活性分子的方法。荧光成像是一种高灵敏度、高选择性能快速响应和高效分析生物体的有利工具，可用于追踪体内目标状态、变化和活动状况，从而促进细胞生物学的进展。小分子荧光探针具有良好的稳定性、灵敏度和选择性，用于荧光成像还可以保持生物样品完整性。由于其优良的特性，被广泛应用与生物检测和成像中。近年已经开发了许多用于NTR和NADH检测的小分子荧光探针，但均不能实现NTR与NADH双线检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一类对于硝基还原酶(NTR)与辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)具有双响应荧光染料分子，其具有通式I的结构：
Figure BDA0002256777650000021
通式I中：
所述的M是N或P；
所述的R1和R2各独立选自：
Figure BDA0002256777650000022
其中的x选自0-8的整数；
所述的L选自：
Figure BDA0002256777650000023
其中的n选自于0-6的整数。
另一方面，本发明提供上述荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
在催化剂存在条件下，化合物a和b按照摩尔比1:1-1:10反应，制备通式I的化合物；
Figure BDA0002256777650000031
反应温度为0-200℃，反应时间为1-32小时，反应溶剂选自乙醇、冰醋酸、乙二醇单甲醚、甲醇、二氯甲烷、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、N-N-二甲基甲酰胺或其混合物；催化剂选自哌嗪、哌啶、氢氧化钾、氢氧化钠、吡啶、甲醇钠、甲醇-氢氧化钾、碳酸钾、三乙胺和4-二甲氨基吡啶。催化剂与反应物摩尔比为1:0.05-1:0.2。
本发明所述的荧光染料具有高的灵敏度和分辨率、低/无毒性、合适的水溶性、高选择性识别以及特殊的光学性质等特点。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异，可以避免生物自发荧光的产生。
除此之外，本发明所述的荧光染料具有对生物体内硝基还原酶(NTR)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)具有双线响应的特性。因此，本发明另一方面的目的还在于提供本发明所述的荧光染料在制备硝基还原酶(NTR)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)检测试剂中的应用。特别是具有NTR与NADH双线检测功能的检测试剂。区别于目前市面上存在的具有单一检测功能的硝基还原酶(NTR)或者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)检测试剂，本发明的双响应荧光染料分子可以用于制备对其具有双线检测功能的试剂，在生物学检测方面具有良好的应用前景。
附图说明
本发明附图9幅：
附图1是本发明的双响应荧光染料分子的结构通式I。
附图2是染料1-1的吸收光谱。
附图3是染料1-2的发射光谱。
附图4是染料1-3的水溶性试验结果图。
附图5是染料1-4的离子选择性测试结果图。
附图6是染料1-1对硝基还原酶响应试验结果图。
附图7是染料1-2对辅酶NADH响应试验结果图。
附图8是染料1-3光稳定性测试结果图。
附图9是染料1-4对细胞毒性测试结果图。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一类具有双响应的有机荧光染料，其具有通式Ⅰ的结构：
Figure BDA0002256777650000041
通式I中，所述的M选自N和P；
通式I中，所述的R1和R2各独立选自于：
Figure BDA0002256777650000042
作为优选，所述的R1和R2各独立地选自：
Figure BDA0002256777650000043
更为优选地，所述的R1和R2各独立地选自：
Figure BDA0002256777650000044
在上述不同R1和R2所限定的技术方案中，各基团中的x独立选自于0-8的整数；优选是0-6的整数；最优选0-4的整数。
本发明所述的通式I中，所述的L是连接基团，选自：
Figure BDA0002256777650000051
优选地，所述的L选自：
Figure BDA0002256777650000052
更为优选地，所述的L选自：
Figure BDA0002256777650000053
最为优选的技术方案中，所述L选自
Figure BDA0002256777650000061
在上述关于连接基团L选择的技术方案及优选积水方案中，各基团化学式中的n各自独立地选自0-6的整数，优选0-4的整数。
容易理解，上述各个优选的技术特征可以自由组合，以构成本发明技术方案下的优选实施方式。作为举例但并非限定的描述，本发明所述及的荧光染料最优技术方案中，选自1-1、1-2、1-3和1-4：
Figure BDA0002256777650000062
另一方面，本发明也描述了上述荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
在催化剂存在条件下，化合物a和b按照摩尔比1:1-1:10反应，制备通式I的化合物；
Figure BDA0002256777650000063
反应温度为0-200℃，反应时间为1-32小时，反应溶剂选自乙醇、冰醋酸、乙二醇单甲醚、甲醇、二氯甲烷、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、N-N-2甲基甲酰胺或其混合物；反应催化剂选自哌嗪、哌啶、氢氧化钾、氢氧化钠、吡啶、甲醇钠、甲醇-氢氧化钾、碳酸钾、三乙胺和4-二甲氨基吡啶。
其中催化剂与反应物摩尔比为1:0.05-1:0.2。
具体实施方式中，所述步骤的反应温度优选30-180℃，更优选50-180℃，最优选60-160℃；所述的反应时间优选1-24h，更优选1-20h，最优选1-18h。
所述的反应溶剂优选乙醇、冰醋酸、甲醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、N-N-2-甲基甲酰胺或其混合物，更优选乙醇、冰醋酸、甲醇、二氯甲烷、N-N-2-甲基甲酰胺或其混合物，最优选乙醇、冰醋酸、甲醇、N-N-2-甲基甲酰胺或其混合物；所述的反应催化剂优选哌嗪、哌啶、氢氧化钾、吡啶、甲醇钠、甲醇-氢氧化钾、三乙胺和4-二甲氨基吡啶；更优选哌嗪、哌啶、吡啶、甲醇钠、甲醇-氢氧化钾、三乙胺和4-二甲氨基吡啶；最优选哌嗪、哌啶、吡啶、甲醇-氢氧化钾和4-二甲氨基吡啶；化合物a，b进行反应优选摩尔比1:1-1:7，更优选1:1-1:6.5，最优选1:1-1:6。
对使用本发明的合成方法所制备的荧光染料，以核磁共振谱图、单晶X射线衍射等来确认其结构。
本发明所述的荧光探针具备以下优点：
所述的荧光探针对于生物体内的硝基还原酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有高灵敏度，高选择性。
所述的有机染料具有优异的光学性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白和光损伤。
所述染料化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化。
鉴于此，本发明所述的荧光探针可用于生物体内硝基还原酶(NTR)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的识别检测。除了以本文中所述的形式直接用于生物体内NTR和NADH的识别检测，含有本发明的荧光染料的组合物也可以用于生物体内NTR和NADH的识别检测。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
染料化合物1-1的合成路线如下：
Figure BDA0002256777650000081
(1)染料化合物1-1的合成
将5mmol的a-1(合成方法参考文献：Kawaguchi,Hirobumi；Hamasaki,Ichiya；Inagaki,Yoshio.Stilbene derivative and electrophotographic photoreceptorusing it May6,1998JP 10114728)和6.25mmol的b-1(合成方法参考文献：Venis,MichaelA.and Thomas,Emrys W.Synthesis and auxin activity of 5-substituted 1-naphthaleneacetic acids.Phytochemistry,1990,29,381-383)加入到含有6mL无水乙醇的圆底烧瓶中再加入哌啶作催化。反应加热至100℃反应3h后升温至120℃持续反应5h后停止。真空旋干除去溶剂，用柱色谱分离法处理(石油醚：二氯甲烷，1：1，v/v)得到橙红色化合物1-1，收率50％。
(2)染料化合物1-1的表征
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.67(d,J＝8.6Hz,1H),8.21(d,J＝8.6Hz,1H),8.10(t,J＝8.2Hz,2H),7.78(d,J＝7.8Hz,2H),7.67(dd,J＝14.4,8.6Hz,2H),7.21(dd,J＝14.4,7.8Hz,2H),7.04(d,J＝7.8Hz,2H),6.95(d,J＝9.6Hz,2H),6.81(d,J＝14.4Hz,1H),6.63(d,J＝7.8Hz,4H),6.58(d,J＝7.8Hz,2H),2.62(t,J＝10.8Hz,2H),1.65(m,2H),1.12(t,J＝10.8Hz,3H).
实施例2：染料化合物1-1的吸收光谱检测试验
吸取用DMSO配置的6mmol/L的染料母液3μL加入含有3mL高纯水的四通比色皿中，测定其吸收光谱，收集波长在230-800nm处的吸光度值，其最大吸光度值所对应的波长即为其吸收波长。结果如图2所示。
本实施例所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例3
染料化合物1-2的合成路线如下：
Figure BDA0002256777650000091
(1)染料化合物1-2的合成
将5mmol的a-2(合成方法参考文献：Wang,Jianli et al.Synthesis andcharacterization of greenish-blue emitting vinyl copolymer containing pyreneand triarylamine moieties.Polymer International,2014,63(10),1797-1805.)和6.25mmol的b-2加入到含有6mL无水乙醇的圆底烧瓶中再加入哌啶作催化。反应加热至100℃反应3h后升温至120℃持续反应5h后停止。真空旋干除去溶剂，用柱色谱分离法处理(石油醚：二氯甲烷，1：1，v/v)得到橙红色化合物1-2，收率50％。
(2)染料化合物1-2的表征
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝8.6Hz,2H),8.12(d,J＝16.2Hz,2H),8.02(d,J＝8.7Hz,2H),7.88(d,J＝16.2Hz,2H),7.81-7.73(m,2H),7.69(d,J＝8.2Hz,2H),7.62(d,J＝8.6Hz,2H),7.46-7.31(m,2H),7.27(s,1H),7.21(d,J＝16.3Hz,1H),7.20-7.18(m,1H),7.17(s,1H),7.13(d,J＝8.2Hz,2H),7.11(s,1H),7.04(s,1H),6.88(d,J＝16.2Hz,2H).
实施例4：染料化合物1-2的发射光谱检测试验
吸取用DMSO配置的6mmol/L的染料1-2母液3μL加入含有3mL高纯水四通比色皿中，测定其发射光谱，激发波长为445nm,收集波长在460-800nm处的荧光强度，其荧光强度最强处所对应的波长即为发射波长，结果如图3所示。
实施例5
染料化合物1-3的合成路线如下：
Figure BDA0002256777650000092
(1)染料化合物1-3的合成
将5mmol的a-3(合成方法参考文献：Song,Xinbo et al.Targetable and fixablerotor for quantifying mitochondrial viscosity of living cells by fluorescencelifetime imaging.Journal of Materials Chemistry B:Materials for Biology andMedicine,2017；5(2),360-368.)和6.25mmol的b-3加入到含有6mL无水乙醇的圆底烧瓶中再加入哌啶作催化。反应加热至100℃反应3h后升温至120℃持续反应5h后停止。真空旋干除去溶剂，用柱色谱分离法处理(石油醚：二氯甲烷，1：1，v/v)得到橙红色化合物1-3，收率50％。
(2)染料化合物1-3的表征
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝8.6Hz,2H),8.02(d,J＝8.7Hz,2H),7.78-7.60(m,4H),7.47(d,J＝8.2Hz,4H),7.37(s,1H),7.34(d,J＝16.3Hz,2H),7.30(d,J＝8.6Hz,2H),7.26(s,1H),7.13(s,1H),7.04(s,1H),7.02(d,J＝16.2Hz,2H).
实施例6：染料化合物1-3的水溶性检测试验
称取一定量上述合成的染料1-3配成浓度为6mM的DMSO溶液，用移液枪移取上述母液1μL稀释至3mL水中，并且每次以梯度浓度加入，搅拌并充分使其溶解，同时确保DMSO最终加入体积小于总体积的千分之一。测定其吸光度值，测试结果如图4所示。结果表明：染料化合物1-3具有良好的水溶性
本实施例所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例7
染料化合物1-4的合成路线如下：
Figure BDA0002256777650000101
(1)染料化合物1-4的合成
将5mmol的化合物a-4(合成方法参考文献：Jang,Seok-Hoon et al.Highlyefficient organic photosensitizer with dinaphthylphenylamine unit as a donorfor DSSCs.Bulletin of the Korean Chemical Society,2011；32(11),4109-4112.)和6.25mmol的b-4(合成方法参考文献：Stiller,Eric T.；Diassi,Patrick A.etal.Synthesis and antiinflammatory activities ofα-methylfluorene-2-acetic acidand related compounds.Journal of Medicinal Chemistry,1972,15(10),1029-1032.)加入到含有6mL无水乙醇的圆底烧瓶中再加入哌啶作催化。反应加热至100℃反应3h后升温至120℃持续反应5h后停止。真空旋干除去溶剂，用柱色谱分离法处理(石油醚：二氯甲烷，1.5：1，v/v)得到橙红色化合物1-4，收率40％。
(2)染料化合物1-4的表征
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.46(s,1H),8.32(d,J＝8.6Hz,1H),8.18(d,J＝8.6Hz,1H),7.91(d,J＝8.2Hz,1H),7.88(d,J＝8.2Hz,2H),7.77(d,J＝8.2Hz,4H),7.71(s,1H),7.62(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(d,J＝8.6Hz,2H),7.47(d,J＝8.6Hz,2H),7.42-7.37(m,2H),7.34(d,J＝16.3Hz,2H),7.30(d,J＝8.6Hz,2H),7.26(s,1H),7.09(s,1H),6.72(d,J＝16.2Hz,2H),4.12(s,2H).
实施例8：染料化合物1-4的离子干扰试验
称取一定量上述合成的染料化合物1-4配成浓度为6mM的DMSO溶液，用移液枪移取上述母液1μL至3mL PBS中，随后在测试系统中依次加入20倍当量的离子干扰物(干扰物从1～15分别为SnCl2,CdCl2,MnCl2,CoCl2,CuSO4,HgCl2,Zn(NO3)2·6H2O,FeCl2·7H2O,K2HPO4·H2O,Na2CO3,MgSO4,LiCO3,Al(NO3)3)，并测试其荧光发射光谱。测试结果如5图所示。结果表明染料化合物1-4不受众多离子干扰的影响，可以进行专一性检测。
实施例9：染料化合物1-1对硝基还原酶响应试验
吸取用DMSO配置的6mmol/L的染料1-1母液5μL加入含有3mL高纯水的四通比色皿中，测定其发射光谱，随后在比色皿中加入1mg/mL的硝基还原酶2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，测定其变化。测试结果如图6所示。结果表明硝基还原酶使得530nm处的荧光强度增强，染料化合物1-1具备对硝基还原酶的检测能力。
实施例10：染料1-2对辅酶NADH响应试验
吸取用DMSO配置的6mmol/L的染料1-2母液5μL加入含有3mL高纯水的四通比色皿中，测定其发射光谱，随后在比色皿中加入50nM的辅酶NADH 2、4、6、8、10μL，测定其变化。测试结果如图7所示。结果表明NADH使得660处的荧光强度减弱，染料化合物1-2具备对NADH的检测能力。
实施例11：染料化合物1-3光稳定性试验
吸取用DMSO配置的6mmol/L的染料1-3母液5μL加入含有3mLDMSO溶液的四通比色皿中并封口。随后将比色皿放置于距离光源30cm的位置处，并在比色皿与光源之间放置含有饱和亚硝酸钠溶液的冷肼。然后依次测试其在不同光照时间间隔下的荧光发射光谱，结果如图8所示，化合物1-3在500W 7.0h的碘钨灯照射下显示出了良好的光稳定性。
实施例12：染料化合物1-4对细胞毒性的检测试验
选用HeLa细胞作为研究对象。以细胞存活率来表征染料对细胞毒性的大小。以5*104个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔内的体积为100μL，37℃5％CO2条件下培养24h。而后梯度浓度加入染料分子1-1于培养基中，每个梯度浓度设置5个复孔，设置空白对照，培养后检测细胞的存活率。检测时先在每孔中加入20μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，37℃5％CO2条件下培养4h。然后移去原有培养液并加入DMSO(150μL/孔)，而后用酶标仪测定OD值，重复三次，结果如图9所示。结果表明：上述合成染料化合物1-4对于细胞具有较小的毒性。

Claims (8)

1.一类双响应荧光染料分子，具有通式I的结构：
Figure FDA0002256777640000011
通式I中：
所述的M是N或P；
所述的R1和R2各独立选自：
Figure FDA0002256777640000012
其中的x选自0-8的整数；
所述的L选自：
Figure FDA0002256777640000013
其中的n选自于0-6的整数。
2.根据权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的R1和R2各独立地选自：
Figure FDA0002256777640000021
其中x选自0-6的整数。
3.根据权利要求2所述的荧光染料，其特征在于，所述的x选自0-4的整数。
4.根据权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的L选自：
Figure FDA0002256777640000022
其中n选自于0-4的整数。
5.根据权利要求4所述的荧光染料，其特征在于，所述的L选自：
Figure FDA0002256777640000023
其中n选自于0-4的整数。
6.根据权利要求1所述的荧光染料，选自化合物1-1、1-2、1-3和1-4：
Figure FDA0002256777640000031
7.权利要求1所述的双响应荧光染料分子的制备方法，包括如下步骤：
在催化剂存在条件下，化合物a和b按照摩尔比1:1-1:10反应，制备通式I的化合物；
Figure FDA0002256777640000032
反应温度为0-200℃，反应时间为1-32小时，反应溶剂选自乙醇、冰醋酸、乙二醇单甲醚、甲醇、二氯甲烷、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、N-N-二甲基甲酰胺或其混合物；催化剂选自哌嗪、哌啶、氢氧化钾、氢氧化钠、吡啶、甲醇钠、甲醇-氢氧化钾、碳酸钾、三乙胺和4-二甲氨基吡啶。
8.权利要求1所述的双响应荧光染料分子在制备硝基还原酶(NTR)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)检测试剂中的应用。
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