CN110810229A

CN110810229A - 一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法

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Publication number: CN110810229A
Application number: CN201911228243.XA
Authority: CN
Inventors: 王同华; 李莓; 张瑶婷; 郭一鸣; 刘新红; 曲亮; 范连益
Original assignee: HU'NAN PROV CROPS RESEARCH INST
Current assignee: HU'NAN PROV CROPS RESEARCH INST
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明公开了一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，涉及抗草甘膦油菜种子的领域，包括以下步骤：S1,将待检油菜种子置于抗草甘膦浓度为0.1～1.5（g/L）的溶液中浸泡8～10h；S2,将S1中的浸泡后的种子进行发芽暗培养48～60h；S3,暗培养的种子幼胚胚根有根毛，即判定所述油菜品种为抗草甘膦油菜，幼胚胚根无根毛，即为非抗草甘膦油菜。本发明的检测方法方便，操作简单，成本低且快速有效，能明显减少草甘膦转基因种子的抗性检测的工作量，在植物转基因研究中意义重大，在油菜抗草甘膦转基因油菜杂交种纯度鉴定中具有很好的应用前景，在大规模的抗草甘膦油菜的品种选育和杂交种纯度鉴定中具有实用价值。

Description

一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法

技术领域

本发明涉及抗草甘膦油菜种子领域，具体涉及抗草甘膦油菜种子的鉴定方法。

背景技术

目前，草甘膦是世界上应用最广泛的除草剂之一，因其具有广谱、低毒、安全、无土壤残留的特点，迅速占据了世界除草剂的主导地位。其作用机理主要是通过阻碍芳香氨基酸的生物合成，抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，导致莽草酸在生物体内积累，干扰植物氨基酸代谢使得植物死亡。目前，抗草甘膦基因EPSPS已被成功转移到多种作物，如抗草甘膦水稻、抗草甘膦大豆、抗草甘膦油菜等。该基因通过编码抗草甘膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，可以阻断草甘膦对生物合成途径的干扰，从而使植物不被草甘膦杀灭。因此，农作物中转入该基因，可使施用于农田的草甘膦只作用于杂草，而不影响作物的正常生长。

1985年Comai将鼠伤寒沙门氏菌的aroA突变基因转移到烟草上,首次获得抗草甘膦的转基因植物，抗除草剂油菜品种就是利用这种转基因手段获得的。目前生产上应用较多的转基因抗除草剂油菜主要是抗草甘膦除草剂，影响最大的也是转基因抗草甘膦油菜。而且，加拿大等国家已登记发放了大批抗草甘膦油菜品种，如RT73(1995年)、Quest(1996年)、LG3295(1996年)、Hysyn101RR(1997年)、45A50(1998年)、45A51(1998年)、SWArrow(1998年)、ZCT7076(1999年)、PR5374(2000年)等等。因此，在油菜的生产和研究中就需要进行转基因抗草甘膦油菜的鉴定。目前抗草甘膦转基因油菜育种和应用中，一是利用目的基因的特异引物进行聚合酶链式反应（PCR）来鉴定是否存在目的基因DNA片段，如潘爱虎等利用PCR检测转基因抗草甘膦油菜；二是油菜苗期喷施草甘膦溶液筛选转基因抗草甘膦油菜；三是将油菜种子或组织研磨后，利用转基因测试纸条进行检测。前两种方法步骤繁琐、成本高、费时费力、在油菜种质纯度大量鉴定中有局限性，而且苗期喷施草甘膦溶液将导致非抗性材料死亡。第三种方法虽然快速、成本低，但其检测的种子不能保留；若检测单株营养体，鉴定周期必须延长。因此，建立一种能快速鉴定抗草甘膦油菜种子的方法非常重要。

本发明通过探索能有效区分抗性和非抗性油菜种子的最适草甘膦浓度，从而建立一种能快速鉴定抗草甘膦油菜种子的方法，为抗草甘膦油菜的筛选提供了新的快速检测手段。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，至少在一定程度上克服了相关技术中的一个或者多个技术问题。

本申请实施例提供一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，包括以下步骤：

S1,将待检油菜种子置于抗草甘膦浓度为0.1～1.5（g/L）的溶液中浸泡8～10h；

S2,将S1中的浸泡后的种子进行暗培养；

S3,当所述种子幼胚胚根有根毛，即判定所述油菜品种为抗性油菜；幼胚胚根无根毛，即为非抗草甘膦油菜。

在一些实施例中，所述抗草甘膦浓度为0.5～1.0（g/L）。

在一些实施例中，所述暗培养的时间为48～60h。

在一些实施例中，还包括，根据当所述胚根能否到达预设长度，即判定所述油菜品种为抗性或非抗性油菜。

在一些实施例中，还包括，根据当所述胚根到达预设长度，即判定所述油菜品种为抗性油菜。

在一些实施例中，还包括，将检测后的所述油菜幼胚移植到基质中进行培养，根据幼苗进行抗性鉴定验证。

本发明的优点：

本申请实施例提供的方法，通过将油菜种子置于抗草甘膦浓度为0.1～1.5（g/L）的溶液中浸泡，进行培养，根据种子幼胚根根毛的有无，判定所述油菜品种是否为抗性油菜种子，这种检测方法方便，操作简单，成本低且快速有效，能明显减少转基因后续检测的工作量，在植物转基因研究中意义重大。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例7的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法中1.0g/L条件下油菜胚根的发芽状况；

图2是本发明实施例8的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法中1.0g/L条件下油菜胚根的发芽状况；

图3是本发明实施例7的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法的草甘膦浓度为1.0g/L时，不同油菜品种的群体共分离验证结果；

图4是本发明实施例5的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法的草甘膦浓度为0.5g/L时，不同油菜品种的群体共分离验证结果；

图5是本发明实施例的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法中不同油菜品种以不同引物进行PCR扩增，阳性表现与幼胚根毛有无共分离分析结果；

图6是本发明实施例的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法中苗期抗性表现与幼胚根毛有无共分离分析结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，包括以下步骤：

S1,将待检油菜种子置于抗草甘膦浓度为0.1～1.5（g/L）的溶液中浸泡8～10h。

本申请实施例中，待检测油菜种子品种包括：其中，BC1（中双抗）（注：以中双11号作为受体转育的抗草甘膦转基因油菜）、F2（103469-4）（注：以SC4作为受体转育的抗草甘膦转基因油菜）、SC4（注：SC4为杂交油菜品种沣油682的父本）、103421-2和103426-6（注：以SC4作为受体转育的抗草甘膦转基因油菜纯合抗性品系），20A为杂交油菜品种沣油827的母本；草甘膦是一种非选择性除草剂，其作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该合成酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸生物合成过程中一个关键酶；抗草甘膦基天然存在于多个物种中，它们的长度及位置都有所不同，但是都能共同编码抗草甘膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶。通过该酶的作用，可以阻断草甘膦对生物合成途径的干扰，从而使菌种或植物不被草甘膦杀灭。因此，农作物中转入该基因，可使施用于农田的草甘膦只作用于杂草，而不影响作物的正常生长，因此，对于提高作物产量及减轻劳动量、提高劳动效率大有裨益。

在一些实施例中，步骤S1,将待检油菜种子置于抗草甘膦浓度为0.1～1.5（g/L）的溶液中浸泡8～10h,可以通过以下步骤实现：

步骤S11,配置0.1～1.5g/L草甘膦溶液；

步骤S12，准备滤纸，将所述滤纸置于0.1～1.5g/L草甘膦溶液中浸泡。

本申请实施例中，所述浸泡是在室温下进行的，所述室温的温度为25～30℃，所述种子在滤纸上的保湿时间为8-10h。

示例性的，将待检油菜种子置于经抗草甘膦浓度为1.0（g/L）的溶液浸泡过的滤纸上，于25℃，在滤纸上保湿9h。

S2,将S1中的浸泡后的种子进行暗培养。

本申请实施例中，暗培养为：将油菜种子置于一定温度、湿度、通气等适宜的黑暗环境中进行培养。因为植物组织培养中脱分化阶段需要避光培养。光会阻碍组织的脱分化，在无光的条件下愈伤组织长得更快。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜时可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。愈伤组织形成以后，在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株；暗培养于25～28℃条件下进行；暗培养的时间为48～60h。

S3,当所述种子幼胚胚根有根毛，即判定所述油菜品种为抗草甘膦油菜；幼胚胚根光滑无根毛，即为非抗草甘膦油菜。

本申请实施例中，胚根：胚的下部未发育的根；根毛：是指密生在胚根的尖端的细毛，是根吸收水分和养料的主要部分，根毛是表皮细胞向外突出的、顶端密闭的管状结构，易与土粒紧贴在一起，有效地进行吸收作用。

在一些实施例中，所述抗草甘膦浓度为0.5～1.0（g/L）。

在一些实施例中，所述暗培养的时间为48～60h。

本申请实施例中，根据所述胚根能否到达预设长度来判断所述油菜品种为抗性或非抗性油菜，可以作为辅助指标高效区分抗性或非抗性油菜品种，其中，所述预设长度为：25mm，即胚根长度到达身长超过25mm，即可以判定所述油菜品种为抗性油菜，幼胚胚根长度作为辅助指标，为油菜品种的鉴定，提供了双保险，进一步确定鉴定结果的准确性。

示例性的，当胚根长度超过25mm，即判定所述油菜品种为抗性油菜。

本申请实施例中，基质：包括经过发酵腐熟处理的菇渣、醋渣、木薯渣混合发酵物料及椰糠、碳糠或草木灰及草炭、蛭石、珍珠岩；检测后的所述油菜幼胚没有失去活性，将鉴定后的抗性幼胚移植到基质土中培养，可根据成活的幼苗进一步进行抗性鉴定。所述抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，经过多次测试，对所有油菜品种普遍适用。

实施例1

S1,将待检油菜种子置于0.1g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿8h；

S2,将S1的浸泡后的种子置于28℃条件下进行发芽暗培养60h；

S3,观察草甘膦溶液发芽暗培养种子幼胚胚根根毛的有无，幼胚胚根光滑无根毛，即为非抗性油菜品种，幼胚胚根有根毛即为非抗性品种。

实施例2

S1,将待检油菜种子置于0.1g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿10h；

S2,将S1的浸泡后的种子置于25℃条件下进行发芽暗培养48h；

实施例3

S1,将待检油菜种子置于1.5g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿8h；

S2,将S1的浸泡后的种子置于28℃条件下进行发芽暗培养60h；

实施例4

S1,将待检油菜种子置于1.5g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿10h；

S2,将S1的浸泡后的种子置于25℃条件下进行发芽暗培养48h；

实施例5

S1,将待检油菜种子置于0.5g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿8h；

S2,将S1的浸泡后的种子置于28℃条件下进行发芽暗培养60h；

实施例6

S1,将待检油菜种子置于0.5g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿10h；

S2,将S1的浸泡后的种子置于25℃条件下进行发芽暗培养48h；

实施例7

S1,将待检油菜种子置于1.0g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿8h；

S2,将S1的浸泡后的种子置于28℃条件下进行发芽暗培养60h；

实施例8

S1,将待检油菜种子置于1.0g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿10h；

S2,将S1的浸泡后的种子置于25℃条件下进行发芽暗培养48h；

对照组

S1,将待检油菜种子分别置于ddH₂O（对照）浸泡的滤纸上，室温下保湿8-10h；

S2,将S1的种子置于25-28℃条件下进行发芽暗培养48-60h；

S3,观察S2中利用ddH₂O暗培养种子幼胚胚根根毛的有无和伸长度。

将实施例1-8所培养的种子幼胚和对照组的种子幼胚进行比较，发现

实施例1-8的种子幼胚根毛正常生长且胚根长度明显长于对照，即为抗性油菜品种；对照组幼胚胚根光滑无根毛且胚根长度明显短于对照，即为非抗性油菜品种。

实验例：

1.供试材料和试剂

1.1供试材料，如表1

表1供待鉴定油菜材料

其中，BC1（中双抗）（注：以中双11号作为受体转育的抗草甘膦转基因油菜）、F2（103469-4）（注：以SC4作为受体转育的抗草甘膦转基因油菜）、SC4（注：SC4为杂交油菜品种沣油682的父本）、103421-2和103426-6（注：以SC4作为受体转育的抗草甘膦转基因油菜纯合抗性品系），20A为杂交油菜品种沣油827的母本；

1.2试剂

农达（41%草甘膦异丙胺盐水剂），美国孟山都公司生产；国产琼脂（agar）购于北京索莱宝科技有限公司。

2.抗草甘膦油菜种子快速鉴定方法的构建

2.1草甘膦溶液处理浓度筛选

将裁成适合大小的3层滤纸后置于培养皿中，倒入不同质量浓度（5.0g/L、1.0g/L、0.5g/L、0.25g/L、0.1g/L）的草甘膦溶液至滤纸充分湿润。将培养皿平分为两部分，分别取非抗性材料和纯合抗性后代各25粒种子播种在培养基上，在室温下保湿8-10h后暗培养48～60h。观察不同浓度草甘膦溶液中各材料的幼胚伸长状况及胚根有无根毛，筛选能有效区分抗性与非抗性油菜的草甘膦溶液浓度。记录根毛有无结果，幼胚有无根毛数目记录结果如表2。结果表明，在0.5～1.0g/L剂量范围内的草甘膦浓度为快速鉴定抗性油菜品系的最适浓度。

表2草甘膦抗性表型鉴定结果

图1和图2均是本发明实施例的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法中1.0g/L草甘膦溶液发芽培养后的油菜胚根的发育状况；

其中，图1中A为SC4油菜品系阴性对照，图1中B为103421-2油菜品系阳性对照,图2中C为103421-2油菜品系阳性对照，图2中D为SC4油菜品系阴性对照。

如图1和图2所示：阴性对照均发芽，但胚根短小且均无根毛生长；阳性对照均发芽，胚根较长且均有根毛生长，所以在草甘膦浓度为0.5～1.0g/L剂量范围内内快速鉴定抗性油菜品系，通过根据所述胚根根毛的有无结合与阴性对照培根伸长长度比较，可以鉴定所述油菜品种为抗性或非抗性油菜。

即胚根到达预设长度或有根毛，即判定所述油菜品种为抗性油菜；胚根不能到达预设长度或无根毛，即判定所述油菜品种为非抗性油菜。

2.2 在后代分离群体中抗性单株鉴定

2.2.1 分离群体的幼胚表型筛选

将待检油菜抗性分离群体种子BC1（中双抗）和F2（103469-4）分别置于ddH₂O（对照）和0.5～1.0g/L草甘膦溶液浸泡的滤纸上，室温下保湿8～10h，然后置于25～28℃条件下进行发芽暗培养48～60h；观察利用ddH₂O和草甘膦溶液发芽暗培养种子幼胚胚根根毛的有无和伸长度，幼胚胚根光滑无根毛且长度明显短于对照，即为非抗性单株，根毛正常生长和幼胚胚根的即为非抗性单株。表型鉴定结果（即抗性和非抗性颗粒总数）结果记录如表3，卡方检验表明BC1分离群体抗性单株：非抗单株符合1:1分离比，F2分离群体抗性单株：非抗单株符合3:1分离比，说明在草甘膦浓度为0.5～1.0g/L剂量范围内能够有效鉴定抗性和非抗性油菜。

表3 F2、BC1表性结果卡方检验X²

2.2.2 分离表型鉴定和PCR扩增鉴定结果的共分离验证

将步骤2.2.1中获得的抗性和非抗性幼胚移植到基质土中培养，至四到五片真叶时，选取幼嫩茎叶提取DNA，利用FMV35S、GOX（修饰）、CP4-EPSPS为引物进行PCR，对PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍照，记录结果。幼苗喷施大田除草浓度的草甘膦溶液，五到七天后观察油菜苗期的抗性表现。

利用CTAB法提取步骤2.2.1幼胚基因组DNA，利用FMV35S、GOX（修饰）、CP4-EPSPS为引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

dNTPs(2.5 mM) 0.8ul

10×Taq polymerase buffer (MgCl2) 2.0 ul

Primer F(5 uM) 1.0ul

Primer R(5 uM) 1.0ul

Taq polymerase(5 U/uL) 0.4ul

DNA template 1.0ul

ddH2O补足20 ul。

3.3 所述PCR反应程序：94℃，5min；94℃，20s；59℃，40s；72℃，40s；40个循环；72℃，3min；15℃，2min。

PCR反应以ddH2O作为空白对照，对所有PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍照，记录结果。引物序列如表4所示，FMV 35S和CP4-EPSPS基因扩增长度为200bp，GOX基因扩增长度为450bp。

表4引物序列

实验结果：

以FMV35S为引物分别扩增中双抗BC1分离群体和103469-4 F2分离群体单株，PCR阳性和非阳性表现与表型鉴定结果均呈共分离，说明在草甘膦浓度为0.5～1.0g/L时发芽培养油菜种子，可以有效鉴定出待检种子是否含有抗草甘膦基因。

通过琼脂糖凝胶电泳均表现为阳性的单株，喷施草甘膦后未发现有死亡现象，表现阴性的单株在7～12天全部死亡，这些结果说明草甘膦浓度为0.5～1.0g/L时，幼胚上长有根毛的油菜种子含有抗除草剂基因，且苗期对草甘膦表现为抗性。

其中，图中a、c、e、g为阳性对照,b、d、f、h为阴性对照。

如图5所示：

左上以FMV35S为引物扩增浙江抗油菜品系;左下以GOX为引物扩增浙江抗油菜品系;

右上以FMV35S为引物扩增103426-6油菜品系;右下以GOX为引物扩增103426-6油菜品系。

图3是本发明实施例的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法的草甘膦浓度为1g/L时，不同油菜品种的群体共分离验证结果；图4是本发明实施例1的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法的草甘膦浓度为0.5g/L时，不同油菜品种的群体共分离验证结果；

其中，E、H表示油菜品系为103421-2，F、I表示油菜品系为103469-4，G、J表示油菜品系为SC4。

如图4和图5所示：表现为抗性的株数与BC1（中双抗）和F2（103469-4）群体分离比无显著差异，说明在草甘膦浓度为0.5～1.0g/L剂量范围内能够有效鉴定抗性和非抗性油菜。

图6是本发明实施例的一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法中苗期抗性表现与幼胚根毛有无共分离分析结果；

其中，1-6以FMV35S为引物，7-12以GOX为引物，13-18以CP4-EPSPS为引物。

如图6所示：通过琼脂糖凝胶电泳均表现为阳性，且喷施除草剂草甘膦后未发现有死亡现象，这些结果说明草甘膦浓度为0.5～1.0g/L时，幼胚长有根毛的油菜种子含有抗除草剂基因，且苗期对草甘膦表现为抗性。

本发明的有益效果：

（1）在植物转基因研究中意义重大，在油菜种质纯度鉴定中具有很好的应用前景，能大大减少资金与时间的投入，在大规模检测中具有一定的实用价值。

（2）通过本发明可以得出，在抗草甘膦后代种子萌发阶段加入额外筛选压力完全可以有效地区分抗性和非抗性油菜植株。

（3）本发明的检测方法快速简便、省钱、省力、且结果可靠，在大规模的油菜种质纯度鉴定以及抗草甘膦油菜种子的筛选中具有一定的实用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2,将S1中的浸泡后的种子进行暗培养；

S3,当所述种子幼胚胚根有根毛，即判定所述油菜品种为抗草甘膦油菜；幼胚胚根无根毛，即为非抗草甘膦油菜。

2.根据权利要求1所述的抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，其特征在于，所述抗草甘膦浓度为0.5～1.0（g/L）。

3.根据权利要求1或2所述的抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，其特征在于，所述暗培养的时间为48～60h。

4.根据权利要求1所述的抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，其特征在于，还包括，根据当所述种子幼胚胚根能否到达预设长度，即判定所述油菜品种为抗性或非抗性油菜。

5.根据权利要求1所述的抗草甘膦油菜种子的鉴定方法，其特征在于，还包括，将检测后的所述油菜幼胚移植到基质中进行培养，根据幼苗进行抗性鉴定验证。