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CN110819707B - 一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法 - Google Patents

一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法 Download PDF

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CN110819707B CN201911160967.5A CN201911160967A CN110819707B CN 110819707 B CN110819707 B CN 110819707B CN 201911160967 A CN201911160967 A CN 201911160967A CN 110819707 B CN110819707 B CN 110819707B
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Abstract

本发明公开了一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点（IRES）元件的高通量鉴定方法。利用针对mRNA链5’‑端帽子结构及3’‑端多聚腺苷酸尾巴设计的寡聚核苷酸通过逆转录从样本中获取全长的cDNA文库，利用TN5转座酶及所设计含特殊接头序列的核酸片段使cDNA文库片段化，利用含有红色荧光蛋白及绿色荧光蛋白及特殊元件的慢病毒报告基因质粒载体来筛选具有活性的IRES元件并排除翻译过程中造成的假阳性结果，利用长读长测序技术对活性IRES元件进行鉴定并排除转录过程中启动子及可变剪切造成的假阳性结果。所述方法将IRES元件的高通量鉴定推向临床应用，从而可对疾病发生发展过程中IRES元件所扮演的角色进行深入研究。

Description

一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高 通量鉴定方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法。
背景技术
内部核糖体结合位点（IRES）元件是近年来在人体中被发现参与发育及应激等重要功能的一类位于mRNA的核酸元件。由于其特殊性及重要性，对于筛选哪些mRNA含有IRES元件对于研究其在各类生命活动中的角色尤为重要。目前对于IRES元件的鉴定方法存在一些局限性：
1、传统的IRES元件鉴定的方法采用双荧光素酶报告基因系统，即将潜在具有IRES活性的序列通过分子克隆技术获取后插入报告基因载体，通过试剂盒对荧光素酶活性进行检测并与阴性对照或阳性对照进行对比，从而判断其是否具有IRES活性。这种方法目前被绝大多数实验室用于IRES元件的鉴定，但由于通量不高，所以目前通过这种方法被鉴定的IRES元件并不多。同时，由于假阳性结果存在的可能性，因此需要额外的实验来排除这些假阳性的结果。
2、为了解决通量问题，有高通量鉴定的方法被开发，如通过检测在细胞应激条件下，认为仍能与核糖体结合的mRNA群体中包含含有IRES元件的mRNA，或在非细胞系统通过人工合成的mRNA进行体外翻译，通过判断插入片段的翻译效率的强弱来判断其序列是否存在潜在的IRES活性。但这些方法也存在局限性，如与核糖体结合的mRNA也有可能不存在IRES元件，从而无法一次性地获得检测结果，或在体外进行翻译活性鉴定的方法忽略了细胞微环境对其IRES活性的影响，从而得到的结果并不真实。因此，利用报告基因系统对IRES元件的鉴定仍然是金标准，在这些方法后续仍需要通过报告基因系统来对结果进行验证，因此通量不高的问题并未得到解决。
3、随后，有研究利用荧光分选技术对人工合成的核酸序列进行了检测，但这项技术并未对针对细胞样本来源的IRES元件进行设计，且该技术仅仅照搬了传统IRES元件检测的模式，因此仍需要通过额外的高通量实验对启动子活性及可变剪切位点可能造成的假阳性结果进行排除。而对于高通量检测而言，步骤的繁复既增加资金的投入，同时由于其流程较长，多次高通量结果之间可能存在的差异又对结果的判读造成影响。
综上所述，建立起一种高通量地，针对性强的，流程相对简洁的针对多种来源细胞样本中所包含的IRES元件鉴定的方法迫在眉睫，但目前尚无能解决上述局限性的方法被建立。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法包括如下步骤：
（1）利用寡聚核苷酸链从各种来源的细胞样本中获取含有所有被转录的mRNA的全长cDNA文库；
（2）利用核酸碎片化技术将所获取的全长cDNA文库片段化成100-2000 bp大小的DNA片段；
（3）将被片段化的DNA片段插入含有两种不同类型报告基因的双顺反子质粒载体中，并使质粒载体在不同细胞中表达；
（4）根据两段顺反子基因的表达情况比值，并通过活细胞分选系统将携带活性IRES元件的细胞分选出来，利用针对mRNA链5’-端帽子结构及3’-端下游报告基因序列设计的寡聚核苷酸，通过逆转录从样本中获取全长的含有上游报告基因、插入序列、下游报告基因的cDNA文库，并对不同比值强度组cDNA文库利用核酸序列码进行标记；所述的核酸序列码是可以被添加在报告基因序列两端的核苷酸片段；
（5）通过长读长测序技术对各组片段进行测序，并通过测序结果判断片段是IRES元件还是启动子或者可变剪切位点。
优选地，步骤（1）中所述的寡聚核苷酸链包括两条分别能结合于mRNA链上的5’-端帽子结构及3’-端多聚腺苷酸尾巴序列，和一对序列相同的能用于扩增cDNA文库的寡聚核苷酸链。
更优选地，步骤（1）中所述的寡聚核苷酸链序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
优选地，步骤（2）中所述将所获取的全长cDNA文库片段化成100-2000 bp大小的DNA片段，是利用TN5转座酶和针对TN5转座酶设计的转座子-酶切位点的由核苷酸组成的接头对，实现cDNA文库进行片段化，并使双链DNA片段化后长度范围处于100-2,000 bp之间。
更优选地，所述核苷酸组成的接头对中的一组序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；另一组序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
优选地，步骤（3）中所述的含有两种不同类型报告基因的双顺反子质粒载体的骨架为慢病毒载体，双顺反子为可发射不同波长荧光的上游红色荧光蛋白和下游绿色荧光蛋白，所述上游红色荧光蛋白的终止密码子之后有三联终止密码子、发卡结构及多克隆位点序列。
优选地，步骤（4）中所述的活细胞分选系统的内部元件可以检测荧光信号并对发射出不同荧光强度的活细胞进行区分并收集。
优选地，步骤（4）中所述的寡聚核苷酸链包括两条分别能结合于mRNA链上的5’-端帽子结构及3’-端下游报告基因序列，和一对序列相同的能用于扩增cDNA文库的寡聚核苷酸链。
更优选地，步骤（4）中所述的寡聚核苷酸链序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.3所示。
优选地，步骤（5）中所述长读长测序技术检测的核酸片段长度范围为5 -50 kb。
更优选地，所述长读长测序技术检测的核酸片段长度范围为10 -15 kb。
本发明的工作原理是利用全长mRNA序列逆转录及扩增技术从细胞来源的样本中获取含有真实的IRES元件的cDNA文库，利用特殊的双顺反子质粒载体完成对IRES元件活性的测定及排除由翻译过程中通读造成的假阳性结果，利用长读长测序技术完成IRES元件的鉴定及排除由启动子和可变剪切位点造成的假阳性结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明所述方法可以高通量地鉴定全转录组的潜在IRES元件。
（2）本发明所述方法可以便捷地利用从各种来源的细胞样本中提取总RNA完成文库构建，并用于高通量地鉴定IRES元件。所述各种来源的细胞样本包括患者来源组织样本，动物来源组织样本以及细胞株来源样本。
（3）本发明所述方法可以根据实验目的选取不同细胞进行IRES元件活性测定。所述的不同细胞，这些细胞的培养条件或细胞种类可以根据使用者的需要进行调整，如选取肿瘤来源细胞，在细胞培养过程中加入应激因素，以及在细胞中对基因进行干扰、过表达及基因编辑。
（4）本发明所述方法可以利用单次长读长测序完成IRES元件的鉴定及排除由启动子和可变剪切位点造成的假阳性结果。相比传统方法中不可避免的多次高通量测序带来的额外费用支出及人力物力的消耗，本发明所述方法能显著节约成本，仅利用一次高通量测序即可对IRES元件进行鉴定并排除其他可能干扰结果判读的假阳性结果。避免了多次高通量测序自身的复杂流程对结果一致性造成的影响，从而提高结果的准确性。
总之，利用针对mRNA链5’-端帽子结构及3’-端多聚腺苷酸尾巴设计的寡聚核苷酸通过逆转录从样本中获取全长的cDNA文库，利用TN5转座酶及所设计含特殊接头序列的核酸片段使cDNA文库片段化，利用含有红色荧光蛋白及绿色荧光蛋白及特殊元件的慢病毒报告基因质粒载体来筛选具有活性的IRES元件并排除翻译过程中造成的假阳性结果，利用长读长测序技术对活性IRES元件进行鉴定并排除转录过程中启动子及可变剪切造成的假阳性结果。所述方法将IRES元件的高通量鉴定推向临床应用，从而可对疾病发生发展过程中IRES元件所扮演的角色进行深入研究。
本发明建立了一种高通量的可用于系统地鉴定多种细胞来源的样本中的IRES元件的方法，可用于系统地的发现及鉴定包含但不限于人类组织等细胞来源的样本中的IRES元件，较传统用于鉴定IRES元件的方法通量更高，过程更简洁，目的性更明确。
附图说明
图1是本发明所述高通量的可用于系统地鉴定多种细胞来源的样本中的IRES元件的方法流程图；
图2是发明中文库构建步骤中的具体方法示意图；
图3是发明中所用载体结构图及IRES元件活性鉴定及分选步骤中的具体方法示意图；
图4是发明中IRES元件序列鉴定步骤中的原理及具体方法示意图。
具体实施方式
所述针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法包括如下步骤：
1、利用RNA提取试剂Trizol提取细胞来源的总RNA。利用Nanodrop分光光度计检测所提取的总RNA的浓度，并利用设计的两条分别能结合于mRNA链上的5’-端帽子结构及3’-端多聚腺苷酸尾巴序列的寡聚核苷酸链进行逆转录过程。所述寡聚核苷酸链序列为：能结合5’-端帽子结构的寡聚核苷酸(5’-3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG（SEQ IDNO.1；其中，倒数第二个和倒数第三个G为核糖核苷酸碱基G；最后一个G为锁核苷酸碱基G）；其余均由序列所标注脱氧核糖核苷酸碱基组成），能结合3’-端多聚腺苷酸尾巴序列的寡聚核苷酸(5’-3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN（SEQID NO.2；其中，V为混合脱氧核糖核苷酸碱基组分，其组成成分为三种脱氧核糖核苷酸碱基C, G, A；N为混合脱氧核糖核苷酸碱基组分，其组成成分为四种脱氧核糖核苷酸碱基C, G,A, T；其余序列均由所标注脱氧核糖核苷酸碱基组成）。合成的cDNA第一链通过一对序列相同的引物(5’-3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（SEQ ID NO.3）来进行聚合酶链式反应达到扩增的目的。扩增后的双链cDNA文库用于后续步骤。
2、利用TN5转座酶和针对TN5转座酶设计的转座子-酶切位点的由核苷酸组成的接头对实现对获取的cDNA文库进行片段化。所述由核苷酸组成的接头有两对寡聚核苷酸链(5’-3’) ：pCTGTCTCTTATACACATCTGG（SEQ ID NO.4；其中，pC为磷酸化修饰脱氧核糖核苷酸碱基C）和pCGCGCCAGATGTGTATAAGAGACAG（SEQ ID NO.5；其中，pC为磷酸化修饰脱氧核糖核苷酸碱基C），pCTGTCTCTTATACACATCTCG（SEQ ID NO.6；其中，pC为磷酸化修饰脱氧核糖核苷酸碱基C）和pGACCGAGATGTGTATAAGAGACAG（SEQ ID NO.7；其中，pG为磷酸化修饰脱氧核糖核苷酸碱基G）分别进行退火反应形成。通过将TN5转座酶、由核苷酸组成的接头以及双链cDNA文库在55℃进行时长1小时的孵育后，对片段化的文库用磁珠进行富集，使其长度范围处于100 bp-2000 bp之间。用微量核酸浓度检测试剂盒检测富集后的片段化cDNA文库浓度，用毛细管电泳技术对富集后的片段化cDNA文库进行长度范围检测。
3、将片段化后的cDNA文库插入含有两种不同类型报告基因的双顺反子质粒载体的两段顺反子间。所述含有两种不同类型报告基因的双顺反子质粒载体，该载体骨架为慢病毒载体，两段顺反子为可发射不同波长荧光的红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白，且在上游红色荧光蛋白的终止密码子之后有三联终止密码子、发卡结构及多克隆位点序列。三联终止密码子及发卡结构可以避免翻译过程中的通读现象造成的假阳性结果，而多克隆位点则有利于cDNA文库的插入。载体的具体信息见附图说明图3中的载体图谱。将构建好的载体转导进入细胞内进行病毒包装，获得的病毒经过滴度测定后，根据实验目的转导进入不同的细胞中。这些被感染的细胞会根据插入的片段的IRES元件活性不同而表达不同强度的下游顺反子，通过与上游顺反子表达强度进行对比可以检测IRES元件的活性。
4、将被病毒感染的细胞进行6到7天的培养后，通过流式细胞分选仪根据上游红色荧光蛋白及下游绿色荧光蛋白的强度比值进行分选。根据比值从大到小可分为6组。每组细胞分别进行总RNA的提取，随后对所提取的RNA进行逆转录及聚合酶链式反应达到扩增获取全长双链cDNA文库的目的。在此过程中，利用设计的两条分别能结合于mRNA链上的5’-端帽子结构及3’-端下游顺反子序列的寡聚核苷酸链进行逆转录。所述寡聚核苷酸链序列为：能结合5’-端帽子结构的寡聚核苷酸(5’-3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG（SEQ IDNO.1；其中，倒数第二个和倒数第三个G为核糖核苷酸碱基G；最后一个G为锁核苷酸碱基G），能结合3’-端下游顺反子序列的寡聚核苷酸(5’-3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTAGCTACTAGCTAGTCGAGATCTGAGT（SEQ ID NO.8）。在合成全长的含有上游报告基因-插入序列-下游报告基因的双链cDNA文库后，在不同组加入不同的核酸序列码连接在其末端进行标记。所述核酸序列码的特征在于其是核酸序列不同核苷酸片段，可以被添加在核苷酸双链的两端。这些序列码因为序列不同，因此可以在后续的测序过程中被区分，从而根据被区分的序列判断这段序列来源于荧光强度比值范围为多少的细胞群体。
5、将被核酸序列码标记后的双链cDNA链利用标准的三代测序文库构建流程进行建库，并通过三代测序技术对所有序列进行鉴定。由于上下游顺反子长度之和为1447 bp，而插入片段的长度范围为100 bp-2000 bp，因此片段长度范围在1500 bp- 3500 bp之间。因此，可选取测序长度范围在5 kb-50 kb的长读长测序技术对被标记的双链cDNA的序列进行完整地检测。 同时，参考见附图说明图4中的原理介绍，对于受启动子活性造成的假阳性结果片段，其上游顺反子序列会缺失，对于含有潜在剪切位点序列，其上游顺反子序列会受到一定程度的剪切，对于非特异性扩增，其下游序列不包含步骤3中所述双顺反子质粒载体所包含的下游顺反子序列。因此，只有上下游顺反子均完整的序列才会被认为是IRES元件，而其余异常序列也可以在同一次测序过程中被鉴定。在测序过程中同时可以区分所述核酸序列码序列，从而判断这段序列来源于荧光强度比值为多少的细胞群体。通过此法能够完成IRES元件活性及序列的鉴定，并消除假阳性结果对结果判读的干扰。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法
<141> 2019-11-23
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> null
<400> 1
aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg 30
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> null
<400> 2
aagcagtggt atcaacgcag agtacttttt tttttttttt tttttttttt tttttvn 57
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 3
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> null
<400> 4
ctgtctctta tacacatctg g 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> null
<400> 5
cgcgccagat gtgtataaga gacag 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> null
<400> 6
ctgtctctta tacacatctc g 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> null
<400> 7
gaccgagatg tgtataagag acag 24
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> null
<400> 8
aagcagtggt atcaacgcag agtactagct actagctagt cgagatctga gt 52

Claims (4)

1.一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）利用寡聚核苷酸链从各种来源的细胞样本中获取含有所有被转录的mRNA的全长cDNA文库；
（2）利用核酸碎片化技术将所获取的全长cDNA文库片段化成100-2000 bp大小的DNA片段；
（3）将被片段化的DNA片段插入含有两种不同类型报告基因的双顺反子质粒载体中，并使质粒载体在不同细胞中表达；
（4）根据两段顺反子基因的表达情况比值，并通过活细胞分选系统将携带潜在活性IRES元件的细胞分选出来，利用针对mRNA链5’-端帽子结构及3’-端下游报告基因序列设计的寡聚核苷酸，通过逆转录从样本中获取全长的含有上游报告基因、插入序列、下游报告基因的cDNA文库，并对不同比值强度组cDNA文库利用核酸序列码进行标记；所述的核酸序列码是可以被添加在报告基因序列两端的核苷酸片段；
（5）通过长读长测序技术对各组片段进行测序，并通过测序结果判断片段是IRES元件还是启动子或者可变剪切位点；
其中，步骤（1）中所述的寡聚核苷酸链包括两条分别能结合于mRNA链上的5’-端帽子结构及3’-端多聚腺苷酸尾巴序列，和一对序列相同的能用于扩增cDNA文库的寡聚核苷酸链；步骤（2）中所述将所获取的全长cDNA文库片段化成100-2000 bp大小的DNA片段，是利用TN5转座酶和针对TN5转座酶设计的转座子-酶切位点的由核苷酸组成的接头对，实现cDNA文库进行片段化，并使双链DNA片段化后长度范围处于100-2,000 bp之间；步骤（3）中所述的含有两种不同类型报告基因的双顺反子质粒载体的骨架为慢病毒载体，双顺反子为可发射不同波长荧光的上游红色荧光蛋白和下游绿色荧光蛋白，所述上游红色荧光蛋白的终止密码子之后有三联终止密码子、发卡结构及多克隆位点序列；步骤（4）中所述的活细胞分选系统的内部元件可以检测荧光信号并对发射出不同荧光强度的活细胞进行区分并收集；步骤（4）中所述的寡聚核苷酸链包括两条分别能结合于mRNA链上的5’-端帽子结构及3’-端下游报告基因序列，和一对序列相同的能用于扩增cDNA文库的寡聚核苷酸链；步骤（5）中所述长读长测序技术检测的核酸片段长度范围为5 -50 kb，对于受启动子活性造成的假阳性结果片段，其上游顺反子序列会缺失，对于含有潜在剪切位点序列，其上游顺反子序列会受到一定程度的剪切，对于非特异性扩增，其下游序列不包含步骤（3）中所述双顺反子质粒载体所包含的下游顺反子序列，只有上下游顺反子均完整的序列才会被认为是IRES元件，并根据序列码序列判断IRES元件来源于荧光强度比值范围为多少的细胞群体，以此评估IRES元件的活性。
2.根据权利要求1所述针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法，其特征在于，步骤（1）中所述的寡聚核苷酸链序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法，其特征在于，所述核苷酸组成的接头对中的一组序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示；另一组序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1所述针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法，其特征在于，步骤（4）中所述的寡聚核苷酸链序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.3所示。
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