CN110819665B - 一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种6，7，8‑三羟基香豆素的制备方法，该方法包括：(1)以秦皮苷或/和秦皮素为起始原料，将所述原料加入第一溶液中使其溶解，获得原料液；(2)动物粪菌制作载体：在无菌条件下收集动物的新鲜粪便，加入生理盐水匀浆，离心后取上清液；(3)厌氧培养：将所述上清液加入到营养肉汤中，厌氧恒温培养后，加入所述原料液，再加入厌氧培养液，厌氧恒温培养，获得第一培养液；(4)产物的提取：萃取所述第一培养液，合并萃取液后减压回收；(5)产物的纯化：利用制备液相色谱进行纯化。本发明转化率可达98.0％以上，步骤简单、速度快，对环境友好，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法。
背景技术
秦皮素和秦皮苷，香豆素类化合物，是中药秦皮的有效成分，秦皮素是秦皮苷的水解产物。Bruno M.Bizzarri等人以秦皮素为底物，2-碘酰基苯甲酸为氧化剂，反应生成6，7，8-三羟基香豆素，生成的产物较秦皮素有更强的抗氧化性和抑菌活性。但该种合成方法具有副产物多，反应终点不易控制，产物不易分离的缺点。因此，有必要研究一种新型的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法。
微生物转化研究始于20世纪，旨在利用细菌、真菌或其它微生物与外源性底物共培养，得到有价值的产物，其中发挥主要作用的是微生物产生的酶。中药中含有多种复杂的有效成分，每一类成分都发挥了重要的作用，但是传统中药研究已不能满足人民日益增长的用药需求，因此，将中药与微生物转化相结合，有助于更好地提炼和转化其中的有效成分。
发明内容
本发明目的是提供一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是：一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，该方法包括：(1)以秦皮苷或/和秦皮素为起始原料，将所述原料加入第一溶液中使其溶解，获得原料液；
(2)动物粪菌制作载体：在无菌条件下收集动物的新鲜粪便，加入生理盐水匀浆，离心后取上清液；
(3)厌氧培养：将所述上清液加入到营养肉汤中，厌氧恒温培养后，加入所述原料液，再加入厌氧培养液，厌氧恒温培养，获得第一培养液；
(4)产物的提取：萃取所述第一培养液，合并萃取液后减压回收；
(5)产物的纯化：利用制备液相色谱进行纯化。
进一步的，步骤(1)中所述第一溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液、碳酸缓冲液、Tris缓冲液或者水。
进一步的，步骤(2)中所述粪便为大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或人类的粪便，优选为大鼠粪便。
进一步的，步骤(3)中所述营养肉汤的成分为蛋白胨、牛肉浸粉，所述营养肉汤成分可以为任意一种或两种成分的组合。
进一步的，步骤(3)中所述厌氧的条件为CO2、N2、Ar或He氛围，所述培养的时间为2-10d。
进一步的，步骤(3)中所述厌氧培养液的成分为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁、刃天青、L-半胱氨酸、L-抗坏血酸；所述厌氧培养液的加入量是所述营养肉汤体积的0.2-5倍。
进一步的，步骤(4)中所述萃取的溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、二氯甲烷或正己烷，萃取剂的量为0.5-2倍，次数为1至3次。
进一步的，步骤(5)中的分离使用硅胶、C8柱、C18柱中的任意一种。
本发明提供了一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，优点为：解决了现有6，7，8三羟基香豆素生产工艺复杂、效率低的难题，具有操作步骤简单、转化效率高、转化率可达98.0％以上、速度快，对环境友好，适合工业化生产的特点。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为本发明在实施方式中秦皮苷和秦皮素的微生物转化示意图，其中，(A)为秦皮苷，(B)为秦皮素，(C)为6，7，8-三羟基香豆素；
图2为本发明在实施例2中时间对产物6，7，8-三羟基香豆素转化率得影响的示意图，其中，1为秦皮素，2为6，7，8-三羟基香豆素；
图3为本发明在实施例3中时间对产物6，7，8-三羟基香豆素转化率得影响的示意图，其中，1为秦皮苷，2为秦皮素，3为6，7，8-三羟基香豆素。
具体实施方式
本发明提供了一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，包括步骤：
(1)秦皮苷或/和秦皮素为起始原料：加入生理盐水或其它溶液使其溶解；
(2)动物粪菌为载体：在无菌条件下收集动物的新鲜粪便，可以为大鼠、小鼠、人类或者其它动物的粪便，优选大鼠粪便，加入生理盐水匀浆，离心后取上清液，离心速度为2000-4000r/min，时间为5-10min；
(3)厌氧培养：将上述上清液加入到营养肉汤中，CO2、N2或其它无氧条件36.0-38.0℃恒温培养12-36h，加入原料，再加入0.5-1.0倍体积的厌氧培养液，厌氧恒温培养；
(4)产物的提取：萃取上述培养液，萃取溶剂可用乙酸乙酯、正丁醇或其它与水不互溶的有机溶剂，优选乙酸乙酯，萃取1至3次，合并萃取液后减压回收；
(5)产物的纯化：用硅胶、ODS或其它填料进行分离，优选硅胶或ODS。
其微生物转化过程如图一。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例按如下步骤展示一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法
1.原料准备
精密称取秦皮素50.0mg，0.83mL DMSO助溶后4.17mL生理盐水溶解。
2.营养肉汤和厌氧培养液的配置
取18.0g营养肉汤和9.5g厌氧培养液，分别加入1000mL去离子水，溶解后封口，120℃高压蒸汽灭菌15min。
3.不同粪便的收集和体外培养
在超净工作台上收集6只SD雄性大鼠的新鲜粪便共5.0g，加入25.0mL的无菌生理盐水后匀浆，取上清液25mL加入到提前灭好菌的100mL营养肉汤中，混匀，放入37℃的恒温培养箱CO2厌氧培养24h，使菌充分生长。用相同的方法收集小鼠、人类、豚鼠、兔子的粪便后体外培养
4.秦皮素的粪菌转化
将5mL原料和50mL厌氧培养液加入到培养了24h的100mL粪菌液中，37℃厌氧培养7d，HPLC监测反应。
表1
请参阅表1，表1为本发明实施例1中不同的物种粪便对6，7，8-三羟基香豆素转化率的影响；如表1所示，各物种粪便对6，7，8-三羟基香豆素转化率影响为：大鼠>人>小鼠>豚鼠>兔子。
实施例2
本实施案例按如下步骤展示一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法：
1.原料准备
精密称取秦皮素50.0mg，0.83mL DMSO助溶后4.17mL生理盐水溶解。
2.营养肉汤和厌氧培养液的配置
取18.0g营养肉汤和9.5g厌氧培养液，分别加入1000mL去离子水，溶解后封口，120℃高压蒸汽灭菌15min。
3.大鼠粪菌的体外培养
在超净工作台上收集6只SD雄性大鼠的新鲜粪便共5.0g，加入25.0mL的无菌生理盐水后匀浆，取上清液25mL加入到提前灭好菌的100mL营养肉汤中，混匀，放入37℃的恒温培养箱CO2厌氧培养24h，使菌充分生长。
4.秦皮素的粪菌转化
将5mL原料和50mL厌氧培养液加入到培养了24h的100mL粪菌液中，37℃厌氧培养7d，HPLC监测反应。
如图2所示，代谢产物从第二天开始产生，第三天转化率达17.21％，第五天转化率为42.79％，第七天转化率为100％。
5.代谢产物的分离制备
用1倍体积量的乙酸乙酯萃取上述培养液，重复三次，合并萃取液后减压回收，5mL50％的甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，制备液相分离。
6.代谢产物的鉴定
代谢产物15mg用DMSO-d6溶解后，1H-NMR(600MHz)、13C-NMR(151MHz)分析。代谢产物1mg溶解于2mL 50％色谱甲醇中，LC-MS分析。
转化产物为黄色粉末状固体，易溶于乙酸乙酯、二甲基亚砜，微溶于甲醇，最大吸收为334nm。1H-NMR(600MHz,dmso)，δ:7.82(1H,d,J＝9.42,3H),6.55(1H,s,5H),6.14(1H,d,J＝9.42,4H)；13C-NMR(151MHz,dmso)，δ:160.69(C,C-2),145.02(C,C-4),143.01(C,C-6),139.18(C,C-7),138.10(C,C-8a),132.92(C,C-8),111.45(C,C-3),110.31(C,C-4a),103.16(C,C-5)；ESI-MS，m/z:193.9。通过以上信息可确定转化产物为6，7，8-三羟基香豆素。
实施例3
本实施案例按如下步骤展示一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法：
1.原料准备
精密称取秦皮苷50.0mg，0.83mL DMSO助溶后4.17mL生理盐水溶解。
2.营养肉汤和厌氧培养液的配置
取18.0g营养肉汤和9.5g厌氧培养液，分别加入1000mL去离子水，溶解后封口，120℃高压蒸汽灭菌15min。
3.大鼠粪菌的体外培养
在超净工作台上收集6只SD雄性大鼠的新鲜粪便共5.0g，加入25.0mL的无菌生理盐水后匀浆，取上清液25mL加入到提前灭好菌的营养肉汤100mL，混匀，放入37℃的恒温培养箱CO2厌氧培养24h，使菌充分生长。
4.秦皮苷的粪菌转化
将5mL原料和50mL厌氧培养液加入到培养24h的100mL粪菌液中，37℃厌氧培养10d，HPLC监测反应。
如图3所示，第二天秦皮苷完全转化成秦皮素，代谢产物从第二天开始产生，第十天转化率为100％。
5.代谢产物的分离制备
用1倍体积量的正丁醇萃取上述培养液，重复三次，合并萃取液后减压回收，石油醚：乙酸乙酯＝1：1硅胶柱分离。
综上所述，本发明所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，操作简单，产率高，对环境更友好，适合工业化生产。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于，该方法包括：
（1）以秦皮素为起始原料，将所述原料加入第一溶液中使其溶解，获得原料液；
（2）动物粪菌制作载体：在无菌条件下收集动物的新鲜粪便，加入生理盐水匀浆，离心后取上清液，其中，所述粪便为大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或人类的粪便；
（3）厌氧培养：将所述上清液加入到营养肉汤中，厌氧恒温培养后，加入所述原料液，再加入厌氧培养液，厌氧恒温培养，获得第一培养液；
（4）产物的提取：萃取所述第一培养液，合并萃取液后减压回收；
（5）产物的纯化：利用制备液相色谱进行纯化。
2.根据权利要求1所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述第一溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液、碳酸缓冲液、Tris缓冲液或者水。
3.根据权利要求1所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述粪便为大鼠粪便。
4.根据权利要求3所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述起始原料还可以为秦皮苷，或者秦皮苷和秦皮素。
5.根据权利要求1所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述营养肉汤的成分为蛋白胨和/或牛肉浸粉。
6.根据权利要求1所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述厌氧的条件为CO2、N2、Ar或He氛围，所述培养的时间为2-10 d。
7.根据权利要求1所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述厌氧培养液的成分为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁、刃天青、L-半胱氨酸、L-抗坏血酸；所述厌氧培养液的加入量是所述营养肉汤体积的0.2-5倍。
8.根据权利要求1所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述萃取的溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、二氯甲烷或正己烷，萃取剂的量为0.5-2倍，次数为1至3次。
9.根据权利要求1所述的一种6，7，8-三羟基香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（5）中的分离使用硅胶、C8柱、C18柱中的任意一种。
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