CN110818797B

CN110818797B - 一种抗人ca153蛋白的重组抗体

Info

Publication number: CN110818797B
Application number: CN201810904816.5A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏; 何志强; 孟媛; 游辉
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: CN110818797A

Abstract

本发明涉及一种新颖的包含CA153蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。所述结合蛋白活性强，与人CA153蛋白具有很高的亲和力，可广泛应用于CA153蛋白的检测领域。

Description

一种抗人CA153蛋白的重组抗体

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及一种抗人CA153蛋白的重组抗体。

背景技术

乳腺癌(Breast Cancer)是妇女最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年大约有120万妇女患有乳腺癌,有50万左右死于乳腺癌。近年来，我国乳腺癌的发病率呈逐年增长趋势，并且它的致病特点是发病年龄较年轻，早期多无症状，就诊时病期相对偏晚，出现转移致存活期缩短，所以早期诊断、早期治疗是提高患者生存率的关键。

如何提高乳腺癌的早期诊断率是目前国内外学者共同关注的问题。乳腺癌相关的血清标志物单独用于早期诊断时，因敏感性及特异性较低，而限制了这些标志物的临床使用。近年来肿瘤标志物的检测已越来越多的为临床诊断和治疗恶性肿瘤应用，有多种与乳腺癌相关的肿瘤标志物。CA153是目前公认的对乳腺癌较为特异的肿瘤标志物，在乳腺癌中过度表达，与病理类型无关，与临床分期、肿瘤大小、腋窝淋巴结状况及雌孕激素受体相关。CA153是乳腺细胞上皮表面糖蛋白的变异体，是乳腺癌的重要标志物。CA153的测定可辅助乳腺癌病人的治疗监测，其动态测定有助于II期和III期乳腺癌病人治疗后、复发的早期发现、监测乳腺癌转移病人对治疗的反应性。它是检测乳腺癌术后复发最有用的指标，96％的患者局部或全身复发时，CA153明显升高早于放射学和临床各项检测。血清中浓度增高还与肿瘤的严重程度密切相关；反之；其值下降，提示疗效显著。临床上用于检测CA153水平的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)，化学发光，胶体金等，不同方法都有各自的优缺点，但是都需要针对于CA153的特异性单克隆抗体。传统的临床诊断使用的都是鼠源的单克隆抗体。

现有的CA153抗体由于活性低、亲和力差，无法很好地应用于CA153蛋白的检测中，因此本领域对于有效且特异性结合检测CA153并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种新颖的包含CA153抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。

所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与CA153蛋白具有K_D≤1.89×10^-8mol/L的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为K-X1-S-X2-Y-T-F-T-X3-Y-D-I-N，其中，

X1是A、D或E，X2是G或D，X3是T或S；

互补决定区CDR-VH2为W-I-Y-P-X1-D-G-S-X2-K-F-N-X3-K-F，其中，

X1是K、G或R，X2是I或L，X3是D或E；

互补决定区CDR-VH3为X1-R-E-G-P-X2-Y-A-M-D-Y，其中，

X1是V或A，X2是Q、N或G；

互补决定区CDR-VL1为H-A-X1-Q-N-X2-N-V-W-L-S，其中，

X1是S或T，X2是L、V或I；

互补决定区CDR-VL2为Y-X1-A-S-X2-L-H-T-G，其中，

X1是R或K，X2是K或N；

互补决定区CDR-VL3为Q-Q-X1-Q-S-X2-P-R-T，其中，

X1是D、Y或G，X2是S或Y。

一个重要优点在于，所述结合蛋白活性强，与人CA153蛋白具有很高的亲和力。

具体实施方式

本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。

在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

名词定义

“包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

当在本文中使用时，“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

本发明的示例性实施方案

本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与CA153蛋白具有K_D≤1.89×10^-8mol/L的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为K-X1-S-X2-Y-T-F-T-X3-Y-D-I-N，其中，

X1是A、D或E，X2是G或D，X3是T或S；

互补决定区CDR-VH2为W-I-Y-P-X1-D-G-S-X2-K-F-N-X3-K-F，其中，

X1是K、G或R，X2是I或L，X3是D或E；

互补决定区CDR-VH3为X1-R-E-G-P-X2-Y-A-M-D-Y，其中，

X1是V或A，X2是Q、N或G；

互补决定区CDR-VL1为H-A-X1-Q-N-X2-N-V-W-L-S，其中，

X1是S或T，X2是L、V或I；

互补决定区CDR-VL2为Y-X1-A-S-X2-L-H-T-G，其中，

X1是R或K，X2是K或N；

互补决定区CDR-VL3为Q-Q-X1-Q-S-X2-P-R-T，其中，

X1是D、Y或G，X2是S或Y。

在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与CA153蛋白具有K_D≤1.89×10^-8mol/L，K_D值也可以选择1.0×10^-9mol/L、2.0×10^-9mol/L、3.0×10^-9mol/L、4.0×10^-9mol/L、5.0×10^-9mol/L、6.0×10^-9mol/L、7.0×10^-9mol/L、8.0×10^-9mol/L、9.0×10^-9mol/L、1.0×10^-10mol/L、3.0×10^-10mol/L、5.0×10^- ¹⁰mol/L、7.0×10^-10mol/L、8.7×10^-10mol/L、9.0×10^-10mol/L的亲和力；或者8.7×10^-10mol/L≤K_D≤1.89×10^-8mol/L。

其中，亲和力按照本发明说明书中的方法测定。

在一些实施方式中：

所述互补决定区CDR-VH1中，X3是S；

所述互补决定区CDR-VH2中，X3是E；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是V；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是S；

所述互补决定区CDR-VL2中，X1是K；

所述互补决定区CDR-VL3中，X2是Y。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是A，X2是G。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是E，X2是G。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是D，X2是G。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是A，X2是D。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是E，X2是D。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是D，X2是D。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是K，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是G，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是R，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是K，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是G，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是R，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是G。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是K。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是K。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是D。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Y。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是G。

在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs(例如重链的3个CDRs，或者轻链的3个CDRs)；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体的“功能片段”，例如纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

scFv(sc＝单链)，双特异抗体(diabodies)。

本发明所述的“功能片段”特别地指对于CA153具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。

这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。

抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。

需要说明的是，除本申请上述公开的氨基酸序列外，骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。

在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠；

轻链恒定区序列如SEQ ID NO:1所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:2所示。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的结合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子。

本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体，例如质粒，进一步为表达质粒，在本申请的一个实施例中会介绍该载体的构建方法。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。

所述宿主细胞可以为真核细胞，比如哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种生产如上所述的结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于诊断乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肺腺癌或结直肠癌的诊断剂或试剂盒中的应用。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中的CA153蛋白的方法，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的CA153蛋白与权利要求如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述CA153蛋白的存在；

在此实施方式中，所述结合蛋白可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；

在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合CA153的不同抗原表位；

所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述CA153蛋白结合；

在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包括如上所述的结合蛋白。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。SMARTERTM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。

1.1、引物

扩增Heavy Chain和Light Chain 5’RACE引物：

SMARTER II A Oligonucleotide：

5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’；

5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：5’>(T)₂₅VN<3’(N＝A,C,G,orT；V＝A,G,orC)；

Universal Primer A Mix(UPM):

5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’

Nested Universal Primer A(NUP):

5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’

mIg-kR：5’>CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT<3’。

mIg-HR：5’>TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC<3’。

1.2、抗体可变区基因克隆及测序

采用MagExtractor-RNA提取试剂盒从分泌Anti-CA153 9D2单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTER^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、NestedUniversal Primer A(NUP)和mIg-kR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal PrimerA Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIg-HR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.7KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆各4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

1.3、Anti-CA153 9D2抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为378bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为411bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

1.4、重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体基因测序结果，设计Anti-Dengue NS1 7D9抗体的HeavyChain和Light Chain基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

CA153-9D2-HF：5’>CCCAAGCTTATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATG<3’；

CA153-9D2-HR:5’>CACGAATTCTTACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATG<3’；

CA153-9D2-LF:5’>CATGAAGCTTATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATG<3’；

CA153-9D2-LR:5’>CATGGAATTCTTACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACA<3’；

通过PCR扩增方法扩出0.72KB的Light Chain基因片段和1.4kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

实施例二

重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞及表达上清抗体活性鉴定

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，转入10ml含CD CHO AGT培养基中，37度摇床中培养(8％CO₂、震幅150)；每天取样检测细胞活率，当细胞活率低于50％，离心细胞培养上清，得到的抗体(具有序列如SEQ ID NO:3以及4所示的轻链和重链)。

经分析，重链的互补决定区(WT)：

CDR-VH1为K-A(X1)-S-D(X2)-Y-T-F-T-T(X3)-Y-D-I-N

CDR-VH2为W-I-Y-P-G(X1)-D-G-S-I(X2)-K-F-N-D(X3)-K-F；

CDR-VH3为A(X1)-R-E-G-P-N(X2)-Y-A-M-D-Y；

轻链的互补决定区：

CDR-VL1为H-A-T(X1)-Q-N-L(X2)-N-V-W-L-S；

CDR-VL2为Y-R(X1)-A-S-K(X2)-L-H-T-G；

CDR-VL3为Q-Q-D(X1)-Q-S-S(X2)-P-R-T；

其中，X1、X2、X3均为待突变位点。

表1与抗体活性有关的突变位点

发明人将WT中的CDR位点进行上述突变，以获得活性更好的抗体。

包被液稀释羊抗鼠IgG 1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的CA153单克隆抗体，100uL/孔，37℃,60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释100倍的CA153抗原(肿瘤腹水CA153定值8.2KU/ml)，每孔100uL，37℃,40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记HRP另一株的CA153单克隆抗体(1:4K)，每孔100uL，37℃,30min；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

表2抗体活性分析数据

“-”代表无活性。

从表2可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点(保证筛选得到的抗体活性与突变1相近，抗体活性±10％)，部分结果如下。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

突变位点的亲和力分析

利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10ug/ml，CA153腹水标本(肿瘤腹CA153定值8.2KU/ml)用PBST进行梯度稀释：400U/ml、200U/ml、100U/ml、50U/ml、25U/ml、12.5U/ml、6.25U/ml、0U/ml；

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69 GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据(KD表示平衡解离常数既亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。计算时假定CA153腹水标本1U/ml相当于1nmol/ml)。

表4亲和力分析数据

从表4可以看出，表3中列出的突变位点对抗体的亲和力影响不大。

为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。

表5以WT为骨架进行的突变

表6亲和力分析数据

从表5和表6分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点与其他位点的关联也不大。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 一种抗人CA153蛋白的重组抗体

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 2

<211> 324

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Asp Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Leu Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Asp Pro Ser Arg Ile Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Gln Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 4

<211> 442

<212> PRT

<213> DIQMNQSPSSLSADLGDTITITCHASQNLNVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGDPSRISGSGSGTGFTLTIRSLQPEDIATYYCQQDQSYPRTFGGGTKLEIK

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Ile Lys Phe Asn Asp Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro

210 215 220

Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp

260 265 270

Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser

305 310 315 320

Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln

340 345 350

Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe

355 360 365

Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu

370 375 380

Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe

385 390 395 400

Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn

405 410 415

Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

420 425 430

Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

Claims

1.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原为CA153蛋白，所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；

互补决定区CDR-VH1为K-X1-S-X2-Y-T-F-T-X3-Y-D-I-N，其中，X3是S；

互补决定区CDR-VH2为W-I-Y-P-X1-D-G-S-X2-K-F-N-X3-K-F，其中，X3是E；

互补决定区CDR-VH3为X1-R-E-G-P-X2-Y-A-M-D-Y，其中，X1是V；

互补决定区CDR-VL1为H-A-X1-Q-N-X2-N-V-W-L-S，其中，X1是S；

互补决定区CDR-VL2为Y-X1-A-S-X2-L-H-T-G，其中，X1是K；

互补决定区CDR-VL3为Q-Q-X1-Q-S-X2-P-R-T，其中，X2是Y；

各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

位点 CDR-VH1 X1/X2 CDR-VH2 X1/X2 CDR-VH3 X2 CDR-VL1 X2 CDR-VL2 X2 CDR-VL3 X1 突变 1 A/D G/I N L K D 突变 1-1 E/D R/I Q I N Y 突变 1-2 D/D K/I G V K G 突变 1-3 A/G G/L N L N Y 突变 1-4 E/G R/L Q I K G 突变 1-5 D/G K/L G V N D 突变 1-6 A/D G/I N I K G 突变 1-7 E/D R/I G V N D 突变 1-8 D/D G/I Q L K G 突变 1-9 A/G G/L Q V N D 突变 1-10 E/G R/L G I K Y 突变 1-11 D/G K/L N V N G 突变 1-12 A/D G/I N I K Y 突变 1-13 E/D R/L N L N G 突变 1-14 D/D K/L G V K D 突变 1-15 A/G R/L Q I N G 突变 1-16 E/G K/I N V K D 突变 1-17 D/G R/I N I N Y 突变 1-18 A/D G/L G L K D 突变 1-19 E/D K/L Q V N Y 突变 1-20 D/D R/L N I K G 突变 1-21 A/G K/I G L N Y 突变 1-22 E/G G/I Q V K G 突变 1-23 D/G R/I N I N D 突变 1-24 A/D G/L Q V K G 突变 1-25 E/D R/L N I N D 突变 1-26 D/D K/I G L K Y 突变 1-27 A/G G/I Q V N D 突变 1-28 E/G R/I N I K Y 突变 1-29 D/G K/L G L N G 突变 1-30 A/D R/L G I K Y 突变 1-31 E/D K/I Q L N G 突变 1-32 D/D G/I N V K D 突变 1-33 A/G R/I G I N G 突变 1-34 E/G K/L Q L K D 突变 1-35 D/G G/L N V N Y 突变 1-36 A/D G/L Q L K D 突变 1-37 E/D K/I N V N Y 突变 1-38 D/D R/I G I K G 突变 1-39 A/G K/L N L N Y 突变 1-40 E/G G/L Q V K G 突变 1-41 D/G R/L G I N D 突变 1-42 A/D K/I N V K G 突变 1-43 E/D G/I G I N D 突变 1-44 D/D K/L Q L K Y 突变 1-45 A/G G/L G V N D 突变 1-46 E/G R/L Q I K Y 突变 1-47 D/G K/I N L N G 突变 1-48 A/D G/I Q I K Y 突变 1-49 E/D K/L N L N G 突变 1-50 D/D G/L G V K D 突变 1-51 A/G R/L Q I K G 突变 1-52 E/G K/I N L K D 突变 1-53 D/G G/I G V N Y

。

2.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原为CA153蛋白，所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；

互补决定区CDR-VH1为K-X1-S-X2-Y-T-F-T-X3-Y-D-I-N，其中，X3是T；

互补决定区CDR-VH2为W-I-Y-P-X1-D-G-S-X2-K-F-N-X3-K-F，其中，X3是D；

互补决定区CDR-VH3为X1-R-E-G-P-X2-Y-A-M-D-Y，其中，X1是A；

互补决定区CDR-VL1为H-A-X1-Q-N-X2-N-V-W-L-S，其中，X1是T；

互补决定区CDR-VL2为Y-X1-A-S-X2-L-H-T-G，其中，X1是R；

互补决定区CDR-VL3为Q-Q-X1-Q-S-X2-P-R-T，其中，X2是S；

各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

位点 CDR-VH1 X1/X2 CDR-VH2 X1/X2 CDR-VH3 X2 CDR-VL1 X2 CDR-VL2 X2 CDR-VL3 X1 WT A/G K/I Q L K D WT 1-1 E/G G/I N V N Y WT 1-5 D/D R/L G I N D WT 1-10 E/D R/L Q I K Y WT 1-20 D/G R/L N I K G

。

3.根据权利要求1~2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的一种。

4.根据权利要求1~2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

5.根据权利要求4所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD任何其中之一恒定区的序列。

6.根据权利要求4所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

7.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为乳牛。

8.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为火鸡或斗鸡。

9.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区来源于小鼠。

10.根据权利要求9所述的结合蛋白，其特征在于，轻链恒定区序列如SEQ ID NO:1所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:2所示。

11.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1~10任一项所述的结合蛋白。

12.一种载体，其包含权利要求11所述的核酸分子。

13.一种宿主细胞，其被权利要求12所述的载体所转化。

14.一种生产权利要求1~10任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在培养基中和合适的培养条件下培养权利要求13所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。

15.权利要求1~10任一项所述的结合蛋白在制备用于CA153蛋白检测试剂中的应用。

16.如权利要求1~10任一项所述的结合蛋白在制备检测测试样品中的CA153蛋白的试剂盒中的应用，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的CA153蛋白与权利要求1~10任一项所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述CA153蛋白的存在。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，在步骤a）中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。

18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述CA153蛋白结合。

19.一种试剂盒，其包括权利要求1~10任一项所述的结合蛋白。