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CN110461332A - 制备和分析血浆中的荧光化合物的方法 - Google Patents

制备和分析血浆中的荧光化合物的方法 Download PDF

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CN110461332A CN201880007191.0A CN201880007191A CN110461332A CN 110461332 A CN110461332 A CN 110461332A CN 201880007191 A CN201880007191 A CN 201880007191A CN 110461332 A CN110461332 A CN 110461332A
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Abstract

本文公开了一种用于分析患者血浆中荧光化合物浓度的方法。该方法包括从患者收集血浆样品，用溶剂稀释样品并通过HPLC分析稀释的样品。样品制备过程中样品不需要脱水，也不需要内标。

Description

制备和分析血浆中的荧光化合物的方法
相关申请的引证
本申请要求2017年11月20日提交的美国临时申请序列号62/588,606的优先权权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
本发明的领域一般地涉及血浆中的荧光化合物的检测和定量。更具体地，本申请涉及分析和定量患者的血浆中的(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双(氮烷二基))双(3-羟基丙酸)的方法。
在临床试验期间和之后经常需要对患者血浆中的小分子药物进行分析。在临床试验期间，有必要建立正确的药物剂量以优化功效并最小化不良副作用。在某些情况下，太少的药物(即，最小的功效和治疗效果)可能与太多(即，不良副作用)一样有害。
肾小球滤过率(GFR)被广泛接受为患者中最可靠的肾功能量度。因此，存在对GFR的准确实时测量的医学需求，以评估由于急性或慢性肾损伤引起的肾功能。目前评估肾功能的常见临床实践测量血清肌酐水平及其24小时清除率，以基于Ferguson和Waikar或Inker等人的GFR方程获得估算的GFR(eGFR)。然而，由于合适的实验室处理样品所需的时间，该方法缺乏适当的灵敏度和准确性，同时具有时间延迟性。此外，结果根据诸如年龄、水合作用、肌肉质量和饮食等因素而有很大差异。
外源性GFR示踪剂，如碘海醇如图1所示，提供有效的GFR评估。碘海醇不会在患者器官中代谢或汇集。其分布遵循穿过毛细血管的简单浓度梯度，并且通过简单的肾小球过滤完全消除，而没有肾小管肾分泌或重吸收。为了使用碘海醇进行GFR测定，在多个时间点从患者收集血液样品，然后进行仔细的实验室分析。使用WinNonlin PK/PD建模和模拟软件通过数据的PK分析确定GFR值。这是一个劳动密集型过程，对医疗和实验室人员提出了很高的要求。它还需要延长的时间，因为除了之后要求的实验室分析之外，必须在几个小时内收集多个样品。
慢性肾病(CKD)是一种医学病症，其特征在于肾功能随时间逐渐丧失。它包括损害肾脏的病症，并降低其从个体血流中正确去除废物的能力。CKD的并发症包括高血压、贫血(低血细胞计数)、骨弱(骨质薄弱)、营养不良、神经损伤和心脏病风险增加。根据国家肾脏基金会的统计，大约全部CKD病例的三分之二是由糖尿病或高血压引起的。除家族史外，肾脏疾病的其他风险因子包括年龄、种族、高血压和糖尿病。GFR是确定肾功能水平和评估患者CKD分期的最佳测试。
GFR是确定肾功能水平(其确定CKD分期)的重要测试。如下所示，患者的GFR越低，CKD越严重。
已经进行了很多努力以寻找可以实时透皮检测的外源性荧光剂。参见US 9,480,687、US 9,114,160、US 8,722,685、US 8,115,000和US 8,778,309的教导；其各自的全部内容通过引用并入本文。除了许多其他小分子外，还合成了具有优异的光物理性质和其他化学和物理特性的荧光化合物MB-102。
MB-102，(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双(氮烷二基))双(3-羟基丙酸)是，如图1所示，正在开发的用于实时GFR测定的荧光剂。当激发434nm时，它在556nm处发出强荧光信号，目前正在进行人体临床研究。值得注意的是，可以透皮地实时测量在患者血流中循环的MB-102的量和它通过肾小球滤过消除的速率。这消除了对耗时的样品收集和实验室分析的需要，同时为医务人员提供患者肾功能的实时评估。因此，需要验证用于量化患者的血浆或血流中的MB-102的量的方法的准确性。
血浆样品的实验室分析通常涉及蛋白质沉淀、蒸发和干燥，然后在与HPLC相容的溶剂中重构(复配，reconstitution)。这是一个劳动密集型过程，并延长了获得结果之前所需的时间。蛋白质沉淀方法的另一个缺点是需要样品中的内标以确保准确的结果。这些步骤延长了分析所需的时间并引入了错误的机会。因此，需要缩短分析所需的时间并减少错误的机会。
发明内容
在一个方面，本文公开了一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法。该方法包括收集血浆样品，用至少一种溶剂稀释血浆样品，并通过HPLC分析稀释的样品，从而测量血浆中化合物的量。在HPLC分析之前不干燥血浆样品，并且不向样品中添加内标。
在另一个方面，本文公开了一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法。该方法包括从患者收集血浆样品，向样品中加入至少一种溶剂，从而使血浆蛋白沉淀，从样品中除去沉淀的血浆蛋白，并通过HPLC分析样品，从而测量血浆中的化合物的量。在HPLC分析之前不干燥样品，并且不向样品中添加内标。
附图说明
图1示出了MB-102和碘海醇的结构。
图2是1％血浆/PBS中MB-102在3.3ng/mL下与对照空白(1％血浆/PBS)的HPLC色谱图的叠加图。
图3A和3B示出了对于两种不同样品，在1％血浆/PBS中在0.4ng/mL下的MB-102的信号/噪声、USP拖尾因子和USP平板计数。
图4是掺入(加标，spike)1X PBS中的MB-102的峰纯度。
图5是标准样品制备后血浆样品中的MB-102的峰纯度。
图6是GMP合同实验室对照内部评估测试的，从患者获得的血浆中MB-102的相关性图。
图7是来自临床试验的12名患者的MB-102的药代动力学分析。
图8a、8b和8c是比较临床试验中三名患者的MB-102和碘海醇的清除率的图表。
图9是使用直接稀释或蛋白质沉淀测试的血浆中的MB-102的相关性图。
图10是通过内部测试对照GMP合同实验室测试的样品直接稀释测试的血浆中的MB-102浓度的相关性图。
图11是通过直接稀释和蛋白质沉淀测试的显示溶血的血浆样品中的MB-102浓度(血红蛋白水平为50mg/dL至100mg/dL)的相关性图。
图12是通过直接稀释和沉淀测试的显示溶血的血浆样品中的MB-120浓度(血红蛋白水平为100mg/dL至250mg/dL)的相关性图。
具体实施方式
本文公开了一种用于监测有此需要的患者中的荧光化合物浓度的方法。该方法包括收集血浆样品，用至少一种溶剂稀释血浆样品，并通过高压液相色谱(HPLC)分析稀释的样品。重要的是，样品在分析前未进行干燥，样品制备过程中也未添加内标。
在一些实施方案中，荧光化合物是如本文其他地方公开的式I化合物。优选地，化合物是(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双(氮烷二基))双(3-羟基丙酸)(MB-102)，或其药学上可接受的盐，如下所示：
在一些实施方案中，通过从患者收集血液样品来制备血浆样品，并使用本领域已知的方法收集血浆。可以从人类患者、动物或体外研究中收集血浆。可以收集血浆的动物的实例包括但不限于狗、猫、牛、马、猪、山羊、猴子、大鼠和小鼠。优选地，从人类患者收集血浆。可以立即分析血浆中的荧光化合物，或者可以将其储存以便在后续时间段进行分析。如果储存血浆样品以便在后续时间段进行分析，则进行样品储存以使分解最小化。一种储存方法是在-80℃或更低的温度下冷冻样品。本领域公认的防止样品降解的其他储存方法是可接受的并且包括在本文中。
在HPLC分析之前，将样品用至少一种溶剂稀释。溶剂可以是水性的或有机的。在一些方面，水性溶剂是盐水。在某些方面，将使用多于一种的溶剂。每种溶剂可以是水性或非水性的，并且可以彼此独立地选择。
在一些方面，水性溶剂是选自磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、甲酸盐、葡糖酸盐(gluconate)、乳酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐、铵盐(ammonium)、胍盐、HEPES、二甲砷酸盐(cacodylate)、Tris、tris-HCl、马来酸盐、硼酸盐、甘氨酸盐、琥珀酸盐、PIPES及其任何组合的缓冲液形式。优选地，水性溶剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
合适的非水性溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、己烷、氯仿、DMF、DMSO、乙酸、丙酮、乙腈、丁醇、四氯化碳、二乙二醇、乙醚、DME、乙二醇、二氯甲烷、硝基甲烷、石油醚、丙醇、吡啶、甲苯、MTBE、三乙胺、二甲苯和苯。优选地，有机溶剂可与水混溶。最优选地，有机溶剂是甲醇、乙醇、乙腈或DMSO。在一个实施方案中，有机溶剂是甲醇。
缓冲液的pH值与HPLC溶剂系统相容，并且在进行HPLC分析所需的时间段内不会引起血浆样品的分解。在一些方面，pH将介于约2至12之间。在另一个方面，水性溶剂的pH为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12。如在本上下文中所用，关于pH的“约”表示±0.5单位。在另一方面，水性样品的pH为约生理pH，为约7.0-7.4。
用溶剂稀释血浆样品，以便通过HPLC容易地分析血浆中的荧光化合物的浓度。如本领域所知，如果分析物的浓度太高，则会使柱和检测器过载。这可能导致峰拖尾和分析物保留时间变化，可能导致定量和鉴定中的错误。如果分析物的浓度太低，信号可能会在基线噪声中丢失并且不能正确检测。必须避免这两种情况，从而使本文公开的方法可提供准确的结果。对于待分析的样品仅确定分析物的浓度太高这并不罕见。在这种情况下，将样品再次稀释并重新分析。在一些方面，血浆样品用溶剂以1:1v/v比(样品:溶剂)稀释。在另一方面，稀释比为1:(0.1-100)v/v。在又一方面，稀释比为(0.1-100):1v/v。在又一方面，稀释比(v/v)为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900或1:1000。
在本文公开的用于测量患者血浆中荧光化合物浓度的方法的另一个方面，该方法包括从患者收集血浆样品，向样品中加入至少一种溶剂以使蛋白质沉淀，从样品中除去沉淀的蛋白质，并通过HPLC分析样品。重要的是，样品在分析前未进行干燥，样品制备过程中也未添加内标。
荧光化合物可以是荧光染料。本公开的荧光染料倾向于具有吸收、激发和发射波长，其都在约350nm或更大的近红外(NIR)或可见光谱内。这对于诊断程序是有益的，因为可见光和NIR光不可能损伤组织。具有约350nm或更大波长的光倾向于渗透到组织中，从而允许在使用小于约350nm的UV波长可能无法到达的感兴趣组织中进行诊断程序。合适的荧光染料包括吖啶、吖啶酮、蒽、蒽环(anthracy lines)、蒽醌、氮杂薁(azaazulenes)、偶氮薁、苯、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并吲哚羰菁(benzoindocarbocyanines)、苯并吲哚、苯并噻吩、咔唑、香豆素、菁、二苯并呋喃、二苯并噻吩、二吡咯烷染料(dipyrrolo dyes)、黄酮、荧光素、咪唑、吲哚羰菁、吲哚菁、吲哚、异吲哚、异喹啉、萘并萘二酮(naphthacenedione)、萘、萘醌、菲、菲啶、菲啶、吩硒嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、苯基呫吨、聚氟苯、嘌呤、吡嗪、吡唑、吡啶、嘧啶酮、吡咯、量子点、喹啉、喹诺酮、罗丹明、方酸菁、并四苯、噻吩、三苯甲烷染料、氧杂蒽、氧杂蒽酮及其衍生物。
在一些实施方案中，荧光化合物是如本文其他地方公开的式I化合物。优选地，化合物是(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双(氮烷二基))双(3-羟基丙酸)(“MB-102”)，或其药学上可接受的盐，如下所示：
在一些实施方案中，通过从患者收集血液样品来制备血浆样品，并使用本领域已知的方法分离血浆。可以立即分析血浆中的荧光化合物，或者可以将其储存以便在另一时间进行分析。如果储存血浆样品以便在后续时间段进行分析，则进行样品储存以使分解和破裂(breakdown)最小化。一种储存方法是在-80℃或更低的温度下冷冻样品。本领域公认的防止样品降解的其他储存方法是可接受的并且包括在本文中。
在一些实施方案中，加入以引起蛋白质沉淀的溶剂是选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、己烷、氯仿、DMF、DMSO、乙酸、丙酮、乙腈、丁醇、四氯化碳、二乙二醇、乙醚、DME、乙二醇、二氯甲烷、硝基甲烷、石油醚、丙醇、吡啶、甲苯、MTBE、三乙胺、二甲苯和苯的有机溶剂。在某些方面，使用多于一种溶剂。每种溶剂可以是水性或非水性的，并且可以彼此独立地选择。
使用本领域已知的方法进行沉淀蛋白质的去除。过滤和离心是本文包括的两种方法。
除去沉淀的蛋白质后，直接分析样品或可用另外的溶剂稀释它。用于稀释的溶剂可以是水性、非水性溶剂或其任何组合。在一些实施方案中，水性溶剂是盐水。在另一个方面，水性溶剂是选自磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、甲酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐、铵盐、胍盐、HEPES、二甲砷酸盐、Tris、tris-HCl、马来酸盐、硼酸盐、甘氨酸盐、琥珀酸盐、PIPES及其任何组合的缓冲液。优选地，水性溶剂是磷酸盐缓冲盐水。
水性溶剂体系的pH值与HPLC溶剂系统相容，并且在进行HPLC分析所需的时间段内不会引起血浆样品的分解。在一些方面，pH将介于约2至12之间。在另一个方面，水性溶剂的pH为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12。如在本上下文中所用，关于pH的“约”表示±0.5单位。在另一方面，水性样品的pH为约生理pH，为约7.0-7.4。
在另一方面，用于在分析之前稀释样品的溶剂是有机的非水性溶剂。合适的有机非水性溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、己烷、氯仿、DMF、DMSO、乙酸、丙酮、乙腈、丁醇、四氯化碳、二乙二醇、乙醚、DME、乙二醇、二氯甲烷、硝基甲烷、石油醚、丙醇、吡啶、甲苯、MTBE、三乙胺、二甲苯和苯。优选地，有机溶剂可与水混溶。最优选地，有机溶剂是甲醇、乙醇、乙腈或DMSO。在一个实施方案中，有机溶剂是甲醇。
在另一方面，用于稀释样品的溶剂包括至少两种选自本文公开的水性和有机溶剂的任何可能组合的不同溶剂。另外，由于采用HPLC进行分析，因此选择溶剂体系使得它不干扰分析物检测。
用于沉淀蛋白质和/或制备用于HPLC分析的样品的溶剂量将根据样品而变化。如本文其他地方所讨论的，将调节所需溶剂的量，使得HPLC提供适当的结果。用这种方法可以进行两次稀释：a)溶剂加入以引起蛋白质沉淀，和b)在除去蛋白质沉淀后向上清液中加入溶剂。在该方法中，为这两个步骤添加的溶剂的总量(合并量)将影响HPLC分析中的分析物的浓度。添加到血浆样品中的溶剂的总量将使得分析物浓度不会太高或太低。在一些方面，血浆样品用溶剂以1:1v/v比(样品:溶剂)稀释，其中这是指两种稀释中样品与溶剂的总体积的比。在另一方面，稀释比为1:(0.1-100)v/v。在又一方面，稀释比为(0.1-100):1v/v。在又一方面，稀释比(v/v)为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900或1:1000。两种稀释中使用的溶剂的比例可以相对于彼此为(0.1-100):(100-0.1)v/v。在一些方面，仅可发生蛋白质沉淀的稀释步骤。蛋白质沉淀后样品的浓度可以使得不需要进一步稀释。
如本领域所知，当从患者收集血样时，血液溶血可能是一个问题。血液溶血的原因很多，包括难以收集样本、不安全线(unsecure line)、污染、针头尺寸不合适、管混合不当、样品管填充不当以及样品储存不当。收集的样品中的任何血液溶血都可干扰对血浆进行的分析。已知溶血由于血浆被溶血的红细胞的内容物污染而在许多不同类型的分析中导致不准确的实验室测试结果。溶血后，血红蛋白释放到样品的血浆或血清中。溶血的一个常见迹象是患者的血浆或血清中的颜色变化。可以使用以下网站上的比色图表视觉上进行血浆或血清中的血红蛋白含量的粗略估计，因此估计溶血的存在或不存在：http://blog.fisherbioservices.com/avoiding-hemolysis-in-blood-sample-collection-and-processing，其教导通过引用并入。溶血的另一个迹象是由于引起光散射的红细胞减少导致血液样品的浑浊度降低。
在一些方面，将用于测量患者血浆中荧光化合物浓度的方法应用于其中已发生至少一些溶血的样品。在另一个方面，用于测量患者血浆中MB-102浓度的方法应用于其中已发生部分或完全溶血的血浆样品。
在本文公开的一些实施方案中，荧光化合物是式I的吡嗪分子，或其药学上可接受的盐，其中
X1和X2各自独立地为–CO2R1、–CONR1R2、–CO(AA)或–CONH(PS)；Y1和Y2各自独立地选自–NR1R2和
Z1为单键、–CR1R2–、–O–、–NR1–、–NCOR1–、–S–、–SO–或–SO2–；R1至R2各自独立地选自H、–CH2(CHOH)aH、–CH2(CHOH)aCH3、–CH2(CHOH)aCO2H、–(CHCO2H)aCO2H、–(CH2CH2O)cH、–(CH2CH2O)cCH3、–(CH2)aSO3H、–(CH2)aSO3 -、–(CH2)aSO2H、–(CH2)aSO2 -、–(CH2)aNHSO3H、–(CH2)aNHSO3 -、–(CH2)aNHSO2H、–(CH2)aNHSO2 -,–(CH2)aPO4H3、–(CH2)aPO4H2 -、–(CH2)aPO4H2-、–(CH2)aPO4 3-、–(CH2)aPO3H2、–(CH2)aPO3H-和–(CH2)aPO3 2-；AA是包含一个或多个选自天然和非天然氨基酸的氨基酸的肽链，这些氨基酸通过肽或酰胺键连接在一起，并且每种情况的AA可以与每种其他情况相同或不同；PS是硫酸化或非硫酸化多糖链，其包含通过糖苷键连接的一个或多个单糖单元；且“a”是1至10的数字，“c”是1至100的数字，“m”和“n”中的每一个独立地是1至3的数字。在一些方面，X1和X2中的至少一个是–CO(PS)或–CO(AA)。在另一方面，X1和X2都是-CO(AA)。
(AA)是包含通过肽键连接在一起的一种或多种天然或非天然氨基酸的肽链。肽链(AA)可以是单一氨基酸，同多肽链(同聚多肽链)或杂多肽链(杂聚多肽链)，并且可以是任何合适的长度。在一些实施方案中，天然或非天然氨基酸是α-氨基酸。在另一方面，α-氨基酸是D-α-氨基酸或L-α-氨基酸。在包含两个或更多个氨基酸的多肽链中，每个氨基酸在所有方面彼此独立地选择，包括但不限于侧链结构和立体化学。例如，在一些实施方案中，肽链可包含1至100个氨基酸、1至90个氨基酸、1至80个氨基酸、1至70个氨基酸、1至60个氨基酸、1至50个氨基酸、1至40个氨基酸、1至30个氨基酸、1至20个氨基酸、或甚至1至10个氨基酸。在一些实施方案中，肽链可包括1至100个α-氨基酸、1至90个α-氨基酸、1至80个α-氨基酸、1至70个α-氨基酸、1至60个α-氨基酸、1至50个α-氨基酸、1至40个α-氨基酸、1至30个α-氨基酸、1至20个α-氨基酸、或甚至1至10个α-氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸选自D-丙氨酸、D-精氨酸D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、甘氨酸、D-组氨酸、D-高丝氨酸、D-异亮氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-蛋氨酸、D-苯丙氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸和D-缬氨酸。在一些实施方案中，肽链(AA)的α-氨基酸选自精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、高丝氨酸、赖氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，肽链(AA)的α-氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、高丝氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，肽链(AA)是指单一氨基酸(例如，D-天冬氨酸或D-丝氨酸)。
在一些实施方案中，(AA)是选自21种必需氨基酸的单一氨基酸。在其他方面，AA选自D-精氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-高丝氨酸、D-赖氨酸和D-丝氨酸。优选地，AA是D-天冬氨酸、甘氨酸、D-丝氨酸或D-酪氨酸。最优选地，AA是D-丝氨酸。
在一些实施方案中，(AA)是β-氨基酸。β-氨基酸的实例包括但不限于β-苯丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基-3-(3-溴苯基)丙酸、3-氨基丁酸、顺式-2-氨基-3-环戊烯-1-羧酸、反式-2-氨基-3-环戊烯-1-羧酸、3-氨基异丁酸、3-氨基-2-苯基丙酸、3-氨基-4-(4-联苯基)丁酸、顺式-3-氨基-环己烷羧酸、反式-3-氨基-环己烷羧酸、3-氨基-环戊烷羧酸、3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸、2-(氨基甲基)苯乙酸、3-氨基-2-甲基丙酸、3-氨基-4-(2-萘基)丁酸、3-氨基-5-苯基戊酸、3-氨基-2-苯基丙酸、4-溴-β-Phe-OH、4-氯-β-高phe-OH、4-氯-β-Phe-OH、2-氰基-β-高phe-OH、2-氰基-β-高phe-OH、4-氰基-β-高phe-OH、3-氰基-β-Phe-OH、4-氰基-β-Phe-OH、3,4-二甲氧基-β-Phe-OH、γ,γ-二苯基β-高ala-OH、4-氟-β-Phe-OH、β-Gln-OH、β-高ala-OH、β-高arg-OH、β-高gln-OH、β-高glu-OH、β-高hyp-OH、β-高leu-OH、β-高lys-OH、β-高met-OH、β2-高苯丙氨酸、β-高phe-OH、β3-高pro-OH、β-高ser-OH、β-高thr-OH、β-高trp-OH、β-高trp-OMe、β-高tyr-OH、β-Leu-OH、β-Leu-OH、β-Lys(Z)-OH、3-甲氧基-β-Phe-OH、3-甲氧基-β-Phe-OH、4-甲氧基-β-Phe-OH、4-甲基-β-高phe-OH、2-甲基-β-Phe-OH、3-甲基-β-Phe-OH、4-甲基-β-Phe-OH、β-Phe-OH、4-(4-吡啶基)-β-高ala-OH、2-(三氟甲基)-β-高phe-OH、3-(三氟甲基)-β-高phe-OH、4-(三氟甲基)-β-高phe-OH、2-(三氟甲基)-β-Phe-OH、3-(三氟甲基)-β-Phe-OH、4-(三氟甲基)-β-Phe-OH、β-Tyr-OH、3-(苄基氨基)丙酸乙酯、β-Ala-OH、3-(氨基)-5-己烯酸、3-(氨基)-2-甲基丙酸、3-(氨基)-2-甲基丙酸、3-(氨基)-4-(2-萘基)丁酸、3,4-二氟-β-高phe-OH、γ,γ-联苯基-β-高ala-OH、4-氟-β-高phe-OH、β-Gln-OH、β-高ala-OH、β-高arg-OH、β-高gln-OH、β-高glu-OH、β-高hyp-OH、β-高ile-OH、β-高leu-OH、β-高lys-OH、β-高met-OH、β-高phe-OH、β3-高脯氨酸、β-高thr-OH、β-高trp-OH、β-高tyr-OH、β-Leu-OH、2-甲基-β-高phe-OH、3-甲基-β-高phe-OH、β-Phe-OH、4-(3-吡啶基)-β-高ala-OH、3-(三氟甲基)-β-高phe-OH、β-谷氨酸、β-高丙氨酸、β-高谷氨酸、β-高谷氨酰胺、β-高羟基脯氨酸、β-高异亮氨酸、β-高亮氨酸、β-高蛋氨酸、β-高苯丙氨酸、β-高脯氨酸、β-高丝氨酸、β-高苏氨酸、β-高色氨酸、β-高酪氨酸、β-亮氨酸、β-苯丙氨酸、吡咯烷-3-羧酸和β-Dab-OH。
(PS)是硫酸化或非硫酸化多糖链，包括通过糖苷键连接的一个或多个单糖单元。多糖链(PS)可以是任何合适的长度。例如，在一些实施方案中，多糖链可包含1至100个单糖单元、1至90个单糖单元、1至80个单糖单元、1至70个单糖单元、1至60个单糖单元、1至50个单糖单元、1至40个单糖单元、1至30个单糖单元、1至20个单糖单元、或甚至1至10个单糖单元。在一些实施方案中，多糖链(PS)是由戊糖或己糖单糖单元组成的同多糖链。在其他实施方案中，多糖链(PS)是由戊糖和己糖单糖单元中的一个或两个组成的杂多糖链。在一些实施方案中，多糖链(PS)的单糖单元选自葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖和核糖。在一些实施方案中，多糖链(PS)是指单个单糖单元(例如，葡萄糖或果糖)。在另一方面，多糖链是氨基糖，其中糖上的一个或多个羟基已被胺基取代。与羰基的连接可以是通过胺或羟基。
在一些实施方案中，对于式I的吡嗪衍生物，Y1或Y2中的至少一个是
其中Z1是单键、–CR1R2–、–O–、–NR1–、–NCOR1–、–S–、–SO–或–SO2–；R1至R2各自独立地选自H、–CH2(CHOH)aH、–CH2(CHOH)aCH3、–CH2(CHOH)aCO2H、–(CHCO2H)aCO2H、–(CH2CH2O)cH、–(CH2CH2O)cCH3、–(CH2)aSO3H,–(CH2)aNHSO3H和–(CH2)aPO3H2；a、c和m如本文其他地方所述。
在又一方面，Y1和Y2中的至少一个是–NR1R2，并且R1至R2如上所述。在又一方面，Y1和Y2均为–NR1R2，并且R1至R2如上所述。或者，R1和R2均独立地选自H、–CH2(CHOH)aCH3、–(CH2)aSO3H、–(CH2)aNHSO3H和–(CH2)aPO3H2。在另一方面，R1和R2都是氢。
最优选地，吡嗪是
或其药学上可接受的盐。
在吡嗪化合物的任何方面，一个或多个原子可以替代地被相同元素的同位素标记的原子取代。例如，氢原子可以用氘或氚同位素标记；碳原子可以用13C或14C同位素标记；氮原子可以用14N或15N同位素标记。同位素标记可以是稳定同位素或可以是不稳定同位素(即，放射性)。吡嗪分子可含有一个或多个同位素标记。同位素标记可以是部分或全部的。例如，吡嗪分子可以用50％氘标记，从而使分子具有可以通过质谱法或其他技术容易监测的特征。作为另一个实例，吡嗪分子可以用氚标记，从而使分子具有可以使用本领域已知的技术在体内和体外监测的放射性特征。
药学上可接受的盐是本领域已知的。在本文的任何方面，吡嗪可以是药学上可接受的盐的形式。作为实例而非限制，药学上可接受的盐包括Berge等人，在J.Pharm.Sci.,66(1),1(1977)中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文作为其教导。盐可以是阳离子的或阴离子的。在一些实施方案中，药学上可接受的盐的抗衡离子选自乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐(依地酸盐)、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐、延胡索酸盐(富马酸盐)、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚(hexylresorcinate)、海巴明青霉素、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐(lactobionate)、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴、甲基硝酸盐(methylnitrate)、甲基硫酸盐(methylsulfate)、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐(polygalacturonate)、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、三乙基碘、己二酸盐、海藻酸盐、氨基水杨酸盐、脱水亚甲柠檬酸盐、槟榔碱、天冬氨酸盐、硫酸氢盐、丁基溴、樟脑酸盐、二葡萄糖酸盐、二氢溴酸盐、二琥珀酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐(jemisulfate)、氢氟酸盐(judrofluoride)、氢碘酸盐(judroiodide)、亚甲基双(水杨酸盐)、萘二磺酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯乙基巴比妥酸盐(phenylethylbarbarbiturate)、苦味酸盐、丙酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、苄星青霉素、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、苯乙苄胺、克立咪唑、二乙胺、哌嗪、氨丁三醇、铝、钙、锂、镁、钾、钠锌、钡和铋。能够形成盐的吡嗪衍生物中的任何官能团可以使用本领域已知的方法任选地形成一个。作为实例而非限制，可以通过向吡嗪中加入盐酸来形成胺盐酸盐。可以通过向吡嗪添加磷酸盐缓冲液来形成磷酸盐。存在的任何酸官能团，例如磺酸、羧酸或膦酸，可以用合适的碱和形成的盐去质子化。或者，胺基可以用适当的酸质子化以形成胺盐。盐形式可以是单电荷，双电荷或甚至三电荷的，并且当存在多于一种抗衡离子时，每个抗衡离子可以与其他的每一个相同或不同。
本文对“吡嗪”、“吡嗪衍生物”、“吡嗪分子”、“吡嗪化合物”或“吡嗪类似物”的所有提及均适用于所有式I化合物。另外，对吡嗪的每个提及包括其所有药学上可接受的盐，除非另有说明。盐形式可以带电荷或不带电荷，并且可以质子化以形成适当的阳离子或去质子化以形成适当的阴离子。本文公开的所有方面和实施方案适用于式I的化合物，并且具体实例仅是说明性的而非限制本公开的范围。
在一些方面，怀疑或已知患者的肾脏具有至少一种医学损伤，并且本文公开的方法用于确定患者中存在的肾损伤或缺陷的水平。在一些方面，患者具有估计的GFR(eGFR)或先前确定的GFR小于110、小于90、小于60、小于30或小于15。使用标准医学技术确定患者的eGFR，并且此类方法是本领域已知的。在一些方面，患者将不会患有或不会怀疑患有他们肾脏的医疗问题。GFR监测可以作为患者的一般或常规健康评估的一部分或作为预防性评估来进行。
由于患者尿液中蛋白质浓度的增加可能表明某种方式的肾损伤或缺陷，因此本文公开的方法适用于其尿液分析显示蛋白质水平增加的患者。在一些方面，通过标准医学测试(例如，试条测试)确定患者的尿液中蛋白质水平增加。作为实例而非限制，患者的尿液分析可显示白蛋白增加、肌酐增加、血尿素氮增加(即，BUN试验)，或其任何组合。
在一些方面，患者先前已被诊断患有至少1期CKD。在其他方面，患者先前已被诊断患有2期CKD、3期CKD、4期CKD或5期CKD。在另一方面，患者尚未被诊断患有CKD但具有一种或多种与CKD相关的风险因子。在另一方面，患者没有已知的CKD风险因子。
实施例
(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双-(氮烷二基))-双(3-羟基丙酸)(“MB-102”)的制备
制备MB-102API的样品并根据GMP标准进行分析以用于两个临床试验。以下程序具有代表性。
步骤1：2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)-双(氮烷二基))(2R,2'R)-双(3-羟基丙酸)二苄酯的形成
向装有克莱森接头(Claisen adapter)和加料漏斗的500mL圆底烧瓶中加入D-丝氨酸苄酯盐酸盐(24.33g,105.0mmol)，并通过套管加入无水DMF(300mL)。将溶液在冰浴中冷却并在N2气氛下搅拌15分钟。在30分钟时间内通过加料漏斗滴加DIPEA(19.16mL,110.0mmol)，再过30分钟后，除去冷却浴，并且一次性加入二酸(9.91g,50.0mmol)。将砖红色悬浮液搅拌30分钟并一次性加入HOBt·H2O(17.61g,115.0mmol)。15分钟后，将反应烧瓶在冰浴中冷却，并在15分钟内分批加入EDC·HCl(22.05g,115.0mmol)。将所得悬浮液缓慢温热至室温并在N2下搅拌过夜(约17小时)。
将深色溶液在高真空(浴温60℃)下浓缩成糖浆状残余物，将其在EtOAc和超纯水H2O(milli-Q H2O)(各400mL)之间分层。分离各层，水层用EtOAc(3×200mL)萃取。将合并的EtOAc萃取液依次用0.50M KHSO4，饱和NaHCO3、H2O和盐水(各250mL)洗涤。减压除去溶剂，得到23.7g的橙色固体。粗产物通过使用CHCl3:MeOH梯度的硅胶快速色谱纯化，得到双酰胺(19.6g,71％)，为橙色固体：Rf＝0.45[CHCl3:MeOH(9:1,v/v)]。1H NMR(DMSO-d6)δ8.56(d,J＝8.0Hz,2H,可与D2O交换),7.40–7.33(m,10H),6.76(s,4H,可与D2O交换),5.37(t,J＝5.5Hz,2H),5.20(m,4H),4.66-4.63(dt,J＝8.0,4.0Hz,2H),3.97–3.93(m,2H),3.81–3.77(m,2H)。13C NMR(DMSO-d6)δ170.1,164.9,146.4,135.8,128.4,128.0,127.6,125.9,66.2,61.1,54.4；RP-LC/MS(ESI)m/z 553.3(M+H)+(Rt＝4.44min,5-95％B/6min)。C26H28N6O8的计算值：C,56.52；H,5.11；N,15.21.发现值：C,56.39；H,5.11；N,14.99.
步骤2：(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双-(氮烷二基))-双(3-羟基丙酸)的形成
将步骤1的双酰胺(7.74g,14.0mmol)在EtOH:H2O(560mL；3:1v/v)中在10％Pd/C(0.774g)的存在下氢化。将反应混合物用氩气吹扫并在氢气氛下(缓慢鼓泡)在室温下搅拌5.5小时。再次用Ar吹扫反应混合物，并通过硅藻土(Celite)过滤除去催化剂。将床用EtOH:H2O(400mL；1:1v/v)洗涤，并将合并的滤液真空浓缩。将产物在高真空下干燥。将残余物用CH3CN研磨，得到MB-102(4.89g,94％)，为橙色粉末。1H NMR(DMSO-d6)δ8.46(d,J＝8.3Hz,2H,可与D2O交换),6.78(br s,4H,可与D2O交换),4.48–4.45(dt,J＝8.1,3.9Hz,2H),3.88(dd,J＝11.1,3.9Hz,2H),3.74(dd,J＝11.1,3.7Hz,2H).13C NMR(DMSO-d6)δ171.6,164.7,146.4,125.9,61.2,54.3.RPLC/MS(ESI)m/z 373.2(M+H)+(Rt＝2.86min,5-95％B/6min).对于C12H16N6O8的分析计算值：C,38.71；H,4.33；N,22.57.发现值：C,38.44；H,4.51:N,22.33.
直接稀释分析的样品制备
对于通过直接稀释的样品制备，在验证研究或样品分析当天，在PBS中的1％人血浆中制备了含有0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、16.0、40.0、100.0、200.0、400.0ng/mL的校准标准品以及MB-102的低、中、高水平下的质量对照。在临床研究中使用的MB-102给药溶液(18.6mg/mL)首先用PBS中的1％人血浆1/100稀释，以形成186μg/mL的MB-102的储备溶液。将该储备溶液用PBS中的1％人血浆进一步稀释，以形成2000ng/mL的MB-102的校准标准工作原液用于制备校准标准品。还通过用PBS中的1％血浆稀释，从186μg/mL的MB-102原液制备(300ng/mL)的QC工作原液。通过用PBS中的1％人血浆稀释，从该QC工作原液制备低、中和高水平的质量对照。
蛋白质沉淀分析的样品制备
对于通过蛋白质沉淀的样品制备，如下制备了含有0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、16.0、40.0、100.0、200.0、400.0ng/mL的校准标准品以及MB-102的低、中、高水平下的质量对照。对于每种标准品和QC，制备1X PBS中10,000倍浓度的MB-102。将这些储备溶液用血浆稀释1/100以在99％血浆/1％PBS中制备MB-102的工作校准标准品和QC。将200μL的这些工作标准品和QC等分到600μL的小瓶中并储存在-80℃下直至使用。使用相同的HPLC方法，将这些工作校准标准品和QC定性和认证用于分析未知样品。
患者样本的分析
从两项临床研究中获得血浆样品。将所有血浆样品储存在-80℃下直至分析。
对于通过直接稀释分析的样品，将10μL的血浆样品(解冻至室温并充分混合)用990μL的1X PBS稀释，充分混合约10分钟，并以1000rpm离心2分钟。通过HPLC直接分析。
对于通过蛋白质沉淀分析的样品，将50μL的血浆(解冻至室温并充分混合)用200μL的含有4.5％的1X PBS(v/v)的甲醇稀释，混合至少10秒，并以>4000rpm离心持续10分钟。将整个上清液转移到第二容器中。从那里，将50μL的上清液与950μL的1X PBS混合。将样品混合并通过HPLC分析。通过该步骤，消除了血浆蛋白沉淀后上清液的脱水(干燥，dry-down)。将一部分上清液用1X PBS直接稀释用于HPLC分析，从而不需要通常用于蛋白质沉淀方法的内标。
HPLC分析
分析在Waters Acquity UPLC H级色谱系统上进行，该系统配备有柱加热器、样品加热器/冷却器、真空除气器、自动取样器、荧光检测器和能够提供二元梯度的泵。HPLC分析柱，Phenomenex Luna C18(2),4.6x 250mm,5μm,(Phenomenex,Cat.No.00G-4252-E0，S/N H15-133556)和安全防护盒C18,4x 3mm ID,5μm(Phenomenex,Cat.No.KJ0-4282)用于分析。配备UPLC系统的Waters Empower 3软件用于分析设置，分析监测和数据处理。使用两种流动相，流动相A：0.1％的三氟乙酸的水溶液(Fisher,等级)和流动相B：0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液(Fisher Scientific,等级)。将柱温设定为30℃，自动取样器温度设定为5℃，激发波长设定为434nm，且检测/发射波长设定为556nm。计数率设定为5点/秒；PMT增益设定为50；流动池温度为环境温度；注射量为10μL。使用所示的梯度，MB-102在约3.6分钟洗脱。
时间(min.) 流速(mL/min) ％A ％B 梯度曲线
0.00 1.1 85 15 6
5.00 1.1 40 60 6
5.05 1.6 10 90 6
6.75 1.6 10 90 6
6.80 1.1 85 15 6
10.00 1.1 85 15 6
方法验证
使用本文所述的HPLC方法和样品制备，进行验证研究以确定精度、准确度、线性度、再现性、血浆和样品溶液稳定性、冻融稳定性、定量下限(lowest limits ofquantitation)和特异性。验收标准是与正常值的±15％数据偏差，除了在将其设定为±20％的定量下限(LLOQ)。在内部和GMP合同实验室分析样品，以确保方法的有效性和结果的准确性。
特异性和选择性
通过比较空白样品和加标MB-102样品的色谱图，研究了血浆成分与MB-102的干扰和分析。LLQ被确定为空白样品的噪声水平的至少10倍，而LLOD被确定为空白样品的噪声水平的至少三倍。
准确度和精度
进行在1％血浆/PBS中的五种浓度水平的MB-102的样品制备的三次重复，并分析其准确度测定。为了精确测定仪器注射，进行了10次200ng/mL样品的注射，以确保重复注射高度精确。
回收率
通过比较血浆样品对照与加标MB-102的那些血浆样品，在三种不同浓度的MB-102下测定回收率。从加标样品中回收的MB-102的百分比确定为回收率百分比。
血浆样品稳定性和血浆溶液稳定性
在长期储存血浆样品(在-80℃下冷冻)和短期储存(有/无光照和2-8℃的台式环境温度)血浆溶液的样品处理过程中，评估MB-102的稳定性。测试血浆样品的三个冷冻/解冻循环(-80℃至室温)。对于24和48小时的时间间隔，评估MB-102在室温下在有/无光照，2-8℃下和自动取样器温度(5℃)下在血浆溶液中的稳定性。
结果
图2示出了具有空白对照(1％血浆/PBS)的MB-102(在1％血浆/PBS中为3.3ng/mL)的HPLC色谱图的叠加图。监测在556nm下从MB-102发射的荧光波长用于定量。样品溶液中的1％的血浆蛋白在3.62分钟附近没有洗脱峰以干扰MB-102用于检测或定量。
方法验证
方法验证研究的结果总结在表1中。MB-102标准品校准显示，对于浓度为0.4ng/mL至400ng/mL的三个数量级的线性响应非常好，R2为0.9997，使用权重为1/X的线性回归。0.4ng/mL下的LLOQ的信噪比为15.18，USP拖尾为1.072，且USP平板计数为39934，如图3A所示。通过额外的仪器优化获得了改进的信噪比(19.48)(图3B)。
表1.方法验证研究的结果
测定精密度非常好，显示回收率为99.2％，RSD为0.45％，并且对于所有研究的条件，回收率的准确度为95.7％至101.2％。三次冷冻/解冻循环表明血浆在-80℃下非常稳定。在4℃下和在室温下无光储存长达48小时的样品溶液稳定性也非常稳定。当溶液在室温下有光照储存48小时时，MB-102有少量降解(～1-2％)。所有三种浓度的加标回收率均在加标量的±15％范围内。为了确定未知样品在3.62分钟洗脱的MB-102峰的纯度，将血浆样品蛋白质沉淀，将上清液脱水并重构至PBS中。产生在445nm(在PDA模式下)监测的HPLC色谱图。将来自PBS中的加标样品的MB-102PDA峰纯度与从临床研究中收集的血浆样品的峰纯度进行比较。如图4和图5所示的结果表明，在临床研究中在445nm处吸收的在3.62分钟洗脱的MB-102峰是纯的。
患者样本的分析
为了支持临床研究以评估MB-102通过透皮荧光传感监测肾功能的效用，从在0、5、10、15、30、60、90、120、180、240、300、360、480、600和720分钟收集的每位研究参与者的血液样品制备血浆样品。该方法被转移到GMP认证的生物分析实验室，用于验证和分析整个临床研究的血浆样品。将GMP实验室的结果与内部测试的结果进行比较，以确保准确度和可重复性。
来自同一研究的12名患者的血浆样品在内部使用以验证GMP实验室结果。内部获得的这些受试者的结果和GMP实验室的结果的比较显示在图6中。相关性的线性回归表明斜率为1.018，R2为0.9903。来自这12名受试者的药代动力学分析显示在图7中，表明MB-102的清除率因患者而异。
由于在该研究中将碘海醇与MB-102共同给药作为参考标记，因此在图8a、8b和8c中示出了MB-102和碘海醇对三位受试者的药代动力学的比较。如图所示，对于这里所示的三位受试者中的每一位，MB-102的清除率与碘海醇的清除率平行。因此，MB-102可以与碘海醇类似地进行GFR测定。
为了更好地理解如图6所示的1.0177的相关性(当比较内部与GMP合同实验室进行的测量时)，研究通过蛋白质沉淀进行HPLC分析的传统血浆样品制备方法。使用改良的蛋白质沉淀方法分析来自相同12名受试者的血浆样品。通过直接稀释法(direction dilutionmethod)与蛋白质沉淀法测定的MB-102的相关性图显示在图9中。相关斜率为1.0074且R2为0.9944的结果有力地支持了通过直接稀释法制备的血浆中的MB-102含量的分析的有效性。通过蛋白质沉淀制备血浆样品是耗时的并且需要设置额外的实验室设备。在1X PBS中通过1/100直接稀释制备血浆样品是简单、快速、精确和准确的。
使用蛋白质沉淀法，分析来自59名受试者的临床研究的血浆样品。将结果与使用直接稀释法从GMP实验室获得的结果进行比较。这两组数据的相关性图如图10所示。得到1.0153的相关斜率，其中R2为0.9941。使用假设方差相等的双样本t检验，来自该数据的p值(0.579>0.05)表明配对(pairs)的平均值没有统计学差异。
显示溶血的血液样品的分析
在开发本文公开的方法期间，研究了溶血对血浆中MB-102定量的影响。传达将血液采集和血浆制备过程中的溶血作用降至最低的临床方案，并与试验现场的临床医生进行讨论；然而，在59名受试者的所有血浆样品中，注意到几个具有一定程度溶血的样品。临床研究所接收的大于90％的血浆样品的血红蛋白含量为50mg/dL以下。几种血浆样品的血红蛋白含量为约100-250mg/dL。使用直接稀释和蛋白质沉淀方法比较这些样品的MB-102浓度。图11中的结果是针对血红蛋白含量为50mg/dL至100mg/dL的样品。相关曲线的斜率(1.0194)表明，当将其与图10中所示的相关曲线的斜率(1.0153)进行比较时，对MB-102定量的影响是最小的。
图12中的结果是显示血红蛋白含量为100mg/dL至250mg/dL的样品。相关曲线的斜率(1.1107)表示当与图10中所示的相关曲线的斜率(1.0153)相比时对MB-102定量的影响。由于这四个血浆样品来自四个不同的受试者，在样品采集的不同时间点，它们对确定清除率以及因此GFR的影响不会很大。
来自这些研究的数据表明，具有荧光检测的直接稀释和沉淀方法都是精确和准确的，并且适用于测定人血浆中的MB-102。

Claims (20)

1.一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法，所述方法包括：
收集血浆样品，
用至少一种溶剂稀释所述血浆样品；和
通过HPLC分析稀释的所述样品，从而测量所述血浆中的所述化合物的量；
其中在HPLC分析之前不干燥所述血浆样品，并且不向所述样品中添加内标。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光化合物是式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中
X1和X2各自独立地为–CO2R1、–CONR1R2、–CO(AA)或–CONH(PS)；
Y1和Y2各自独立地选自–NR1R2和
Z1为单键、–CR1R2–、–O–、–NR1–、–NCOR1–、–S–、–SO–或–SO2–；
R1至R2各自独立地选自H、–CH2(CHOH)aH、–CH2(CHOH)aCH3、–CH2(CHOH)aCO2H、–(CHCO2H)aCO2H、–(CH2CH2O)cH、–(CH2CH2O)cCH3、–(CH2)aSO3H、–(CH2)aSO3 -、–(CH2)aSO2H、–(CH2)aSO2 -、–(CH2)aNHSO3H、–(CH2)aNHSO3 -、–(CH2)aNHSO2H、–(CH2)aNHSO2 -、–(CH2)aPO4H3、–(CH2)aPO4H2 -、–(CH2)aPO4H2-、–(CH2)aPO4 3-、–(CH2)aPO3H2、–(CH2)aPO3H-和–(CH2)aPO3 2-；
AA是包含选自天然和非天然氨基酸的一个或多个氨基酸的肽链，所述一个或多个氨基酸通过肽或酰胺键连接在一起，并且每种情况的AA可与每种其他情况相同或不同；
PS是硫酸化或非硫酸化的多糖链，其包含通过糖苷键连接的一个或多个单糖单元；且
“a”是1至10的数字，“c”是1至100的数字，“m”和“n”中的每一个独立地是1至3的数字。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物是
或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种溶剂选自水性溶剂、非水性溶剂及其任何组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种溶剂是PBS。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述血浆样品显示出血液溶血的迹象。
7.一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法，所述方法包括：
收集血浆样品，
向所述样品中加入至少一种溶剂，从而使血浆蛋白沉淀，
从所述样品中去除沉淀的所述血浆蛋白，和
通过HPLC分析所述样品，从而测量所述血浆中的所述化合物的量；
其中在HPLC分析之前不干燥所述样品，并且不向所述样品添加内标。
8.根据权利要求7所述的方法，其中去除沉淀的所述血浆蛋白包括离心所述样品，
离心的所述样品具有上清液和沉淀物；并且
在HPLC分析之前，用至少一种溶剂稀释所述上清液。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少一种溶剂选自甲醇、PBS及其任何组合。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述荧光化合物是式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中
X1和X2各自独立地为–CO2R1、–CONR1R2、–CO(AA)或–CONH(PS)；
Y1和Y2各自独立地选自–NR1R2和
Z1为单键、–CR1R2–、–O–、–NR1–、–NCOR1–、–S–、–SO–或–SO2–；
R1至R2各自独立地选自H、–CH2(CHOH)aH、–CH2(CHOH)aCH3、–CH2(CHOH)aCO2H、–(CHCO2H)aCO2H、–(CH2CH2O)cH、–(CH2CH2O)cCH3、–(CH2)aSO3H、–(CH2)aSO3 -、–(CH2)aSO2H、–(CH2)aSO2 -、–(CH2)aNHSO3H、–(CH2)aNHSO3 -、–(CH2)aNHSO2H、–(CH2)aNHSO2 -,–(CH2)aPO4H3、–(CH2)aPO4H2 -、–(CH2)aPO4H2-、–(CH2)aPO4 3-、–(CH2)aPO3H2、–(CH2)aPO3H-和–(CH2)aPO3 2-；
AA是包含选自天然和非天然氨基酸的一个或多个氨基酸的肽链，所述一个或多个氨基酸通过肽或酰胺键连接在一起，并且每种情况的AA可以与每种其他情况相同或不同；
PS是硫酸化或非硫酸化的多糖链，其包含通过糖苷键连接的一个或多个单糖单元；且
“a”是1至10的数字，“c”是1至100的数字，“m”和“n”中的每一个独立地是1至3的数字。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述化合物是
或其药学上可接受的盐。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少一种溶剂选自水性溶剂、非水性溶剂及其任何组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述水性溶剂是磷酸盐缓冲盐水且所述非水性溶剂是甲醇。
14.根据权利要求7所述的方法，其中所述血浆样品显示出血液溶血的迹象。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述血浆来自人、动物或体外研究。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂是选自磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、甲酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐、铵盐、胍盐、HEPES、二甲砷酸盐、Tris、tris-HCl、马来酸盐、硼酸盐、甘氨酸盐、琥珀酸盐、PIPES及其任何组合的水性缓冲液。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂是选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、己烷、氯仿、DMF、DMSO、乙酸、丙酮、乙腈、丁醇、四氯化碳、二乙二醇、乙醚、DME、乙二醇、二氯甲烷、硝基甲烷、石油醚、丙醇、吡啶、甲苯、MTBE、三乙胺、二甲苯和苯的非水性溶剂。
18.根据权利要求7所述的方法，其中所述血浆来自人、动物或体外研究。
19.根据权利要求7所述的方法，其中所述溶剂是选自磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、甲酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐、铵盐、胍盐、HEPES、二甲砷酸盐、Tris、tris-HCl、马来酸盐、硼酸盐、甘氨酸盐、琥珀酸盐、PIPES及其任何组合的水性缓冲液。
20.根据权利要求7所述的方法，其中所述溶剂是选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、己烷、氯仿、DMF、DMSO、乙酸、丙酮、乙腈、丁醇、四氯化碳、二乙二醇、乙醚、DME、乙二醇、二氯甲烷、硝基甲烷、石油醚、丙醇、吡啶、甲苯、MTBE、三乙胺、二甲苯和苯的非水性溶剂。
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