CN110468223A

CN110468223A - 基于dUTP/UNG法的肺炎支原体和鲍特菌属核酸检测的引物、探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN110468223A
Application number: CN201910920002.5A
Authority: CN
Inventors: 岳素文; 林笑冬; 王雷; 陈江莎; 张志强
Original assignee: Beijing Zhuo Chenghui Biological Polytron Technologies Inc
Current assignee: Beijing Zhuo Chenghui Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2039-09-26
Also published as: CN110468223B

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及基于dUTP/UNG的肺炎支原体和鲍特菌属核酸检测引物、探针、试剂盒及方法，达到定量检测、灵敏度高、特异性高、操作简单，可有效避免假阳性结果，可同时准确鉴定肺炎支原体和3种常见的鲍特氏菌和鲍特菌属，建立一种六重实时荧光定量PCR检测方法。

Description

基于dUTP/UNG法的肺炎支原体和鲍特菌属核酸检测的引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于dUTP/UNG的肺炎支原体和鲍特菌属核酸检测的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是介于细菌与病毒之间的一种病原微生物，主要引起呼吸系统疾病，由口、鼻分泌物经空气传播，主要见于儿童和青少年，其引起的肺炎占非细菌性肺炎的50％。

肺炎支原体(M.Pneumonia)是引起人类支原体肺炎的病原体，一般以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。肺炎支原体主要经飞沫传染，潜伏期一般2～3 周，发病率以青少年最高；其临床症状表现较轻，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状。在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。

鲍特菌属细菌是革兰阴性无芽孢的小球杆菌，鲍特氏菌属包括7个种，其中百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、支气管败血鲍特氏菌、霍氏鲍特氏菌四个种引起人类呼吸道疾病，具有较大的临床价值，其DNA同源性高达72％～94％。

百日咳鲍特氏菌被认为只感染人类，而副百日咳鲍特氏菌常见于绵羊和人类感染。支气管败血鲍特氏菌可以导致多种动物呼吸道感染，偶尔也感染人类。霍氏鲍特氏菌不产生其它三种可产生的毒力因子，然而越来越多的类百日咳样病例归因于新出现的霍氏鲍特氏菌病原体。

百日咳和副百日咳合并感染率不到2％，且很大程度上取决于患者的年龄。据估计，全球每年发生1600万百日咳感染病例，19.5万死亡病例。在欧洲国家，每年大约有4万例报导。即使百日咳疫苗已经普遍推广，百日咳仍然是公共健康卫生的一个重大威胁，百日咳发病率一直在显著提高，由于临床表现的复杂性和不典型性，为避免延误治疗，及时而准确的诊断尤为重要。

病原微生物常用的实验室诊断方法：

(1)分离培养法：是诊断最可靠的依据，常作为确诊的“金标准”。但肺炎支原体和鲍特菌属的培养条件苛刻，生长缓慢，鲍特菌属培养方法的敏感度取决于症状持续时间、年龄、免疫状态，因而缺乏早期诊断价值。

(2)血清学检测：血清学检查结果受病程的影响，即使早期产生的IgM也需要在感染1 周后才能被检测到。婴幼儿由于免疫功能尚未发育完善、产生抗体的能力较低，可能出现假阴性。

(3)核酸扩增技术：实时荧光定量扩增联合了PCR和荧光探针技术，扩增和检测同时进行，检测时间短，敏感度及特异度高，成为临床实验室诊断病原微生物感染的主要方法。

始点定量荧光检测系统实时监测累积的荧光强度而实现的，具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点，已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断等方面。美国和其他地区，实时定量PCR方法是直接检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的推荐方法。

CN107630098A公开了一种用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光PCR检测体系、试剂盒及检测方法。该荧光PCR检测体系包括非荧光扩增引物系统、检测探针系统以及荧光扩增引物系统。能够进行呼吸道多种细菌的联合检测，解决了荧光PCR检测受限于检测通道的瓶颈问题。上述荧光PCR检测体系、试剂盒及检测方法具有高通量、低成本、少耗时的特点。

CN109234456A公开了一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用，具体提供一种可同时检测6种呼吸道病原体包括肺炎支原体和百日咳杆菌的引物组和探针组、试剂盒以及它们的用途，该发明采用NASBA法扩增产物，但是RNA提取方法复杂，而且RNA易降解，会对样本检测造成不良影响。

本发明的目的是提供一种检测肺炎支原体和鲍特菌属的实时荧光定量PCR引物探针和试剂盒，可同时准确鉴定肺炎支原体和3种常见的鲍特氏菌和鲍特菌属，建立一种基于荧光定量 PCR平台的六重PCR检测方法。

发明内容

为解决现有技术的上述问题，本发明设计并筛选了同时鉴定肺炎支原体、百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、霍氏鲍特氏菌和鲍特菌实时荧光定量PCR特异性引物及探针。

本发明的目的在于提供一种用于同时检测肺炎支原体、百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、霍氏鲍特氏菌和鲍特菌属多重实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种同时检测肺炎支原体、百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、霍氏鲍特氏菌和鲍特菌属的荧光实时定量PCR方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

选择肺炎支原体、百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、霍氏鲍特氏菌和鲍特菌属的特异性的检测基因和保守序列，优选地，肺炎支原体选择P1蛋白，鲍特菌属分别选择IS481、IS1001、IS1002、ptxP和recA基因。在Genbank中查找上述基因的全长序列，把每种基因序列的全长序列导入序列比对软件中，比对分析获得可用于引物探针设计的保守序列区段。把每种基因的保守序列区段分别输入引物设计软件中，设计6种检测目标的引物对探针，设计规则为：Tm 值一致；GC含量均一化；避免出现发夹结构、引物二聚体；单重PCR验证特异性好、敏感性好；BLAST分析无与感染部位相关病原交叉的、特异性好；将所有扩增目标病原体的引物对探针混合物进行多重PCR可以进行同时扩增的。得到以下引物对、探针序列：

检测肺炎支原体的引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条序列组成；

检测IS481的引物对由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的两条序列组成；

检测IS1001的引物对由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的两条序列组成；

检测IS1002的引物对由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的两条序列组成；

检测ptxP的引物对由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的两条序列组成；

检测recA的引物对由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的两条序列组成；

检测肺炎支原体的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

检测IS481的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

检测IS1001的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

检测IS1002的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

检测ptxP的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

检测recA的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

进一步地，以其他物种序列为模板设计用于检测内对照IC的引物对和探针，预防假阴性的出现。

优选地，本申请以拟南芥序列为模板设计内对照引物，所依据的拟南芥序列如SEQID NO： 22所示，其中上游引物序列为SEQ ID NO：19所示，下游引物序列为SEQ ID NO：20所示，探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：21所示。

其中，探针5’端的荧光基团为FAM、CY5、HEX、VIC或ROX中的一种，3’端的淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种。

优选地，将所述引物和探针分为2个体系进行包装，其中，A体系由以下引物对和探针组成：

由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示两条序列组成的检测肺炎支原体的引物对；

由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示两条序列组成的检测IS481的引物对；

由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示两条序列组成的检测IS1001的引物对；

由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示两条序列组成的检测内标的引物对；

核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示检测肺炎支原体的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示检测IS481的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示检测IS1001的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示检测内标基因拟南芥序列的探针；

B体系由以下引物对和探针组成：

由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示两条序列组成的检测IS1002的引物对；

由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示两条序列组成的检测ptxP的引物对；

由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示两条序列组成的检测recA的引物对；

核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示检测IS1002的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示检测ptxP的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示检测recA的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示检测内标基因拟南芥序列的探针。

优选地，反应体系含有dUTP/UNG防污染措施，避免假阳性结果；反应体系中加入内标对照引物探针组，用于监控反应体系可能存在的抑制因素，可控制反应体系内部质量，判断反应是否受到抑制，避免假阴性结果。

进一步地，PCR反应体系具体如下：PCR反应液10μL，10×引物探针混合物2μL，DNA模板5μL，超纯水补至20μL；优选地，引物探针混合物中引物的浓度为3-6μM，探针的浓度为1-3μM。

进一步地，PCR反应条件具体如下：45℃10min；95℃5min；95℃15s，60℃45s，循环45次。

本发明还提供一种采用上述方法进行检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述引物对和探针组合，以及本发明所述PCR试剂。

进一步地，使用本发明所述的试剂盒进行检测：

1.样本采集：

鼻拭子：左手扶住患者的下颌部，右手持无菌拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子擦拭另侧鼻孔。将拭子浸入采样液中，在采样液中挤压拭子头部3 次，用力折断拭子的尾部，弃去尾部。

咽拭子：左手用压舌板压住患者的舌头。右手持无菌拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入采样液中，在采样液中挤压拭子头部3次，用力折断拭子的尾部，弃去尾部。

其中，采样液为含有蛋白质稳定剂以及抗生素的缓冲液。

鼻咽深部分泌物：采用负压吸引器收集鼻咽分泌物于无菌容器，加入4倍体积的无菌生理盐水，吹打混匀4℃液化过夜。

痰液：晨起用清水反复漱口，然后用力咯出气管深处痰液，盛于无菌痰杯内，用4倍体积氢氧化钠溶液45℃液化20分钟，立即送检。

2.模板提取：

采用常规方法提取DNA。

3.建立多重实时荧光PCR检测体系：

其中，多重PCR引物浓度及反应体系配置如下：

试剂盒检测的反应体系为20μL，其配置如下：含IC模板和UNG酶的PCR反应液10μL；10×引物探针混合物2μL，DNA模板5μL，超纯水补至20μL。

优选地，UNG酶为UDG酶或UNG酶；

优选地，所述引物探针混合物中引物的浓度为3-6μM，探针的浓度为1-3μM。

多重PCR反应的反应条件如下：45℃10min；95℃5min；95℃15s，60℃45s，循环45次。

4.多重实时荧光PCR结果，在IC阳性的前提下，根据不同荧光通道信号判定结果：

表1肺炎支原体和鲍特菌属检测结果判定表

备注：内标除外的其他通道共同阳性的则为共感染。

由表1可知，在ROX通道内标成立的情况下，若反应一FAM通道信号为阳性，则样本中含有肺炎支原体；若反应一VIC通道信号为阳性，则样本中含有百日咳鲍特菌；若反应一CY5通道和反应二FAM通道信号同时为阳性，则样本中含有副百日咳鲍特菌；若反应一VIC通道和反应二recA通道同时为阳性，则样本中含有霍氏鲍特菌，若反应一VIC通道或反应一CY5单独出现阳性信号，则样本中含有鲍特菌属。

本发明所述技术方案能够对肺炎支原体和鲍特菌属感染进行多重、快速、准确的检测，以便进行及时治疗，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，灵敏度高，特异性高，有效预防假阴性和假阳性结果。

附图说明

图1反应一非特异性验证结果，图中扩增曲线为不同编号的样品微生物检测孔的内标扩增曲线，其中检测曲线的颜色与图例中样品编号相对应，检测系统成立，且待检微生物均未出现荧光信号，表明本发明试剂盒具有较好的特异性；

图2反应二非特异性验证结果，图中扩增曲线为不同编号样品微生物检测孔的内标扩增曲线，其中检测曲线的颜色与图例中样品编号相对应，检测系统成立，且待检微生物均未出现荧光信号，表明本发明试剂盒具有较好的特异性；

图3反应一FAM通道(肺支)标准曲线，说明肺支原体检测在10³～10⁷线性相关系数R²>0.99，线性相关性好；

图4反应一VIC通道(IS481)标准曲线，说明百日咳鲍特氏菌IS481检测在10³～10⁷线性相关系数R²>0.99，线性相关性好；

图5反应一CY5通道(IS1001)标准曲线，说明副百日咳鲍特氏菌IS1001检测在10³～10⁷线性相关系数R²>0.99，线性相关性好；

图6反应二FAM通道(IS1002)标准曲线，说明副百日咳鲍特氏菌IS1002检测在10³～10⁷线性相关系数R²>0.99，线性相关性好；

图7反应二VIC通道(ptxP)标准曲线，说明霍氏鲍特氏菌ptxP检测在10³～10⁷线性相关系数R²>0.99，线性相关性好；

图8反应二CY5通道(recA)标准曲线，说明鲍特菌属recA检测在10³～10⁷线性相关系数R²>0.99，线性相关性好。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，百日咳鲍特氏菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为23524)、肺炎衣原体(源自中国人民解放军军区医院，编号为14127)，副百日咳鲍特氏菌(编号9797)、支气管败血鲍特氏菌(编号为ATCC10580)和霍氏鲍特氏菌(编号为ATCC700053)，阳性对照为含有目标序列的串联质粒。

其中，实时荧光定量PCR结果的判定条件为：

1)调整阈值：仪器根据前15个循环反应背景值，自动调整判定阈值。

2)质量控制：空白对照、阳性对照和内标对照成立，否则视实验无效；

其中，阳性对照为含有目标序列的串联质粒。

3)每个荧光检测通道的判断与解释：a)若样本有S型扩增，且Ct值小于36，则判定样本为阳性；b)若样本无S型扩增曲线，且内标Ct值小于36，则判定为阴性；c)若样本无明显S型扩增曲线，且内标Ct值小于36，但报告有Ct值，则判定为非特异性扩增；可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。

下述实施例中所用其他材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得；若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议条件。

实施例1

选择肺炎支原体、百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、霍氏鲍特氏菌和鲍特菌属的特异性的检测基因和保守序列：肺炎支原体选择P1蛋白，鲍特菌属分别选择IS481、IS1001、IS1002、 ptxP和recA基因。在Genbank中查找上述基因的全长序列，把每种基因序列的全长序列导入序列比对软件中，比对分析获得可用于引物探针设计的保守序列区段。把每种基因的保守序列区段分别输入引物设计软件中，设计6种检测目标的引物对探针，设计规则为：Tm值一致； GC含量均一化；避免出现发夹结构、引物二聚体；单重PCR验证特异性好、敏感性好；BLAST 分析无与感染部位相关病原交叉的、特异性好；将所有扩增目标病原体的引物对探针混合物进行多重PCR可以进行同时扩增的。得到如SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:18所示引物对、探针序列用于组装试剂盒；此外，以拟南芥序列为模板设计内对照(IC)引物对、探针如SEQ ID NO: 19-SEQ ID NO:21所示，并将所述试剂盒中的引物对、探针分装为以下两种体系：

表2 A体系：含有肺炎支原体、IS481、IS1001和内标引物探针汇总表

表3 B体系：IS1002、ptxP、recA和内标引物探针汇总表

其中，A体系又名A管、反应一，B体系又名B管、反应二。

试剂盒的使用方法具体如下：

1、样本采集

采样液：含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素的缓冲液，具体为Hank’s或 Eagle’s培养液加入抗生素和0.5％BSA。

痰液：晨起用清水反复漱口，然后用力咯出气管深处痰液(不要从咽部或口腔咳出的痰)，盛于无菌痰杯内，盖紧盖，立即送检，不应超过2小时。用4倍体积氢氧化钠溶液45℃液化20分钟。

2、模板提取

采用常规方法提取DNA，取样本时加入10μL内标参与提取。

3、反应体系的配制

试剂盒检测的反应体系为20μL，其配置如下：PCR反应液10μL(含UDG酶)；10×引物探针 A管或B管混合物2μL，其中引物的浓度为3-6μM，探针的浓度为1-3μM，DNA模板5μL，超纯水补至20μL。

3、PCR反应

将PCR管放入荧光定量PCR仪中，按照如下程序进行PCR反应：45℃，10min；95℃，5min；95℃，15s，60℃，45s，循环45个反应。

实施例2

选择肺炎支原体、百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、支气管败血鲍特氏菌和霍氏鲍特氏菌的阳性样品，分别提取将5个待检目标病原的基因组DNA。将5个待检目标病原体DNA模板分别梯度稀释成相当于10⁷copies/mL，10⁶copies/mL，10⁵copies/mL，10⁴copies/mL， 10³copies/mL，10²copies/mL，10copies/mL的检测样本。

使用本发明试剂盒分别检测肺炎支原体、百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、支气管败血鲍特氏菌和霍氏鲍特氏菌不同稀释度的模板，检测5个目标病原的最低检出限，结果如表4 所示：

表4肺炎支原体和鲍特菌属最低检出限试验结果

注：+表示将模板稀释至10²copies/mL重复检测25次，25次检测均为阳性；-表示将模板稀释至 10²copies/mL重复检测25次，25次检测至少一次为阴性。

由表4可知，试剂盒检测5种目标的最低检出限均能达到10²copies/mL。

实施例3

将本发明所述的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、30、90、150、240、300、330、360和390天的试剂盒进行保存期试验，分别以10⁵copies/mL肺炎支原体和鲍特菌属的混合模板作为评估用检测样本，保存期检测结果如表5所示：

表5保存期试验结果

保存期	检测各通道的有效性
		第0天	A管和B管各通道均有效
第30天	A管和B管各通道均有效
		第90天	A管和B管各通道均有效
第150天	A管和B管各通道均有效
		第240天	A管和B管各通道均有效
第300天	A管和B管各通道均有效
		第330天	A管和B管各通道均有效
第360天	A管和B管各通道均有效
		第390天	A管和B管各通道均有效

由表5可知，在-20℃冰箱保存的试剂盒，在不同保存期检测A和B管各通道均有效，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为13个月。

实施例4

选择人冠状病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为2233)、巨细胞病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为303)、肠道病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为977)、麻疹病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为1513)、人偏肺病毒(源自中国人民解放军总医院，编号为1768)、流行性腮腺炎病毒(源自中国人民解放军总医院，编号为3145)、鼻病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为2343)、百日咳杆菌(源自中国人民解放军总医院，编号为 23524)、肺炎衣原体(源自中国人民解放军总医院，编号为14127)、肺炎支原体(源自中国人民解放军总医院，编号为14121)、流感嗜血杆菌(来自中国医学菌种保藏中心，编号为58532)、无毒结核分枝杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为93009)、脑膜炎奈瑟菌(源自中国人民解放军总医院，编号为21123)、金黄色葡萄杆菌(源自中国人民解放军总医院，编号为 31122)、肺炎链球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为31108)、化脓链球菌(源自中国人民解放军总医院，编号为25341)、唾液链球菌(源自中国人民解放军总医院，编号为25346)、棒状杆菌(源自中国人民解放军总医院，编号为32451)、大肠杆菌(源自中国人民解放军总医院，编号为32516)、乳杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为34106)、卡他莫拉菌(源自中国人民解放军总医院，编号为11256)、淋球菌(源自中国人民解放军总医院，编号为13251)、铜绿假单胞杆菌(源自中国人民解放军总医院，编号为15204)、表皮葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26069)这些与待检测目标核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物。

如图1、图2所示，应用本发明试剂盒检测这些待检微生物，图中扩增曲线为不同编号的样品微生物检测孔的内标扩增曲线，其中检测曲线的颜色与图例中样品编号相对应，检测系统成立，且待检微生物均未出现荧光信号，表明本发明试剂盒能够有效区分非目标微生物，具有较好的特异性。

实施例5

选择包含P1蛋白扩增子、IS481基因扩增子、IS1001基因扩增子、IS1002基因扩增子、ptxP 基因扩增子和recA基因扩增子的质粒，将质粒浓度调整至10⁸copies/mL，然后进行梯度稀释至 10⁷copies/mL，10⁶copies/mL，10⁵copies/mL，10⁴copies/mL，10³copies/mL。

使用本发明试剂盒检测质粒稀释的梯度。根据实施例2进行操作，试剂盒检测标准曲线试验结果如表6、图3-图8所示：

表6肺炎支原体和鲍特菌属标准曲线试验结果

由表6、图3-图8可知，通过对10³-10⁷copies/mL的肺支原体或鲍特菌属的检测，本发明所述试剂盒线性相关系数均大于0.99，线性相关性好，因此本发明所述试剂盒可用于检测不同浓度的肺支原体或鲍特菌属样本。

实施例6

选择包含P1蛋白扩增子、IS481基因扩增子、IS1001基因扩增子、IS1002基因扩增子、 ptxP基因扩增子和recA基因扩增子的串联质粒，将质粒浓度调整至10⁵copies/mL，使用本发明试剂盒检测质粒稀释的梯度。将扩增产物分成10份，每三份一组，剩余一份作为对照。第一组分别加入0.05μLUDG酶，第二组分别加入0.1μLUDG酶，第三组分别加入0.2μLUDG酶。每组于45℃分别消化8min、10min和12min。消化后取5μL作为模板用试剂盒进行检测，与未消化的产物进行对比。产物消化后作为模板经试剂盒检测没有任何目标扩增，未消化产物作为模板经试剂盒检测各目标通道有目标扩增，且Ct值较初次扩增提前，结果如表7所示：

表7 UDG酶不同用量及消化时间检验结果

由表7可知，使用dUTP/UNG反应体系45℃消化10min可有效防污染。

实施例7

单重PCR验证敏感性评估相关数据：

选择包含P1蛋白扩增子、IS481基因扩增子、IS1001基因扩增子、IS1002基因扩增子、 ptxP基因扩增子和recA基因扩增子的串联质粒，将质粒浓度调整至200copies/mL、100copies/mL和50copies/mL，根据实施例2配制各目标单重体系进行检测，各重复检测25次，至少24次为阳性即可确定此浓度为最低检出限浓度。各目标最低检出限确定结果见表8：

表8单重PCR最低检出限结果

由表8可知，6个目标单重体系最低检出限均能达到100copies/mL，其中IS1001基因和 ptxP的单重检测体系最低检出限能达到50copies/mL。

本发明建立的肺炎支原体和鲍特菌属多重实时荧光定量PCR检测方法，能够对肺炎支原体和鲍特菌属感染进行快速、准确的检测，以便进行及时治疗，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，可以进行多重检测，具有灵敏度高，特异性高，线性相关性好的特点；此外，还可以预防假阴性结果和假阳性结果。为呼吸道传染临床样本中肺炎支原体和鲍特菌属的快速筛查提供了完备的解决方案，能实现对肺炎支原体和百日咳杆菌进行快速、准确的筛查，有效预防突发公共卫生事件的发生。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司

<120> 基于dUTP/UNG的肺炎支原体和鲍特菌属核酸检测的引物、探针、试剂盒及方法

<130> 1

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccagcggaa ttagtacgaa cac 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtggctttg acattcgctt 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccagcggaa ttagtacgaa cac 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggccttcac cgacatcc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtaggccact gcgtcctt 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttccccagcg ccgtccagtt cc 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagcgactcg atttgatgat cctg 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgttgccat cgacatgacc a 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccacgcgcac ccgatcaatg acc 23

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtatgcccac tcccgta 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgtgatgac cgacaac 17

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacgcacacc gcccgaaa 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gccacctacc agagcgaat 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgatagaccc gcgttaccct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atctggcaca ccggcgcatt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacgacaaaa ccagcaaggc 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccaaactgct tttcgatctg gg 22

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccctggccgc agcgctc 17

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tctgattacc gaatctcgta 20

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcccgcaaaa tctggtc 17

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttaccttgaa ctaatcggca ttgct 25

<210> 22

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tctgattacc gaatctcgta tttcttatac ttctgcttca atgtcaacat tcacctcatt 60

tgtattttag tttttacctt gaactaatcg gcattgctcc cgaaacatgt tcagagagct 120

gctgcggacc agattttgcg gga 143

Claims

1.基于dUTP/UNG的肺炎支原体和鲍特菌属荧光实时定量PCR引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对包括以下序列：

对应的，所述探针包括以下序列：

检测肺炎支原体的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

检测IS481的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

检测IS1001的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

检测IS1002的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

检测ptxP的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

检测recA的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

2.根据权利要求1所述引物对和探针组合，其特征在于，还包括用于检测内对照IC的引物对和探针，其中内对照IC选择的为拟南芥基因中的序列SEQ ID NO:22，其中检测IC的引物对和探针具体序列如下：

检测内对照IC的引物对由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的两条序列组成；

检测内对照基因IC的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。

3.根据权利要求1或2所述引物对和探针组合，其特征在于，所述探针5’端的荧光基团为FAM、CY5、HEX、VIC或ROX中的一种，3’端的淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种。

4.一种基于dUTP/UNG的肺炎支原体和鲍特菌属核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述引物对和探针组合，以及PCR试剂。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂为包含IC模板和UNG酶的PCR反应液。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述UNG酶包括UDG酶或UNG酶。

7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述引物对和探针组合分为2个体系进行包装，其中，A体系由以下引物对和探针组成：

核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的检测肺炎支原体的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的检测IS481的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示检测IS1001的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的检测内标基因拟南芥序列的探针；

B体系由以下引物对和探针组成：

由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示两条序列组成的检测内对照基因的引物对；

核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的检测IS1002的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的检测ptxP的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的检测recA的探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的检测内对照基因的探针。

8.一种检测肺炎支原体和鲍特菌属的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，采用权利要求4-7任意一项所述试剂盒进行检测。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，其中PCR反应体系具体如下：PCR反应液10μL，10×引物探针混合物2μL，DNA模板5μL，超纯水补至20μL；

其中，引物探针混合物中引物的浓度为3-6μM，探针的浓度为1-3μM。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，其中PCR反应条件具体如下：45℃10min；95℃5min；95℃15s，60℃45s，循环45次。