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CN110403914A - 用于儿童早期应用的羧酸 - Google Patents

用于儿童早期应用的羧酸 Download PDF

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CN110403914A
CN110403914A CN201910511373.8A CN201910511373A CN110403914A CN 110403914 A CN110403914 A CN 110403914A CN 201910511373 A CN201910511373 A CN 201910511373A CN 110403914 A CN110403914 A CN 110403914A
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CN
China
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carboxylic acid
calcium
peptide
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CN201910511373.8A
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范明
姚玉海
赵凤兰
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Lanxi Lishun Biological Co Ltd
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Lanxi Lishun Biological Co Ltd
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Abstract

本发明提供含羧酸的组合物的制备方法，属于生物技术领域，上述羧酸包括羧酸或其药学上可接受的盐，该羧酸以微胶囊形式给药，且羧酸与壁材发生包埋以完成微囊化，该微胶囊中还包括乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙；上述微囊化在弱碱性环境下进行。本发明提供的制备方法能增强壁材亲水性以提高其包埋率，填补表面凹陷以提升微胶囊流动性能，避免肽分子团聚及抢夺钙离子造成配位率降低的现象，提高肽源和钙源利用率以及肽钙螯合率；该组合物及羧酸用于预防或改善因屏障功能降低引起的过敏性疾病，抑制炎症介质释放，提高机体痒阈值，缓解或减轻痰痒症状，降低肺组织中炎症因子表达，改善肺部炎症，其适用于婴儿或幼儿、孕期28周以上孕妇及哺乳期妇女。

Description

用于儿童早期应用的羧酸
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于儿童早期应用的羧酸。
背景技术
近年来随着我国城市化与经济快速发展，城市环境空气污染比较严重，与成人相比，儿童具有更虚弱的健康状况且通常更易受到各种损伤。环境空气污染对儿童健康造成多种危害，尤其在生命最初的数日或数月，其通过直接地或与婴儿的遗传易感性协同地促进或调控损伤，儿童基于空气中的细菌、过敏原的致病率迅速增加，儿童肺炎、腹泻、湿疹、鹅口疮等感染发病率较高。已知身体的屏障表面例如皮肤、呼吸道、消化道等在出生后继续发展其“屏障功能”，屏障完整性的影响是显著的。当屏障完整性降低，会发生感染和化学和/或过敏原暴露。
国际著名流行病学家巴克教授David Barker于1995年提出巴克假说：出生前与出生后早期阶段环境污染物暴露可以影响胎儿与新生儿的发育可塑性，并能够影响胎儿发育编程或导致基因程序改变，产生永久性结构功能改变，从而使儿童对环境污染物敏感性显著增强，诱发过敏与感染性疾病风险增加，甚至能够导致成年后一系列相关疾病的发生与恶化。已知在生命的早期的发育过程中存在关键的时间段-所谓的“机会之窗”，这对于免疫系统的发育是至关重要的，因此在以后的生命中对于受试者的一般健康是至关重要的。因此，希望在生命早期改善儿童的屏障功能，以防止儿童早期的严重疾病。另外，期望在以后的生命中具有改善的屏障功能的长期效果。优选地，应该通过药剂改善屏障功能，且药剂可以方便地施用，因此具有良好的受试者依从性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能增强壁材亲水性以提高其包埋率；填补表面凹陷以促使颗粒表面光滑，提升微胶囊流动性能；能避免肽分子间团聚及抢夺钙离子造成配位率降低的现象，提高肽源和钙源利用率以及肽钙螯合率的含羧酸的组合物的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种用于预防或改善因屏障功能降低引起的过敏性疾病；能抑制炎症介质释放，提高机体痒阈值，缓解或减轻痰痒症状；降低肺组织中炎症因子表达，改善肺部炎症的用于儿童早期应用的羧酸及其组合物，其适用于婴儿或幼儿、孕期28周以上孕妇及哺乳期妇女。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
含羧酸的组合物的制备方法，上述羧酸包括羧酸或其药学上可接受的盐，该羧酸以微胶囊形式给药，上述羧酸与壁材发生包埋以完成微囊化，所得微胶囊颗粒粒径为2-30μm，上述微胶囊中还包括乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙；上述微囊化在弱碱性环境下进行。优选地，组合物中羧酸、乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙的重量比为5-9:0.5-1:2。该组合物对活性成分进行微囊化保护，使得组合物具有过敏性低、生物利用率高的优势，该组合物对改善免疫屏障功能具有直接效应，在生命早期施用组合物，能改善儿童的免疫组织屏障功能，并因此影响上皮细胞功能和相关基质以及免疫细胞，防止感染、化学品诱导的病变，以及具有对过敏原暴露的保护手段。
对本发明而言，羧酸包括2-6个碳原子；其药学上可接受的盐中羧酸基团为：-(CH2)xCO2Y，其中x介于1-3，Y为钠、钾、铁、锌、锡中的一种或多种金属阳离子。
对本发明而言，壁材为卵磷脂，上述壁材在微胶囊中的重量占比为30-40％；上述微囊化操作条件为：超声处理15-20min，喷雾干燥进风温度为140-150℃，进料泵速为4-6r/min。壁材形成乳液，羧酸、肽螯合钙和乙酰基羟脯氨酸作为芯材形成溶液，两者混合存在不相容的两相界面，进行超声处理能起到均质乳化的效果，形成均相乳液，再进行喷雾干燥，干燥过程中囊球内外水分均匀蒸发，形成致密囊壁，提高芯材的包埋率。
对本发明而言，弱碱性环境由微囊化反应体系所用乙醇溶剂中包含的二酒石酸烟碱和三烯丙胺提供；其中二酒石酸烟碱和三烯丙胺在乙醇溶剂中的重量占比分别为0.01-0.15％和0.05-0.1％。二酒石酸烟碱和三烯丙胺提供的弱碱性环境，使得卵磷脂能与两者形成水合作用，相互共用水合分子，以增强卵磷脂亲水性，既能促进卵磷脂与肽钙溶液互溶均质，有利于卵磷脂包裹肽钙分子以提高包埋率，又能借助干燥过程中内部水分子蒸发引起的水合作用减弱效应，使两者聚集在微胶囊表层，填补水分子蒸发导致的表面凹陷，使得微胶囊颗粒表面光滑，提升了微胶囊流动性能，另一方面两者进入机体后，尤其是通过皮肤用药渗入表皮细胞后，能利用官能团吸附在肥大细胞表面并降低细胞表面抗体活性，抑制肥大细胞释放组胺等炎症介质，提高机体痒阈值，缓解或减轻机体因皮肤过敏反应引起的痰痒症状。
对本发明而言，肽螯合钙中钙源为氯化钙，肽源为乳清蛋白肽；上述肽螯合钙易溶于水，钙含量为10-20％，螯合率为7-15％。氯化钙与多肽螯合后经乙醇作用直接形成沉淀，易于分离，因此作为理想钙源，蛋白肽螯合钙比氨基酸螯合钙稳定性好，由于空间位阻效应，肽螯合钙中存在自由羧基，能减少与其他微量元素的拮抗作用，吸收率和生物效价高，同时蛋白肽大分子能在需要时有效地释放钙离子，避免大量钙离子突然释放引起血钙过高现象，完成蛋白肽与钙同补，具有双重营养作用。
对本发明而言，肽螯合钙的制备条件如下：肽源与钙源的重量比为1:5-6，肽源溶液初始pH为10-11，反应温度为60-65℃，恒温水浴震荡反应时间为45-60min。
对本发明而言，乳清蛋白肽分子量为500-7000Da；上述乳清蛋白肽通过以下步骤获得：取乳清蛋白粉配制成浓度为3-6％的混合液，调节pH，再加入碱性蛋白酶，于温度为55-65℃、转速为150-180r/min条件下酶解3-4h后，灭酶并冷却，离心取沉淀，即得。乳清蛋白被誉为“蛋白之王”，能促进钙的吸收，水解后制得乳清蛋白肽，分子量较蛋白质分子量小，更易被儿童的机体吸收，也减轻了儿童的消化系统负担，经酶解得到的肽暴露出更多的羧基及氨基端以便与钙离子结合，乳清蛋白水解程度越大，就能得到越多羧基及氨基，能螯合更多钙离子，增加肽螯合钙营养价值。
本发明还提供了一种用于儿童早期应用的羧酸，该羧酸包含在上述制备方法所制得的组合物中；上述羧酸或组合物在制备预防或改善因免疫屏障功能降低引起的过敏性疾病的药用组合物或制剂中的用途。
对本发明而言，上述儿童为0-3岁的婴儿或幼儿；上述过敏性疾病包括腹泻、皮炎、湿疹、呼吸道感染、念珠菌感染或它们的组合。优选地，上述包含羧酸或组合物的药用组合物或制剂的给药方式为局部、鼻内或口服施用。组合物可以作为营养型产品或药用产品，用于预防或改善的过敏性疾病不限于与免疫屏障功能降低直接相关的疾病，而且还延伸到由于免疫屏障功能降低而导致的疾病，特别地，由于金属或尘螨引起的皮炎或湿疹或念珠菌感染，还包括由于金属、化妆品、染料等引起的过敏性接触性皮炎，还包括由于洗涤剂、化妆品等引起的刺激性接触性皮炎等。
本发明使用的术语“婴儿”是指0-12个月龄的儿童，“幼儿”是指1-3岁的儿童；本发明中儿童还包括早产儿，“早产儿”是指在妊娠36周之前出生的婴儿。
对本发明而言，羧酸或组合物还包括在制备改善免疫屏障功能的营养组合物或制剂中的用途，该营养组合物或制剂适用于孕期28周以上孕妇及哺乳期妇女，上述营养组合物或制剂的给药方式为局部或口服施用。在本发明的一些实施方案中，孕期28周以上孕妇口服施用组合物，孕妇施用该组合物既能加强自身对营养物质的补充和对免疫屏障的改善，又能提前促进婴儿在母体内吸收，能尽早地预防外界空气中过敏原对儿童的损伤。在本发明的另一些实施方案中，哺乳期妇女施用该组合物，尤其是母乳喂养的妇女，可通过口服给药的方式，加强自身和婴儿的免疫屏障改善作用，也可通过局部用药，如非喂养时间在乳房周围涂抹，以预防喂养时细菌或过敏原通过食道侵染婴儿。
本发明的羧酸或组合物包括适用于在人或非人动物中治疗、控制、改善、改进病症或预防疾病或障碍的组合物。因此，其包括用于人类或兽医学领域的营养性或药物组合物。这种组合物中包含羧酸或其生理学上可接受的盐，乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙，和任选的载体或赋形剂，由此组合物与载体和赋形剂被用其处理的靶生物体耐受。
本发明的有益效果为：
1)本发明制备的含羧酸的组合物作为营养型产品或药用产品，对改善免疫屏障功能具有直接效应，在生命早期施用组合物，能改善儿童免疫组织屏障功能，并因此防止感染、化学品诱导的病变，以及具有对过敏原暴露的保护手段；
2)本发明中以卵磷脂为壁材，以羧酸、肽钙及乙酰基羟脯氨酸为芯材，制得为微胶囊化颗粒，微胶囊能起到显著的缓释和保护作用，一方面减少胃酸对有效成分分解作用，使部分有效成分能直接被肠道吸收，有利于防治消化道炎症等，另一方面降低儿童消化系统的总体负担，提高组合物吸收率和生物效价；
3)本发明中组合物的微囊化制备方法能增强壁材亲水性以提高其包埋率，能填补微胶囊表面凹陷以促使微胶囊颗粒表面光滑，提升微胶囊流动性能，能抑制肥大细胞释放组胺等炎症介质，提高机体痒阈值，缓解或减轻机体因皮肤过敏反应引起的痰痒症状；
4)本发明中提供的肽螯合钙能减轻了儿童的消化系统负担，完成蛋白肽与钙同补，具有双重营养作用，其制备方法能避免肽分子间发生团聚，又能避免过量羧基和氨基对钙离子抢夺造成配位率降低的现象，提高肽源和钙源的利用率以及肽钙螯合率，降低肺组织中炎症因子TGF-β1、IL-6、IL-17A的表达，改善如肺炎、哮喘等过敏引起的肺部炎症；
5)本发明的组合物用于0-3岁的婴儿或幼儿，用于制备预防或改善因屏障功能降低引起的过敏性疾病的药用组合物或制剂，包括腹泻、皮炎、湿疹、呼吸道感染、念珠菌感染或它们的组合，还包括制备适用于孕期28周以上孕妇及哺乳期妇女的、用于改善免疫屏障功能的营养组合物或制剂。
本发明采用了上述技术方案提供用于儿童早期应用的羧酸，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为组合物微胶囊的扫描电镜显微照片，标记说明：A-实施例2，B-实施例4；
图2为组合物微胶囊中钙离子在模拟胃液中的消化释放曲线示意图；
图3为组合物微胶囊中钙离子在模拟肠液中的消化释放曲线示意图；
图4为组合物对被动皮肤过敏反应试验结果示意图；
图5为组合物组胺致豚鼠局部痉痒试验结果示意图；
图6为组合物对致敏小鼠肠道炎症因子和抗炎因子mRNA表达水平的影响示意图；
图7为组合物对致敏小鼠肺部炎症因子和抗炎因子mRNA表达水平的影响示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
含羧酸的组合物的制备方法，上述羧酸包括羧酸或其药学上可接受的盐，该羧酸以微胶囊形式给药，上述羧酸与壁材发生包埋以完成微囊化，所得微胶囊颗粒粒径为2-30μm，上述微胶囊中还包括乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙；上述微囊化在弱碱性环境下进行。优选地，组合物中羧酸、乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙的重量比为5-9:0.5-1:2。该组合物对活性成分进行微囊化保护，使得组合物具有过敏性低、生物利用率高的优势，该组合物对改善免疫屏障功能具有直接效应，在生命早期施用组合物，能改善儿童的免疫组织屏障功能，并因此影响上皮细胞功能和相关基质以及免疫细胞，防止感染、化学品诱导的病变，以及具有对过敏原暴露的保护手段。
对本发明而言，羧酸包括2-6个碳原子；其药学上可接受的盐中羧酸基团为：-(CH2)xCO2Y，其中x介于1-3，Y为钠、钾、铁、锌、锡中的一种或多种金属阳离子。
用于本发明的羧酸没有特别限制，只要含有羧基-COOH并具有通式R–COOH的有机化合物，其中R是与官能团-COOH相连的剩余部分，该羧酸可含有一个或多个不对称中心，因此以外消旋物和外消旋混合物、单一对映体、单一非对映异构体和非对映异构体混合物形式存在。在本发明的一些实施方案中，R是饱和脂肪族烃，R代表甲基、乙基、丙基、丁基或戊基侧链。在本发明的另一些实施方案中，R是被取代的饱和脂肪族烃或酯，其中有一个或多个相同或不同的选自以下的取代基：羟基、氨基、卤素或硝基，更具体地，包括但不限于2-羟基丙酸、双乳酸、3-羟基丙酸、2,3-二羟基丙酸、3-羟基丙酸甲酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丙酯。
用于本发明的羧酸在药学上可接受的盐中，只要含有基团-(CH2)xCO2Y，并具有通式R-(CH2)xCO2Y，其中R是具有1-10个碳原子的直链或支链的饱和脂肪族烃。在本发明的一些实施方案中，R更优选地为1-3个碳原子的烷基，包括但不限于庚酸钠、4,4-二甲基己酸钾、4,6-二甲基庚酸锡、乙酸铁、乙酸铁钠。
对本发明而言，壁材为卵磷脂，上述壁材在微胶囊中的重量占比为30-40％；上述微囊化操作条件为：超声处理15-20min，喷雾干燥进风温度为140-150℃，进料泵速为4-6r/min。壁材形成乳液，羧酸、肽螯合钙和乙酰基羟脯氨酸作为芯材形成溶液，两者混合存在不相容的两相界面，进行超声处理能起到均质乳化的效果，形成均相乳液，再进行喷雾干燥，干燥过程中囊球内外水分均匀蒸发，形成致密囊壁，提高芯材的包埋率。
对本发明而言，弱碱性环境由微囊化反应体系所用乙醇溶剂中包含的二酒石酸烟碱和三烯丙胺提供；其中二酒石酸烟碱和三烯丙胺在乙醇溶剂中的重量占比分别为0.01-0.15％和0.05-0.1％。二酒石酸烟碱和三烯丙胺提供的弱碱性环境，使得卵磷脂能与两者形成水合作用，相互共用水合分子，以增强卵磷脂亲水性，既能促进卵磷脂与肽钙溶液互溶均质，有利于卵磷脂包裹肽钙分子以提高包埋率，又能借助干燥过程中内部水分子蒸发引起的水合作用减弱效应，使两者聚集在微胶囊表层，填补水分子蒸发导致的表面凹陷，使得微胶囊颗粒表面光滑，提升了微胶囊流动性能，另一方面两者进入机体后，尤其是通过皮肤用药渗入表皮细胞后，能利用官能团吸附在肥大细胞表面并降低细胞表面抗体活性，抑制肥大细胞释放组胺等炎症介质，提高机体痒阈值，缓解或减轻机体因皮肤过敏反应引起的痰痒症状。
在本发明具体的实施方案中，微囊化操作步骤如下：取卵磷脂分散于乙醇溶剂中，配制成重量分数为10-20％的卵磷脂乳状液，然后取羧酸、肽螯合钙和乙酰基羟脯氨酸溶于水中，加入到已配好的卵磷脂乳状液中，搅拌均匀后，于30-50℃水浴中超声处理后，进行喷雾干燥，即得微胶囊颗粒。
对本发明而言，肽螯合钙中钙源为氯化钙，肽源为乳清蛋白肽；上述肽螯合钙易溶于水，钙含量为10-20％，螯合率为7-15％。氯化钙与多肽螯合后经乙醇作用直接形成沉淀，易于分离，因此作为理想钙源，蛋白肽螯合钙比氨基酸螯合钙稳定性好，由于空间位阻效应，肽螯合钙中存在自由羧基，能减少与其他微量元素的拮抗作用，吸收率和生物效价高，同时蛋白肽大分子能在需要时有效地释放钙离子，避免大量钙离子突然释放引起血钙过高现象，完成蛋白肽与钙同补，具有双重营养作用。
对本发明而言，肽螯合钙的制备条件如下：肽源与钙源的重量比为1:5-6，肽源溶液初始pH为10-11，反应温度为60-65℃，恒温水浴震荡反应时间为45-60min。在本发明具体的实施方案中，肽螯合钙的制备步骤如下：取乳清蛋白肽加水配成重量分数为2-10％的溶液，用1mol/L的氢氧化钠调节pH，置于恒温水浴中，然后取钙盐加入溶液，搅拌溶解后，密封，震荡反应后，加入乙醇静止沉淀，离心，取沉淀干燥，即得。
对本发明而言，乳清蛋白肽分子量为500-7000Da；上述乳清蛋白肽通过以下步骤获得：取乳清蛋白粉加水配制成重量浓度为3-6％的混合液，用1mol/L的氢氧化钠调节pH为10-11.5，再加入碱性蛋白酶，密封，于温度为55-65℃、转速为150-180r/min条件下恒温水浴震荡，酶解3-4h后，灭酶并冷却，离心取沉淀，即得，上述反应中酶底物浓度比为0.04-0.06。乳清蛋白被誉为“蛋白之王”，能促进钙的吸收，水解后制得乳清蛋白肽，分子量较蛋白质分子量小，更易被儿童的机体吸收，也减轻了儿童的消化系统负担，经酶解得到的肽暴露出更多的羧基及氨基端以便与钙离子结合，乳清蛋白水解程度越大，就能得到越多羧基及氨基，能螯合更多钙离子，增加肽螯合钙营养价值。
本发明还提供了一种用于儿童早期应用的羧酸，该羧酸包含在上述制备方法所制得的组合物中；上述羧酸或组合物在制备预防或改善因免疫屏障功能降低引起的过敏性疾病的药用组合物或制剂中的用途。
对本发明而言，上述儿童为0-3岁的婴儿或幼儿。本发明使用的术语“婴儿”是指0-12个月龄的儿童，“幼儿”是指1-3岁的儿童；本发明中儿童还包括早产儿，“早产儿”是指在妊娠36周之前出生的婴儿。
优选地，上述包含羧酸或组合物的药用组合物或制剂的给药方式为局部、鼻内或口服施用。在本发明中药用组合物或制剂可包含几种类型的药学上可接受的载体，制成多种剂型，包括但不限于溶液剂、乳液(例如微乳液和纳米乳液)、凝胶、固体、胶束和脂质体。药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、滑石、硅酸、甘油、藻酸盐、透明质酸、胶原蛋白、脂肪酸单甘油酯和羟甲基纤维素。
优选地，药用组合物或制剂用于局部施用时，其剂型包括适合局部施用于皮肤的制剂。通过局部用药能改善免疫屏障功能，来减少皮肤发红、瘙痒、皱纹、局部肿胀和/或不规则破裂及疼痛。在本发明的一些实施方案中，用于皮肤的组合物中药学上可接受的载体为组合物重量约20-80％，优选地，载体是能用于预防或缓解干燥以及保护皮肤的，如多种合适的润肤剂是已知的并且可以在本发明中使用。
对本发明而言，上述过敏性疾病包括腹泻、皮炎、湿疹、呼吸道感染、念珠菌感染或它们的组合。组合物可以作为营养型产品或药用产品，用于预防或改善的过敏性疾病不限于与免疫屏障功能降低直接相关的疾病，而且还延伸到由于免疫屏障功能降低而导致的疾病，特别地，由于金属或尘螨引起的皮炎或湿疹或念珠菌感染，还包括由于金属、化妆品、染料等引起的过敏性接触性皮炎，还包括由于洗涤剂、化妆品等引起的刺激性接触性皮炎等。尘螨还与过敏性气道炎症如鼻炎和哮喘有关，其也可以使用本发明的方法和组合物来预防或改善。念珠菌感染中包括但不限于白色念珠菌感染引起的鹅口疮，鹅口疮可由产道、母亲乳头等渠道传染，易使营养不良、免疫力低下或长期使用抗生素的儿童发生鹅口疮，其也可以使用本发明的方法和组合物来预防或改善。过敏性疾病引起的呼吸道感染包括但不限于肺炎、哮喘、支气管炎等，也可以使用本发明的方法和组合物来预防或改善。
本发明中羧酸或组合物以微囊化颗粒的形式，降低儿童消化系统的总体负担，且能作为控释组合物施用，其在儿童较成人胃酸浓度低的胃液中不能完全吸收，剩余部分能进入到肠道直接于肠道中被再次吸收，提高了其生物利用率，同时能直接作用于肠道，用于具有过敏、特别是严重过敏且尤其是与他们的食物摄取相关的过敏的儿童，如初次添加辅食或奶粉，以改善其消化道炎症、肠道钙吸收、肠道消化不良、腹泻等。
对本发明而言，羧酸或组合物还包括在制备改善免疫屏障功能的营养组合物或制剂中的用途，该营养组合物或制剂适用于孕期28周以上孕妇及哺乳期妇女，上述营养组合物或制剂的给药方式为局部或口服施用。在本发明的一些实施方案中，孕期28周以上孕妇口服施用组合物，孕妇施用该组合物既能加强自身对营养物质的补充和对免疫屏障的改善，又能提前促进婴儿在母体内吸收，能尽早地预防外界空气中过敏原对儿童的损伤。在本发明的另一些实施方案中，哺乳期妇女施用该组合物，尤其是母乳喂养的妇女，可通过口服给药的方式，加强自身和婴儿的免疫屏障改善作用，也可通过局部用药，如非喂养时间在乳房周围涂抹，以预防喂养时细菌或过敏原通过食道侵染婴儿。
本发明的羧酸或组合物包括适用于在人或非人动物中治疗、控制、改善、改进病症或预防疾病或障碍的组合物。因此，其包括用于人类或兽医学领域的营养性或药物组合物。这种组合物中包含羧酸或其生理学上可接受的盐，乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙，和任选的载体或赋形剂，由此盐与载体和赋形剂被用其处理的靶生物体耐受。
虽然在前面的描述中详细描述了本发明的各方面，但是这样的描述应被认为是说明性或示例性的而非限制性的。应当理解，本领域普通技术人员可以在所附权利要求的范围和精神内进行改变和修改。特别地，本发明覆盖了具有来自上文和下文所述的不同实施方案的特征的任何组合的其他实施方案，而本发明的范围并不限制于在以下具体实例中。
实施例1：
含羧酸的组合物的制备方法，其具体步骤如下：
1)取乳清蛋白粉加水配制成重量浓度为4％的混合液，用1mol/L的氢氧化钠调节pH为10.5，再以酶底物浓度比为0.05的比例加入碱性蛋白酶，密封，于温度为65℃、转速为160r/min条件下恒温水浴震荡，酶解3.5h后，灭酶并冷却，离心取沉淀，即得乳清蛋白肽；
2)取乳清蛋白肽加水配成重量分数为6％的溶液，用1mol/L的氢氧化钠调节pH为10，置于60℃恒温水浴中，然后取氯化钙加入溶液，搅拌溶解后，密封，震荡反应50min后，加入乙醇静止沉淀，离心，取沉淀干燥，即得肽螯合钙，上述乳清蛋白肽与氯化钙的重量比为1:5.5；
3)取卵磷脂分散于乙醇溶剂中，配制成重量分数为12％的卵磷脂乳状液，然后以重量比为7.5:0.5:2的比例取羧酸、乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙溶于水中，加入到已配好的卵磷脂乳状液中，搅拌均匀后，于40℃水浴中超声处理15min后，在进风温度为145℃、进料泵速为5r/min的条件下进行喷雾干燥，即得微胶囊颗粒，上述乙醇溶剂中含有重量占比分别为0.1％的二酒石酸烟碱和0.05％的三烯丙胺，卵磷脂在微胶囊中的重量占比为40％，上述羧酸为等比例混合的双乳酸和庚酸钠。
实施例2：
含羧酸的组合物的制备方法，其具体步骤如下：
1)取乳清蛋白粉加水配制成重量浓度为5％的混合液，用1mol/L的氢氧化钠调节pH为11，再以酶底物浓度比为0.06的比例加入碱性蛋白酶，密封，于温度为60℃、转速为180r/min条件下恒温水浴震荡，酶解3h后，灭酶并冷却，离心取沉淀，即得乳清蛋白肽；
2)取乳清蛋白肽加水配成重量分数为8％的溶液，用1mol/L的氢氧化钠调节pH为10.5，置于65℃恒温水浴中，然后取氯化钙加入溶液，搅拌溶解后，密封，震荡反应45min后，加入乙醇静止沉淀，离心，取沉淀干燥，即得肽螯合钙，上述乳清蛋白肽与氯化钙的重量比为1:6；
3)取卵磷脂分散于乙醇溶剂中，配制成重量分数为15％的卵磷脂乳状液，然后以重量比为8.3:0.7:2的比例取羧酸、乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙溶于水中，加入到已配好的卵磷脂乳状液中，搅拌均匀后，于45℃水浴中超声处理20min后，在进风温度为150℃、进料泵速为6r/min的条件下进行喷雾干燥，即得微胶囊颗粒，上述乙醇溶剂中含有重量占比分别为0.05％的二酒石酸烟碱和0.07％的三烯丙胺，卵磷脂在微胶囊中的重量占比为35％，上述羧酸为等比例混合的丙酸和乙酸铁。
实施例3：
本实施例与实施例2不同之处在于：
步骤2)所用乳清蛋白肽溶液中还分散有0.03mM的环丙乙酸和0.05mM的4-叔丁基苯酚，随着温度升高，体系中反应物间碰撞几率变大，两者加入反应体质后，分别与肽中游离羧基端及胺基端形成氢键，既能避免肽分子间发生团聚引起肽分子结构变化，又能避免过量羧基和氨基对钙离子抢夺造成的与钙离子配位率降低的现象，在反应后期随着分子运动加剧，氢键作用减弱，释放出余量羧基和氨基与钙离子配位，提高肽源和钙源的利用率以及肽钙螯合率，另一方面两者协同其他成分，能加强肺部免疫屏障作用，降低肺组织中炎症因子TGF-β1、IL-6、IL-17A的表达，改善肺部病理状态，改善如肺炎、哮喘等过敏引起的肺部炎症；
其他步骤与实施例2中一致，制得微胶囊颗粒。
实施例4：
本实施例与实施例2不同之处在于：
步骤3)所用乙醇溶剂中未添加二酒石酸烟碱和三烯丙胺，即微囊化操作未在弱碱性环境下进行；
其他步骤与实施例2中一致，制得微胶囊颗粒。
实施例5：
本实施例与实施例2不同之处在于：
含羧酸的组合物的制备方法，其具体步骤如下：取卵磷脂分散于乙醇溶剂中，配制成重量分数为15％的卵磷脂乳状液，然后取羧酸溶于水中，加入到已配好的卵磷脂乳状液中，搅拌均匀后，于45℃水浴中超声处理20min后，在进风温度为150℃、进料泵速为6r/min的条件下进行喷雾干燥，即得微胶囊颗粒，上述乙醇溶剂中含有重量占比分别为0.05％的二酒石酸烟碱和0.07％的三烯丙胺，卵磷脂在微胶囊中的重量占比为35％，上述羧酸为等比例混合的丙酸和乙酸铁。
实施例6：
本实施例中取实施例2所制组合物，向其中添加重量占比为50％的甘油，制成乳液，用于局部施用于儿童皮肤，具体施用于因过敏引起的皮肤发红、瘙痒、皱纹、局部肿胀和/或不规则破裂部位。
实施例7：
本实施例中取实施例2所制组合物，向其中添加重量占比分别为20％的明胶和25％的透明质酸，制成乳液，用于局部施用于哺乳期妇女，具体施用于母乳喂养的妇女，于非喂养时间在乳房周围涂抹，以预防喂养时细菌或过敏原通过食道侵染婴儿。
实施例8：
本实施例中取实施例2所制组合物，向其中添加水、藻酸盐后，制成溶液剂，用于口服施用于儿童，具体适用于包括腹泻、皮炎、湿疹、肺炎、哮喘、鹅口疮或它们的组合。
实施例9：
本实施例中取实施例2所制组合物，向其中添加乳糖、藻酸盐和羟甲基纤维素后，制成固体片剂，用于口服施用于孕期28周以上孕妇及哺乳期妇女，具体适用于加强自身和婴儿的免疫屏障改善作用。
试验例1：
组合物性质与结构分析
1、乳清蛋白肽螯合钙螯合率及钙含量分析：
试验样品：实施例2、实施例3制备得肽螯合钙产物。
1)螯合率的测定：用取0.1g肽螯合钙加入50mL蒸馏水，依次将2-3mL三乙醇胺、0.8-1mL氢氧化钾溶液(pH12-13，1.25mol/L)、适量钙指示剂加入，摇匀，用EDTA溶液(稀释10倍，Ca 0.0456mg/mL)滴定，溶液从紫红色变成纯蓝色为终点，记录EDTA体积V0。按公式计算总钙含量(g)：再取0.1g肽螯合钙加入20mL乙醇，恒温条件下震摇1h，在3500r/min速度下离心10min，去除上清液，蒸馏水定容沉淀至20mL，吸取2mL此溶液，同上述步骤一样进行EDTA滴定，记录EDTA体积V1。按公式计算螯合钙含量(g)：钙螯合率的计算方法如下：
2)钙离子含量测定：取50ml蒸馏水加入5ml钙标准溶液加入，摇匀，随后依次将3ml三乙醇胺、0.8-1mL氢氧化钾溶液(1.25mol/L，PH为12-13)、适量钙指示剂加入三角瓶，摇匀，用EDTA溶液(稀释10倍)滴定，至指示剂由紫红色变纯蓝色为止，记录消耗EDTA体积V0。计算每毫升EDTA相当于钙的毫克数，即滴定度T：用上述相同方法测定5g肽螯合钙消耗EDTA体积V，计算钙离子含量：其中X-试样中钙含量，单位为mg/100g，T-滴定度，单位为mg/mL，V-测定样品中EDTA的用量，单位为mL，V0-测定空白样时EDTA的用量，单位为mL，f-试样稀释倍数，m-试样质量，单位为g。测定所得结果如下表1所示。
表1乳清蛋白肽螯合钙螯合率及钙含量测定结果
螯合率％ 钙含量％
实施例2 12.6 15.7
实施例3 14.3 19.2
由上表可知，实施例3较实施例2而言，肽钙螯合率得到了显著提高，进而提高单位质量中钙含量，提高了钙源利用率，进而提升了其生物效价，说明肽源溶液中分散的环丙乙酸和4-叔丁基苯酚对肽钙螯合反应有显著的有益效果。
2、微胶囊的结构测定：试验样品：实施例2和4所制组合物微胶囊。
试验方法：采用电镜扫描组合物微胶囊的显微结构，观察微胶囊的外观形态，拍照对比。结果如附图1所示。
图1为组合物微胶囊的扫描电镜显微照片，其中A-实施例2，B-实施例4。由图中可得，实施例4微胶囊颗粒表面出现明显凹陷现象，实施例2颗粒表面饱满光滑，说明实施例4中卵磷脂分子与水界面不相容，以致水分子在干燥蒸发后表面出现凹陷，而实施例2中提供弱碱性环境的二酒石酸烟碱和三烯丙胺能增强卵磷脂亲水性，并填补水分子蒸发导致的表面凹陷，使得微胶囊颗粒表面光滑，提升了微胶囊流动性能。
试验例2：
体外模拟人体胃部及肠道环境消化试验
试验样品：实施例2、4所制组合物微胶囊。
试验方法：1、人工模拟胃液(SGF1)的配制(不含胃蛋白酶)：准确称取2.0gNaCl于1L烧杯中，加入少量水，加入3.0mL浓HCl，蒸馏水稀释至近1L，最后调节pH至1.3，定容至1L；人工模拟胃液(SGF2)的配制(含胃蛋白酶)：准确称取2.0gNaCl、3.2g胃蛋白酶于烧杯中，加入少量水，加入3.0mL浓HCl，蒸馏水稀释至近1L，最后调节pH至1.3，定容至1L。
2、人工模拟肠液(SIF1)的配制(不含胰蛋白酶)：准确称取6.8gKH2PO4于烧杯中，加入190mL的0.2mol/LNaOH，650ml蒸馏水，最后调节pH至7.5；人工模拟肠液(SIF2)的配制(含胰蛋白酶)：准确称取6.8gKH2PO4、10g胰蛋白酶于烧杯中，加入190mL的0.2mol/LNaOH,650ml蒸馏水。最后调节pH至7.5。
3、模拟胃部/肠道消化：量取150ml模拟胃液SGF1/肠液SIF1于烧杯中，置于37℃恒温水浴中。准确称量0.1g样品于小烧杯中，用10ml模拟胃液SGF2/肠液SIF2分散，通过小漏斗移入渗析袋(已检漏，底部封口)，再用10mlSGF2/SIF2分三次洗涤烧杯与漏斗，一起移入渗析袋，封口。浸入SGF1/SIF1中，置于37℃恒温震荡器中，恒速150r/min模拟消化。定时取样测定有效成分释放率，以钙离子计。钙离子释放率F的计算公式如下：式中：Mt为测得1ml消化液中钙离子的质量，mg，M0为测得0.1g样品中钙离子的总含量，mg，150为总的烧杯中消化液总体积为150ml。微胶囊在模拟胃部及肠道中消化试验结果如图2、3所示。
图2为组合物微胶囊中钙离子在模拟胃液中的消化释放曲线示意图，图3为组合物微胶囊中钙离子在模拟肠液中的消化释放曲线示意图。
以卵磷脂包埋有效成分的目的在于保护其在胃部免受胃酸破坏，能更多地到达肠道吸收部位，因此在模拟胃部消化时主要考察有效成分缓释效果。由图2可知，在胃部消化30-120min时间段，实施例4较实施例2的微胶囊对钙离子释放率更大，且较早达到最大释放率，说明实施例4较实施例2微胶囊的释放效果差，是由于实施例2提供的弱碱性环境下，卵磷脂对有效成分的包埋率更高，因此在胃部的缓释效果更好，能减轻胃部的消化负担。
由图3可知，在模拟肠道消化100min以后，各样品钙离子释放率趋于稳定，其中实施例2的钙离子释放率最高，而实施例4的释放率较低，说明在实施例2提供的弱碱性环境下形成的微胶囊在肠液中更易于释放其中包埋的有效成分，能促进肠道直接吸收，直接作用于病症部位，防治效果更好。
试验例3：
羧酸及组合物在儿童鹅口疮中的治疗试验
试验样品：实施例2、5所制组合物微胶囊。
试验方法：对儿童鹅口疮患者进行分组，每组男34例，女25例，每组每日餐后以生理盐水清洁口腔，先使用2％碳酸氢钠溶液涂擦患处，然后分别敷以微胶囊药粉，并以制霉菌素片粉末为对照组，涂药后均禁食水30分钟，以5天为1个疗程。1个疗程后，比较三组疗效及治疗期间不良反应。
疗效判定标准为：治愈：口腔白色凝乳状斑消失，口腔黏膜光滑，镜检未见菌丝及孢子；显效：口腔白色凝乳状斑明显缩小，分泌物镜检有菌丝及孢子；有效：口腔白色凝乳状斑有所缩小，分泌物镜检有菌丝及孢子；无效：口腔白色凝乳状斑无变化甚至增大，分泌物镜检有菌丝及孢子。总有效＝治愈+显效+有效。统计结果如下表2所示。
表2羧酸及组合物在儿童鹅口疮中的治疗效果
试验期间，三组均未见明显不良反应，表明组合物不增加不良反应。由上表可知，实施例2表现最优异，总有效率达到了94.9％，其次是对照组，总有效率达到93.2％，而实施例5只达到了91.5％，说明组合物治疗儿童鹅口疮效果优异且安全；于实施例5中单一羧酸比较，组合物中有效成分不但能治疗鹅口疮，还能促进上皮组织的再生与修复，改善组织免疫屏障作用，降低儿童再次患病几率。
试验例4：
组合物对被动皮肤过敏反应的试验
试验样品：实施例2、3、4、5所制组合物微胶囊。
试验方法：SD大鼠60只，雌雄各半，体重150-200克，随机分成6组，实施例2-5组、生理盐水为空白组、地塞米松为对照组，每天以相同剂量5mg/kg灌胃，连续7天。末次给药同时各鼠背部剪毛，每侧剪三点，每点间距1.5cm，取抗血清，用生理盐水稀释成1:30、1:40、1:50的浓度，皮内注射于剪毛的各点，每点0.1ml，48小时后静脉注射0.5％伊文思蓝溶液1ml内含卵蛋白1mg。经30min后，断颈处死动物，剪下背部皮肤，检查注射各点的蓝色反应斑直径，并计算抑制率，统计结果如图4所示。
图4为组合物对被动皮肤过敏反应试验结果示意图。由图可知，实施例3表现最优异，反应斑直径最小，抑制率最高，其次是实施例2及对照组，两组差异不明显，再次是实施例4，最次是实施例5；说明组合物对被动皮肤过敏反应有明显的抑制作用，能有效抑制及治疗过敏病症。结果中实施例3较实施例2优异，是由于制备中提高了肽钙螯合率，营养成分增加，有效成分之间协同作用增强；实施例2较实施例4优异，是由于实施例2制备中提高了有效成分包埋率，单位有效给药量增加，效果显著；实施例5效果最差，说明相同给药量下，单一羧酸的抑制效果较组合物中成分间协同作用发挥的抑制效果差。
试验例5：
组合物对组胺致豚鼠局部痉痒的试验
试验样品：实施例2、3、4、5所制组合物微胶囊。
试验方法：SD大鼠60只，雌雄各半，体重150-200克，随机分成6组，实施例2-5组、生理盐水为空白组、地塞米松为对照组，每天以相同剂量5mg/kg灌胃，连续7天。末次给药后，用剪刀剪去豚鼠右股外侧毛，面积1cm2，用剃须刀剃净绒毛，再用粗砂纸擦伤至渗血，末次给药1h后，开始在创面处滴0.01％磷酸组织胺0.05ml/只，此后每隔3min依0.02％、0.03％、0.04％……递增浓度，每次均为0.05ml/只。直至出现豚鼠回头舔擦伤处。以引起的豚鼠出现回头舔右股外侧所给予的磷酸组胺总量为致痒阐，求各组平均值，并统计及比较致痒阈值。结果如图5所示。
图5为组合物组胺致豚鼠局部痉痒试验结果示意图。由图可知，实施例3与实施例2表现最优异，痒阈值最高，两组差异不明显，其次是实施例4及对照组，两组差异不明显，最次是实施例5；说明组合物能提升机体局部瘙痒阈值，能有效缓解或减轻机体因皮肤过敏反应引起的痰痒症状。结果中实施例3和实施例2差异不明显；实施例2较实施例4优异，是由于实施例2制备中提供弱碱性环境的二酒石酸烟碱和三烯丙胺能抑制肥大细胞释放组胺等炎症介质，提高机体痒阈值，效果显著；实施例5效果最差，说明相同给药量下，单一羧酸较组合物中成分间协同作用发挥的止痒效果差。
试验例6：
组合物对致敏小鼠肠道炎症因子和抗炎因子的影响试验
试验样品：实施例2、5所制组合物微胶囊。
试验方法：1、致敏：BALB/c小鼠第1日用含10μg卵清蛋白(V级)及1mg氢氧化铝凝胶的生理盐水0.5ml腹腔注射进行基础致敏，第15日用只含10μg卵清蛋白(V级)的生理盐水0.5ml腹腔注射强化致敏，自第20日起，以卵清蛋白(Ⅱ级)生理盐水溶液0.4ml(卵清蛋白浓度为250g/L)对上述BALB/c小鼠进行隔日灌胃激发，直至第42日；
2、取小鼠32只，均分为4组，即实施例2、实施例5、空白组(未致敏)和过敏组，实施例2和实施例5组小鼠自第20日起给予皮下注射高浓度的组合物200mg/kg(0.1ml/10g体重)，1次/日×22日，过敏组注射等量生理盐水。实验第40天进行卵清蛋白肠道激发后48小时处死小鼠，全部小鼠于处死前12小时禁食。杀鼠前1小时不再进行肠道激发。取空肠于0.01M PBS液中反复清洗，取一部分空肠冻存于液氮，用RT-PCR法测定TGF-β1，IL-6，IL-17A，IL-10mRNA表达水平，结果如图6所示。
图6为组合物对致敏小鼠肠道炎症因子和抗炎因子mRNA表达水平的影响示意图。由图中可知，过敏发生时，肠道内存在以TGF-β1、IL-6、IL-17A表达增高为主的炎症反应。组合物干预后，小鼠TGF-β1表达未下降，但能有效降低致敏小鼠肠道炎症因子IL-6、IL-17A的过度表达，IL-10mRNA表达各组间比较无显著差异。说明实施例所制组合物均能抑制炎症因子，有利于缓解或治疗过敏引起的腹泻，但单一羧酸较组合物中成分间协同作用发挥的肠道炎症因子抑制效果差。
试验例7：
组合物对致敏小鼠肺部免疫状态的影响试验
试验样品：实施例2、3、5所制组合物微胶囊。
试验方法：方法同实施例6，测定TGF-β1，IL-6，IL-17A mRNA表达水平，结果如图7所示。
图7为组合物对致敏小鼠肺部炎症因子和抗炎因子mRNA表达水平的影响示意图。由图中可知，过敏发生时，肺组织中存在以TGF-β1、IL-6、IL-17A表达增高为主的炎症反应。组合物干预后，实施例3中小鼠TGF-β1、IL-6、IL-17A表达均出现明显下降，实施例2及实施例5小鼠TGF-β1表达未下降，但能有效降低致敏小鼠肺部炎症因子IL-6、IL-17A的过度表达。说明实施例所制组合物均能抑制炎症因子，有利于缓解或治疗过敏引起的肺炎、哮喘等呼吸道感染病症，其中实施例3较实施例2效果更优，范围更广，更有利于改善肺部病理状态；单一羧酸较组合物中成分间协同作用发挥的肺部炎症因子抑制效果差。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.含羧酸的组合物的制备方法，所述羧酸包括羧酸或其药学上可接受的盐，其特征在于：羧酸以微胶囊形式给药，所述羧酸与壁材发生包埋以完成微囊化，所得微胶囊颗粒粒径为2-30μm，所述微胶囊中还包括乙酰基羟脯氨酸和肽螯合钙；所述微囊化在弱碱性环境下进行。
2.根据权利要求1所述的含羧酸的组合物的制备方法，其特征在于：所述羧酸包括2-6个碳原子；所述药学上可接受的盐中羧酸基团为：-(CH2)xCO2Y，其中x介于1-3，Y为钠、钾、铁、锌、锡中的一种或多种金属阳离子。
3.根据权利要求1所述的含羧酸的组合物的制备方法，其特征在于：所述壁材为卵磷脂，所述壁材在微胶囊中的重量占比为30-40％；所述微囊化操作条件为：超声处理15-20min，喷雾干燥进风温度为140-150℃，进料泵速为4-6r/min。
4.根据权利要求1所述的含羧酸的组合物的制备方法，其特征在于：所述弱碱性环境由微囊化反应体系所用乙醇溶剂中包含的二酒石酸烟碱和三烯丙胺提供；所述二酒石酸烟碱和三烯丙胺在乙醇溶剂中的重量占比分别为0.01-0.15％和0.05-0.1％。
5.根据权利要求1所述的含羧酸的组合物的制备方法，其特征在于：所述肽螯合钙中钙源为氯化钙，肽源为乳清蛋白肽；所述肽螯合钙易溶于水，钙含量为10-20％，螯合率为7-15％。
6.根据权利要求5所述的含羧酸的组合物的制备方法，其特征在于：所述肽螯合钙的制备条件如下：肽源与钙源的重量比为1:5-6，肽源溶液初始pH为10-11，反应温度为60-65℃，恒温水浴震荡反应时间为45-60min。
7.根据权利要求5所述的含羧酸的组合物的制备方法，其特征在于：所述乳清蛋白肽分子量为500-7000Da；所述乳清蛋白肽通过以下步骤获得：取乳清蛋白粉配制成浓度为3-6％的混合液，调节pH，再加入碱性蛋白酶，于温度为55-65℃、转速为150-180r/min条件下酶解3-4h后，灭酶并冷却，离心取沉淀，即得。
8.用于儿童早期应用的羧酸，其特征在于：羧酸包含在权利要求1-7任一项所制得的组合物中；所述羧酸或组合物在制备预防或改善因免疫屏障功能降低引起的过敏性疾病的药用组合物或制剂中的用途。
9.根据权利要求8所述的用于儿童早期应用的羧酸，其特征在于：所述儿童为0-3岁的婴儿或幼儿；所述过敏性疾病包括腹泻、皮炎、湿疹、呼吸道感染、念珠菌感染或它们的组合。
10.根据权利要求8所述的用于儿童早期应用的羧酸，其特征在于：所述羧酸或组合物还包括在制备改善免疫屏障功能的营养组合物或制剂中的用途；所述营养组合物或制剂适用于孕期28周以上孕妇及哺乳期妇女。
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