CN110161236A - 一种检测牛病毒性腹泻病毒的电化学免疫传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测牛病毒性腹泻病毒的石墨烯电化学免疫传感器。本发明用甲壳胺(Chi)包裹石墨烯，在80℃下还原AgNO3，得到石墨烯‑甲壳胺‑银纳米粒子(G‑Chi‑AgNP纳米复合物)。将G‑Chi‑AgNP纳米复合物固定在金电极表面，然后用于吸附固定抗BVDV单克隆抗体。已固定在金电极表面的抗BVDV单克隆抗体，能与待测样品中的BVDV发生特异性结合，生成抗体‑抗原复合物，从而改变金电极界面的电子传导能力而引起响应电流值的变化，达到对BVDV进行准确、快速分析检测的目的。本发明建立的BVDV电化学免疫传感器具有特异性好和灵敏度高的优点，在BVDV快速检测领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测牛病毒性腹泻病毒的石墨烯电化学免疫传感器及其应用。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)，又名牛病毒性腹泻-粘膜病病毒，属于黄病毒科，是一种主要侵害牛、羊、鹿等反刍动物以及猪的一种重要传染病。BVDV的感染会引起腹泻、粘膜糜烂、溃疡、白细胞减少、咳嗽及怀孕母牛流产或产生畸形胎儿等，且该病发病率高、死亡率低，牛群中相当一部分是BVDV的携带者，感染BVDV的牛终身带毒，持续排毒，该病毒可通过血液、排泄物等多种途径传播，给养牛业带来极大的危害，造成严重的经济损失，建立一种准确、快速检测BVDV的方法就显得极为重要。
发明内容
本发明的一个实施例具体用甲壳胺(Chi)包裹石墨烯，在80℃下还原AgNO3，得到石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子(G-Chi-AgNP纳米复合物)。将G-Chi-AgNP纳米复合物固定在金电极表面，然后用于吸附固定抗BVDV单克隆抗体。已固定在金电极表面的抗BVDV单克隆抗体，能与待测样品中的BVDV发生特异性结合，生成抗体-抗原复合物，从而改变金电极界面的电子传导能力而引起响应电流值的变化，达到对BVDV进行准确、快速分析检测的目的。
本发明的一个目的是提供一种检测牛病毒性腹泻病毒的电化学传感器，所述传感器包括在传感器的电极表面设置可特异性检测牛病毒性腹泻病毒的多肽、蛋白、核酸和/或糖类分子。
具体的，所述设置包括在电极表面先涂石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子G-Chi-AgNP纳米复合物，然后再涂可特异性检测牛病毒性腹泻病毒的多肽、蛋白、核酸和/或糖类分子。
具体的，所述蛋白包括抗BVDV单克隆抗体。
再具体的，所述抗BVDV单克隆抗体用于ELISA的工作浓度为1：3000；或用于免疫沉淀反应时的工作浓度为1-2ug/100-500ug蛋白；还具体的，所述抗BVDV单克隆抗体是用BVDV分离株Nadl制备得到的单克隆抗体；所述制备方法包括现有的单克隆抗体制备方法，具体包括小鼠杂交瘤细胞法制备单克隆抗体；还具体的，所述抗BVDV单克隆抗体为BVDV(13/G4)，其靶蛋白是BVDV的非结构蛋白p125/p80；所述抗BVDV单克隆抗体BVDV(13/G4)是IgG2a型(kappa轻链)单克隆抗体。所述抗BVDV单克隆抗体BVDV(13/G4)是鼠源单克隆抗体。
具体的，所述传感器的电极包括金电极。
具体的，所述抗牛病毒性腹泻病毒BVDV单克隆抗体最后还需要用牛血清白蛋白进行封闭。
本发明的另一个目的是提供一种检测牛病毒性腹泻病毒的产品，所述产品包括本发明任一所述的电化学传感器。
本发明的还一个目的是提供一种检测牛病毒性腹泻病毒的方法，所述方法包括使用本发明任一所述的电化学传感器、或本发明所述产品进行牛病毒性腹泻病毒的检测。
具体的，所述方法不包括以疾病的诊断和治疗为目的的方法。
具体的，所述方法包括将待测样品涂到所述传感器表面，37℃孵育30min后进行峰电流值的检测。
本发明的还一个目的是提供本发明任一所述的电化学传感器、本发明所述产品在检测牛病毒性腹泻病毒中的应用；或在制备检测牛病毒性腹泻病毒相关产品中的应用。
具体的，所述应用不包括以疾病的诊断和治疗为目的应用。
本发明的还一个目的是提供一种检测牛病毒性腹泻病毒的电化学传感器的制备方法，所述方法包括在传感器的电极表面设置可特异性检测牛病毒性腹泻病毒的多肽、蛋白、核酸和/或糖类分子；具体的，所述设置包括在电极表面先涂石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子G-Chi-AgNP纳米复合物，然后再涂可特异性检测牛病毒性腹泻病毒的多肽、蛋白、核酸和/或糖类分子；具体的，所述蛋白包括抗牛病毒性腹泻病毒BVDV单克隆抗体；具体的，所述传感器的电极包括金电极；再具体的，所述抗牛病毒性腹泻病毒BVDV单克隆抗体最后还需要用牛血清白蛋白进行封闭。
本发明所构建的电化学免疫传感器对BVDV的检测敏感度为102.2TCID50，特异性试验结果表明，该传感器对牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV),牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis,MB),牛冠状病毒(Bovine Coronavirus)，猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)无交叉反应。因此，本发明建立的BVDV电化学免疫传感器具有特异性好和灵敏度高的优点。
本发明建立的BVDV电化学免疫传感器既具备了电化学分析特有的灵敏、快速、简单、携带和使用便捷及潜在的仪器可微型化等优点，同时也具备免疫分析法中特异性强的特点，在BVDV快速检测领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为免疫传感器制备过程的线性伏安曲线图，其中a表示裸金电极得到的曲线；b表示G-Chi-AgNP修饰后的电极得到的曲线；c表示Ab/BVDV固定后的电极得到的曲线；d表示BSA封闭后的电极得到的曲线。
图2为BVDV孵育时间对传感器的响应电流的影响的实验结果图。
图3为免疫传感器的特异性实验结果图，其中1代表牛病毒性腹泻病毒，2代表牛轮状病毒，3代表牛传染性鼻气管炎病毒，4代表牛分支杆菌，5代表牛冠状病毒，6代表猪瘟病毒。
图4为不同浓度牛病毒性腹泻病毒的线性伏安曲线图，其中a的浓度为0，b的浓度为102.2TCID50，c的浓度为103.2TCID50，d的浓度为104.2TCID50，e的浓度为105.2TCID50，f的浓度为106.2TCID50。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的抗BVDV单克隆抗体购自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC.公司(商品编号：sc-101592)；该抗BVDV单克隆抗体BVDV(13/G4)是IgG2a型(kappa轻链)单克隆抗体；BVDV(13/G4)的靶蛋白是BVDV的非结构蛋白p125/p80；用于免疫沉淀反应时的工作浓度为1-2ug/100-500ug蛋白，用于ELISA的工作浓度为1：30-1：3000；该单抗是用BVDV分离株Nadl制备得到的单克隆抗体。所述抗BVDV单克隆抗体BVDV(13/G4)是鼠源单克隆抗体。
实施例1、石墨烯电化学免疫传感器的制备
石墨烯的制备
冰水浴条件下加入1g石墨粉、2.5g KNO3、100mL H2SO4，搅拌均匀后缓慢加入5g高锰酸钾，随后置于35℃水浴反应2h，加入100mL去离子水，于95℃继续反应1h，观察到混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温后加入300mL蒸馏水，并加入H2O2(质量分数为30％)中和未反应的高锰酸钾，然后用0.5mol/L的HCl洗涤，再用二次去离子水反复离心洗涤5次，真空干燥，既得氧化石墨。称取10mg氧化石墨置于烧杯中，加入100mL二次去离子水，超声1h，得到氧化石墨烯(GO)。再以NaBH4作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯。
G-Chi-Ag纳米复合物的制备
将0.5g的甲壳胺(MV:1.5×105；DAC:≥90.0％；)(Chi)加入到100mL1.0％(V/V)醋酸溶液中，室温条件下磁力搅拌1h，得到0.5wt％甲壳胺溶液。将1mg的石墨烯G加入到1mL以上甲壳胺溶液超声2h，得到稳定的G-Chi悬浊液。取2mL 1mM AgNO3溶液加入到上述制备好的G-Chi悬浊液中，在室温条件下搅拌6h，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到G-Chi-AgNPs纳米复合物。
传感器的制备
用0.05μm的Al2O3抛光粉将金电极(GE,)打磨至镜面后用去离子水清洗，依次用二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水超声5min。然后将金电极置于0.5mol·L- 1H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度为50mV/s(电压范围为-0.3～+1.5V)，扫描直到循环伏安图稳定之后，用移液枪移取8μL G-Chi-AgNP纳米复合物涂到金电极表面，4℃下自然晾干，然后滴涂15μL0.1mg/mL抗BVDV单克隆抗体(Ab/BVDV)置于4℃下反应8小时，再滴涂15μL1wt％牛血清白蛋白BSA溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净，最后滴涂15μL待测样品37℃下反应30min，用二次去离子水反复离心洗涤3次，置于1M KCl溶液中进行线性伏安扫描(LSV)，电化学工作站(CHI660D电化学工作站购自北京华科普天科技责任有限公司)的LSV测定参数：电位扫描范围-0.15～0.25V，扫描速率为0.05V/s。对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极。
电极修饰过程的电化学表征
图1为免疫传感器制备过程的线性伏安图。图1中a为金电极在含有1M KCl溶液中进行线性伏安扫描(LSV)。如图1b所示，当金电极覆盖一层G-Chi-AgNP纳米复合物后，出现明显的电化学吸收峰。这是因为银纳米粒子具有电化学活性。随后依次固定Ab/BVDV、BSA后，得到的LSV曲线的峰电流值均明显下降(图1c,d)，这是因为Ab/BVDV、BSA是蛋白分子物质不导电，阻碍了电极表面的电子转移。
实施例2、石墨烯电化学免疫传感器的检测
(一)检测
孵育时间优化：
将牛病毒性腹泻病毒BVDV滴涂在修饰好的金电极即实施例1制备好的传感器上，分别选择5,10,15，20,30,40,50,60min作为BVDV孵育时间，测定反应后电流变化情况。
在传感器的制备过程中，BVDV的免疫反应时间对传感器的响应信号有重要的影响。当电极滴涂了BVDV后在37℃中依次反应5,10,15，20,30,40,50,60min，然后在含有1MKCl溶液中进行线性伏安扫描(LSV)缓冲溶液中进行扫描。得到的峰电流值和时间关系曲线如图2所示，30min以前随着时间的延长工作电极的峰电流值不断的降低，之后电流值基本不发生变化，说明免疫反应已经结束。因此在我们选择30min为BVDV的孵育时间。
(二)特异性实验
试验中选取牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV),牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis,MB),牛冠状病毒(Bovine Coronavirus)，猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)进行特异性试验，将以上病毒滴涂在修饰好的金电极即实施例1制备好的传感器上，37℃孵育30min后进行检测。
结果如图3所示，该传感器只有在BVDV存在时峰电流值降低，而对其它病原体(包括BRV,IBRV,MB,BCV，CSFV)的检测，其CV的峰电流值几乎不发生改变，即对其它病原体的检测为阴性，表明该传感器特异性良好。
(三)敏感性实验
对病毒含量为106.2TCID50的BVDV进行10倍倍比稀释，各取15μL用实施例1制备好的传感器进行检测。
结果如图4所示，在10-5稀释时，其响应电流值仍然明显下降，因此该免疫传感器的最低检出量为102.2TCID50。
(四)临床样品的检测
用DMEM培养基洗脱采自广西各地牛场的45份出现腹泻症状的牛粪便棉拭子样品，5000r/min离心10min后取上清作为待检样品，以NADL株作为阳性对照，用本研究建立的电化学免疫传感器进行检测，同时参照国标(SN/T1905-2007,牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程[S])进行PCR检测。
检测结果为其中18份为阳性样品，27份为阴性样品，与PCR方法的检测结果相符。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测牛病毒性腹泻病毒的电化学传感器，其特征在于，所述传感器包括在传感器的电极表面设置可特异性检测牛病毒性腹泻病毒的多肽、蛋白、核酸和/或糖类分子。
2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述设置包括在电极表面先涂石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子G-Chi-AgNP纳米复合物，然后再涂可特异性检测牛病毒性腹泻病毒的多肽、蛋白、核酸和/或糖类分子。
3.根据权利要求1和/或2任一所述的电化学传感器，其特征在于，所述蛋白包括抗牛病毒性腹泻病毒BVDV单克隆抗体。
4.根据权利要求1、2和/或3任一所述的电化学传感器，其特征在于，所述传感器的电极包括金电极。
5.根据权利要求3所述的电化学传感器，其特征在于，所述抗牛病毒性腹泻病毒BVDV单克隆抗体最后还需要用牛血清白蛋白进行封闭。
6.一种检测牛病毒性腹泻病毒的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1、2、3、4和/或5任一所述的电化学传感器。
7.一种检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1、2、3、4和/或5任一所述的电化学传感器、或权利要求6所述产品进行牛病毒性腹泻病毒的检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括将待测样品涂到所述传感器表面，37℃孵育30min后进行峰电流值的检测。
9.权利要求1、2、3、4和/或5任一所述的电化学传感器、权利要求6所述产品在检测牛病毒性腹泻病毒中的应用；或在制备检测牛病毒性腹泻病毒相关产品中的应用。
10.一种检测牛病毒性腹泻病毒的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括在传感器的电极表面设置可特异性检测牛病毒性腹泻病毒的多肽、蛋白、核酸和/或糖类分子；具体的，所述设置包括在电极表面先涂石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子G-Chi-AgNP纳米复合物，然后再涂可特异性检测牛病毒性腹泻病毒的多肽、蛋白、核酸和/或糖类分子；具体的，所述蛋白包括抗牛病毒性腹泻病毒BVDV单克隆抗体；具体的，所述传感器的电极包括金电极；再具体的，所述抗牛病毒性腹泻病毒BVDV单克隆抗体还需要用牛血清白蛋白进行封闭。
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