CN110168100A

CN110168100A - 使用mitra尖端提取检测囊性纤维化突变的方法

Info

Publication number: CN110168100A
Application number: CN201780083042.8A
Authority: CN
Inventors: H·桑德斯; N·J·克拉克
Original assignee: Quest Diagnostics Investments LLC
Current assignee: Quest Diagnostics Investments LLC
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2019-08-23
Also published as: US11473144B2; BR112019009790A2; US20180135128A1; US11486005B2; JP2022137019A; US20200056240A1; US20230134138A1; CA3044033A1; EP3541953A1; MX2019005684A; EP3541953A4; WO2018093723A1; JP2020501601A

Abstract

本公开文本提供了用于确定表现出囊性纤维化症状的患者或有囊性纤维化风险的患者是否将受益于用一种或多种抗囊性纤维化治疗剂进行的治疗的方法。这些方法基于在使用体积计量吸收微量取样装置收集的小体积干生物流体样品中检测遗传性囊性纤维化相关突变。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

Description

使用MITRA尖端提取检测囊性纤维化突变的方法

技术领域

本公开文本提供了用于确定表现出囊性纤维化症状的患者或有囊性纤维化风险的患者是否将受益于用一种或多种抗囊性纤维化治疗剂进行的治疗的方法。这些方法基于在使用体积计量吸收微量取样装置收集的小体积干生物流体样品中检测遗传性囊性纤维化相关突变。可以使用下一代测序(NGS)检测对应于一种或多种囊性纤维化相关突变的靶核酸序列的改变。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

背景技术

下文提供对本公开文本的背景的说明只为了帮助读者理解本公开文本，并且并不承认描述或构成本公开文本的现有技术。

囊性纤维化(CF)是高加索人群中最常见的严重常染色体隐性遗传性障碍。它影响北美大约1/2,500的活产儿(Boat等人,The Metabolic Basis of Inherited Disease,第6版,第2649-2680页,McGraw Hill,NY(1989))。北欧高加索人后裔中大约有1/25人是所述疾病的携带者。负责基因位于7号染色体长臂上存在的250,000个碱基对基因组序列中。该序列编码称为“囊性纤维化跨膜调节因子”(或“CFTR”)的膜相关蛋白。CFTR基因中存在超过1000种不同的突变，每种突变在不同群体中具有不同的发生频率，目前报告给囊性纤维化遗传分析联盟(Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium)。这些突变存在于CFTR基因的编码区(例如ΔF508，在约70％的CF等位基因中发现的突变，代表508位处苯丙氨酸残基的缺失)和非编码区(例如5T、7T和9T变体对应于位于内含子8的剪接分支/受体位点处具有5、7或9个胸苷碱基的序列)。

囊性纤维化的主要症状包括慢性肺病、胰腺外分泌功能不全和汗液电解质水平升高。症状与囊性纤维化是外分泌障碍一致。尽管目前在分析跨越CF患者细胞上皮顶膜的离子转运方面取得了进展，但尚不清楚氯离子通道的异常调节是否代表了所述疾病的主要缺陷。

下一代测序(NGS)广泛用于遗传性障碍，包括囊性纤维化的诊断，因为其具有高数据通量并且能够在单次测定中检测多种基因改变。然而，与从生物样品(例如血液)收集和制备核酸相关的程序通常是麻烦的，通常需要专门的设备或技术技能。此外，某些患者群诸如老人或幼儿不能提供大量血液用于反复测试。

因此，需要快速且非侵入性方法来确定患者是否具有产生囊性纤维化的遗传基础或有产生罹患囊性纤维化的后代的风险。

发明内容

一方面，本公开文本提供了一种用于检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的方法，所述方法包括(a)从自微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取样品CFTR核酸；(b)产生包含对应于样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库；以及(c)使用高通量大规模平行测序检测文库中扩增子中的至少一个中的至少一种突变。

另外或可替代地，在一些实施方案中，干生物流体样品是干血浆、干血清或干全血。在一些实施方案中，微量取样装置的吸收尖端上的干生物流体样品是通过手指针刺从患者收集的。在一些实施方案中，微量取样装置是体积计量吸收微量取样装置。在某些实施方案中，微量取样装置是尖端。

另外或可替代地，在一些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来进行的。在某些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。在另一个实施方案中，裂解缓冲液包含800mM盐酸胍；30mM Tris·Cl，pH8.0；30mM EDTA，pH 8.0；5％Tween 20；以及0.5％Triton X-100。在其他实施方案中，裂解缓冲液包含2.5％-10％十二烷基硫酸钠。

另外或可替代地，在一些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液在90℃下接触长达15分钟来进行的。在某些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达1小时来进行的。在其他实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达16-18小时来进行的。

在一些实施方案中，微量取样装置的样品体积不超过10-20μL。在一些实施方案中，从微量取样装置的吸收尖端洗脱不超过400ng基因组DNA。在其他实施方案中，从微量取样装置的吸收尖端洗脱约100ng至约400ng基因组DNA。在一些实施方案中，方法还包括将衔接子序列连接到多个扩增子的末端。衔接子序列可以是P5衔接子、P7衔接子、P1衔接子、A衔接子或Ion Xpress^TM条形码衔接子。另外或可替代地，在一些实施方案中，方法还包括将一种或多种诱饵序列与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交。

另外或可替代地，在一些实施方案中，至少一种突变选自碱基变化、基因缺失和基因重复。另外或可替代地，在一些实施方案中，至少一种突变与囊性纤维化相关，并且可以包括表2中所列出的一种或多种突变。

在任何上述实施方案中，干生物流体样品是从表现出囊性纤维化症状或具有囊性纤维化或CFTR突变家族史的个体获得。在一些实施方案中，干生物流体样品是从患有囊性纤维化或具有至少一种CFTR突变的妇产科患者的男性伴侣获得。

另外或可替代地，在一些实施方案中，多个靶区段一起跨越CFTR基因的所有编码区和非编码区。在一些实施方案中，多个靶区段还跨越紧邻CFTR基因的第一外显子上游的启动子区的约1000个核苷酸。在一些实施方案中，多个靶区段还跨越紧邻CFTR基因下游的约200至350个核苷酸。

另外或可替代地，在一些实施方案中，高通量大规模平行测序是使用焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、边合成边测序、边连接边测序或SMRT^TM测序来进行的。在某些实施方案中，高通量大规模平行测序涉及读取深度法。另外或可替代地，在一些实施方案中，多个扩增子还包含唯一性索引序列。

另一方面，本公开文本提供了一种用于检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的方法，所述方法包括产生包含对应于样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库，其中从用裂解缓冲液和蛋白酶K从微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取样品CFTR核酸。在另一个实施方案中，使用高通量大规模平行测序检测样品CFTR核酸中的至少一种突变。在一些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。

另外或可替代地，在一些实施方案中，与参考CFTR核苷酸序列的相应区域相比，样品CFTR核酸的多个靶区段包含至少一种改变。在某些实施方案中，参考CFTR核苷酸序列包含野生型CFTR核酸序列。

一方面，本公开文本提供了一种用于选择表现出囊性纤维化症状的患者或有囊性纤维化风险的患者来用抗囊性纤维化治疗剂治疗的方法，所述方法包括(a)从微量取样装置的吸收尖端洗脱患者的干生物流体样品，其中干生物流体样品包含样品CFTR核酸；(b)产生包含对应于样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库；(c)使用高通量大规模平行测序检测文库中扩增子中的至少一个中的至少一种突变；以及(d)选择患者来用抗囊性纤维化治疗剂治疗。干生物流体样品可以是干血浆、干血清或干全血。在一些实施方案中，微量取样装置是体积计量吸收微量取样装置。在某些实施方案中，微量取样装置的吸收尖端上的干生物流体样品是通过手指针刺从患者收集的。在某些实施方案中，微量取样装置是尖端。在一些实施方案中，患者的CFTR基因中具有一种或多种突变，并且可以包括表2中所列出的一种或多种突变。

在任何上述实施方案中，抗囊性纤维化治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：青霉素(penicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、头孢菌素(cephalosporin)、大环内酯、氟喹诺酮、磺酰胺、四环素、氨基糖苷、粘菌素(colistin)、安西奈德(Amcinonide)、二丙酸倍他米松(Betamethosone diproprionate)、氯倍他索(Clobetasol)、氯可托龙(Clocortolone)、地塞米松(Dexamethasone)、二氟拉松(Diflorasone)、度他雄胺(Dutasteride)、特戊酸氟美松(Flumethasone Pivalate)、氟尼缩松(Flunisolide)、肤轻松醋酸酯(Fluocinolone Acetonide)、醋酸氟轻松(Fluocinonide)、氟米龙(Fluorometholone)、丙酸氟替卡松(Fluticasone propionate)、丙酸氟替卡松、丙酸氟替卡松、氟氢缩松(Flurandrenolide)、氢氟噻嗪(Hydroflumethiazide)、醋氯芬酸(aceclofenac)、阿西美辛(acemetacin)、阿司匹林(aspirin)、塞来昔布(celecoxib)、右旋布洛芬(dexibuprofen)、右旋酮洛芬(dexketoprofen)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、依托昔布(etoricoxib)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indometacin)、酮洛芬(ketoprofen)、甲芬那酸(mefenamicacid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、舒林酸(sulindac)、替诺昔康(tenoxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、祛痰药、抗组胺药、止咳药、右美沙芬(Dextromethorphan)、高渗盐水、阿法链道酶(dornase alfa)、粘液溶解剂、胰酶、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K以及减少胃酸的补充剂。

另一方面，本公开文本提供了一种用于检测个体中受囊性纤维化影响或作为囊性纤维化携带者的遗传基础的方法，所述方法包括：(a)通过扩增从个体获得的CFTR核酸的多个靶区段来产生扩增子文库，其中从自微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取样品CFTR核酸；(b)使用高通量大规模平行测序对扩增子文库中的扩增子进行测序，以及(c)当CFTR核酸的靶区段中一个或多个的核苷酸序列包含与囊性纤维化相关的突变时，检测感染囊性纤维化或作为囊性纤维化携带者的遗传基础。

本文还提供了用于在干生物流体样品中检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的试剂盒，所述试剂盒包含皮肤穿刺工具、体积计量吸收微量取样装置、裂解缓冲液和蛋白酶K，其中至少一种突变包含表2中列出的CFTR突变中的一种或多种。

另外或可替代地，在一些实施方案中，试剂盒还包含与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交的一个或多个引物对。在一些实施方案中，试剂盒还包含与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交的一个或多个诱饵序列。在一些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。

在本发明技术的试剂盒的任何上述实施方案中，体积计量吸收微量取样装置是尖端。

附图说明

图1显示了来自在自动提取平台上使用DNA Investigator试剂盒从尖端进行的单尖端和双尖端提取的DNA产量的比较。对于双尖端提取，将从来自同一患者的两个单独尖端洗脱的裂解物组合在一起。图1证明双尖端提取使DNA产量平均增加了2倍。

图2显示了每个覆盖的CFTR靶区域(或热点)在囊性纤维化扩展组(扩展筛)上的读取覆盖量。图2证明，对于全负载的384个样品运行(即在以全容量即377个操作样品(Ops)和7个尖端执行的板上运行样本)中的所有覆盖的CFTR靶区域，所有7个尖端样本都超过了最低QC标准。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明技术所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。

除非上下文另外说明或另外显而易见，否则如本文所用，关于数字的术语“约”通常视为包括属于所述数字任一方向(大于或小于)的1％–10％范围内的数字。

术语“衔接子”是指化学合成的短核酸序列，其可以用于连接核酸序列的末端以促进与另一个分子的附接。衔接子可以是单链或双链的。衔接子可以并有用于PCR扩增或测序的短(典型地少于50个碱基对)序列。

如本文所用，向受试者“施用”治疗剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，所述途径包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)或局部。施用包括自施用和由另一个人施用。

如本文所用，基因或基因产物(例如标记基因或基因产物)的改变是指基因或基因产物内存在突变，例如与正常或野生型基因相比，影响基因或基因产物的数量或活性的突变。与正常或健康组织或细胞(例如对照)中基因或基因产物的数量、结构和/或活性相比，遗传改变可导致患病组织或细胞中其数量、结构和/或活性变化。例如，与在正常的健康组织或细胞中所观察到的相比，在患病组织或细胞中，与囊性纤维化相关的改变可具有编码膜相关蛋白“囊性纤维化跨膜调节因子”(或“CFTR”)的基因的改变的核苷酸序列(例如突变)、氨基酸序列、染色体易位、染色体内转化、拷贝数、表达水平、蛋白质水平、蛋白质活性。示例性突变包括但不限于点突变(例如沉默、错义或无义)、缺失、插入、倒位、连接突变、重复、易位、染色体间和染色体内重排。突变可以存在于基因的编码区或非编码区中。在某些实施方案中，所述改变与表型例如与囊性纤维化相关的表型相关。

如本文所用，关于核酸序列的术语“扩增(amplify或amplification)”是指增加样品中核酸序列群的表现的方法。将扩增反应中在体外产生的特定靶核酸序列的拷贝称为“扩增子”或“扩增产物”。扩增可为指数性或线性的。靶核酸可为DNA(诸如例如基因组DNA和cDNA)或RNA。尽管下文所述的示例性方法涉及使用聚合酶链反应(PCR)扩增，但本领域技术人员熟知多种其他方法，诸如等温法、滚环法等。本领域技术人员应理解，这些其他方法可代替PCR方法使用或与PCR方法一起使用。参见例如Saiki,“Amplification of GenomicDNA”,PCR Protocols,Innis等人编,Academic Press,San Diego,CA 1990,第13-20页；Wharam等人,Nucleic Acids Res.29(11):E54-E54(2001)。

如本文所用，“诱饵”是一种杂交捕获试剂，其检索靶核酸序列以用于测序。诱饵可以是核酸分子，例如DNA或RNA分子，其可以与靶核酸杂交(例如互补)，从而使得可捕获靶核酸。在一个实施方案中，诱饵是RNA分子(例如天然存在或修饰的RNA分子)；DNA分子(例如天然存在或经修饰的DNA分子)或其组合。在其他实施方案中，诱饵包括结合实体，例如亲和标签，所述结合实体使得可例如通过与结合实体结合来捕获且分离由诱饵和与所述诱饵杂交的核酸形成的杂交体。在一个实施方案中，诱饵适用于溶液相杂交。

如本文所用，“诱饵组”是指一种或多种诱饵分子。

本文所用的术语“携带者状态”或“囊性纤维化携带者”意指具有含有与囊性纤维化相关的突变CFTR核酸序列的CFTR等位基因以及不是突变CFTR核酸序列的第二等位基因的人。囊性纤维化是一种“常染色体隐性”疾病，所述疾病是指突变在以杂合状态与非疾病相关的等位基因一起存在时几乎不产生表型效应，但当一个人是纯合的或复合杂合子(即两个CFTR等位基因都是突变的CFTR核酸序列)时会产生疾病病态。

如本文所用的“CFTR核酸”是指含有CFTR基因的序列的核酸、mRNA、cDNA或此种CFTR序列的一部分。CFTR核酸可以含有CFTR编码区。CFTR核酸可以是基因组DNA、cDNA、单链DNA或mRNA。在一些实施方案中，仅对样品CFTR核酸的单链进行扩增和/或测序。在一些实施方案中，对双链CFTR DNA的两条链进行扩增和测序。CFTR核酸可以存在于生物样品中，或可以从生物样品中分离。

如本文所用的术语“CFTR启动子区”是指CFTR基因中代表翻译起始位点上游的至少前250个核苷酸(nt)的区段。在其他实施方案中，启动子区可以包括就在起始密码子上游的前250nt、前300nt、前350nt、前400nt、前450nt、前500nt、前1kb、前5kb、前10kb、前15kb，前20kb、前21kb或前22kb的序列。如本文所定义的启动子区的缺失可伴随下游外显子/内含子的缺失，但不是所有CFTR基因的缺失。在一些实施方案中，涉及CFTR启动子区和下游CFTR基因序列的相应缺失涉及约少于10个外显子，更典型地涉及少于5个外显子。可以使用侧接缺失或重复序列的引物来检测CFTR启动子区的缺失或重复。在某些实施方案中，启动子缺失或复制涉及具有至少一个或多个核苷酸、至少四个或更多个核苷酸、至少5个或更多个核苷酸、至少8个或更多个核苷酸或至少12个或更多个核苷酸的区段。

如本文所用的术语“编码序列”意指可以被转录和/或翻译以产生相应的mRNA和/或多肽或其片段的核酸序列或其互补序列或其一部分。编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录物中的外显子，所述外显子通过细胞的生化机制连接在一起以提供成熟的mRNA。反义链是此种核酸的互补序列，并且可以从其推导出编码序列。如本文所用的术语“非编码序列”意指核酸序列或其互补序列或其一部分，其不在体内转录成氨基酸，或其中tRNA不相互作用以放置或试图放置氨基酸。非编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录物中的内含子序列，以及基因相关序列，诸如启动子、增强子、沉默子等。

如本文关于多核苷酸(即核苷酸诸如寡核苷酸或靶核酸的序列)所用的术语“互补体”、“互补”或“互补性”是指Watson/Crick碱基配对原则。如本文所用的核酸序列的互补体是指如下寡核苷酸，该寡核苷酸在与核酸序列比对以使一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对时呈“反向平行缔合”。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。本文所述的核酸中可以包括天然存在的核酸中通常未发现的某些碱基。这些碱基包括例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)以及肽核酸(PNA)。互补性无需完美；稳定双链体可以含有错配碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可在考虑多个变量后凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度以及错配碱基对的发生率。互补序列还可以为与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，并且还可以为cDNA。

如本文所用，术语“基本上互补”意指两个序列在严格杂交条件下杂交。本领域技术人员应了解，基本上互补的序列无需沿其整个长度杂交。特别地，基本上互补的序列可以包含不与靶序列杂交的连续碱基序列，所述连续碱基序列位于在严格杂交条件下与靶序列杂交的连续碱基序列的3'或5'。

如本文所用，“对照”或“参考”是用于比较目的在实验中使用的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”的。如本文所用的“对照核酸样品”或“参考核酸样品”是指来自对照或参考样品的核酸分子。在某些实施方案中，参考或对照核酸样品是野生型或非突变的DNA或RNA序列。在某些实施方案中，参考核酸样品经过纯化或分离(例如将其从其天然状态中去除)。在其他实施方案中，参考核酸样品来自非患病样品，例如血液对照、组织对照或来自同一或不同受试者的任何其他非患病样品。

“覆盖深度”是指来自被映射到给定位置的测序用读取片段的核苷酸数量。

如本文所用的术语“缺失”涵盖从核酸去除一个或多个核苷酸的突变。相反，术语“重复”是指在核酸中紧邻该序列处插入具有相同序列的一个或多个核苷酸的突变。在一些实施方案中，缺失或重复涉及具有四个或更多个核苷酸的区段。

如本文所用，术语“检测”是指确定样品中目标核酸中突变或改变的存在。检测不要求方法提供100％灵敏度。

术语“剂量”或“基因剂量”是指样品中存在的基因或基因部分的拷贝数。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如使得可预防与囊性纤维化相关的一种或多种症状发作或使得可改善所述一种或多种症状的量。在治疗或预防应用的背景下，向受试者施用的治疗剂的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，诸如一般健康状况、年龄、性别、体重以及药物耐受性。所述量还取决于疾病的程度、严重程度和类型。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。如本文所用，治疗药物或治疗剂的“治疗有效量”是指使遗传性障碍诸如囊性纤维化的生理作用至少得到改善的水平。治疗有效量可以分一次或多次施用给予。

如本文所用，术语“提取”或“分离”是指将核酸与样品中存在的其他细胞物质分离所采取的任何操作。术语提取或分离包括机械或化学裂解，添加清洁剂或蛋白酶或者沉淀和去除其他细胞物质。

本文关于引物使用的术语“侧接”意指引物与邻接标靶上欲扩增的目标区域的靶核酸杂交。技术人员将理解，最佳引物是如下引物对，其与标靶双链DNA分子每条链上的一个目标区域的5'杂交，使得可以用合适的DNA聚合酶将核苷酸添加到引物的3'末端。侧接CFTR外显子的引物通常被设计成不是退火到外显子序列，而是退火到邻接外显子的序列(例如内含子序列)。然而，在一些实施方案中，扩增引物可以被设计成退火到外显子序列。

本文使用的“基因”是指包含产生RNA所必需的调节和编码序列的DNA序列，其可以具有非编码功能(例如核糖体或转运RNA)或可以包括多肽或多肽前体。RNA或多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留所需的活性或功能即可。尽管核酸序列可以以DNA形式显示，但是本领域普通技术人员认为相应的RNA序列将具有类似序列，其中胸腺嘧啶被尿嘧啶替代，即“T”被“U”替代。

个体的“囊性纤维化的遗传基础”是指个体的基因型，特别是其CFTR核酸的基因型，以及个体是否具有造成囊性纤维化的至少一种CFTR突变。本文关于CFTR基因或其基因座使用的术语“野生型”是指在NCBI GenBank基因座ID M58478(HUMCFTC)、AC000111和AC000061中发现的CFTR基因序列。可以在Audrezet等人,Hum.Mutat.23(4),343-357(2004)和/或Genbank登录号NM_000492.3中发现CFTR基因的cDNA。“罕见CFTR突变”是CFTR基因序列的一种突变，其存在于囊性纤维化患者的<0.1％中。“私有性CFTR突变”是CFTR基因序列的一种突变，其仅在单个家族或小群组中发现。“常见CFTR突变”是CFTR基因序列的一种突变，其与囊性纤维化相关，并且存在于囊性纤维化患者的至少0.1％中。

如本文所用的术语“杂交”是指如下过程，其中两个基本上互补的核酸链(在至少14至25个核苷酸的片段上至少约65％互补，至少约75％或至少约90％互补)在适当严格的条件下彼此退火，以通过在互补碱基对之间形成氢键来形成双链体或异源双链体。典型地且优选地用探针长度的核酸分子来进行杂交，所述核酸分子优选长度为15-100个核苷酸，更优选长度为18-50个核苷酸。核酸杂交技术为本领域所熟知。参见例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y。杂交和杂交强度(即核酸之间的缔合强度)受以下因素影响，诸如：核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格性以及所形成杂交物的热熔点(T_m)。本领域技术人员了解如何估计并调节杂交条件的严格度，以使得具有至少期望互补性水平的序列可稳定杂交，而具有较低互补性的序列不会杂交。对于杂交条件和参数的例子，参见例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborPress,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M等人,1994,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Secaucus,N.J。在一些实施方案中，在严格杂交条件下发生特异性杂交。对靶核酸具有特异性的寡核苷酸或多核苷酸(例如探针或引物)将与靶核酸在适合的条件下“杂交”。

如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可为个别生物体、脊椎动物、哺乳动物或人类。在一个优选实施方案中，个体、患者或受试者是人类。

如本文所用，术语“文库”是指核酸序列的集合，例如衍生自全基因组、亚基因组片段、cDNA、cDNA片段、RNA、RNA片段或其组合的核酸集合。在一个实施方案中，文库核酸序列的一部分或全部包含衔接子序列。衔接子序列可以位于一端或两端。衔接子序列可以用于例如测序方法(例如NGS方法)，用于扩增，用于逆转录或用于克隆到载体中。

文库可以包含核酸序列的集合，例如靶核酸序列(例如CFTR核酸序列)、参考核酸序列或其组合。在一些实施方案中，文库的核酸序列可以来源于单个受试者。在其他实施方案中，文库可以包含来自超过一个受试者(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多个受试者)的核酸序列。在一些实施方案中，可以组合来自不同受试者的两个或更多个文库以形成具有来自超过一个受试者的核酸序列的文库。在一个实施方案中，受试者是患有囊性纤维化或有患囊性纤维化风险的人类。

“文库核酸序列”是指核酸分子，例如DNA、RNA或其组合，其是文库的成员。典型地，文库核酸序列是DNA分子，例如基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中，文库核酸序列是断裂的，例如剪切或酶促制备的基因组DNA。在某些实施方案中，文库核酸序列包含来自受试者的序列和并非来源于受试者的序列，例如衔接子序列、引物序列或使得可鉴别例如“条形码”序列的其他序列。在一些实施方案中，文库包含对应于靶核酸序列诸如样品CFTR核酸序列的多个区段的扩增子。

如本文所用的术语“多重PCR”是指两种或更多种产物的扩增，所述产物各自使用不同的引物对引发。

如本文使用的“下一代测序或NGS”是指测定单独的核酸分子(例如在单分子测序中)的核苷酸序列或以高通量平行方式(例如同时对超过10³、10⁴、10⁵个或更多个分子进行测序)测定单独核酸分子的克隆扩增代表物(proxy)的核苷酸序列的任何测序方法。在一个实施方案中，可以通过在由测序实验产生的数据中计数核酸物质同源序列的相对出现次数来估计文库中所述核酸物质的相对丰度。下一代测序方法是本领域中已知的，并且描述于例如Metzker,M.Nature Biotechnology Reviews 11:31-46(2010)中。

如本文所用，“寡核苷酸”是指在主要以指定间隔包含相同单体单元的主链上具有核酸碱基序列的分子。以如下方式将碱基安排在主链上，使得其可以与具有与所述寡核苷酸的碱基互补的碱基序列的核酸结合。最常见的寡核苷酸具有糖磷酸酯单元的主链。可区分2'位不具有羟基的寡脱氧核糖核苷酸与2'位具有羟基的寡核糖核苷酸。寡核苷酸还可以包括如下衍生物，其中羟基中的氢由有机基团例如烯丙基替代。用作引物或探针的寡核苷酸通常长度为至少约10-15个核苷酸，或长度为最多约70、100、110、150或200个核苷酸，并且更优选地长度为至少约15至25个核苷酸。用作特异性扩增或特异性检测特定靶核酸的引物或探针的寡核苷酸通常能够与靶核酸特异性地杂交。

如本文所用，术语“引物”是指如下寡核苷酸，其在置于诱导合成与靶核酸链互补的引物延伸产物的条件下，即在不同的核苷酸三磷酸和在适当缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等)中的聚合酶存在下以及在合适的温度下时，能用作核酸序列合成的起始点。引物中的一个或多个核苷酸可例如通过添加甲基、生物素或地高辛配基(digoxigenin)部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸来修饰。引物序列无需反映模板的准确序列。例如，可使非互补核苷酸片段附接于引物的5'端，其中引物序列的其余部分与所述链基本上互补。如本文所用的术语引物包括可合成的引物的所有形式，所述形式包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、经标记的引物等。如本文所用的术语“正向引物”意指退火到双链DNA(dsDNA)的反义链的引物。“反向引物”退火到dsDNA的正义链。

引物长度典型地为10、15、18或30个核苷酸，或长度为最多约100、110、125或200个核苷酸。在一些实施方案中，引物长度优选在约15至约60个核苷酸之间，并且长度最优选在约25至约40个核苷酸之间。在一些实施方案中，引物长度为15至35个核苷酸。对于最佳的杂交或聚合酶链反应扩增，没有标准长度。用于特定引物应用的最佳长度可以以H.Erlich,PCR Technology,Principles and Application for DNA Amplification,(1989)中所述的方式容易地确定。

如本文所用，术语“引物对”是指可以一起用于扩增目标核酸的给定区域的正向和反向引物对(即左侧和右侧引物对)。

如本文所用的“探针”是指与靶核酸通过杂交相互作用的核酸。探针可以与靶核酸序列完全互补或部分互补。互补水平通常基于探针的功能取决于多种因素。可以以本领域中熟知的多种方式中的任一种标记或不标记或者修饰探针。探针可以与靶核酸特异性地杂交。探针可以是DNA、RNA或RNA/DNA杂交体。探针可以是寡核苷酸、人工染色体、断裂的人工染色体、基因组核酸、断裂的基因组核酸、RNA、重组核酸、断裂的重组核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸、环杂环的寡聚体或核酸的缀合物。探针可以包含经修饰的核碱基、经修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间连接。探针长度典型地为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100个核苷酸或更长。

如本文所用，术语“样品”是指从患者获得的临床样品。在优选实施方案中，从生物来源获得样品(即“生物样品”)，诸如从受试者收集的组织或体液。样品来源包括但不限于粘液、痰(处理或未处理)、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管洗涤液(BW)、血液、体液、脑脊髓液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织(例如活组织检查材料)。优选的样品来源包括血浆、血清或全血。

“样品CFTR核酸”是生物样品中或从生物样品中分离的CFTR核酸。用于释放或以其他方式获得用于检测的核酸的加工方法是本领域熟知的，并且可以包括核酸操作步骤，例如从生物样品中提取DNA或RNA，以及通过逆转录来自生物样品的RNA制备cDNA。生物样品可以是体液或组织样品。在一些实施方案中，生物样品可以包含血液、血浆、血清、尿液、粪便、表皮样品、阴道样品、皮肤样品、面颊拭子、精子、羊水、培养细胞、骨髓样品和/或绒毛膜绒毛、培养细胞等。在一些实施方案中，生物样品可以是用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品。还可以使用固定或冷冻的组织。10-15ml的羊水，在两个T-25烧瓶中80％-100％汇合的培养细胞和25mg绒毛膜绒毛是用于加工的有用样品量。

如本文关于本发明技术的方法所用的术语“灵敏度”是方法在异质序列群中检测预选序列变体的能力的量度。如果给定如下样品，其中预选序列变体以样品中序列的至少F％存在，方法可以以C％的预选置信度、S％的次数检测到预选序列，则方法对F％的变体具有S％的灵敏度。举例而言，如果给定如下样品，其中预选变体序列以样品中序列的至少5％存在，方法可以以99％的预选置信度、10次有9次检测到预选序列(F＝5％；C＝99％；S＝90％)，则方法对5％的变体具有90％的灵敏度。示例性灵敏度包括至少50、60、70、80、90、95、98和99％。

如本文所用的“测序深度”或“读取深度”是指序列已被测序的次数(测序深度)。作为例子，可以通过比对多个测序运行结果并且计数某个大小(例如100bp)的非重叠窗中读取片段的起始位置来确定读取深度。可以使用本领域已知的方法基于读取深度确定拷贝数改变，所述方法例如Yoon等人,Genome Research September；19(9):1586-1592(2009)；Xie等人,BMC Bioinformatics 10:80(2009)；或Medvedev等人,Nature Methods 6(增刊11):513-20(2009)中所述的方法。使用该类方法和分析被称为“读取深度法”。

如本文关于寡核苷酸引物所用的术语“特异性”意指在比对所述寡核苷酸与待扩增的核酸时，引物的核苷酸序列与所述核酸的一部分具有至少12个碱基的序列同一性。对核酸具有特异性的寡核苷酸引物是在严格的杂交或洗涤条件下，能够与目标标靶杂交并且基本上不与非目标核酸杂交的引物。更高水平的序列同一性是优选的，并且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少85％-95％，并且更优选至少98％的序列同一性。可以使用采用本领域熟知算法的市售电脑程序以默认设置来测定序列同一性。如本文所用，具有“高序列同一性”的序列至少在约50％的所比对核苷酸位置处，优选至少在约60％的所比对核苷酸位置处，且更优选至少在约75％的所比对核苷酸位置处具有相同的核苷酸。

如本文所用，“特异性”是方法区分真实存在的预选序列变体与测序假象或其他密切相关序列的能力的量度。特异性是避免假阳性检测的能力。假阳性检测可能由以下引起：在样品制备期间引入目标序列中的错误、测序误差或密切相关序列如假基因或基因家族成员的疏忽测序。如果在应用于N_总个序列的样品集时，其中X_真实序列是真实变体并且X_非真实是非真实变体，方法选择了非真实变体中的至少X％为非变体，则方法具有X％的特异性。例如，如果在应用于1,000个序列的样品集时，其中500个序列是真实变体并且500个是非真实变体，方法选择了500个非真实变体序列中的90％为非变体，则方法具有90％的特异性。示例性特异性包括至少50、60、70、80、90、95、98和99％。

如本文所用的术语“严格杂交条件”是指至少与以下一样严格的杂交条件：在42℃下在50％甲酰胺、5x SSC、50mM NaH₂PO4(pH 6.8)、0.5％SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA和5x Denhart氏溶液中杂交过夜；在45℃下用2x SSC、0.1％SDS洗涤；并且在45℃下用0.2x SSC、0.1％SDS洗涤。在另一个实施例中，严格杂交条件不应允许在20个连续核苷酸的片段上有超过两个碱基不同的两个核酸杂交。

如本文所用术语“靶核酸”或“靶序列”或“靶区段”是指待分析样品中待检测和/或定量的目标核酸序列。靶核酸可由以下构成：染色体区段、具有或不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的区段或部分或针对其设计探针或引物的核酸序列。靶核酸可以包括一个或多个野生型序列、突变、缺失、插入或重复、串联重复元件、目标基因、目标基因区域或所述区域的任何上游或下游区域。靶核酸可以代表特定基因的替代序列或等位基因。靶核酸可源自基因组DNA、cDNA或RNA。

如本文所用，术语“治疗”是指获得有益或期望的临床结果的操作，所述临床结果包括但不限于减轻或改善疾病或病症的一种或多种病征或症状(例如部分或完全消退)，降低疾病的程度，稳定(即不恶化，实现稳定的疾病)疾病状态，改善或缓解疾病状态，降低进展速度或减少进展时间以及缓解(部分或全部)。

本发明技术的方法中采用的微量取样装置

常规的干血斑技术伴有许多缺点，所述缺点包括不精确的样品体积和对恒定样品粘度的依赖(即样品将均匀地散布在样品卡上的预期)。当向卡片施用等体积的样品时，恒定粘度产生保持恒定的血斑直径。然而，由于血液中的血细胞比容(HCT)或细胞压积(PCV)水平不同，所以血液样品之间的粘度显著变化。具有高血细胞比容水平的样品在血斑纸上形成较小直径的斑点，导致在取样斑点的固定直径内具有不同血液浓度。据信斑点直径中的PCV水平显示出约45％的变化。当将内标物喷洒在血斑上时，这可能会引起定量时45％的误差。本文公开的方法中采用的微量取样装置具有几个优点，包括收集更精确的血液体积，没有血细胞比容偏差，以及容易地用标准液体处理器进行自动化操作以进行实验室加工的能力。

另外，相对于所公开的微量取样装置，常规血斑技术需要相对多体积的血液。干血斑通常每个斑点需要50-75μl，而微量取样装置可以由大约20μl产生结果。本领域中认为，对于检测病毒载量，与其他样品类型诸如血浆相比，干血斑通常具有性能可变性问题(Pannus等人,Medicine,95:48(e5475)(2016))，并且对于某些类型的评估(例如光密度)，与其他样品类型诸如血清相比，干血斑的体积可能需要显著较高(Brandao等人,J.Clin.Virol.,57:98-102(2013))。实际上，发现使用干血斑和血浆斑点筛查两者来检测在接受抗逆转录病毒疗法的HIV患者中的病毒载量和治疗无效，两个结果都产生高的假阳性率(Sawadogo等人,J.Clin.Microbiol.,52(11):3878-83(2014))。

可用于本发明技术的方法的微量取样装置包含具有远端和近端的吸收尖端。吸收尖端远端的宽度比近端的宽度窄。近端附接于固持器，而远端配置成接触待吸收的流体，诸如血液。微量取样装置使得生物流体样品诸如血液可容易地干燥、运输，然后进行分析。在某些实施方案中，生物流体是来自手指针刺的血液。

芯吸作用将血液吸入吸收尖端。吸收尖端与固持器之间的任选障壁阻止血液通过或芯吸到固持器。吸收尖端由即使在可获得过量流体时也芯吸起基本上相同体积的流体(体积计量吸收微量取样或VAMSTM)的材料构成。吸收尖端的体积影响所吸收流体的体积。可以改变吸收尖端的尺寸和形状以调节所吸收血液的体积和吸收速率。可以接受约7-15μL、约20μL并且甚至高达约30μL的血液体积。取样时间可以是约2秒、约3秒、约5秒或最多约10秒。

在一些实施方案中，用于吸收尖端的材料是亲水性的(例如聚酯)。可替代地，所述材料最初可以是疏水性的，随后进行处理以使其具有亲水性。可以通过各种已知方法使疏水性基质具有亲水性，所述方法诸如基质的等离子体处理或表面活性剂处理(例如Tween-40或Tween-80)。在一些实施方案中，使用等离子体处理使疏水性材料诸如聚烯烃(例如聚乙烯)具有亲水性。可替代地，可以使用将亲水性聚合物接枝到表面上和用极性或亲水性分子诸如糖将表面上的活性基团化学官能化来实现吸收尖端的亲水性表面。还可以使用共价修饰来将极性或亲水性官能团添加到吸收尖端的表面上。用于吸收尖端的其他合适材料包括烧结玻璃、烧结钢、烧结陶瓷以及塑料的烧结聚合物和烧结聚乙烯。

在一些实施方案中，微量取样装置包括由亲水性聚合物材料制成的吸收尖端，所述吸收尖端的尺寸足以在约2-5秒内吸收最多约20μL的血液，长度小于约5mm(0.2英寸)，横截面积小于约20mm²，并且密度小于约4g/cc。在一些实施方案中，吸收尖端由聚乙烯构成并且被配置成吸收约1-20微升血液，优选在1-7秒内，并且更优选在约1-5秒内。吸收尖端可以含有干血、干抗凝血剂或内标物中的一种或多种。

在某些实施方案中，吸收尖端的体积为约35mm³，在约3秒内吸收约13-14微升血液，在约2.5秒内吸收9-10微升血液，并且孔隙体积为约38％。在某些实施方案中，吸收尖端的体积为约24微升，密度为约0.6g/cc，在约2.5秒内吸收约10微升血液，并且孔隙体积为约40％。在一些实施方案中，体积计量吸收微量取样装置是如US 2013/0116597中所述的尖端，所述案通过全文引用的方式并入本文中。

吸收尖端可以成形为具有类似截头圆锥的具有窄且圆的远端的外部。在一些实施方案中，固持器具有圆柱形柱，所述圆柱形柱配合到吸收尖端中心内的凹部中并且沿着吸收尖端和固持器的纵向轴线延伸。吸收尖端的锥形形状有助于快速且均匀地芯吸样品。

可以将固持器适配为与移液管一起使用。在一些实施方案中，管状圆锥形固持器是优选的，其中吸收尖端位于固持器的窄端。固持器的较宽相对端可以是封闭的或开放且中空的，并且可以被任选地配置成附接于移液管尖端。固持器可以具有向外延伸的凸缘，所述凸缘被设置成邻接固持器、干燥架或测试设备中的配合结构，以帮助将吸收尖端定位在此类固持器、干燥架和测试设备中的期望位置处。

在某些实施方案中，固持器可以包括移液管尖端或配置成与移液管尖端嵌套的逐渐变细的管状结构。吸收尖端可以由聚乙烯构成，并且吸收尖端和固持器都在无菌条件下制造，或最后进行灭菌。吸收尖端可以含有干抗凝血剂。在一些实施方案中，固持器具有沿固持器的长度延伸的多个肋。肋可以具有选择来使吸收尖端不与凹部的壁接触的高度和长度，其中固持器和吸收尖端被放置在凹部中以进行吸收尖端中干血液的运输或提取。

在吸收小体积样品之后，然后干燥吸收尖端。在一些实施方案中，将小体积血液样品在环境温度或室温下干燥至少10分钟，至少20分钟，至少30分钟，至少40分钟，至少50分钟，至少1小时，至少2小时，至少3小时，至少4小时，至少5小时，至少6小时，至少8小时，至少12小时，至少16小时，至少20小时，至少24小时，至少48小时，至少72小时或至少96小时。在某些实施方案中，将小体积血液样品干燥约2-3小时。

可以在合适的支架或固持器上进行干燥，或优选地，可以将吸收尖端和固持器转移到特殊的干燥容器中，所述干燥容器被配置成便于干燥，同时使吸收尖端与干燥容器的壁或其他潜在的污染表面之间的接触达最少。干燥容器可以具有干燥剂以便于干燥。干燥容器还可以提供保护盖，可以密封所述保护盖以进行运输而防止污染。在一些实施方案中，盖具有表面，可以在所述表面上写入印刷标记以鉴别干血液样品的来源并且提供其他相关信息。在一些实施方案中，容器的尺寸和容器内固持器的相对位置将符合SBS微孔板规格。可以将微量取样装置和干燥容器与干燥剂一起放置在塑料袋中以辅助干燥，并且可以以这种方式运输，或在去除干燥剂之后运输。

在一些实施方案中，固持器的较宽相对端是中空的，并且容器具有包括安装突起部分的第一部分，所述安装突起部分的尺寸被设计成配合到固持器的中空端中并且可释放地接合所述中空端。另外或可替代地，容器具有第二部分，所述第二部分可释放地紧固于第一部分，并且具有被配置成包封固持器的一部分以进行固持器运输的凹部。容器可以包含多个开口，从而使得空气可进入微量取样装置的吸收尖端。此外，第一部分可以具有如下侧面，其中具有足够尺寸的进入端口，并且所述进入端口被定位成使得当固持器在安装突起上时可以穿过所述端口施加标记并且施加到固持器上。

在测试位置处接收之后，可以手动或通过自动化构件在预定体积的合适缓冲液(如本文所述)中洗脱吸收尖端，以从干血液中提取目标核酸或蛋白质。物理搅拌技术诸如流体和/或吸收尖端的超声处理或涡旋可以加速从干血液到液体样品基质中的提取过程。可以使用物理分离技术诸如离心、蒸发/重构、浓缩、沉淀、液/液萃取和固相萃取进一步简化样品基质以进行进一步分析。

每个容器可以包封多个固持器，其中每个固持器在其远端包含吸收尖端并且具有中空的近端。容器同样具有多个细长的安装突起，安装突起各自的尺寸被设计成配合到多个固持器的中空端中并且可释放地接合所述中空端。容器的第二部分具有凹部，所述凹部被配置成将多个固持器中的每一个分别包封在容器内的单独外壳中。在某些实施方案中，多个固持器中的每一个具有沿固持器长度延伸的多个肋，其中肋被配置成使吸收尖端不接触容器的壁。根据需要，可以将干燥剂放置在容器内以帮助干燥吸收尖端中的血液或维持干燥。每个固持器可以具有将固持器与容器以及与至少一个其他固持器相关联的可见标记，诸如序列号，其中数字的各部分指示相关的固持器/吸收尖端和所运输固持器的容器。

核酸提取

一方面，本公开文本提供了一种用于从用体积计量吸收微量取样装置(例如尖端)收集的干生物流体样品中提取基因组DNA的方法。在一些实施方案中，通过使体积计量吸收微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来洗脱干生物流体样品。裂解缓冲液可以包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。蛋白酶K是一种广谱丝氨酸蛋白酶，其在很宽的pH范围(4-12)内是稳定的，其中最适pH为pH 8.0。蛋白酶K切割的主要位点是与具有封闭的α氨基的脂族和芳族氨基酸的羧基相邻的肽键。将反应温度从37℃升高到50℃-60℃可以使蛋白酶K活性增加数倍。可以通过添加0.5％-1％十二烷基硫酸钠(SDS)、3M氯化胍、1M硫氰酸胍或4M尿素来提高蛋白酶K活性。

可替代地，用于核酸提取的其他方案可以用于本发明技术的方法中。其他市售核酸纯化试剂盒的例子包括Molzym GmbH&Co KG(Bremen,DE)、Qiagen(Hilden,DE)、Macherey-Nagel(Düren,DE)、Roche(Basel,CH)或Sigma(Deisenhofen,DE)。还可以使用基于使用聚苯乙烯珠粒等的其他核酸纯化系统作为载体材料。

在一些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA包含使存在于干生物流体样品中的细胞中的核蛋白复合物变性。在某些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA包含去除蛋白质污染物、灭活核酸酶活性和/或去除干生物流体样品中存在的生物和/或化学污染物。

在一些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA可以使用自动DNA提取平台进行。在一些实施方案中，自动DNA提取平台具有高通量容量，诸如每个循环高达100次提取。在某些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA可以使用市售自动化工作站诸如或自动化来进行。在一些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA在带有EZ1DNA Investigator试剂盒的EZ1 Advanced XL、EZ1Advanced或EZ1^TM自动化系统上进行。在一些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA使用市售试剂盒进行。

NGS平台

在一些实施方案中，高通量大规模平行测序采用使用可逆染料终止子的边合成边测序。在其他实施方案中，利用通过连接测序进行测序。在又其他实施方案中，测序是单分子测序。下一代测序技术的例子包括但不限于焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序等。

Ion Torrent^TM(Life Technologies,Carlsbad,CA)扩增子测序系统采用基于流动的方法，其检测在DNA复制中并入未经修饰的核苷酸期间由氢离子释放引起的pH变化。为了与该系统一起使用，最初通过产生侧接测序衔接子的DNA片段来产生测序文库。在一些实施方案中，可以通过乳液PCR在颗粒上克隆扩增这些片段。然后将具有扩增模板的颗粒放置在硅半导体测序芯片中。在复制期间，向芯片一个接一个地添加大量核苷酸，并且如果核苷酸与特定微孔中的DNA分子互补，则将所述核苷酸并入。在核苷酸由聚合酶并入DNA分子中时自然释放质子，从而引起可检测的局部pH改变。然后该孔中溶液的pH改变，并且用离子传感器检测。如果模板序列中存在均聚物重复序列，则将在单个循环中并入多个核苷酸。这产生相应数量的释放氢和比例较高的电子信号。

454TM GS FLX ^TM测序系统(Roche,Germany)在大规模平行焦磷酸测序系统中采用基于光的检测方法。焦磷酸测序使用DNA聚合，一次添加一种核苷酸物质，并且通过因释放附接的焦磷酸盐而发射的光检测且定量添加到给定位置的核苷酸数量。为了与454^TM系统一起使用，将衔接子连接的DNA片段固定在油包水乳液中的小DNA捕获珠粒上，并且通过PCR(乳液PCR)扩增。将每个结合DNA的珠粒放置在picotiter板上的孔中，并且将测序试剂递送到板的孔中。在测序运行期间，在picotiter板装置上以固定次序依次添加四种DNA核苷酸。在核苷酸流动期间，对与每个珠粒结合的DNA的数百万拷贝进行平行测序。当将与模板链互补的核苷酸添加到孔中时，将核苷酸并入现有DNA链上，从而产生由仪器中的CCD相机记录的光信号。

基于可逆染料终止子的测序技术：首先将DNA分子附接到载玻片上的引物上并且扩增，以便形成局部克隆集落。添加四种类型的可逆终止子碱基(RT碱基)，并且洗去未并入的核苷酸。与焦磷酸测序不同，一次只能使DNA延伸一种核苷酸。用相机拍摄荧光标记的核苷酸的图像，然后以化学方法从DNA中去除染料和末端3'阻断子，从而使得可进行下一个循环。

Helicos的单分子测序使用添加有聚A尾衔接子的DNA片段，所述片段与流动池表面附接。在每个循环中，添加DNA聚合酶和单种荧光标记的核苷酸，从而引起表面固定的引物-模板双链体的模板依赖性延伸。由Helioscope测序仪进行读取片段的处理。在获得平铺整个阵列的图像之后，化学切割和荧光标记的释放使得可进行后续的延伸和成像循环。

边合成边测序(SBS)，如“旧式”染料终止电泳测序，依赖于通过DNA聚合酶并入核苷酸来测定碱基序列。将具有固定衔接子的DNA文库变性为单链并移植到流动池中，接着桥接扩增以在玻璃芯片上形成高密度斑点阵列。可逆终止子法使用可逆形式的染料终止子，其一次添加一种核苷酸，通过重复去除阻断基团来检测每个位置的荧光以使得可聚合另一种核苷酸。核苷酸并入的信号可以随所有使用的荧光标记的核苷酸、磷酸盐驱动的光反应和氢离子传感而变化。SBS平台的例子包括Illumina GA、HiSeq 2500、HiSeq 1500、HiSeq2000或HiSeq 1000。个人测序系统(Illumina,Inc.)也采用了使用可逆终止子化学的边合成边测序。

与边合成边测序方法相反，边连接边测序方法使用DNA连接酶来测定靶序列。该测序方法依赖于通过模板DNA链上的局部互补性相邻的寡核苷酸的酶促连接。该技术采用根据测序位置标记的具有固定长度的所有可能寡核苷酸的分区。对寡核苷酸进行退火且连接，并且用DNA连接酶优先连接以匹配序列在该位置产生二核苷酸编码的色空间信号(通过释放荧光标记的探针，所述探针对应于沿着寡核苷酸的已知位置处的已知核苷酸)。LifeTechnologies的SOLiD^TM测序仪主要使用该方法。测序之前，通过乳液PCR来扩增DNA。将各自仅含有相同DNA分子的拷贝的所得珠粒沉积在固体平面基板上。

SMRT^TM测序基于边合成边测序方法。在零模波导(ZMW)小孔样容器中合成DNA，其中捕获工具位于孔的底部。使用未经修饰的聚合酶(与ZMW底部附接)和在溶液中自由流动的荧光标记的核苷酸进行测序。以仅在孔底部出现的荧光被检测到的方式构建孔。荧光标记在核苷酸并入DNA链中时与所述核苷酸分离，留下未经修饰的DNA链。

也可以使用AnyDot芯片(Genovoxx,Germany)进行DNA的高通量测序，所述芯片允许监测生物过程(例如miRNA表达或等位基因变异性(SNP检测))。例如，AnyDot芯片允许核苷酸荧光信号检测的10X-50X增强。其他高通量测序系统包括以下文献中披露的那些：Venter,J.等人,Science 2001年2月16日；Adams,M.等人,Science 2000年3月24日；和M.J,Levene等人,Science299:682-686,2003年1月；以及美国申请公开号2003/0044781和2006/0078937。

本发明技术的囊性纤维化检测测定

本文提供了用于检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的方法，所述方法包括产生包含对应于样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库，其中从用裂解缓冲液和蛋白酶K从微量取样装置的吸收尖端(例如尖端)洗脱的干生物流体样品中提取样品CFTR核酸。在一些实施方案中，样品CFTR核酸中的至少一种突变选自碱基变化、基因缺失和基因重复。在某些实施方案中，样品CFTR核酸中的至少一种突变与囊性纤维化相关，并且包含本公开文本表2中所列突变中的一种或多种。在一些实施方案中，使用高通量大规模平行测序检测样品CFTR核酸中的至少一种突变。在一些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。

在一些实施方案中，干生物流体样品是干血浆、干血清或干全血。在某些实施方案中，干生物流体样品是从表现出囊性纤维化症状或具有囊性纤维化或CFTR突变家族史的患者获得。在一些实施方案中，干生物流体样品是从患有囊性纤维化或具有至少一种CFTR突变的妇产科患者的男性伴侣获得。在一些实施方案中，干生物流体样品是从不能提供大量血液用于反复测试的患者(诸如婴儿或老年人)获得。

在一些实施方案中，微量取样装置的吸收尖端上的干生物流体样品是通过手指针刺从患者收集的。在某些实施方案中，微量取样装置是尖端。干生物流体样品的洗脱可以通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来进行。在某些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。在另一个实施方案中，裂解缓冲液包含800mM盐酸胍；30mM Tris·Cl，pH 8.0；30mM EDTA，pH 8.0；5％Tween 20；以及0.5％Triton X-100。

另外或可替代地，在一些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液在90℃下接触长达15分钟来进行的。另外或可替代地，在某些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达1小时来进行的。在其他实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达16-18小时来进行的。在一些实施方案中，微量取样装置的样品体积不超过10-20μL。

在方法的一些实施方案中，从微量取样装置的吸收尖端洗脱不超过400ng基因组DNA。在方法的其他实施方案中，从微量取样装置的吸收尖端洗脱约100ng至约400ng基因组DNA。在一些实施方案中，方法还包括将衔接子序列连接到多个扩增子的末端。衔接子序列可以是P5衔接子、P7衔接子、P1衔接子、A衔接子或Ion Xpress^TM条形码衔接子。另外或可替代地，在一些实施方案中，方法还包括将一种或多种诱饵序列与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交。

在某些实施方案中，根据本发明技术扩增和测序的CFTR靶区段可以代表CFTR基因的一个或多个单独的外显子或一个或多个外显子的一个或多个部分，或CFTR mRNA或cDNA的一个或多个部分。靶区段还可以包括CFTR启动子区和/或一个或多个CFTR内含子。在一些实施方案中，靶区段代表整个CFTR基因或整个CFTR编码区。在一些实施方案中，靶区段代表整个CFTR编码区和至少一个内含子或其部分，以及位于紧邻编码序列上游(在5'方向上)的相邻区域。相邻的上游区域可以包含紧邻CFTR编码序列上游的序列的约100个核苷酸至约500、750、1000、1100或1200个核苷酸。在一些实施方案中，相邻的上游区域包含CFTR启动子序列的全部或一部分。在一些实施方案中，样品CFTR核酸是基因组DNA。

另一方面，本公开文本提供了一种用于检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的方法，所述方法包括产生包含对应于样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库，其中从用裂解缓冲液和蛋白酶K从微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取样品CFTR核酸，和使用高通量大规模平行测序检测样品CFTR核酸中的至少一种突变。在一些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。

另外或可替代地，在一些实施方案中，与参考CFTR核苷酸序列的相应区域相比，样品CFTR核酸的多个靶区段包含至少一种改变。参考CFTR核苷酸序列可以是来自正常(未罹患囊性纤维化和非囊性纤维化携带者)个体的CFTR基因组或cDNA序列或其一部分。在一些情况下，参考CFTR核苷酸序列可以包含野生型CFTR核酸序列。可以采用本领域已知的各种方法(例如读取深度法)来分析测序数据，以确定与参考CFTR核酸序列相比，样品CFTR核酸序列中是否存在差异。

在一些实施方案中，样品CFTR核酸中的至少一种突变选自碱基变化、基因缺失和基因重复。在一些实施方案中，样品CFTR核酸中至少一种突变与囊性纤维化相关，并且可以包括表2中公开的一种或多种突变。

在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于检测从个体获得的CFTR样品核酸中的一种或多种罕见CFTR突变或私有性突变，从而鉴别具有一种或多种罕见或私有性CFTR突变的个体。在一些实施方案中，本发明技术的方法用于在携带者在常规突变的常规筛查测试中测试为阴性后鉴别专性囊性纤维化携带者中的罕见家族性突变。此类常规筛查测试可以包括CF突变筛查(Quest Diagnostics)、CFTR筛查、囊性纤维化筛查(QuestDiagnostics)和囊性纤维化携带者筛查(LabCorp)。在一些实施方案中，本发明方法还可以用于鉴别感染囊性纤维化(即症状性)个体中的罕见突变，所述个体没有通过至少一种常规囊性纤维化突变筛查测试鉴别的两种CFTR序列突变。

另一方面，本公开文本提供了一种用于检测个体中感染囊性纤维化或作为囊性纤维化携带者的遗传基础的方法，所述方法包括：(a)通过扩增从个体获得的CFTR核酸的多个靶区段来产生扩增子文库，其中从自微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取样品CFTR核酸；(b)使用高通量大规模平行测序对扩增子文库中的扩增子进行测序，以及(c)当CFTR核酸的靶区段中一个或多个的核苷酸序列包含与囊性纤维化相关的突变时，检测感染囊性纤维化或作为囊性纤维化携带者的遗传基础。

在一些实施方案中，本文公开的方法用于确认个体中的囊性纤维化携带者状态，所述个体诸如例如具有一种或多种罕见或私有性突变的感染了囊性纤维化的个体的父母、同胞或其他亲属。在一些实施方案中，至少一种突变与囊性纤维化相关，并且包括表2中所列出的一种或多种突变。可以使用本文公开的方法测定核酸样品中的基因序列和基因剂量两者。基因剂量(也称为拷贝数变异或CNV)可以通过进行下一代测序和使用读取深度法来确定。CNV是一种物种的两个个体之间>50bp的基因组序列的增加和损失(Mills等人,Nature 470:59–65(2011))。关于正常样本的所有其他扩增子，正常剂量是一，纯合缺失是1/2并且纯合重复是1¹/₂。

在一些实施方案中，可以对CFTR基因的至少2、5、10、20、25或28且至多25、29或30个靶区段进行测序，其中使用读取深度法确定基因组序列(>50bp)的增加和减少。在一个实施方案中，对29个靶区段进行测序，所述区段代表CFTR编码区(包括所有外显子/内含子连接区)。在另一个实施方案中，除了CFTR基因上游约1kb和下游约300kb之外，还测定了CFTR编码区(包括所有外显子/内含子连接区)。

另外或可替代地，在一些实施方案中，可以用对靶区段具有特异性的寡核苷酸引物或引物对扩增每个CFTR核酸靶区段。在一些实施方案中，单个引物或引物对中的两个引物包含与引物的标靶特异性序列部分的5'末端连接的特定衔接子序列(也称为测序衔接子)。该测序衔接子是具有已知序列的短寡核苷酸，其可以为邻接的未知核酸的扩增和测序两者提供引发位点。因此，衔接子使得可将片段与流动池结合以进行下一代测序。本发明技术中使用的引物中可以包括任何衔接子序列。在一些实施方案中，使用含有寡核苷酸测序衔接子的引物产生对应于样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子，以产生加衔接子标签的扩增子。在其他实施方案中，所用的引物不含衔接子序列，随后(即扩增后)所产生的扩增子与扩增子一端或两端的寡核苷酸测序衔接子连接。

在一些实施方案中，所有正向扩增子(即从与靶区段的反义链杂交的正向引物延伸的扩增子)含有相同的衔接子序列。在一些实施方案中，当进行双链测序时，所有正向扩增子含有相同的衔接子序列，并且所有反向扩增子(即从与靶区段的有义链杂交的反向引物延伸的扩增子)含有与正向扩增子的衔接子序列不同的衔接子序列。在一些实施方案中，衔接子序列还包含索引序列(也称为索引标签、“条形码”或多重标识符(MID))。

在一些实施方案中，衔接子序列是建议用于Illumina测序仪(MiSeq和HiSeq)的P5和/或P7衔接子序列。参见例如Williams-Carrier等人,Plant J.,63(1):167-77(2010)。在一些实施方案中，衔接子序列是建议用于Life Technologies测序仪的P1、A或Ion Xpress^TM条形码衔接子序列。其他衔接子序列是本领域已知的。一些制造商建议将特定的衔接子序列用于其所提供的特定测序技术和机器。

另外或可替代地，在一些实施方案中，对对应于来自超过一个样品的样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子进行测序。在一些实施方案中，对所有样品同时平行测序。在任何上述实施方案中，使用本文描述的方法对对应于来自至少1、5、10、20、30或至多35、40、45、48或50个不同样品的样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子进行扩增和测序。

在一些实施方案中，来源于单个样品来源的扩增子还包含指示产生扩增子的来源的相同索引序列，每个样品的索引序列不同于来自所有其他样品的索引序列。因此，使用索引序列使得每次测序运行可汇集多个样品，随后基于索引序列确定样品来源。在一些实施方案中，使用Access Array^TM系统(Fluidigm Corp.,San Francisco,CA)或Apollo324System(Wafergen Biosystems,Fremont,CA)通过在一个装置中同时扩增来自样品的核酸来产生条形码标记(索引标记)的扩增子文库。

在一些实施方案中，使用含有索引序列的引物(例如正向引物和/或反向引物)产生索引标记的扩增子。可以在文库制备期间作为“条形码标记”工具包括这些索引标记的引物，以将特定扩增子鉴别为源自特定样品来源。当采用衔接子连接和/或索引标记的引物时，衔接子序列和/或索引序列在扩增期间被并入扩增子(与标靶特异性引物序列一起)中。因此，所得扩增子具有测序能力，并且不需要传统的文库制备方案。此外，索引标签的存在使得可区分来自多个样品来源的序列。

在一些实施方案中，可以用非衔接子连接和/或非索引标记引物扩增扩增子，随后可以使测序衔接子和/或索引序列与所得扩增子中的每一个的一端或两端连接。在一些实施方案中，扩增子文库使用多重PCR方法产生。

将来自超过一个样品来源的索引标记扩增子单独定量，然后在高通量测序之前汇集。因此，使用索引序列使得每次测序运行可汇集多个样品(即来自超过一个样品来源的样品)，随后基于索引序列确定样品来源。“多重化”是将多个加衔接子标签和索引标记的文库汇集到单个测序运行中。当使用索引标记的引物组时，该能力可以被用于比较研究。在一些实施方案中，将来自超过一个样品来源的扩增子在高通量测序之前汇集。在一些实施方案中，在测序之前汇集来自多达48个单独来源的扩增子文库。

在一些实施方案中，通过使用专门的融合引物(含有衔接子序列)和捕获珠粒对靶区段进行乳液基克隆扩增来制备测序模板(扩增子)。将单个衔接子结合的片段附接到珠粒的表面，并且在珠粒/片段组分周围形成含有必需的扩增试剂的油乳液。用数百万个单链片段平行扩增数百万个珠粒，产生了准备用于测序仪的文库。

另外或可替代地，在一些实施方案中，构建加衔接子标签(和任选地，索引标记)的扩增子文库的扩增子通过聚合酶链反应(PCR)产生。在一些实施方案中，扩增子文库使用多重PCR方法产生，诸如美国专利号8,092,996中所披露的多重PCR方法，所述专利以全文引用的方式并入本文中。

桥式PCR是产生文库后体外克隆扩增以准备测序的又另一种方法。该方法是在限定的物理区域诸如固体表面例如悬浮的珠粒中克隆扩增单个靶分子即文库成员，或在载玻片上克隆扩增簇的手段。在该方法中，使用附接于固体表面的引物扩增片段，形成“DNA集落”或“DNA簇”。该方法被用于Illumina,Inc.(San Diego,Calif.)制造的一些基因组分析测序仪中。

另外或可替代地，使用诱饵组富集多个扩增子，所述诱饵组包含与多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列。在一些实施方案中，诱饵组的核酸序列是RNA诱饵、DNA诱饵或其组合。

在产生扩增子文库之后，使用高通量大规模平行测序(即下一代测序)对扩增子进行测序。用于进行高通量，大规模平行测序的方法是本领域已知的。在某些实施方案中，高通量大规模平行测序是使用焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、边合成边测序、边连接边测序或SMRT^TM测序来进行的。

囊性纤维化的治疗

本文公开了用于确定患者是否将受益于囊性纤维化的一种或多种治疗的方法。

囊性纤维化的治疗的例子是本领域熟知的，并且包括控制患者系统中感染性微生物组的疗法诸如用抗生素或抗炎药物治疗、胸部物理疗法(CPT)、气道清除技术(ACT)和药物、营养疗法、器官移植(例如肺替代手术)等。

可以使用合适的抗生素或抗生素组合来治疗与囊性纤维化相关的感染。可用于治疗囊性纤维化的抗生素类别包括青霉素，诸如青霉素和阿莫西林；头孢菌素，诸如头孢氨苄(cephalexin)(Keflex)；大环内酯，诸如红霉素(erythromycin)(E-Mycin)、克拉霉素(clarithromycin)(Biaxin)和阿奇霉素(azithromycin)(Zithromax)；氟喹诺酮，诸如环丙沙星(ciprofolxacin)(Cipro)、左氧氟沙星(levofloxacin)(Levaquin)和氧氟沙星(ofloxacin)(Floxin)；磺酰胺，诸如复方新诺明(co-trimoxazole)(Bactrim)和甲氧苄啶(trimethoprim)(Proloprim)；四环素，诸如四环素(Sumycin、Panmycin)和强力霉素(doxycycline)(Vibramycin)；氨基糖苷，诸如庆大霉素(gentamicin)(Garamycin)和妥布霉素(tobramycin)(Tobrex)；以及粘菌素。

抗炎药物可以用于减少由囊性纤维化相关感染引起的炎症和疼痛。抗炎药物的类别包括基于类固醇的抗炎剂，诸如安西奈德、二丙酸倍他米松、氯倍他索、氯可托龙、地塞米松、二氟拉松、度他雄胺、特戊酸氟美松、氟尼缩松、肤轻松醋酸酯、醋酸氟轻松、氟米龙、丙酸氟替卡松、丙酸氟替卡松、丙酸氟替卡松、氟氢缩松和氢氟噻嗪。非甾体抗炎药(NSAID)包括醋氯芬酸、阿西美辛、阿司匹林、塞来昔布、右旋布洛芬、右旋酮洛芬、双氯芬酸、依托度酸、依托昔布、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、舒林酸、替诺昔康以及噻洛芬酸。

粘液稀释药物可以用于帮助保持患者的肺和气道畅通。粘液稀释药物的类别包括祛痰药、抗组胺药和止咳药，诸如愈创甘油醚(Guaifenesin)、右美沙芬、高渗盐水、阿法链道酶和粘液溶解剂。

胸部物理疗法(CPT)可涉及胸部拍击或叩击。反复敲击患者的胸部和背部可有助于松动和排出肺部的粘液，使患者可以咳出粘液。在一些囊性纤维化治疗方案中，每天对患者进行CPT三至四次。在一些囊性纤维化治疗方案中，患者可以坐着或俯卧，同时进行CPT以促进粘液从肺部排出。可以将某些装置用于CPT以减少患者在所述过程中的不适。示例性装置包括但不限于电动胸部拍击板；使用高频气波迫使粘液离开肺部的充气式治疗背心；患者用来呼气的颤动装置；引起振动以移除粘液；以及产生背压以帮助保持气道开放，同样促进从气道壁排出粘液的正压呼气面罩。

气道清除技术(ACT)可有助于松动粘稠的粘液，以使其可以通过咳嗽或喘气从患者的肺部清除。清除气道可有助于减少肺部感染并改善肺功能。已知并且在临床上进行了各种ACT。例如，咳嗽是一种基本的气道清除技术。咳嗽可以是一种无意识的反射，或者可以以健康、自然的方式控制肺部消除粘液。另外，一些呼吸技术也可以帮助清除患者的气道。这些技术的例子包括强制呼气技术(FET)，其涉及强制呼出几次呼吸，接着放松地呼吸；和主动循环呼吸(ACB)，其涉及深呼吸练习，这供给可以松动粘液并且帮助打开呼吸道。在一些囊性纤维化治疗方案中，将ACT与其他治疗一起使用，包括吸入有助于放松气道壁肌肉，稀释和排出粘液的药物。此类药物可以包括但不限于支气管扩张剂、抗生素和粘液稀释剂。在一些实施方案中，在ACT期间通过喷雾器服用药物。

营养疗法可以单独使用或与其他疗法组合用于治疗囊性纤维化。例如，患者可以接受胰酶，其有助于消化脂肪和蛋白质，以及吸收维生素。可以向患者施用维生素A、D、E和K补充剂以提供额外的脂溶性维生素来源。可以使用进料管诸如胃造口管(G管)来将营养溶液直接供应给患者的胃。可以将可减少胃酸的药物或补充剂与口服胰酶同时施用。可以单独或同时施用其他粘液稀释剂以作为营养疗法的一部分通过纠正消化问题治疗肠梗阻。

有囊性纤维化风险的患者包括以下受试者：其(a)具有囊性纤维化的遗传基础；(b)至少一名父母或至少一名祖父母具有囊性纤维化的遗传基础，诸如是囊性纤维化携带者；(c)多代人中具有囊性纤维化的家族性发病率；或(d)一种或多种症状可能与囊性纤维化有关或由囊性纤维化引起。

囊性纤维化相关症状包括但不限于体内粘液和汗液分泌紊乱，以及呼吸系统、消化系统和生殖系统中的相关并发症和症状。例如，囊性纤维化患者可常规地表现出大量浓稠的有时带血的粘液积聚在肺和气道中。这种粘液的堆积可能导致咳嗽、喘息或呼吸短促，并且还可能使细菌更容易在呼吸系统引起感染。由异常病原体引起的对标准抗生素无反应的感染，诸如由粘液样假单胞菌(mucoid Pseudomonas)引起的肺部感染，可能是囊性纤维化的病征。其他囊性纤维化相关症状可以包括鼻窦感染、支气管炎或肺炎、鼻内生长(即息肉)。

囊性纤维化患者可能表现出胰腺中有粘液阻塞的管。这些阻塞阻止消化酶递送到消化道，从而导致消化和吸收受损。因此，囊性纤维化相关症状还可以包括体重减轻或体重增加失败；持续腹泻或块状、恶臭、油腻的粪便；肠梗阻；过量排气；便秘；胃痛以及不适。从长远来看，这些消化系统并发症可能导致营养不良、胰腺炎、直肠脱垂、肝脏疾病、糖尿病和胆结石。

囊性纤维化相关的病征和症状还可以包括不育症、低骨密度和相关的骨变稀障碍诸如骨质疏松症、极咸的汗水、脱水、体液失衡和继而增加的心率、疲劳、虚弱、低血压、中暑以及被称为杵状变化的指尖和脚趾变宽且变圆。

在一些实施方案中，囊性纤维化的治疗包括以下中的一种或多种：感染控制疗法、胸部物理疗法、气道清除疗法、营养疗法和器官移植。

在任何上述实施方案中，抗囊性纤维化治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：青霉素、阿莫西林、头孢菌素、大环内酯、氟喹诺酮、磺酰胺、四环素、氨基糖苷、粘菌素、安西奈德、二丙酸倍他米松、氯倍他索、氯可托龙、地塞米松、二氟拉松、度他雄胺、特戊酸氟美松、氟尼缩松、肤轻松醋酸酯、醋酸氟轻松、氟米龙、丙酸氟替卡松、丙酸氟替卡松、丙酸氟替卡松、氟氢缩松、氢氟噻嗪、醋氯芬酸、阿西美辛、阿司匹林、塞来昔布、右旋布洛芬、右旋酮洛芬、双氯芬酸、依托度酸、依托昔布、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸、祛痰药、抗组胺药、止咳药、右美沙芬、高渗盐水、阿法链道酶、粘液溶解剂、胰酶、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K以及减少胃酸的补充剂。

试剂盒

本公开文本提供了用于在干生物流体样品中检测样品CFTR核酸中的一种或多种突变的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含皮肤穿刺工具、体积计量吸收微量取样装置、裂解缓冲液和蛋白酶K，其中所述一种或多种突变包含表2中列出的一种或多种突变。裂解缓冲液可以包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。在其他实施方案中，裂解缓冲液包含2.5％-10％十二烷基硫酸钠。

在一些实施方案中，试剂盒还包含用于使干生物流体样品中存在的细胞中的核蛋白复合物变性的一种或多种组分。另外或可替代地，在一些实施方案中，试剂盒还包含用于去除蛋白质污染物、灭活核酸酶活性和/或去除干生物流体样品中存在的生物和/或化学污染物的一种或多种组分。

在一些实施方案中，试剂盒还包含与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交的一个或多个引物对。另外或可替代地，在一些实施方案中，试剂盒还包含与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交的一个或多个诱饵序列。在一些实施方案中，样品CFTR核酸的靶区段对应于CFTR基因的编码区或非编码区，诸如外显子或内含子区。在一些实施方案中，样品CFTR核酸的靶区段对应于CFTR区的调节序列，诸如CFTR启动子区或下游调节区。在一些实施方案中，样品CFTR核酸的靶区段可以包括表2中列出的一种或多种CFTR突变。

特别地，在一些实施方案中，本发明技术的试剂盒包含一个或多个引物对或诱饵序列，所述引物对或诱饵序列与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段选择性杂交并且可用于扩增或捕获样品CFTR核酸的一个或多个靶区段。特别地，在一些实施方案中，样品CFTR核酸的靶区段对应于CFTR基因的编码区或非编码区，诸如外显子或内含子区。在一些实施方案中，样品CFTR核酸的靶区段对应于CFTR区的调节序列，诸如CFTR启动子区或下游调节区。在一些实施方案中，样品CFTR核酸的靶区段可以包括表2中列出的一种或多种CFTR突变。

在一些实施方案中，本发明技术的试剂盒包含与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交的单个引物对或诱饵序列。有用的引物对的例子可以在PCT/US 2014/027870中找到，所述案以全文引用的方式并入本文中。在其他实施方案中，本发明技术的试剂盒包含与样品CFTR核酸的多个靶区段杂交的多个引物对或诱饵序列。在某些实施方案中，本发明技术的试剂盒包含多个引物对或诱饵序列，所述多个引物对或诱饵序列包含与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交的超过一个引物对或超过一个诱饵序列。在一些实施方案中，样品CFTR核酸的靶区段对应于CFTR基因的编码区或非编码区，诸如外显子或内含子区。在一些实施方案中，样品CFTR核酸的靶区段对应于CFTR区的调节序列，诸如CFTR启动子区或下游调节区。因此，本文预期本发明技术的试剂盒可以包含识别并且与样品CFTR核酸的一个或多个靶区段特异性杂交的引物对或诱饵序列。

在一些实施方案中，试剂盒可以包含多个体积计量吸收微量取样装置，每个体积计量吸收微量取样装置在近端具有中空固持器并且在远端具有吸收尖端。吸收尖端包含亲水性聚合物材料，所述材料被配置成在约10秒或更短时间内吸收30微升或更少的血液。试剂盒还包括具有多个隔室的容器。每个隔室被配置成可释放地接合体积计量吸收微量取样装置。容器被配置成防止微量取样装置的吸收尖端与内部放置微量取样装置的隔室邻接。

另外或可替代地，在某些实施方案中，试剂盒可以包括多个进入端口，其中每个端口与单独的隔室相关联。每个端口的位置使得可印刷到端口所关联的隔室内存在的体积计量吸收微型取样装置的固持器上。在某些实施方案中，体积计量吸收微型取样装置的固持器具有沿固持器长度延伸的多个肋，其中肋被配置成使吸收尖端不接触容器的壁。容器优选具有两个被配置成形成管形隔室的部分。容器可以具有第一部分，所述第一部分具有多个细长的安装突起，所述安装突起各自沿着不同隔室的一部分延伸。体积计量吸收微量取样装置的固持器的中空端配合到安装突起上，以将固持器可释放地紧固在安装突起上。

在一些实施方案中，试剂盒还包含缓冲液、具有聚合酶活性的酶、具有聚合酶活性且缺乏5'→3'核酸外切酶活性或5'→3'和3'→5’两种核酸外切酶活性的酶、酶辅因子(诸如镁或锰)、盐、链延伸核苷酸(诸如脱氧核苷三磷酸(dNTP))、经修饰的dNTP、核酸酶抗性dNTP或经标记的dNTP，以上是进行测定或反应诸如在干生物流体样品中扩增和/或检测本文所述的一种或多种遗传性囊性纤维化突变所必需的。

在一个实施方案中，本发明技术的试剂盒还包含阳性对照核酸序列和阴性对照核酸序列，以在实验运行期间确保测定的完整性。试剂盒还可以包含使用说明、用于自动化分析的软件、容器、包装诸如意图用于商业销售的包装等。

试剂盒还可以包含以下中的一种或多种：洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂以及检测构件。通常针对意图使用试剂盒的特定扩增/检测技术对缓冲液和/或试剂进行优化。试剂盒中还可以包括使用这些缓冲液和试剂进行程序中的不同步骤的方案。

本发明技术的试剂盒可以包括用于从干生物流体样品制备核酸的组分，所述核酸用于随后扩增和/或检测样品CFTR核酸中的改变(例如表2中公开的CFTR突变)。可以使用此类样品制备组分从干生物流体样品诸如干血清、干血浆或干全血中产生核酸提取物。在上述方法中使用的测试样品将基于如下因素而变化，诸如测定形式、检测方法的性质以及用作待测试的测试样品的特定细胞或提取物。从样品中提取核酸的方法是本领域熟知的，并且可以容易地修改以获得与所用系统相容的样品。用于从测试样品中提取核酸的自动化样品制备系统可购得，例如Roche Molecular Systems的COBAS AmpliPrep System、Qiagen的BioRobot 9600、Qiagen的BioRobot EZ1、QIAsymphony和Applied Biosystems的PRISM^TM6700样品制备系统。

实施例

实施例1：从使用尖端收集的干血液样品中提取基因组DNA

该实施例证明，本发明技术的方法可用于从使用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品(例如干血液)中提取高产量的基因组DNA。

所述研究共招募了四名人类受试者。从4名供血者中的每一名收集三尖端的血液，以同时测试三种提取方法。通过手指针刺在每个尖端上收集装置上收集固定体积的10μL血液。干燥血液样品之后，然后将尖端收集装置的吸收尖端放置在180μL缓冲液G2(含有800mM盐酸胍；30mM Tris·Cl，pH 8.0；30mM EDTA，pH 8.0；5％Tween20；0.5％Triton X-100的裂解缓冲液)中，并且涡旋15秒。三种提取方法中的每一种的剩余样品处理步骤如下所总结：

然后使用dsDNA HS测定试剂盒定量提取的基因组DNA，所述试剂盒使用仅在dsDNA存在下发荧光的dsDNA嵌入染料。因此，使用dsDNA HS测定试剂盒定量dsDNA不受可能影响其他定量方法的RNA、蛋白质、盐或其他污染物的影响。表1证明了从每个尖端获得的DNA产量根据提取方法而改变。确定提取方法3(将尖端与缓冲液G2在90℃下孵育15分钟，并且与蛋白酶K一起在56℃下孵育过夜)产生最高数量的DNA。

这些结果证明，本发明技术的方法可用于从使用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品(例如干血液)中提取高产量的基因组DNA。

实施例2：使用单尖端和双尖端提取的DNA产量的比较。

对从含有来自个体患者的干血的单尖端(单尖端提取)洗脱的裂解物进行DNA提取。对于双尖端提取，将从含有来自同一患者的干血液的两个单独尖端洗脱的裂解物组合在一起。将尖端与缓冲液G2一起在90℃下孵育15分钟，并且与蛋白酶K在56℃下孵育过夜。

根据制造商的说明，在自动提取平台上使用DNA Investigator试剂盒进行随后的核酸提取。比较来自单尖端和双尖端提取的DNA产量(参见图1)。

这些结果证明双尖端提取使DNA产量平均增加了2倍(图1)。这些结果证明，本发明技术的方法可用于从使用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品(例如干血液)中提取高产量的基因组DNA。

实施例3：使用从尖端中提取的干血液样品进行的囊性纤维化扩展筛查

从自7个供体获得的干血液样本中提取基因组DNA。使用用单尖端收集的干燥血液样本进行每次提取，即如实施例2中所述的单尖端提取。然后在囊性纤维化扩展组上测试提取的DNA，所述测试组评估了对应于CFTR基因的38个扩增子。囊性纤维化扩展组涵盖了与囊性纤维化相关的162种CFTR突变(表2)。在MiSeq测序仪上进行下一代测序。用于评估覆盖区域成功测序的质量度量标准包括每个覆盖热点最少有30个读取片段。

结果：如图2所示，对于覆盖热点区中的100％，所有7个样品都通过了QC标准。

这些结果证明，本发明技术的方法能够在用体积计量吸收微量取样装置(例如尖端)收集的小体积干生物流体样品中检测样品CFTR核酸中的至少一种突变。

表2.在囊性纤维化扩展筛查中检测到的CF突变

(续表)

等效内容

本发明技术并非受限于本申请中描述的具体实施方案，意图将所述实施方案作为本发明技术单独方面的单一说明。如本领域技术人员显而易见，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行多种修改和改变。本领域技术人员根据先前描述将显而易见除了本文所列举的方法和装置以外在本发明技术范围内的功能上等效的方法和装置。所述修改和改变意图属于本发明技术的范围内。应理解，本发明技术不受限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，而是当然可以改变的。还应理解，本文所用术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不意图具有限制性。

术语“包含”、“包括”、“含有”等应以可扩展且无限制的方式来理解。另外，本文采用的术语和表达已经被用作具有描述性而没有限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时并非意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，而是认为在要求保护的公开文本的范围内可以进行各种修改。

另外，当本公开文本的特征或方面按马库什组(Markush group)来描述时，本领域技术人员将认为，本公开文本也从而按马库什组的任何单独成员或成员子组来描述。

本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别在提供书面描述方面，本文中公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围以及其子范围的组合。任何所列范围都可以被容易地认为是充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文中论述的每个范围都可以被容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且指随后可以被分解为上述子范围的范围。最后，本领域技术人员将理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组等等。

本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都以全文引用的方式并入，包括所有图式和表格，并入程度使其不会与本说明书的明确教示不一致。

Claims

1.一种用于检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的方法，其包括

(a)从自微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取所述样品CFTR核酸；

(b)产生包含对应于所述样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库；以及

(c)使用高通量大规模平行测序检测所述文库中扩增子中的至少一个中的至少一种突变。

2.权利要求1的方法，其中所述干生物流体样品是干血浆、干血清或干全血。

3.权利要求1或2的方法，其中所述微量取样装置的吸收尖端上的干生物流体样品是通过手指针刺从患者收集的。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述干生物流体样品的洗脱是通过使所述微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来进行的。

5.权利要求4的方法，其中所述裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。

6.权利要求4或5的方法，其中所述干生物流体样品的洗脱是通过使所述微量取样装置的吸收尖端与所述裂解缓冲液在90℃下接触长达15分钟来进行的。

7.权利要求4-6中任一项的方法，其中所述干生物流体样品的洗脱是通过使所述微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达1小时来进行的。

8.权利要求4-7中任一项的方法，其中所述干生物流体样品的洗脱是通过使所述微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达16-18小时来进行的。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述微量取样装置是体积计量吸收微量取样装置。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述微量取样装置是尖端。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述微量取样装置的样品体积不超过10-20μL。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中从所述微量取样装置的吸收尖端洗脱不超过400ng基因组DNA。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中从所述微量取样装置的吸收尖端洗脱约100ng至约400ng基因组DNA。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述至少一种突变选自碱基变化、基因缺失和基因重复。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述至少一种突变选自表2中列出的突变。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述至少一种突变与囊性纤维化相关。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述干生物流体样品是从表现出囊性纤维化症状或具有囊性纤维化或CFTR突变家族史的个体获得的。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述干生物流体样品是从患有囊性纤维化或具有至少一种CFTR突变的妇产科患者的男性伴侣获得的。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述多个靶区段一起跨越CFTR基因的所有编码区和非编码区。

20.权利要求19的方法，其中所述多个靶区段还跨越紧邻所述CFTR基因的第一外显子上游的启动子区的约1000个核苷酸。

21.权利要求20的方法，其中所述多个靶区段还跨越紧邻CFTR基因下游的约200至350个核苷酸。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述高通量大规模平行测序是使用焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、边合成边测序、边连接边测序或SMRT^TM测序来进行的。

23.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述高通量大规模平行测序涉及读取深度法。

24.一种用于检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的方法，其包括产生包含对应于所述样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库，其中从用裂解缓冲液和蛋白酶K从微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取所述样品CFTR核酸。

25.权利要求24的方法，其中使用高通量大规模平行测序检测所述样品CFTR核酸中的至少一种突变。

26.权利要求1-25中任一项的方法，其中与参考CFTR核苷酸序列的相应区域相比，所述样品CFTR核酸的多个靶区段包含至少一种改变。

27.权利要求26的方法，其中所述参考CFTR核苷酸序列包含野生型CFTR核酸序列。

28.一种用于选择表现出囊性纤维化症状的患者或有囊性纤维化风险的患者以用抗囊性纤维化治疗剂治疗的方法，其包括

(a)从微量取样装置的吸收尖端洗脱所述患者的干生物流体样品，其中所述干生物流体样品包含样品CFTR核酸；

(b)产生包含对应于所述样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库；

(c)使用高通量大规模平行测序检测所述文库中扩增子中的至少一个中的至少一种突变；以及

(d)选择所述患者来用抗囊性纤维化治疗剂治疗。

29.权利要求28的方法，其中所述抗囊性纤维化治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：青霉素、阿莫西林、头孢菌素、大环内酯、氟喹诺酮、磺酰胺、四环素、氨基糖苷、粘菌素、安西奈德、二丙酸倍他米松、氯倍他索、氯可托龙、地塞米松、二氟拉松、度他雄胺、特戊酸氟美松、氟尼缩松、肤轻松醋酸酯、醋酸氟轻松、氟米龙、丙酸氟替卡松、丙酸氟替卡松、丙酸氟替卡松、氟氢缩松、氢氟噻嗪、醋氯芬酸、阿西美辛、阿司匹林、塞来昔布、右旋布洛芬、右旋酮洛芬、双氯芬酸、依托度酸、依托昔布、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸、祛痰药、抗组胺药、止咳药、右美沙芬、高渗盐水、阿法链道酶、粘液溶解剂、胰酶、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K以及减少胃酸的补充剂。

30.一种用于在干生物流体样品中检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的试剂盒，其包含皮肤穿刺工具、体积计量吸收微量取样装置、裂解缓冲液和蛋白酶K，其中所述至少一种突变包含表2中列出的CFTR突变中的一种或多种。

31.权利要求30的试剂盒，其还包含与所述样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交的一个或多个引物对。

32.权利要求30或31的试剂盒，其还包含与所述样品CFTR核酸的一个或多个靶区段杂交的一个或多个诱饵序列。

33.权利要求30-32中任一项的试剂盒，其中所述体积计量吸收微量取样装置是尖端。

34.权利要求30-33中任一项的试剂盒，其中所述裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。