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CN110167967A - 针对抗pd-l1抗体的独特型抗体及其用途 - Google Patents

针对抗pd-l1抗体的独特型抗体及其用途 Download PDF

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CN110167967A CN201880006331.2A CN201880006331A CN110167967A CN 110167967 A CN110167967 A CN 110167967A CN 201880006331 A CN201880006331 A CN 201880006331A CN 110167967 A CN110167967 A CN 110167967A
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Abstract

本发明提供针对抗PD‑L1抗体的抗独特型抗体及其使用方法。

Description

针对抗PD-L1抗体的独特型抗体及其用途
相关申请
此申请要求2017年1月18日提交的美国专利申请No.62/447,886,和2017年1月31日提交的美国专利申请No.62/452,934的优先权,通过援引将其每一篇的公开内容完整收入本文。
ASCII文本文件上的序列表的提交
通过援引将ASCII文本文件上的下述提交的内容完整收入本文:计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称:146392038540SEQLIST.txt,记录日期:2018年1月16日,大小:40KB)。
发明领域
本发明涉及抗PD-L1独特型抗体及其使用方法。
发明背景
已经发现T细胞功能障碍或无反应性与诱导的和持久的抑制性受体,编程性死亡多肽1(PD-1)的表达并行发生。结果是,靶向PD-1和经由与PD-1的相互作用来发信号的其它分子,诸如编程性死亡配体1(PD-L1)的治疗剂是一个有强烈兴趣的领域。抑制PD-L1信号传导已经证明是一种增强T细胞免疫来治疗癌症(例如肿瘤免疫)的手段。已经开发使用抗PD-1或抗PD-L1抗体的疗法并用于治疗不同类型的癌症。参见例如美国专利No.8,217,149。
本领域需要检测生物学样品和/或临床样品中的针对PD-L1的治疗性单克隆抗体,而不还检测针对或不针对PD-L1的其它抗体(例如内源免疫球蛋白)。本发明提供特异性检测某些抗PD-L1抗体的抗独特型抗体。这些抗体是有用的,例如在药动学(PK)和药效学研究中和用于量化和监测患者中的治疗性抗PD-L1抗体。
发明概述
在一个方面,本发明提供一种特异性结合抗PD-L1抗体的分离的抗独特型抗体。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含:
(a)轻链可变区,其包含:
(i)包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:1)的HVR-L1；
(ii)包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:2)的HVR-L2；和
(iii)包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:3)的HVR-L3；和
(b)重链可变区,其包含:
(i)包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:4)的HVR-H1；
(ii)包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的HVR-H2；和
(iii)包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:6)的HVR-H3。
在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区,和/或包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链,和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含重链可变区(VH),其包含包含SEQID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQID NO:31的氨基酸序列的HVR-H3；和/或轻链可变区(VL),其包含包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H3；和/或VL,其包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQID NO:15的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H3；和/或VL,其包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQID NO:15的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:54的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:53的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:60的序列的重链和/或包含SEQ ID NO:59的序列的轻链。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H3；和/或VL,其包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQID NO:18的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H3；和/或VL,其包含包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQID NO:21的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H3；和/或VL,其包含包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQID NO:21的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:56的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:55的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:62的序列的重链和/或包含SEQ ID NO:61的序列的轻链。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-H3；和/或VL,其包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQID NO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H3；和/或VL,其包含包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQID NO:27的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H3；和/或VL,其包含包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQID NO:27的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:58的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:57的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:64的序列的重链和/或包含SEQ ID NO:63的序列的轻链。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体特异性结合该抗PD-L1抗体的至少一种HVR。
在一些实施方案中,该分离的抗独特型抗体是与异源模块或可检测模块缀合的。在一些实施方案中,该可检测模块是标记物或生物素。
在另一个方面,本发明提供一种包含如本文中提供的抗独特型抗体的组合物。
在另一个方面,本发明提供一种包含如本文中提供的组合物的试剂盒。
在另一个方面,本发明提供一种编码特异性结合抗PD-L1抗体的抗独特型抗体的分离的核酸,其中该抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:35)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列YISSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:36)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列LVYYDYDDAMDY(SEQ ID NO:34)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列SASSSVSYMH；(SEQ ID NO:14)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:15)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列QQRSSYPPTF(SEQ ID NO:16)。
在另一个方面,本发明提供一种编码特异性结合抗PD-L1抗体的抗独特型抗体的分离的核酸,其中该抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列DYIML(SEQ ID NO:43)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列NINPYYGSTSYNLKFKG(SEQ ID NO:44)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列WGGNYEGWFAY(SEQ ID NO:42)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列HASQGISSNIG；(SEQ ID NO:20)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列HGTNLED(SEQ ID NO:21)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列VQYAQFPLTF(SEQ ID NO:22)。
在另一个方面,本发明提供一种编码特异性结合抗PD-L1抗体的抗独特型抗体的分离的核酸,其中该抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:51)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列YISSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:52)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列TIYYGYDDVMDY(SEQ ID NO:50)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列SASSSVSYMH；(SEQ ID NO:26)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列QQRSGYPPTF(SEQ ID NO:28)。
在另一个方面,本发明提供一种编码如本文中提供的抗独特型抗体的分离的核酸。
在另一个方面,本发明提供一种包含如本文中提供的核酸的载体。
在另一个方面,本发明提供一种包含如本文中提供的载体的宿主细胞。
在一些实施方案中,该宿主细胞是真核的。在一些实施方案中,该宿主细胞是哺乳动物的。在一些实施方案中,该宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一些实施方案中,该宿主细胞是原核的。在一些实施方案中,该宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个方面,本发明提供一种用于生成抗独特型抗体的工艺,其包含在适合于编码该抗独特型抗体的载体表达的条件下培养如本文中提供的宿主细胞和回收该抗独特型抗体。
在另一个方面,本发明提供一种用于检测生物学样品中的抗PD-L1抗体的方法,其包含:
(a)使该生物学样品接触捕捉剂,其中该捕捉剂是包含如本文中提供的抗独特型抗体的组合物,由此形成免疫复合物；
(b)使来自(a)的免疫复合物接触结合该抗PD-L1抗体的可检测抗体；和
(c)通过检测该可检测抗体来测量结合至该组合物的该抗PD-L1抗体的水平。
在另一个方面,本发明提供一种用于检测生物学样品中的抗PD-L1抗体的方法,其包含:
(a)使该生物学样品接触捕捉剂,其中该捕捉剂是结合样品中存在的抗PD-L1抗体的如本文中提供的抗独特型抗体,由此形成免疫复合物；
(b)使来自(a)的免疫复合物接触结合该抗PD-L1抗体的可检测抗体；和
(c)通过检测该可检测抗体来测量结合至该抗独特型抗体的该抗PD-L1抗体的水平。
在一些实施方案中,该抗独特型抗体是固定化至固体支持物的且该方法进一步包含将该生物学样品与结合至该抗PD-L1抗体的该固定化的抗独特型抗体分开的步骤。
在一些实施方案中,该固定化的抗独特型抗体是与生物素缀合且结合至链霉亲合素包被的微量滴定板的。
在一些实施方案中,该可检测抗体是结合人或人源化抗体的来自非人物种的抗体。
在一些实施方案中,该可检测抗体是直接可检测的,或是与辣根过氧化物酶缀合的,或是通过荧光计量或热量计量试剂来检测的。
在一些实施方案中,该生物学样品是自人受试者分离的。
在一些实施方案中,该人受试者是已经用抗PD-L1抗体治疗的,该抗PD-L1抗体包含:
(a)轻链可变区,其包含:
(i)包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:1)的HVR-L1；
(ii)包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:2)的HVR-L2；
(iii)包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:3)的HVR-L3；和
(b)重链可变区,其包含:
(i)包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:4)的HVR-H1；
(ii)包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的HVR-H2；
(iii)包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:6)的HVR-H3。
在一些实施方案中,该方法进一步包含使用标准曲线与已知水平的该抗PD-L1抗体相比来测定该抗PD-L1抗体的水平。
在一些实施方案中,该生物学样品是血液,血浆或血清。
在另一个方面,本发明提供一种用于特异性检测生物学样品中的抗PD-L1抗体的免疫测定法试剂盒,其包含:
(a)如本文中提供的抗独特型抗体或如本文中提供的组合物；
(b)结合该抗PD-L1抗体的可检测抗体；和
(c)关于检测所述抗PD-L1抗体的用法说明书。在一些实施方案中,该试剂盒在用于检测该抗PD-L1抗体的免疫测定法中是有用的。
在另一个方面,本发明提供一种用于检测生物学样品中的抗PD-L1抗体的方法,其包含:
(a)使该生物学样品接触如本文中提供的抗独特型抗体或如本文中提供的组合物,在容许该抗独特型抗体结合该抗PD-L1抗体以形成复合物的条件下进行；
(b)通过免疫固定电泳来分析该样品以比较已接触该抗独特型抗体的样品与未接触该抗独特型抗体的样品；
(c)检测该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在；其中已接触该抗独特型抗体的样品和未接触该抗独特型抗体的样品之间迁移的差异指示该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在。
在另一个方面,本发明提供一种用于检测生物学样品中的M蛋白的方法,其包含:
(a)使该生物学样品接触如本文中提供的抗独特型抗体或如本文中提供的组合物,在容许该抗独特型抗体结合该抗PDL1抗体以形成复合物的条件下进行；
(b)通过免疫固定电泳来分析该样品以比较已接触该抗独特型抗体的样品与未接触该抗独特型抗体的样品；和
(c)检测该生物学样品中M蛋白的存在。在一些实施方案中,步骤(b)导致该抗PD-L1抗体和该抗独特型抗体的复合物与该M蛋白分开。在一些实施方案中,在步骤(c)之前,该方法进一步包含通过测定它的迁移是否受到添加该抗独特型抗体影响来测定条带是否是M蛋白的步骤。在一些实施方案中,该生物学样品是血液,尿液或血清。
在另一个方面,本发明提供一种用于监测抗PD-L1抗体治疗在受试者中的有效性的方法,其包含:
(a)使生物学样品接触如本文中提供的抗独特型抗体或如本文中提供的组合物,在容许该抗独特型抗体结合该抗PD-L1抗体以形成复合物的条件下进行；其中该生物学样品来自该受试者,且其中该受试者具有多发性骨髓瘤且已经用该抗PD-L1抗体治疗；
(b)通过免疫固定电泳来分析该样品以比较已接触该抗独特型抗体的样品与未接触该抗独特型抗体的样品；
(c)检测该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在,其中已接触该抗独特型抗体的样品和未接触该抗独特型抗体的样品之间迁移的差异指示该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在；和
(d)检测该生物学样品中M蛋白的水平；其中该生物学样品中该M蛋白的水平指示该抗PD-L1抗体治疗的有效性。在一些实施方案中,步骤(b)导致该抗PD-L1抗体和该抗独特型抗体的复合物与该M蛋白分开。在一些实施方案中,在步骤(d)之前,该方法进一步包含通过测定它的迁移是否受到添加该抗独特型抗体影响来测定条带是否是M蛋白的步骤。在一些实施方案中,该生物学样品是血液,尿液,或血清。
要理解的是,可以组合本文中描述的各种实施方案的一个,一些,或所有特性以形成本发明的其它实施方案。
附图简述
图1显示抗独特型抗体105D11(SEQ ID NO:54),43B5(SEQ ID NO:56)和48C1(SEQID NO:58)的重链可变区(VH)的氨基酸序列比对。标示了重链接触CDR,Chothia CDR,和Kabat CDR序列。
图2显示抗独特型抗体105D11(SEQ ID NO:53),43B5(SEQ ID NO:55)和48C1(SEQID NO:57)的轻链可变区(VL)的氨基酸序列比对。标示了轻链接触CDR,Chothia CDR,和Kabat CDR序列。
图3显示SPR为抗体105D11结合抗PDL1抗体Fab和抗体YW167B.43(框架对照Fab)生成的动力学(ka,kd,和KD)。
图4显示SPR为抗体43B5结合抗PDL1抗体Fab和抗体YW167B.43(框架对照Fab)生成的动力学(ka,kd,和KD)。
图5显示SPR为抗体48C1结合抗PDL1抗体Fab和抗体YW167B.43(框架对照Fab)生成的动力学(ka,kd,和KD)。
图6显示在Sebia免疫固定电泳(IFE)测定法上对抗独特型抗体的筛选。
图7显示在IFE测定法上以高分辨率检测的多发性骨髓瘤患者的血清(小图1,道A和道K)中的IgA/IgκM蛋白掺入物。将患者‘MM5’血清在如下条件中预温育2小时:以1500μg/ml单独掺入的阿特珠单抗抗独特型小鼠单抗克隆48C1(小图2),以1500μg/ml单独掺入的阿特珠单抗(小图3,道G和道K),和各以1500μg/ml一起添加的阿特珠单抗+阿特珠单抗抗独特型克隆48C1(小图4)。
图8显示阿特珠单抗血清浓度对抗独特型抗体在IFE测定法中改变阿特珠单抗的迁移率的能力的影响。
发明详述
I.定义
除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域普通技术人员普遍理解相同的含义。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)和March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)给本领域技术人员提供本申请中使用的许多术语的一般指导。通过援引完整收录本文中引用的所有参考文献,包括专利申请和出版物。
为了解读此说明书的目的,会应用下面的定义且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。要理解的是,本文中使用的术语学仅仅用于描述特定实施方案的目的,并非意图是限制性的。如果下文所列任何定义与本文中通过援引收录的任何文件冲突,以下文所列定义为准。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合位点和它的结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对它的配偶Y的亲和力一般可以通过解离常数(KD)来代表。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量,包括本文中描述的那些。本文中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性实施方案。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指除完整抗体以外,包含完整抗体中结合完整抗体所结合的抗原的部分的分子。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体生成两个相同的抗原结合片段,称作“Fab”片段,每个具有单个抗原结合位点,和残留的“Fc”片段,其名称反映它容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。
如本文中使用的,术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的变体抗体,例如含有天然发生突变的或在单克隆抗体制剂的生产期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比,单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此,修饰语“单克隆”指示抗体是自实质性同质的抗体群体获得的特征,而且不应解读为要求通过任何特定方法生成抗体。例如,要依照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术生成,包括但不限于杂交瘤方法,重组DNA方法,噬菌体展示方法,和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指没有与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以在药学配制剂中存在。
“天然抗体”指具有不同结构的天然发生免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条同一的轻链和两条同一的重链构成。自N至C端,每条重链具有一个可变区(VH),也称作可变重域或重链可变域,继以三个恒定域(CH1,CH2,和CH3)。类似地,自N至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),也称作可变轻域或轻链可变域,继以一个恒定轻(CL)域。基于它的恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可以指派至两种型中的一种,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
抗体的“类”指它的重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有五大类:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且这些中的数种可进一步分成亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ,。
术语“抗PD-L1抗体”,“抗PD-L1”,“PD-L1抗体”或“结合PD-L1的抗体”指能够以足够亲和力结合PD-L1,使得抗体作为靶向PD-L1中的诊断和/或治疗剂是有用的抗体。在一个实施方案中,抗PD-L1抗体结合无关的非PD-L1蛋白的程度小于抗体对PD-L1的结合的约10％,如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中,结合PD-L1的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。在某些实施方案中,抗PD-L1抗体结合在来自不同物种的PD-L1间保守的PD-L1表位。
“人抗体”是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义具体排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“嵌合”抗体指如下抗体,其中重和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种,而重和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常发生的氨基酸残基的框架。一般地,人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。一般地,序列亚组是如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中,对于VL,亚组是如Kabat等人,见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中,对于VH,亚组是如Kabat等人,见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含实质上整个如下的至少一种,和典型地两种可变域,其中所有或实质上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些,而且所有或实质上所有FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freemanand Co.,page 91(2007))。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。而且,可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature352:624-628(1991)。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。一般地,天然四链抗体包含六个HVR；VH中的三个(H1,H2,H3),和VL中的三个(L1,L2,L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高序列变异性和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环发生于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1,CDR-L2,CDR-L3,CDR-H1,CDR-H2,和CDR-H3)发生于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35B(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1以外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”,或“SDR”,它们是接触抗原的残基。CDR内称作缩短的CDR,或a-CDR的区域内含有SDR。例示性a-CDR(a-CDR-L1,a-CDR-L2,a-CDR-L3,a-CDR-H1,a-CDR-H2,和a-CDR-H3)发生于氨基酸残基31-34(L1),50-55(L2),89-96(L3),31-35B(H1),50-58(H2),和95-102(H3)(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示,HVR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等人,见上文编号。
术语“检测”以最广义使用,包括定性和定量测量靶分子二者。在一个方面,使用本文中描述的检测方法来鉴定生物学样品中感兴趣抗体的仅仅存在。在另一个方面,使用该方法来测试样品中的感兴趣抗体是否以可检测水平存在。在还有另一个方面,可以使用该方法来量化样品中感兴趣抗体的量并进一步比较来自不同样品的抗体水平。
术语“生物学样品”指可能含有感兴趣抗体的任何生物学物质。样品可以是生物学流体,诸如全血或全血成分,包括红血细胞,白血细胞,血小板,血清和血浆,腹水,玻璃体液,淋巴液,滑液,卵泡液,精液,羊水,乳液,唾液,痰液,泪液,汗液,粘液,脑脊液,和可能含有感兴趣抗体的身体的其它组分。在各种实施方案中,样品是来自任何动物的身体样品。在一些实施方案中,样品来自哺乳动物。在一些实施方案中,样品来自人受试者。在一些实施方案中,生物学样品来自临床患者或用一种或多种治疗性抗PD-L1抗体治疗的患者。在某些实施方案中,生物学样品是血清或血浆。在某些实施方案中,生物学样品是来自临床患者的血清。
术语“捕捉试剂”指结合感兴趣靶物(例如抗体)且能够结合和捕捉生物学样品中的感兴趣靶物(例如抗体),使得在合适条件下能将捕捉试剂和感兴趣靶物(例如抗体)的复合物与样品的剩余部分分开的试剂(例如抗体)或此类试剂的混合物。例如,捕捉试剂可以是结合感兴趣抗体的独特型且能够结合和捕捉生物学样品中的感兴趣抗体,使得在合适条件下能将捕捉试剂和感兴趣抗体的复合物与样品的剩余部分分开的抗独特型抗体或此类抗体的混合物。在某些实施方案中,捕捉试剂是固定化的或可固定化的。
如本文中使用的,“抗独特型抗体”是结合关联抗体(在这种情况中是感兴趣抗体)的VH和/或VL域的抗体。典型地,此类抗独特型抗体通过用感兴趣抗体免疫哺乳动物(诸如小鼠)并生成杂交瘤文库并自衍生自杂交瘤的抗体小组选择那些在测定法中产生清楚的信号的抗体制备,无论是对于捕捉试剂或是可检测抗体。在某些实施方案中,抗独特型抗体是固定化的或可固定化的。在一些实施方案中,抗独特型抗体是单克隆抗体且可以是例如啮齿动物抗体,诸如(小)鼠或大鼠抗体。
如本文中使用的,“抗PD-L1独特型抗体”是以足够特异性和亲和力特异性结合抗PD-L1单克隆抗体,从而在检测抗PD-L1抗体中有用的抗体。
术语“可检测抗体”指结合感兴趣抗体且能够经由通过检测手段放大的标记物直接检测,或经由例如经标记的另一种抗体间接检测的抗体。在一些实施方案中,可检测抗体是结合人抗体的来自非人物种的抗体。在一些实施方案中,可检测抗体是结合感兴趣抗体的独特型的抗独特型抗体或此类抗体的混合物。对于直接标记,典型地将抗体与通过一些手段可检测的模块缀合。在一些实施方案中,可检测抗体是与辣根过氧化物酶缀合的。
术语“检测手段”指用于经由然后在本文中的测定法中读出的信号报告检测可检测抗体的存在的模块或技术。它包括放大固定化的标记物(诸如捕捉到微量滴定板上的标记物)的试剂。
“Fab”片段含有重和轻链可变域且还含有轻链恒定域和重链第一恒定域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1域的羧基末端添加少数残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’的名称。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的,它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链中含有恒定区的至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226,或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
“框架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列一般以下面的顺序在VH(或VL)中出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经引入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代可以不是在核酸内容上与亲本细胞完全同一的,而且可以含有突变。本文中包括具有与在最初转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长动物(例如人和非人灵长动物,诸如猴),家兔,和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中,个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与它的天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95％或99％纯度,如通过例如电泳(例如SDS-PAGE,等电聚焦(IEF),毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述,参见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与它的天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括最初含有该核酸分子的细胞中含有的核酸分子,但是该核酸分子存在于染色体外或不同于它的天然染色体位置的染色体位置处。
“编码抗独特型抗体的分离的核酸”指编码抗独特型抗体的重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子,包括单一载体或分开载体中的此类核酸分子,和宿主细胞中的一个或多个位置处存在的此类核酸分子。
术语“包装插页”用于指治疗性产品的商业包装中通常包括的用法说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。
就参照多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不将任何保守替代作为序列同一性的一部分来考虑,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。可以以本领域技术内的多种方式来实现出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局,Washington D.C.,20559,在那里它以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序是公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,California可得的,或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成供在UNIX操作系统上使用,包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中,如下计算给定氨基酸序列A对,与,或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可以表述为给定氨基酸序列A具有或包含对,与,或针对给定氨基酸序列B的某％氨基酸序列同一性):
100x分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中,A对B的％氨基酸序列同一性会不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体描述,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
“治疗有效量”至少是实现可测量的改善或预防特定病症需要的最小浓度。治疗有效量在本文中可以根据诸如患者的疾病状态,年龄,性别,和重量,和抗体在个体中引发期望响应的能力等因素而变化。治疗有效量还是其中抗体的治疗有益效果胜过任何有毒或有害效果的量。
抗PD-L1抗体的“签名肽”指唯独在一种抗体同种型中存在的蛋白水解肽(例如胰蛋白酶肽)。
术语“药学配制剂”或“药学组合物”指如下的制剂,其处于允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的形式,而且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的另外的成分。
“药学可接受载剂”或“有效量”指药学配制剂中,除了活性组分以外,对受试者无毒性的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂,或防腐剂。
如本文中使用的,“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗的个体的天然过程的临床干预,而且可以为了预防或在临床病理过程期间实施。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,减轻疾病的任何直接或间接病理后果,降低疾病进展的速率,改善或缓解疾病状态,和消退或改善预后。在一些实施方案中,使用本发明的抗体来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。
如本文中使用的,术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入它已经导入其中的宿主细胞的基因组的载体。某些载体能够指导它们与之可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
如本文中使用的,单数形式“一个”,“一种”,和“该”包括复数提及物,除非另有指示。
如本文中使用的,术语“约”指这个技术领域技术人员容易知道的相应数值的通常误差范围。在本文中提到“约”数值或参数包括(和描述)针对该数值或参数本身的实施方案。
理解的是,本文中描述的发明的方面和实施方案包括“包含”,“由……组成”,和“本质上由……组成”方面和实施方案。
II.组合物和方法
在一个方面,本发明提供特异性结合抗PD-L1单克隆抗体的抗独特型抗体。本发明的抗体例如对于检测和/或量化生物学样品中,例如临床样品中的抗PD-L1是有用的。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体是单克隆,嵌合,人源化或人的。
A.抗PD-L1抗体
i.例示性抗PD-L1抗体
在某些实施方案中,抗独特型抗体结合抗PD-L1抗体,该抗PD-L1抗体包含(a)轻链可变区,其包含包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:1)的HVR-L1,包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:2)的HVR-L2,和包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:3)的HVR-L3；和(b)重链可变区,其包含包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:4)的HVR-H1,包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的HVR-H2和包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ IDNO:6)的HVR-H3。
在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区,和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含与具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性的轻链可变区,和/或与具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％同一性的重链可变区。
在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链,和包含的SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含与具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性的轻链,和与具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％同一性的重链。
在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体是阿特珠单抗(atezolizumab)
在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗的HVR。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗的重链可变区和/或轻链可变区。
在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体是单克隆,嵌合或人源化的。
抗PD-L1抗体轻链可变区氨基酸序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:7)
抗PD-L1抗体重链可变区氨基酸序列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO:8)
抗PD-L1抗体轻链氨基酸序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:9)
抗PD-L1抗体重链氨基酸序列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:10)
B.抗独特型抗体
i.例示性抗独特型抗体
在一个方面,本发明提供特异性结合本文中描述的抗PD-L1抗体的抗独特型抗体。在一些实施方案中,该抗独特型抗体结合抗PD-L1抗体,其中该抗PD-L1抗体包含(a)轻链可变区,其包含包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:1)的HVR-L1,包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:2)的HVR-L2,和包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:3)的HVR-L3；和(b)重链可变区,其包含包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:4)的HVR-H1,包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的HVR-H2,和包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQID NO:6)的HVR-H3。在一些实施方案中,该抗独特型抗体特异性结合该抗PD-L1抗体的至少一种,至少两种,至少三种,至少四种,至少五种或六种HVR。
在一些实施方案中,该抗独特型抗体包含如图1和2中显示的抗体105D11的一种,两种,三种,四种,五种,或六种HVR(Kabat)。在一些实施方案中,该抗独特型抗体包含如图1和2中显示的抗体105D11的VH和/或VL。
在一些实施方案中,该抗独特型抗体包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中,与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代),插入,或删除,但是包含该VH序列的抗PD-L1独特型抗体保留与包含参照序列的抗独特型抗体结合相同抗PD-L1抗体的能力。在某些实施方案中,在SEQ IDNO:54中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中,替代,插入,或删除在HVR以外的区域中发生(即在FR中)。任选地,该抗PD-L1独特型抗体包含SEQ ID NO:54的VH序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中,该VH包含一种,两种或三种选自下述的HVR:(a)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H1,(b)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-H2,和(c)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H3的。
在另一个方面,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中,与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代),插入,或删除,但是包含该VL序列的抗PD-L1独特型抗体保留与包含参照序列的抗独特型抗体结合相同抗PD-L1抗体的能力。在某些实施方案中,在SEQ ID NO:53中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中,该替代,插入,或删除在HVR以外的区域中发生(即在FR中)。任选地,该抗PD-L1独特型抗体包含SEQ ID NO:53的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中,该VL包含一种,两种或三种选自下述的HVR:(a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH,和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中,该抗体包含SEQID NO:54的VH序列和SEQ ID NO:53的VL序列,包括那些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面,该抗独特型抗体包含如图1和2中显示的抗体43B5的一种,两种,三种,四种,五种,或六种HVR(例如Kabat)。在一些实施方案中,该抗独特型抗体包含如图1和2中显示的抗体43B5的VH和/或VL。
在另一个方面,抗PD-L1独特型抗体包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中,与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代),插入,或删除,但是包含该VH序列的抗PD-L1独特型抗体保留与包含参照序列的抗独特型抗体结合相同抗PD-L1抗体的能力。在某些实施方案中,在SEQ IDNO:56中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中,替代,插入,或删除在HVR以外的区域中发生(即在FR中)。任选地,该抗PD-L1独特型抗体包含SEQ ID NO:56的VH序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中,该VH包含一种,两种或三种选自下述的HVR:(a)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H1,(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H2,和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中,与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代),插入,或删除,但是包含该VL序列的抗PD-L1独特型抗体保留与包含参照序列的抗独特型抗体结合相同抗PD-L1抗体的能力。在某些实施方案中,在SEQ ID NO:55中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中,该替代,插入,或删除在HVR以外的区域中发生(即在FR中)。任选地,该抗PD-L1独特型抗体包含SEQ ID NO:55的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中,该VL包含一种,两种或三种选自下述的HVR:(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH,和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中,该抗体包含分别在SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:55中的VH和VL序列,包括那些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中,该抗独特型抗体包含如图1和2中显示的抗体48C1的一种,两种,三种,四种,五种,或六种HVR(例如Kabat)。在一些实施方案中,该抗独特型抗体包含如图1和2中显示的抗体48C1的VH和/或VL。
在另一个方面,抗PD-L1独特型抗体包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中,与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代),插入,或删除,但是包含该VH序列的抗PD-L1独特型抗体保留与包含参照序列的抗独特型抗体结合相同抗PD-L1抗体的能力。在某些实施方案中,在SEQ IDNO:58中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中,替代,插入,或删除在HVR以外的区域中发生(即在FR中)。任选地,该抗PD-L1独特型抗体包含SEQ ID NO:58的VH序列包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中,该VH包含一种,两种或三种选自下述的HVR:(a)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H1,(b)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H2,和(c)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中,与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代),插入,或删除,但是包含该VL序列的抗PD-L1独特型抗体保留与包含参照序列的抗独特型抗体结合相同抗PD-L1抗体的能力。在某些实施方案中,在SEQ ID NO:57中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中,该替代,插入,或删除在HVR以外的区域中发生(即在FR中)。任选地,该抗PD-L1独特型抗体包含SEQ ID NO:57的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中,该VL包含一种,两种或三种选自下述的HVR:(a)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQID NO:27的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH,和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中,该抗体包含分别在SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:57中的VH和VL序列,包括那些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中,提供了一种抗PD-L1独特型抗体,其中该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含VH,其包含包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H1,包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H2,和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H3；和VL,其包含包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L1,包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L2,和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-L3。
在本发明的又一个方面,依照任何上述实施方案的抗PD-L1独特型抗体是单克隆抗体,包括嵌合,人源化或人抗体。在一个实施方案中,抗PD-L1独特型抗体是抗体片段,例如Fv,Fab,Fab’,scFv,双抗体,或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中,该抗PD-L1独特型抗体是全长抗体,例如完整IgG1抗体或如本文中定义的其它抗体类或同种型。
在本发明的又一个方面,依照任何上述实施方案或本文中描述的抗PD-L1独特型抗体是与异源模块或剂缀合的。
在另一个方面,本文中提供的是一种包含一种或多种依照任何上述实施方案或本文中描述的抗PD-L1独特型抗体的组合物。本文中还提供的是一种编码本文中描述的抗独特型抗体的核酸,一种包含该核酸的载体,和一种包含该载体的宿主细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞是分离或纯化的。在一些实施方案中,该宿主细胞是细胞培养培养液。
ii.生成方法
下面是关于用于生成依照本发明使用的抗独特型抗体的例示性技术的描述。
1.多克隆抗体
本发明的抗体可以包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是技术人员知道的。可以在哺乳动物中生成多克隆抗体,例如通过一次或多次注射免疫剂和(如果期望的话)佐剂。典型地,会通过多次皮下或腹膜内注射在哺乳动物中注射免疫剂和/或佐剂。免疫剂可以包括抗PD-L1,其抗原结合片段,或其融合蛋白。将免疫剂与已知在免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白缀合可能是有用的。此类免疫原性蛋白的例子包括但不限于匙孔虫戚血蓝蛋白,血清清蛋白,牛甲状腺球蛋白,和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以采用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A,合成的海藻糖二棒状霉菌酸酯)。无需过度实验,可以由本领域技术人员选择免疫方案。然后可以对哺乳动物采血,并对血清测定抗独特型抗体滴度。如果期望的话,可以加强哺乳动物直至抗体滴度升高或到平台。
2.单克隆抗体
或者,本发明的抗体可以是单克隆抗体。可以使用由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法或通过重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)生成单克隆抗体。
在杂交瘤方法中,如上文描述地免疫小鼠或其它适宜的宿主动物(诸如仓鼠)引发生成或能够生成会特异性结合用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。或者,可以在体外免疫淋巴细胞。在免疫之后,分离淋巴细胞,然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,pp.59-103(Academic Press,1986))。
如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和生长,该培养基含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称作融合配偶)生长或存活的物质。例如,如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)的话,用于杂交瘤的选择性培养基典型地会包括次黄嘌呤,氨基蝶呤,和胸苷(HAT培养基),这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
融合配偶骨髓瘤细胞是那些高效融合,支持选定的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体,且对针对未融合的亲本细胞选择的选择性培养基敏感的。骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系,诸如那些自索尔克(Salk)研究所细胞分配中心(San Diego,California,USA)可得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤衍生的,和SP-2和衍生物,例如自美国典型培养物保藏中心,Manassas,Virginia,USA可得的X63-Ag8-653细胞。还已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；和Brodeuret al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定法,诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。例如,可以通过Munson etal.,Anal.Biochem.,107:220(1980)中描述的Scatchard分析测定单克隆抗体的结合亲和力。
一旦鉴定出生成具有期望特异性,亲和力,和/或活性的抗体的杂交瘤细胞,克隆就可以通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行生长(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。对于这种目的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤在体内生长,例如通过将细胞腹膜内注射入小鼠。
通过常规抗体纯化规程,诸如例如亲和层析术(例如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析术,羟基磷灰石层析术,凝胶电泳,透析,等,恰当地将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液,腹水,或血清分开。
使用常规规程容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离,可以将DNA放置入表达载体,然后将其转移入在其它情况下不生成抗体蛋白的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞,猿COS细胞,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,或骨髓瘤细胞)以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述论文包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pliickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在又一个实施方案中,可以自使用McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术生成的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物描述通过链改组生成高亲和力(nM范围)人抗体(Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992)),以及组合感染和体内重组作为用于构建很大噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。如此,这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选。
原则上,通过筛选含有噬菌体的噬菌体文库选择合成的抗体克隆,噬菌体展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段。针对期望抗原筛选此类噬菌体文库。表达能够结合期望抗原的Fv片段的克隆吸附至抗原,从而与文库中的非结合性克隆分开。然后自抗原洗脱结合性克隆,而且可以通过另外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。
可以在噬菌体上功能性展示可变域,或是作为单链Fv(scFv)片段,其中VH和VL经由短的,柔性的肽共价连接,或是作为Fab片段,其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用,如Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中描述的。
可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆VH和VL基因的全集并在噬菌体文库中随机重组,然后可以对其搜索抗原结合克隆,如Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中描述的。来自免疫来源的文库在无需构建杂交瘤的情况下提供针对免疫原的高亲和力抗体。或者,可以克隆幼稚全集以在没有任何免疫的情况下提供针对广泛非自身和还有自身抗原的人抗体的单一来源,如由Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后,还可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段,并使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区及在体外实现重排来合成生成幼稚文库,如由Hoogenboom andWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述的。
可以通过本领域已知的多种技术来实现文库的筛选。例如,抗PD-L1可以用于包被吸附板的孔,在附着至吸附板或在细胞分选中使用的宿主细胞上表达,或缀合至生物素用于用链霉亲合素包被的珠捕捉,或在用于淘选展示文库的任何其它方法中使用。
可以通过使用长清洗和单价噬菌体展示(如Bass et al.,Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690中描述的),和低包被密度的抗原(如Marks et al.,Biotechnol.,10:779-783(1992)中描述的)来促进具有低解离动力学(和好结合亲和力)的抗体的选择
可以通过设计合适的抗原筛选规程以选择感兴趣噬菌体克隆,继以使用来自感兴趣噬菌体克隆的Fv序列和合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗独特型抗体克隆来获得本发明的任何抗独特型抗体,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of lmmunologicalInterest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中描述的。
3.抗体变体
在某些实施方案中,涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如,可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜修饰引入编码抗体的核苷酸序列,或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或插入和/或替代。可以做出删除,插入,和替代的任何组合以得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有期望特征,例如抗原结合。
a.替代,插入,和删除变体
在某些实施方案中,提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。对于替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在标题“保守替代”下显示。更加实质性变化在表1中在标题“例示性替代”下提供且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣抗体并对产物筛选期望活性,例如保留/改善抗原结合,降低免疫原性,或改善ADCC或CDC。
表1
原始残基 例示性替代 优选替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以依照共同的侧链特性分组:
-疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
-中性亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
-酸性的:Asp,Glu；
-碱性的:His,Lys,Arg；
-影响链取向的残基:Gly,Pro；
-芳香族的:Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别中的一个的成员交换另一个类别的。
一种类型的替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地,为进一步研究选择的所得变体会相对于亲本抗体具有某些生物学特性中的修饰(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性替代变体是亲和力成熟抗体,其可以方便地生成,例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术,诸如本文中描述的那些。简言之,突变一个或多个HVR残基并在噬菌体上展示变体抗体并筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出改变(例如替代),例如为了改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即由在体细胞突变过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基,参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中做出此类改变,对所得变体VH或VL测试结合亲和力。已经描述了通过二级文库的构建和再选择的亲和力成熟,例如在Hoogenboom et al.,in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brienet al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001)中。在亲和力成熟的一些实施方案中,通过多种方法中的任一种(例如易错PCR,链改组,或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入为突变选择的可变基因。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法牵涉HVR定向办法,其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以特异性鉴定抗原结合中牵涉的HVR残基,例如使用丙氨酸扫描诱变或建模。常常特别靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中,替代,插入,或删除可以在一个或多个HVR中发生,只要此类改变并不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如,可以在HVR中做出并不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。此类改变可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中,每个HVR或是未改变的,或是含有不超过一处,两处或三处氨基酸替代。
一种对于鉴定抗体中诱变可以靶向的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085描述的。在这种方法中,鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基,诸如Arg,Asp,His,Lys,和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代展现功能敏感性的氨基酸位置处引入别的替代。
或者/另外,抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为替代的候选。可以筛选变体以确定它们是否含有期望特性。
氨基酸序列插入包括长度范围自一个残基至含有一百个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C末端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽融合。
4.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物生成抗体,例如如美国专利No.4,816,567中描述的。在一个实施方案中,提供了编码本文中描述的抗独特型抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码构成抗体的VL的氨基酸序列和/或构成VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中,提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中,提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中,宿主细胞包含(例如已经转化有):(1)包含编码构成抗体的VL的氨基酸序列和构成抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体,或(2)包含编码构成抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码构成抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中,宿主细胞是真核的,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如YO,NSO,Sp20细胞)。在一个实施方案中,提供了一种生成抗PD-L1独特型抗体的方法,其中该方法包含培养包含编码如上文提供的抗体的核酸的宿主细胞,在适合于表达该抗体的条件下进行,和任选地自该宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收该抗体。
为了重组生成抗PD-L1独特型抗体,分离编码例如如上文描述的抗体的核酸并插入一种或多种载体用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规规程容易地分离此类核酸并测序(例如通过使用能够特异性结合编码该抗体的重和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
对于克隆或表达编码抗体的载体合适的宿主细胞包括本文中描述的原核或真核细胞。例如,可以在细菌中生成抗体,特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽,参见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199,和5,840,523。还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254,其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。在表达之后,可以在可溶性级分中自细菌细胞糊分离抗体且可以进一步纯化。
在原核生物以外,真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)对于编码抗体的载体是合适的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已经“人源化”,导致生成具有部分或完全人糖基化样式的抗体的真菌和酵母株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li etal.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
对于表达糖基化抗体合适的宿主细胞还衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞联合使用的众多杆状病毒株,特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。还可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
还可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如,适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40是转化的猴肾CV 1系(COS-7)；人胚肾系(293或如例如Graham et al.,J Gen Viral.36:59(1977)中描述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托里(Sertoli)细胞(TM4细胞,如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV 1)；非洲绿猴肾细胞(VER0-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MOCK)；牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep 02)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞,如例如Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFK CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系,诸如YO,NSO和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
C.测定法
可以通过本领域已知的各种测定法对本文中提供的抗PD-L1独特型抗体鉴定,筛选,或表征它们的物理/化学特性和/或生物学活性。
i.结合测定法和其它测定法
在一个方面,对本发明的抗体测试它的抗原结合活性,例如通过诸如ELISA,Western印迹,等已知方法。可以通过本领域已知的常用方法测量结合亲和力。在一个实施方案中,通过如下面的测定法描述的用Fab型式的抗体和抗原分子实施的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量抗体的KD,通过在滴定系列的未标记的抗原存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab,然后用抗Fab抗体包被的板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen et al.(1999)J.Mol.Biol 293:865-881)。为了建立用于测定法的条件,将微量滴定板(Dynex)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5ug/ml捕捉抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜,随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中,将100pM或26pM[125I]抗原与感兴趣Fab的系列稀释液混合(与Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599中抗VEGF抗体,Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而,温育可以持续更长时段(例如65小时)以确保达到平衡。之后,将混合物转移至捕捉板用于于室温温育1小时。然后去除溶液并将板用PBS中的0.1％Tween-20清洗8次。当板已经干燥时,添加150ul/孔闪烁液(MicroScint-20；Packard),并在Topcount伽马计数仪(Packard)上对板计数10分钟。选择每种Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于在竞争性结合测定法中使用。
依照另一个实施方案,通过以10个响应单位(RU)用固定化的抗原CM5芯片于25℃使用-2000或-3000仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)使用表面等离振子共振测定法测量KD。简言之,依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖酐生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠,pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(0.2μM),之后以5μL/min的流速注射以实现大约10个响应单位(RU)的偶联的蛋白质。在注射抗原之后,注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量,以大约25μL/min的流速于25℃注射Fab在含0.05％TWEEN 20TM表面活性剂的PBS(PBST)中的2倍系列稀释液(0.78nM至500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version 3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。作为比koff/kon计算平衡解离常数(KD)。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果结合速率根据上文表面等离振子共振测定法超过106M-1s-1,那么可以通过使用荧光淬灭技术测定结合速率,于25℃测量在渐增浓度的抗原存在下PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab型式)的荧光发射强度的升高或降低(激发＝295nm；发射＝340nm,16nm带通),如用搅动比色杯在分光计,诸如配备断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的。
在另一个方面,可以使用竞争测定法来鉴定与本文中描述的任何抗PD-L1独特型抗体竞争对抗PD-L1抗体的结合的另一种抗独特型抗体。在某些实施方案中,此类竞争性抗体结合抗PD-L1抗体的相同表位(例如线性或构象表位)。Morris(1996)“Epitope MappingProtocols,”in Methods in Molecular Biology vol.Humana Press,Totowa,NJ)中提供了用于定位抗体结合的表位的详细例示性方法。
在一种例示性竞争测定法中,在包含结合抗PD-L1抗体的经标记的第一抗体(例如经标记的第一抗PD-L1独特型抗体)和正在测试它与第一抗体竞争结合抗PD-L1抗体的能力的未标记的第二抗体(例如未标记的第二抗PD-L1独特型抗体)的溶液中温育固定化的抗PD-L1抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含经标记的第一抗体但不含未标记的第二抗体的溶液中温育固定化的抗PD-L1抗体。在允许第一抗体结合抗PD-L1抗体的条件下温育之后,去除过量的未结合的抗体,并测量与固定化的抗PD-L1抗体联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化的抗PD-L1抗体联合的标记物的量对于对照样品实质性减少,那么这指示第二抗体与第一抗体竞争结合抗PD-L1抗体。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)。还可以使用用抗PD-L1抗体转染并在细胞表面上表达的细胞用FACS以如上文描述的方式实施竞争测定法。另外,用抗PD-L1抗体的ELISA也可以在竞争测定法中使用。
在另一个方面,可以使用凝胶移位测定法鉴定本发明的抗独特型抗体和靶抗体(诸如抗PD-L1抗体)之间的相互作用。
在一种例示性凝胶移位测定法中,将抗PD-L1抗体与抗独特型抗体一起预温育。将预温育后的抗PD-L1抗体和没有与抗独特型抗体一起预温育的对照抗PD-L1抗体提交凝胶电泳并用二抗(例如用于IgG/Igκ抗PD-L1抗体的IgG和Igκ二抗)探查。比较预温育后的抗PD-L1抗体和对照抗PD-L1抗体的迁移率,其中预温育后的抗PD-L1抗体和对照抗PD-L1抗体的迁移率的差异指示抗PD-L1抗体和抗独特型抗体之间的相互作用。
D.使用抗独特型抗体的方法
i.使用方法
在某些实施方案中,如本文中提供的任何抗独特型抗体,或包含此类抗体的组合物对于检测生物学样品中抗PD-L1抗体的存在是有用的。在某些实施方案中,如本文中提供的任何抗PD-L1独特型抗体或包含此类抗体的组合物用于量化样品中的抗PD-L1抗体是有用的。在某些实施方案中,生物学样品是生物学流体,诸如全血或全血液成分,包括红血球,白血球,血小板,血清和血浆,腹水,玻璃体液,淋巴液,滑液,卵泡液,精液,羊水,乳汁,唾液,痰液,泪液,汗液,粘液,脑脊液,尿液和可能含有感兴趣抗体的身体的其它成分。在各种实施方案中,样品是来自任何动物的身体样品。在各种实施方案中,样品是来自人的样品。
在某些实施方案中,如本文中提供的任何抗独特型抗体,或包含此类抗体的组合物对于在不影响它结合另一分子(例如结合抗PD-L1抗体的Fc区的抗体)的能力的情况下检测免疫测定法中抗PD-L1的存在是有用的。
抗PD-L1独特型抗体,或包含此类抗体的组合物可以在多种不同测定法中使用,包括但不限于ELISA,基于珠的免疫测定法和质谱术。
在一些实施方案中,如本文中提供的结合抗PD-L1抗体的任何抗独特型抗体,或包含此类抗体的组合物对于消减,检测或区分来自患者样品的抗PD-L1抗体以降低它在测定法中的干扰是有用的。
在一些实施方案中,样品来自哺乳动物。在一些实施方案中,样品来自人受试者,例如在测量临床样品中的抗体,诸如人源化抗体时。在一些实施方案中,生物学样品来自临床患者或用治疗性抗PD-L1抗体(例如阿特珠单抗)治疗的患者。在某些实施方案中,生物学样品是血清或血浆。在某些实施方案中,生物学样品是来自临床患者的血清。在某些实施方案中,生物学样品是尿液。在某些实施方案中,生物学样品是来自临床患者的尿液。
在某些实施方案中,提供了包含标记的抗PD-L1独特型抗体的组合物。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光,显色,电子致密,化学发光,和放射性标记物),以及间接检测(例如经由酶促反应或分子相互作用)的模块,诸如酶或配体。例示性标记物包括但不限于放射性同位素32P,14C,125I,3H,和131I,荧光团诸如稀土螯合物或荧光素和它的衍生物,罗丹明和它的衍生物,丹酰,伞形酮,萤光素酶,例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456),萤光素,2,3-二氢酞嗪二酮,辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶,J3-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖氧化酶,例如葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,杂环氧化酶,诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶,与采用过氧化物来氧化染料前体的酶偶联,诸如HRP,乳过氧化物酶,或微过氧化物酶,生物素/亲合素,自旋标记物,噬菌体标记物,稳定的自由基,等等。
ii.用于检测抗PD-L1抗体的方法和组合物
1.ELISA
在一些实施方案中,在ELISA测定法中使用抗PD-L1独特型抗体。本文中描述的测定法是利用抗PD-L1独特型抗体作为针对感兴趣抗体的捕捉试剂的ELISA。在测定法的第一步中,将怀疑含有或含有感兴趣抗体的生物学样品与捕捉(或包被)抗体接触并一起温育,使得捕捉抗体捕捉或结合感兴趣抗体,使得能在检测步骤中检测它。检测步骤牵涉使用可检测抗体,它在接触任何结合的感兴趣抗体时结合感兴趣抗体,如果存在的话。使用检测手段来检测抗体上的标记物和因而存在的感兴趣抗体的存在或量。
在某些实施方案中,测定法利用下面的步骤。
第一步
在本文中的测定法的第一步中,将怀疑含有或含有如本文中定义的感兴趣抗体的生物学样品与固定化的捕捉(或包被)试剂(其是针对感兴趣抗体的抗独特型抗体)接触并一起温育。在一些实施方案中,这些抗独特型抗体是单克隆抗体,而且可以来自任何物种。在一些实施方案中,这些抗独特型抗体是啮齿动物抗体,在又一些实施方案中,(小)鼠或大鼠,且在又一些实施方案中,(小)鼠抗体。
在各种实施方案中,抗独特型是本文中公开的任何抗独特型抗体。在某些实施方案中,抗独特型抗体是包含三种重链高变区(HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3)和三种轻链高变区(HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3)的抗体,其中:(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列且(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗独特型抗体包含SEQ IDNO:54的重链可变区序列和SEQ ID NO:53的轻链可变区序列。
依照另一个实施方案,该抗独特型抗体是包含三种重链高变区(HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3)和三种轻链高变区(HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3)的抗体,其中:(a)HVR-H1包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列且(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗独特型抗体包含SEQ ID NO:56的重链可变区序列和SEQ ID NO:55的轻链可变区序列。
依照另一个实施方案,抗独特型抗体是包含三种重链高变区(HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3)和三种轻链高变区(HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3)的抗体,其中:(a)HVR-H1包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列且(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗独特型抗体包含SEQ ID NO:58的重链可变区序列和SEQ ID NO:57的轻链可变区序列。
通过使捕捉试剂不溶解方便地实现固定化,或是在测定法规程之前,如通过吸附至水不溶性基质或表面(美国专利No.3,720,760)或非共价或共价偶联(例如使用戊二醛或碳二亚胺交联,有或无用例如硝酸和还原剂在先活化支持物,如美国专利No.3,645,852或Rotmans et al.,J.Immunol.Methods,57:87-98(1983)中描述的),或是在测定法规程之后,例如通过免疫沉淀。在一些实施方案中,捕捉抗体是与生物素缀合且结合至链霉亲合素包被的表面的。在其它实施方案中,捕捉抗体是与蛋白质标签,诸如His标签或GST缀合的,而且结合至合适的表面,例如镍或铜包被的表面,或谷胱甘肽包被的表面。
用于固定化的固相可以是本质上水不溶性且在免疫测定测定法中有用的任何惰性支持物或载体,包括例如表面,颗粒,多孔基质,等形式的支持物。常用的支持物的例子包括小片,凝胶,聚氯乙烯,塑料珠,和自聚乙烯,聚丙烯,聚苯乙烯,等等制造的测定板或测试管,包括96孔微量滴定板,以及颗粒材料,诸如滤纸,琼脂糖,交联右旋糖酐,和其它多糖。或者,反应性水不溶性基质适合用于捕捉试剂固定化,诸如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利No.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中描述的反应性底物。在一些实施方案中,在微量滴定板上包被固定化的捕捉试剂。在一些实施方案中,使用的固相是可用于一次分析数份样品的多孔微量滴定板,例如MICROTESTTM或MAXISORPTM 96孔ELISA板,诸如作为NUNC MAXISORBTM或IMMULONTTM销售的。
用如上文定义的捕捉试剂包被固相,可以根据需要通过非共价或共价相互作用或物理连接来连接。用于附着的技术包括美国专利No.4,376,110和其中引用的参考文献中描述的那些。如果共价的话,将板或其它固相与交联剂连同捕捉试剂一起在本领域公知的条件(诸如于室温1小时)下温育。
常用于将捕捉试剂附着至固相基质的交联剂包括例如1,1-二(重氮基乙酰基)-2-苯基乙烷,戊二醛,N-羟基琥珀酰亚胺酯,例如,与4-叠氮基水杨酸的酯,同双功能亚氨酸酯,包括二琥珀酰亚胺基酯诸如3,3’-二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸酯),和双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷。衍生剂诸如3-((p-叠氮基苯基)-二硫代)丙亚氨酸甲酯产生能够在光存在下形成交联的可光活化的中间体。
如果利用96孔板的话,可以通过温育至少约10小时用典型地在缓冲液,诸如0.05M碳酸钠中稀释的捕捉试剂的混合物包被它们。在一些实施方案中,温育是于约4-20℃,或约4-8℃的温度且于约8-12,约9-10,或约9.6的pH至少过夜。如果想要更短的包被时间(1-2小时)的话,可使用具有硝酸纤维素滤器底物的96孔板(Millipore MULTISCREENTM)或于37℃包被。可以在测定法自身之前很长时间堆叠和包被板,然后可以以手动,半自动,或自动(诸如通过使用机器人)方式对数份样品同时进行测定法。
然后典型地用非特异性结合并饱和结合位点的封闭剂处理包被的板以防止不想要的游离配体对板的孔上过量的位点的结合。对于这种目的适宜的封闭剂的例子包括例如明胶,牛血清清蛋白,卵清蛋白,酪蛋白,和脱脂乳。封闭处理典型地在环境温度的条件下进行约1-4小时,或约1.5-3小时。
在包被和封闭之后,将适当稀释的标准品(纯化的感兴趣抗体)或要分析的生物学样品添加至固定化的相。在某些实施方案中,稀释率是约5-15％,或约10％,以体积计。可用于这种目的的稀释的缓冲液包括(a)含有0.5％BSA,0.05％TWEEN 20TM洗涤剂(P20),0.05％PROCLINTM 300抗生素,5mM EDTA,0.25％3-((3-胆胺基丙基)二甲基铵基)-1-丙磺酸盐(CHAPS)表面活性剂,0.2％β-γ球蛋白,和0.35M NaCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)；(b)含有0.5％牛血清清蛋白(BSA),0.05％P20,和0.05％PROCLINTM 300,pH 7的PBS；(c)含有0.5％BSA,0.05％P20,0.05％PROCLINTM 300,5mM EDTA,和0.35M NaCl,pH 6.35的PBS；(d)含有0.5％BSA,0.05％P20,0.05％PROCLINTM 300,5mM EDTA,0.2％β-γ球蛋白,和0.35M NaCl的PBS；和(e)含有0.5％BSA,0.05％P20,0.05％PROCLINTM 300,5mM EDTA,0.25％CHAPS,和0.35M NaCl的PBS。PROCLINTM 300起防腐剂的作用,而TWEEN 20TM起洗涤剂的作用,消除非特异性结合。
采用的捕捉试剂的量大得足以与标准品相比给出较好信号,但是与样品中的感兴趣抗体的最大预期水平相比没有摩尔过量。在某些实施方案中,添加的生物学样品的量使得固定化的捕捉试剂对于在将样品适当稀释之后生物学样品中预料的游离感兴趣抗体的最大摩尔浓度摩尔过量。这种预料水平主要取决于所分析的特定生物学样品中游离感兴趣抗体的浓度水平与患者的临床状况之间的任何已知关联。如此,例如,成年患者可以具有相当高的他/她的血清中游离感兴趣抗体的最大预期浓度,而儿童基于给予的剂量预期会具有较低的他/她的血清中游离感兴趣抗体的水平。
可以通过感兴趣抗体的感兴趣浓度范围来确定捕捉试剂的浓度,考虑生物学样品的任何必要稀释。还可以凭经验确定捕捉试剂的终浓度以最大化测定法在感兴趣范围上的灵敏度。一般地,摩尔过量合适地小于在任何适宜稀释样品之后生物学样品中感兴趣抗体的约10倍最大预期摩尔浓度。
选择用于温育样品和固定化的捕捉试剂的条件以最大化测定法的灵敏度及最小化解离,及确保样品中存在的任何感兴趣抗体结合固定化的捕捉试剂。于相当恒定的温度实现温育,范围为约0℃至约40℃,例如于室温或约室温。温育的时间一般不超过约10小时。在各种实施方案中,温育时间是于室温或约室温约0.5至3小时,或约1.5至3小时以最大化感兴趣抗体对捕捉试剂的结合。如果添加蛋白酶抑制剂以防止生物学流体中的蛋白酶降解感兴趣抗体的话,温育的持续时间可以更长。
在这个阶段,温育混合物的pH通常会在约4至9.5的范围中,或在约6-9,或约7至8的范围中。选择温育缓冲液的pH以维持显著水平的捕捉试剂对所捕捉的感兴趣抗体的特异性结合。可以采用各种缓冲液来在这个步骤期间实现和维持期望pH,包括硼酸盐,磷酸盐,碳酸盐,TRIS-HCl或TRIS-磷酸盐,乙酸盐,巴比妥,等等。采用的特定缓冲液对本发明不是至关紧要的,但是在个别测定法中,可能优选一种缓冲液胜过另一种。
任选的第二步
在测定法方法的任选的第二步中,将生物学样品(例如通过清洗)与固定化的捕捉试剂分开以去除未捕捉的感兴趣抗体。用于清洗的溶液一般是具有使用考虑事项确定的pH的缓冲液(“清洗缓冲液”)和具有约6-9的pH范围的上文关于温育步骤描述的缓冲液。清洗可以进行三次或更多次。清洗的温度一般是从冰箱到中等温度,在测定时段期间维持恒定温度,典型地约0-40℃,或约4-30℃。例如,可以在清洗之前将清洗缓冲液放置在贮器中于4℃在冰中,而且可以为这个步骤利用洗板仪。还可以在这个阶段添加交联剂或其它合适的药剂以容许新结合的感兴趣抗体共价附着至捕捉试剂如果有捕捉的感兴趣抗体在后续步骤中可能有一定程度的解离的任何担心的话。
第三步
在下一步中,于约20-40℃,或约36-38℃的温度使带有任何结合的存在的感兴趣抗体的固定化的捕捉试剂接触可检测抗体,用于二者接触的确切的温度和时间主要取决于采用的检测手段。例如,当使用4-甲基伞形基-β-半乳糖苷(MUG),链霉亲合素-HRP,或链霉亲合素-β-半乳糖苷酶作为用于检测的手段时,接触可以进行过夜(例如约15-17小时或更多)以放大信号至最大。虽然可检测抗体可以是多克隆或单克隆抗体,但是优选它是单克隆抗体,以降低背景噪声。在一些实施方案中,使用相同的抗独特型抗体用于测定法中的包被和检测。在其它实施方案中,可以使用不同的抗独特型抗体用于包被和检测,选择它们,使得背景噪声最小化。
在一些实施方案中,可检测抗体是结合人抗体的来自非人物种的抗体。在一些实施方案中,可检测抗体是抗huIgG Fc抗体。在一些实施方案中,可检测抗体是小鼠抗huIgGFcγ抗体。在一些实施方案中,可检测抗体是直接可检测的。在某些实施方案中,可检测抗体是生物素化的。在此类情况中,用于生物素化的标记物的检测手段可以是亲合素或链霉亲合素-HRP,而且检测手段的读出可以是荧光计量或色度计量。在一些实施方案中,抗体是与HRP缀合的,而且检测手段是色度计量。
在清洗板之后,将就预期的游离感兴趣抗体的最大浓度而言摩尔过量的可检测抗体(如上文描述的)添加至它。这种抗体(其是直接或间接可检测的)是单克隆抗体,尽管可以采用任何抗体。可检测抗体的亲和力必须高得足以能检测小量的游离感兴趣抗体,但是没有太高使得它引起自捕捉试剂拉出感兴趣抗体。
第四步
在测定法方法的最后一步中,使用用于可检测抗体的检测手段测量现在结合至捕捉试剂的来自样品的任何游离感兴趣抗体的水平。如果生物学样品来自临床患者的话,测量步骤包含比较作为上述三个步骤的结果发生的反应与标准曲线以确定与已知量相比感兴趣抗体的水平。
添加至固定化的捕捉试剂的抗体会是直接标记的,或通过在清洗掉过量的第一抗体之后添加摩尔过量的标记的针对第一抗体的动物物种的IgG的第二抗体而间接检测的。在后一种情况,间接测定法中,将标记的针对第一抗体的抗血清添加至样品从而原位生成标记的抗体。
用于第一或第二抗体的标记物是不干扰游离感兴趣抗体对抗独特型抗体的结合的任何可检测功能性。
合适的标记物的例子是已知供免疫测定法中使用的那些众多标记物,包括可以直接检测的模块,诸如荧光染料,化学发光,和放射性标记物,以及必须反应或衍生化才检测的模块,诸如酶。此类标记物的例子包括放射性同位素32P,14C,125I,3H,和131I,荧光团,诸如稀土螯合物或荧光素和它的衍生物,罗丹明和它的衍生物,丹酰,伞形酮,萤光素酶,例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456),萤光素,2,3-二氢酞嗪二酮,HRP,碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖氧化酶,例如葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,杂环氧化酶,诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶,与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶偶联,诸如HRP,乳过氧化物酶,或微过氧化物酶,生物素(通过例如亲合素,链霉亲合素,链霉亲合素-HRP,和链霉亲合素-β-半乳糖苷酶及MUG可检测),自旋标记物,噬菌体标记物,稳定的自由基,等等。
有常规方法可用于将这些标记物共价结合至蛋白质或多肽。例如,可使用偶联剂(诸如二醛,碳二亚胺,二马来酰亚胺,二亚氨酸酯,二重氮化联苯胺,等等)来用上文描述的荧光,化学发光,和酶标记物标记抗体。参见例如美国专利No.3,940,475(荧光测试术)和美国专利No.3,645,090(酶)；Hunter et al.,Nature,144:945(1962)；David et al.,Biochemistry,13:1014-1021(1974)；Pain et al.,J.Immunol.Methods,40:219-230(1981)；和Nygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407-412(1982)。
缀合此类标记物(包括酶)与抗体是免疫测定法技术的普通技术人员的一种标准操作规程。参见例如O’Sullivan et al.“Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay,”in Methods in Enzymology,ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis,Vol.73(Academic Press,New York,New York,1981),pp.147-166。还可以使用合适的商品化的标记的抗体。
在添加最后的标记的抗体之后,如下测定结合的抗体的量,即经由清洗来去除过量的未结合的标记的抗体,然后使用对于标记物适宜的检测方法测量附着的标记物的量,并关联测量的量与生物学样品中感兴趣抗体的量。例如,在酶的情况中,发生并测量的颜色的量会是存在的感兴趣抗体的量的直接测量。具体地,如果HRP是标记物的话,可以使用底物TMD,使用450nm读取波长和620或630nm参照波长检测颜色。
在一个例子中,在自固定化的相清洗针对未标记的第一抗体的酶标记的第二抗体之后,通过将固定化的捕捉试剂与酶的底物一起温育来发生并测量颜色或化学发光。然后通过与由平行运行的标准感兴趣抗体生成的颜色或化学发光比较来计算感兴趣抗体的浓度。
2.质谱术
在一些实施方案中,在用于抗PD-L1抗体的质谱术测定法中使用抗PD-L1独特型抗体。本文中描述的测定法利用抗PD-L1独特型抗体用于自生物学样品免疫亲和捕捉抗PD-L1抗体。可以在通过质谱术量化抗PD-L1抗体之前使用分离技术,诸如层析术进一步加工样品。在一些实施方案中,通过蛋白水解生成特征性肽片段,并作为抗PD-L1抗体的替代分析物测量选定的签名肽。在某些实施方案中,使用HPLC及通过串联质谱术(MS/MS)的检测来量化替代肽。
a.加工生物学样品
将抗PD-L1抗体施用于哺乳动物,诸如人,或接触选自组织,细胞培养物,血浆或血清的生物学来源。已知来自血清和血浆样品的分析是有问题的,由于它们的高蛋白质组背景,即许多蛋白质和其它分析物。在施用之后的某个时间段之后,范围为数分钟,小时,天,收集包含抗PD-L1抗体,或其片段的生物学样品。可以通过任何手段来收集生物学样品,包括通过注射器或套管抽出流体。生物学样品可以是血液或血液制品,诸如血清,血浆等等或含有感兴趣抗体的其它体液。
通过常规规程加工生物学样品以形成分析样品,包括:配制,固定化,离心,分离,消化,诱导或防止血液细胞凝固,水解,或纯化。加工生物学样品用来去除杂质和降低样品异质性,其可能阻碍样品组分分开,或模糊数据收集或分析。或者/另外,在质谱术分析中,加工简化样品操作,防止降解,最小化样品体积,或选择感兴趣样品组分(分析物)。或者/另外,加工将生物学样品转变成在确定药物代谢或药动学效果中感兴趣的代谢物,片段,或衍生物。
b.捕捉已加工的分析样品
在免疫亲和珠上捕捉抗体,其中珠具有固定化的对施用的抗PD-L1抗体特异性的抗独特型抗体。在各种实施方案中,抗独特型是本文中公开的任何抗独特型抗体。可以使用本领域已知的任何合适方法将对施用的抗PD-L1抗体特异性的抗独特型抗体与免疫亲和珠缀合。在一些实施方案中,对施用的抗PD-L1抗体特异性的抗独特型是生物素化的且经由强生物素-链霉亲合素相互作用(KD＝l0-15M)结合至链霉亲合素包被的顺磁珠。使用链霉亲合素包被的顺磁珠的原理包括:(i)链霉亲合素-生物素相互作用强(KD＝10-15M),(ii)固定化的链霉亲合素/生物素化的分析物是一种已证明的方法,(iii)结合能力高(对于完整蛋白质足够的材料),(iv)非特异性结合低,(v)用质谱术相容溶剂洗脱样品,(vi)自珠回收样品好,和(vii)容易使用且适应自动化。
免疫亲和珠可以包含多孔聚合物整料且可以配置在与收集贮器流体连通的流通通道中。可以在流通容器,诸如柱或漏斗中含有珠,其中在一端或孔口引入来自生物学来源的样品,并自另一端或孔口洗脱样品。免疫亲和珠可以分配在多个流通容器中,每个与分开的收集贮器连通。容器和贮器可以配置在12x8列和行的96微量滴定孔型式,或24x16列和行的384微量滴定孔型式中用于自动化和结果再现性的目的。
通过手动移液或自动化机器人分发将来自接受抗PD-L1抗体的哺乳动物(生物学来源)的血浆或血清样品应用于珠。
珠可以配置在孔或其它容器中,或配置在柱中,或其它流通装置,其中在一端或孔口引入样品,并自另一端或孔口洗脱清洗流出液或洗脱的样品。容许对珠结合的抗独特型抗体特异性的样品组分结合。清洗珠以漂洗掉非特异性蛋白质和其它非特异性样品组分。可以在珠上将结合的抗体去糖基化,例如用PNGaseF。可以将结合的样品组分洗脱入样品板,具有分隔的接受容器或孔。然后可以通过手动移液或通过机器人转移来对洗脱的样品编址并通过反相层析术分开并通过质谱术分析分开的样品组分。
在一些实施方案中,可以用蛋白酶消化生物学样品。通过蛋白水解生成特征性肽片段,并作为抗PD-L1抗体的替代分析物测量选定的签名肽。在一个例示性实施方案中,可以用胰蛋白酶消化来消化生物学样品。对于胰蛋白酶消化,可以将样品用DTT还原,用碘乙酸钠S-羧甲基化,然后用胰蛋白酶消化。可以通过分离方法分析已消化的样品,例如反相HPLC,例如Nucleosil C18柱；大小排阻层析术(SEC),例如TSK 3000SWxL柱；或硼酸盐亲和层析术,使用TSK硼酸盐柱。
c.分开样品组分
为了形成分析样品,可以将生物学样品应用于分离介质以实现多于一种样品组分的分开。分离方法包括亲和,层析术,和电泳方法。亲和方法包括亲和层析术,吸附,和固定化的亲和基质。层析术方法包括HPLC,疏水相互作用(HIC),阴离子交换,阳离子交换,反相,正相,离子对反相,薄层,毛细流,和大小排阻。电泳方法包括单维,平板凝胶,毛细管,聚丙烯酰胺,变性,天然,游离溶液,纸,二维,等电聚焦,和梯度电压。其它分离方法包括:透析,离心,沉降,漂浮,沉淀,免疫沉淀,和凝胶过滤。
分离方法可以通过一种或多种物理化学特性实现生物学样品的组分分开,包括但不限于洗脱时间,疏水性,亲水性,迁移时间,速率,速度,层析保留时间,溶解度,分子体积或大小,净电荷,电荷状态,离子电荷,等电点,解离常数(pKa),抗体亲和力,电泳迁移率,电离电位,偶极矩,成氢键能力,和气相中的离子迁移率。
通过毛细管流输注进入质谱术入口装置的低流速推进质量检测的灵敏度,容许检测和表征较低浓度分析物和较高分子量种类,诸如完整蛋白质和抗体。
d.分开的样品组分的质谱术
用于质谱术分析的的制备一般可以依照已知技术进行。参见“Modem ProteinChemistry:Practical Aspects”,Howard,G.C.and Brown,W.E.,Eds.(2002)CRC Press,Boca Raton,Florida。
本发明的方法是对于分析自生物学样品衍生的抗体混合物适宜的,其中将混合物的不同化学组分首先通过一种或多种工艺分离,分开,或部分分开,包括亲和或层析术,其引起组分顺序地或以分批方式洗脱,或通过质谱术直接检测。可以自质谱术分析阐明抗体的各种结构特征和特性,包括:片段化,脱酰胺,糖化,氧化,部分序列信息,例如N端和C端,二聚体和聚集状态。可以通过测量它的精确质量以高度特异性方式表征生物学样品中中的一种或多种化学组分,因为施用的抗PD-L1抗体具有已知的序列,结构,和分子量。
能够实现高质量精确性,高灵敏度,和高分辨率的多种质谱术系统是本领域已知的且可以在本发明的方法中采用。此类质谱仪的质量分析仪包括但不限于四极(Q),飞行时间(TOF),离子肼,扇形磁场或FT-ICR或其组合。质谱仪的离子源应当主要生成样品分子离子,或假分子离子,和某些可表征片段离子。此类离子源的例子包括大气压电离源,例如电喷射电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。ESI和MALDI是两种最常采用的用于为质谱术分析电离蛋白质的方法。ESI和APCI是最常用的用于通过LC/MS分析小分子的离子源技术(Lee,M.“LC/MS Applications in Drug Development”(2002)J.Wiley&Sons,New York)。
表面增强激光解吸电离(SELDI)是容许高通量质谱术的基于表面的电离技术的一个例子(美国专利No.6,020,208)。典型地,使用SELDI来分析蛋白质和其它生物分子的复杂混合物。SELDI采用化学反应性表面(诸如“蛋白质芯片”)来与溶液中的分析物(例如蛋白质)相互作用。此类表面与分析物选择性相互作用并在其上固定化它们。如此,可以在芯片上部分纯化本发明的分析物,然后在质谱仪中快速分析。通过在基质表面上的不同位点提供多个反应性模块,可以提高通量。
在功能性系统中,质谱仪会精确测量感兴趣化学种类的质量,在它的确切或计算质量的20ppm内,而且典型地在它的确切或计算质量的5ppm或更少内。商品化质量分析仪能同时且以容许为混合物中的多种组分获取足够的谱以确保质谱信号强度或峰面积是定量代表性的频率采样和记录整个质谱。这也会确保为所有质量观察到的洗脱时间不会受质量分析仪修改或扭曲且它会帮助确保定量测量不受需要测量瞬时信号的丰度损害。
可以通过使用具有与靶分析物相似的物理化学特性的内部标准品(IS)来校正分析变异性(Mesmin et al.(2011)Bioanalysis 3:477-480)。在一些实施方案中,在作为抗PD-L1抗体的替代分析物测量签名肽的情况中,与签名肽对应的稳定的同位素标记的(SIL)肽可以用作内部标准品(Hagman et al.(2008)Anal.Chem.80:1290-1296；Mesmin et al.(2010)Rapid Commun.Mass Spectrom.24:2875-2884)。
3.电喷射电离质谱术(ESI)
由于分析物电离效率升高,以较低流速实现较高灵敏度(Gale et al.(1993)Rapid Commun.Mass Spectrom.7:1017)。如此,通过以纳升每分范围中的流速实施电喷射注射含有样品的流体在正确校正之后提供精确量化,而且在与质谱术组合时提供针对流体内含有的分析物的高灵敏度。已经报告了包括微型化和固结的具有亲和层析吸附剂的微柱和微柱阵列的系统和装置,其提供高选择性和灵敏度,和精确定性分析,作为MS的前端(美国专利No.6,811,689；美国专利No.6,020,208；美国专利No.6,579,719)。
可以以通过大多数质谱仪容易测定的质荷比(m/z)检测相对较高分子量化合物(诸如抗体)的质量(典型的m/z范围高至2000至3000)。特别是,电喷射电离质谱术ESI-MS适合于带电荷的,极性的或碱性的化合物和分析多电荷化合物(具有卓越的检测限)。ESI如此容许检测和表征大的生物分子,诸如具有150,000或更高的分子量(MW)的抗体和抗体-药物缀合物。对于高质量离子,典型地观察到一系列多电荷分子离子。通过将测量的m/z比乘以电荷数(n)减去阳离子质量(C+)乘以该离子上的电荷数(n)来确定正离子的分子量。
ESI方法容许通过控制界面透镜电位来控制片段化的存在或缺失。电喷射电离(ESI)与液体分离方法(前端),以及质谱术检测方法(后端)相容(“ElectrosprayIonization Mass Spectrometry:Fundamentals,Instrumentation,and Applications”,Cole,R.B.,Ed.(1997)Wiley,New York)。
可以通过对一些扫描一起取平均并平滑数据以提供较好的峰强度和形状来获取ESI-MS数据。对于低质量化合物,观察到的最丰富的峰常常是正离子模式中的[M+H]+离子和负离子模式中的[M-H]-。还可能观察到二和三电荷离子以及二聚体。会在质量(MW+2C+)/2处观察到二电荷正离子,其中MW是分子量且C+是电离阳离子,诸如H+,Na+,或NH4+。除很低质量化合物之外,检测到的离子会是多电荷的。由于ESI的软(低电离电位)条件,典型地仅仅观察到分子离子。由于离子拥有各种数目的电荷,ESI谱可能具有质荷比不同的数个分子离子峰。
可以将样品(例如ADC或其它生物分子)的稀释溶液缓慢泵送穿过皮下针用于ESI-MS分析。可以经由流注射或LC/MS引入样品。典型的流速范围为小于1微升(μl)每分直至约1毫升(ml)每分。ESI特别适合于通过其它方式难以蒸发或电离的大的生物学分子。将针保持于高电压,而且针的末端处的强电场对雾化的溶液充电并产生带电荷的液滴。带电荷的液滴蒸发水以最终产生经由小孔口移动入真空室的分子离子。在溶剂蒸发过程期间,非共价结合的复合物自溶液转移至气相(Hu et al.(1994))。
一般需要温和的去溶剂化条件来维持完整的气相复合物。可以加热孔口以确保离子完全去溶剂化。一些MS系统可以采用逆流加热的气体。自皮下针发射带电荷的液滴并在进入真空室之前在它们蒸发溶剂时收缩。可以使用热和气流来帮助去溶剂化。通过使用小毛细电喷射发射器,尖头,一种称作纳米电喷射的过程,通过减小液流,可以减少ESI测量需要的样品的量。纳米电喷射方法能为1μl样品产生约10-30分钟的恒定信号。已经显示低的流提高离子效率且降低离子遏制。纳米电喷射方法频繁用于MS/MS蛋白质研究(Komer etal.(1996)J.Am.Soc.Mass Spectrom.7:150-156；Mann,M.and Wilm,M.(1996)Anal.Chem.68:1-8)。
蛋白质的ESI产生多电荷离子,随着分子量升高,电荷的数目趋于增加。可以通过诸如下述方法来确定给定离子种类上的电荷的数目:(i)比较相差一个电荷的两种电荷状态并求解联立方程；(ii)寻找具有相同电荷但不同加合物质量的种类；和(iii)检查解析的同位素簇的质荷比。ESI和ESI-MS的方法和进行这些方法需要的参数是本领域公知的。电喷射电离过程的温和性容许通过质谱术直接检测完整抗体缀合物。
在一个实施方案中,作为方法的一部分运行蛋白质,抗体,抗体片段或抗体缀合物(大分子)的Q1质谱。可以获得大分子的合适质量的Q1质谱。由于蛋白质包膜有移位的潜力,因此新鲜生成用于层析术的所有溶剂并将酸添加至洗脱溶剂以将谱包膜定位在观察范围中。对于大于100,000个质量单位的蛋白质,可以在洗脱溶剂(例如溶剂A(水)和B(乙腈)二者)中以约0.1％(体积)使用酸(诸如甲酸)。可以使用更强的酸,诸如三氟乙酸(TFA),对于小于100,000个质量单位的蛋白质,以0.05％(体积)TFA用于A和B溶剂二者。随着甲酸的量减少,完整糖基化抗体,曲妥珠单抗,取得更多电荷,使包膜进一步向左移位并进入m/z的观察范围(1800-3000m/z)。随着解簇电位(DP)电压自约30-120V升高至约70-190V,抗体上的电荷甚至进一步增加。如此,应用的电压,溶剂组成,和离子配对剂是要考虑和调节的因素。可以提高(倾斜)解簇电位(DP)以获取足够分辨率以选择最好的电荷离子范围。可以在宽范围的m/z上获得线性。抗体的去糖基化帮助量化完整抗体或重链,片段或ADC。糖基化有助于降低电离效率和如此降低灵敏度。在量化抗体或抗体片段缀合物时,抗体的去糖基化可以降低质谱的异质性,提高灵敏度和如此简化分析。
使用解卷积表来确定要量化的每种种类的确切的质荷比(m/z)。诸如AnalystTM QS(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)等解卷积软件应用可商购和/或与质谱仪一起提供。解卷积软件一般给用户提供解卷积的质量的表以及用于计算这些质量的m/z离子的子表。
iii.M蛋白检测
多发性骨髓瘤(MM)是骨髓中的浆细胞的一种癌症。多发性骨髓瘤在血液,尿液,和器官中引起高水平的蛋白质,包括但不限于M蛋白和其它免疫球蛋白(抗体)和β-2-微球蛋白。M蛋白,单克隆蛋白的缩写,也称作副蛋白,是由骨髓瘤浆细胞生成的且能在几乎所有具有多发性骨髓瘤的患者的血液或尿液中找到。
诸如来那度胺等免疫调控性药物已经成为治疗新诊断的患者,化学疗法或移植失败的具有晚期疾病的患者,和具有复发性或顽固性多发性骨髓瘤的患者中的骨髓瘤的重要选项。另一种有力的免疫调控剂是4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮(泊马度胺,)。在一些情况中,此类药剂与标准化学疗法药剂组合使用。例如,来那度胺与地塞米松组合最近批准用于治疗已经接受至少一种在先疗法的具有多发性骨髓瘤的患者。泊马度胺也可以与地塞米松组合施用。阿特珠单抗与其它治疗组合正在多项临床试验中作为多发性骨髓瘤的疗法进行测试。
国际骨髓瘤工作组(IMWG)已经建立MM中对治疗的临床响应的标准,其包括血清/尿液M蛋白水平的变化(通过血清蛋白质电泳(SPE),和免疫固定电泳(IFE)),骨髓浆细胞的百分比,和游离轻链(FLC)比。对于根据IMWG标准要归类为具有完全响应(CR)的患者,血清和尿液必须是M蛋白阴性的,如通过IFE和SPE测定的,而且骨髓浆细胞必须<5％。MM的治疗牵涉引入治疗性单克隆抗体。由于分别使用SPE和IFE来量化和表征免疫球蛋白的克隆性质,因此这些测定法受到疗法期间使用的单克隆抗体干扰。此发明的抗独特型抗体可用于在临床测定法期间使生物学样品中的抗PD-L1抗体移位用于检测M蛋白。
免疫固定电泳(IFE)
免疫固定电泳(IFE)是本领域已知的且是一种两阶段规程,第一阶段使用琼脂糖凝胶蛋白质电泳且第二阶段使用免疫沉淀。标本可以是任何生物学样品。在一个优选实施方案中,标本是血清,尿液或脑脊液。在一个实施方案中,IFE包含下述步骤:(a)通过琼脂糖凝胶上的电泳将蛋白质分开；(b)对电泳后的蛋白实施免疫固定(免疫沉淀),其中用抗血清个体覆盖适宜的电泳迁移迹,抗血清扩散入凝胶并沉淀相应的抗原(当存在时)并用固定剂固定参照迹中的蛋白；(c)通过印迹和清洗自凝胶去除未沉淀的,可溶解的蛋白,其中抗原-抗体复合物的沉淀素捕获在凝胶基质内；和(d)通过染色来显现沉淀的蛋白。在一些实施方案中,免疫固定电泳过程包含:(a)将样品应用于电泳凝胶上的至少两个应用区域；(b)将凝胶电泳；(c)将模板比对到电泳后的凝胶上,模板具有与每个电泳后的区域对应的模板槽；(d)将能够原位固定蛋白的组合物应用于至少一个模板槽并将能够与一种蛋白反应的抗血清应用于剩余模板槽中的至少一个；(e)温育步骤(d)的所得产物；(f)自温育后的,电泳后的凝胶去除模板；(g)清洗步骤(f)的温育后的,电泳后的凝胶；(h)干燥步骤(g)的清洗后的凝胶；(i)将步骤(h)的干燥后的凝胶染色；(j)将步骤(i)的染色后的凝胶脱色；(k)干燥步骤(j)的脱色后的凝胶；并(1)分析步骤(k)的干燥后的凝胶。
在一些实施方案中,该方法用于检测生物学样品中的抗PD-L1抗体。在一些实施方案中,该方法包含(a)使该生物学样品接触如本文中描述的抗独特型抗体或组合物,在容许该抗独特型抗体结合该抗PD-L1抗体以形成复合物的条件下进行；(b)加载电泳凝胶并通过免疫固定电泳与未接触该抗独特型抗体的生物学样品比较已接触该抗独特型抗体的生物学样品中的蛋白的迁移；其中已接触该抗独特型抗体的样品和未接触该抗独特型抗体的样品之间条带的迁移的差异指示该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在。
在一些实施方案中,该方法用于检测生物学样品中的M蛋白。在一些实施方案中,该方法包含(a)使该生物学样品接触如本文中描述的抗独特型抗体或组合物,在容许该抗独特型抗体结合该抗PD-L1抗体以形成复合物的条件下进行；(b)加载电泳凝胶并通过免疫固定电泳与未接触该抗独特型抗体的生物学样品比较已接触该抗独特型抗体的生物学样品中的蛋白的迁移。在一些实施方案中,如果已接触该抗独特型抗体的样品和未接触该抗独特型抗体的样品中的条带的迁移之间没有差异的话,检测到M蛋白。在一些实施方案中,如果已接触该抗独特型抗体的样品和未接触该抗独特型抗体的样品中的条带的迁移有部分移位的话,检测到M蛋白。在一些实施方案中,如果已接触该抗独特型抗体的样品和未接触该抗独特型抗体的样品中的条带的迁移之间有差异的话,未检测到M蛋白。
数家公司提供固结这些步骤中的一个或多个的自动化选项。可以依照由将免疫固定电泳测定法商品化的公司提供的用法说明书实施测定法。例如,可以如http://www.ilexmedical.com/files/Sebia％20inserts/IF_Standard_mask_Hydrasis.pdf处所述实施测定法。
III.试剂盒
此发明的测定法方法可以以试剂盒的形式提供。在一个实施方案中,这样的试剂盒包含本文中描述的抗独特型抗体或包含抗独特型抗体的组合物。在一些实施方案中,这样的试剂盒是包装的组合,包括如下基本要件:由针对感兴趣抗体的抗独特型抗体构成的捕捉试剂；可检测的(标记的或未标记的)结合感兴趣抗体的抗体；和关于如何使用这些试剂实施测定法方法的用法说明书。这些基本要件在本文中上文定义。
试剂盒可以进一步包含用于捕捉试剂的固体支持物,其可以作为分开的要件提供或捕捉试剂早已在其上固定化。
因而,试剂盒中的捕捉抗体可以是在固体支持物上固定化的,或它们可以是在与试剂盒一起包括的或与试剂盒分开提供的支持物上固定化的。在一些实施方案中,捕捉试剂是在固体材料(例如微量滴定板,珠或梳)上包被的或附着至固体材料(例如微量滴定板,珠或梳)的。可检测抗体可以是标记的抗体(直接检测的)或未标记的抗体(通过标记的在不同物种中产生的针对未标记的抗体的抗体检测的)。在标记物是酶的情况中,试剂盒通常会包括酶需要的底物和辅因子；在标记物是荧光团的情况下,提供可检测发色团的染料前体；而在标记物是生物素的情况下,亲合素,诸如亲合素,链霉亲合素,或与HRP或β-半乳糖苷酶(及MUG)缀合的链霉亲合素。
在各种实施方案中,抗独特型抗体是本文中公开的任何抗独特型抗体中的一种或多种。在一些实施方案中,抗独特型抗体选自(a)包含SEQ ID NO:54的重链可变区序列和SEQ ID NO:53的轻链可变区序列的抗独特型抗体；(b)包含SEQ ID NO:56的重链可变区序列和SEQ ID NO:55的轻链可变区序列的抗独特型抗体；(c)包含SEQ ID NO:58的重链可变区序列和SEQ ID NO:57的轻链可变区序列的抗独特型抗体和(d)其组合。
试剂盒典型地还含有感兴趣抗体(作为标准品)以及其它添加剂(诸如稳定剂,清洗和温育缓冲液,等等)。
试剂盒的成分会以预定比率提供,各种试剂的相对量恰当变化以提供实质性最大化测定法的灵敏度的试剂在溶液中的浓度。特别地,试剂可以作为干粉提供,通常是冻干的,包括赋形剂,其在溶解时会提供具有适宜浓度的试剂溶液,供与要测试的样品组合。
在各种实施方案中,包含如本文中描述的抗独特型抗体的试剂盒供如本文中描述的方法中(例如在检测M蛋白的方法中)使用。在一些实施方案中,试剂盒进一步包含在梳上包被或附着的抗独特型抗体,供检测M蛋白的方法中使用。
实施例
通过参考下面的实施例会更加完整地理解本发明。然而,它们不应解读为限制本发明的范围。理解的是,本文中描述的实施例和实施方案仅仅用于例示目的,而且本领域技术人员会想到鉴于它们的各种修饰或变化且要包括在此申请的精神和范围和所附权利要求书的范围内。
实施例1:针对抗PD-L1抗体阿特珠单抗的抗独特型抗体的生成和表征
杂交瘤的生成。
以3-4天间隔在每个后足垫中和腹膜内用含有可代谢角鲨烯,Tween 80,海藻糖6,6-二霉菌酸酯和单磷脂酰磷酰基脂质A(所有成分自Sigma Aldrich,USA获得)的佐剂中的抗PDL1抗体阿特珠单抗对5只Balb/c小鼠(Charles River Laboratories International,Inc.,Wilmington,MA,USA)超免疫。在11次加强之后,通过标准酶联免疫吸附测定法(ELISA)评血清滴度估以鉴定具有针对抗PDL1抗体的阳性血清滴度的小鼠。通过电融合(Hybrimune-HybridomaProduction System；Harvard Apparatus,Inc.,Holliston,MA,USA)将来自脾和腘淋巴结的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653或P3X63Ag.Ul；美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA,USA)融合。在10-14天之后,收获杂交瘤上清液并通过ELISA筛选CDR特异性抗体生成。
抗体克隆和序列。
为了克隆出杂交瘤细胞的抗体序列用于重组抗体生成,使用自培养的杂交瘤细胞分离的总RNA来生成cDNA,用于抗体可变区扩增的PCR模板。用于PCR的寡聚物基于小鼠V基因和J基因种系序列。为了将PCR产物直接亚克隆至哺乳动物表达载体,分别在正向和反向引物的5’和3’端中附加侧翼载体序列。用合并的种系寡聚物分开扩增重和轻链的可变区,在DNA凝胶上显现PCR产物以确认预期大小(重链400bp和轻链350bp)处的单一条带。
用In-Fusion(Clontech)试剂盒分别将纯化的重和轻链PCR产物克隆入pRK5P-小鼠IgG2a和pRK5P-小鼠卡帕载体。在转化连接产物之后,挑取数个单菌落用于DNA测序。比对DNA序列与IMGT种系数据库；选择具有共有序列的克隆并放大用于蛋白质表达。
为了确认重组抗体序列,将重和轻链质粒瞬时共转染入HEK293T细胞。表征纯化的重组IgG并与自杂交瘤培养物分离的IgG比较结合活性和亲和力。
测定了单克隆抗体105D11,43B5和48C1的重和轻链可变域的氨基酸序列,如图1和2中显示的。
通过BIAcore对抗独特型抗体结合阿特珠单抗的表征
使用BIAcoreTM-T2000仪器通过表面等离振子共振(SPR)测量抗PDL1抗ID抗体的结合亲和力。通过在CM5生物传感器芯片上包被的抗小鼠Fc抗体捕捉抗独特型抗体以实现大约200个响应单位(RU)。为了动力学测量,以30μl/min的流速于25℃在HBS-P+缓冲液(0.1MHEPES,1.5M NaCl,0.5％表面活性剂P20–GE Life Science)中注射500nM抗PDL1Fab或框架对照Fab(YW167B.43)(Genentech,South San Francisco,CA)。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合速率(ka)和解离速率(kd)。作为比koff/kon计算平衡解离常数(KD)。见表2。还见图3-5。表2:抗独特型抗体对阿特珠单抗的结合动力学
抗体 k<sub>a</sub> 1/(1/Ms) k<sub>d</sub> 1/(1/s) K<sub>D</sub>(M)
105D11 2.79E+05 4.50E-03 1.65E-08
43B5 9.50E+04 8.62E-03 9.07E-08
48C1 4.21E+05 9.77E-04 2.31E-09
实施例2:供免疫固定电泳测定法中使用的抗独特型抗体的筛选
在Sebia IFE平台上进行针对阿特珠单抗的抗独特型(抗ID)抗体的筛选以鉴定结合阿特珠单抗且在Sebia IFE平台上导致清晰的‘凝胶移位’的抗ID抗体。见图6。
简言之,依照用于操作,贮存和制备供凝胶电泳中使用的血清的标准实验室规程建立样品。依照制造商的指南设置HYDRASYS仪器。依照制造商规定的方案进行迁移方案和凝胶加工设置。
将阿特珠单抗(1500μg/mL)在PBS中重悬浮并与相应的抗ID抗体或假对照(单独的PBS)一起在摇动平台于室温预温育2小时。使用电泳将样品分开,电泳是使用MaxikitHydragel 41F或91F(Sebia,Norcross,GA,USA)在半自动Hydrasys或Hydrasys 2上实施的。然后遵照Sebia IFE方案,使用二抗,诸如IgG,Igκ,Igλ,IgA和/或IgM,依照制造商的说明书实施凝胶的免疫固定(IFE)。结果表明阿特珠单抗在临床测定法平台上是可检测的,而且阿特珠单抗加抗ID的特异性复合物能与单独的阿特珠单抗分开。如此,在添加抗阿特珠单抗(抗ID)抗体之后IgG/Igκ抗体的电泳迁移率的变化提供抗体的身份,即阿特珠单抗的证据。见图6。基于图6中显示的数据,选择抗体48C1,105D11和43B5,因为阿特珠单抗与这些抗体之一的复合物在Sebia IFE平台上展现清晰的凝胶移位。
当血清中阿特珠单抗的浓度升高时,抗ID抗体改变阿特珠单抗的电泳迁移率的能力取决于抗ID抗体的浓度和温育时间。见图8。当血清中阿特珠单抗的浓度为500μg/ml且温育时间为2小时时,对1:1比的阿特珠单抗:抗ID抗体观察到阿特珠单抗的完全凝胶移位。然而,血清中当阿特珠单抗的浓度升高至1000μg/ml时,需要1:4比的阿特珠单抗:抗ID抗体来导致阿特珠单抗的完全凝胶移位。见图8。
实施例3:在来自多发性骨髓瘤患者的血清样品中在M蛋白掺入物存在下检测阿特珠单抗
使用来自具有多发性骨髓瘤的患者的人血清样品。患者的样品在IFE之后显示可检测的血清中的IgA/IgκM蛋白掺入物(图7小图1道A和道K)。将患者的血清在下面的条件中预温育30分钟至2小时:1500μg/ml的单独的阿特珠单抗抗ID抗体48C1(图7小图2),1500μg/ml掺入的单独的阿特珠单抗(图7小图3),和各1500μg/ml的阿特珠单抗+阿特珠单抗抗ID抗体48C1(图7小图4)。使用Maxikit Hydragel 41F或91F(Sebia,Norcross,GA,USA)在半自动Hydrasys 2上实施免疫固定(IFE)测定法。依照制造商的说明书实施IFE测定法。分析数据以确定在例行用于多发性骨髓瘤患者中的临床响应评估的IFE测定法中阿特珠单抗抗ID抗体使阿特珠单抗条带移位的有效性。
在图7小图2中,将患者血清样品与阿特珠单抗抗ID抗体一起预温育。小图1与小图2的比较显示血清与阿特珠单抗抗ID抗体一起的预温育并不干扰患者的可检测的M蛋白的结果。
在图7小图3中,将患者血清样品与1500μg/ml的阿特珠单抗一起预温育。小图1与小图3的比较显示小图3中增加可检测的次要条带(箭道G和K)。这确认了大的生物学药物(诸如阿特珠单抗,它是IgG/Igκ人单抗)是可检测的且能干扰例行用于多发性骨髓瘤患者中的临床响应评估的IFE测定法的结果。
在图7小图4中,将患者血清样品与阿特珠单抗和阿特珠单抗抗独特型小鼠单抗克隆#48C1二者一起预温育。小图3与小图4(图7)的比较显示对掺有阿特珠单抗的血清样品添加阿特珠单抗抗独特型小鼠单克隆抗体导致抗独特型单克隆抗体和阿特珠单抗的结合复合物,由此在IFE凝胶上导致可检测的阿特珠单抗IgG和Igκ自较低至较高分子量的IgG和Igκ移位,而不扰乱M蛋白迁移(图7小图4道G和K)。
虽然为了清楚理解的目的已经通过举例说明较为详细地描述前述发明,但是描述和例子不应解读为限制本发明的范围。通过援引明确地完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
抗PD-L1独特型抗体氨基酸序列
抗独特型抗PD-L1抗体105D11轻链可变区氨基酸序列:
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPPTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:53)
抗独特型抗PD-L1抗体105D11重链可变区氨基酸序列:
EVQLVETGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARLVYYDYDDAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:54)
抗独特型抗PD-L1抗体43B5轻链可变区氨基酸序列:
DIKMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQGISSNIGWLQQKPGKSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:55)
抗独特型抗PD-L1抗体43B5重链可变区氨基酸序列:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNINPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARWGGNYEGWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:56)
抗独特型抗PD-L1抗体48C1轻链可变区氨基酸序列:
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSGYPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:57)
抗独特型抗PD-L1抗体48C1重链可变区氨基酸序列:
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARTIYYGYDDVMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:58)
抗独特型抗PD-L1抗体105D11轻链氨基酸序列:
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPPTFGGGTRLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:59)
抗独特型抗PD-L1抗体105D11重链氨基酸序列:
EVQLVETGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARLVYYDYDDAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:60)
抗独特型抗PD-L1抗体43B5轻链氨基酸序列:
DIKMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQGISSNIGWLQQKPGKSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:61)
抗独特型抗PD-L1抗体43B5重链氨基酸序列:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNINPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARWGGNYEGWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:62)
抗独特型抗PD-L1抗体48C1轻链氨基酸序列:
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSGYPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:63)
抗独特型抗PD-L1抗体48C1重链氨基酸序列:
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARTIYYGYDDVMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:64)
序列表
<110> 基因泰克公司（Genentech, Inc.）
<120> 针对抗PD-L1抗体的独特型抗体及其用途
<130> 146392038540
<140> 未指派
<141> 随本文
<150> US 62/447,886
<151> 2017-01-18
<150> US 62/452,934
<151> 2017-01-31
<160> 64
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 1
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 2
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 3
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 5
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 6
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 10
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 11
Val Ser Tyr Met His Trp Phe
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 12
Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 13
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 14
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 15
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 16
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 17
Ser Ser Asn Ile Gly Trp Leu
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 18
Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu
1 5 10
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 19
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 20
His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 21
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 22
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 23
Val Ser Tyr Met His Trp Phe
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 24
Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 25
Gln Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Pro Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
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Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
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<211> 7
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<220>
<223> 合成构建物
<400> 27
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<220>
<223> 合成构建物
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Gln Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Pro Thr Phe
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<223> 合成构建物
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<220>
<223> 合成构建物
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Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr
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<220>
<223> 合成构建物
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Ala Arg Leu Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Asp Ala
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<220>
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Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
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<220>
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Ser Ser Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> 合成构建物
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<211> 5
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<220>
<223> 合成构建物
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Ser Tyr Asp Met Ser
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<220>
<223> 合成构建物
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Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
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Gly
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<220>
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Thr Asp Tyr Ile Met Leu
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<220>
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<220>
<223> 合成构建物
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Ala Arg Trp Gly Gly Asn Tyr Glu Gly Trp Phe
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
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Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
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Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
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Trp Gly Gly Asn Tyr Glu Gly Trp Phe Ala Tyr
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<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
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Asp Tyr Ile Met Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 44
Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 45
Ser Ser Tyr Asp Met Ser
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<211> 13
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 46
Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 47
Ala Arg Thr Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Asp Val
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 48
Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 49
Ser Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 50
Thr Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Asp Val Met Asp Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 51
Ser Tyr Asp Met Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 52
Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 53
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 53
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 55
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 56
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Gly Gly Asn Tyr Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<211> 106
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 57
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 59
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 60
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
370 375 380
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 61
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 61
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 62
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 62
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Gly Asn Tyr Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile
210 215 220
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
245 250 255
Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
260 265 270
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
275 280 285
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
290 295 300
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
305 310 315 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
355 360 365
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
370 375 380
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
405 410 415
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
420 425 430
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 63
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 63
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 64
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
370 375 380
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
435 440 445
Pro Gly Lys
450

Claims (47)

1.一种特异性结合抗PD-L1抗体的分离的抗独特型抗体,其中该抗PD-L1抗体包含:
(a)轻链可变区,其包含:
(i)包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:1)的HVR-L1；
(ii)包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:2)的HVR-L2；和
(iii)包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:3)的HVR-L3；和
(b)重链可变区,其包含:
(i)包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:4)的HVR-H1；
(ii)包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的HVR-H2；和
(iii)包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:6)的HVR-H3。
2.权利要求1的分离的抗独特型抗体,其中该抗PD-L1抗体包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区,和/或包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区。
3.权利要求2的分离的抗独特型抗体,其中该抗PD-L1抗体包含包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链,和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链。
4.权利要求1-3任一项的分离的抗独特型抗体,其中该分离的抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:35)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列YISSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:36)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列LVYYDYDDAMDY(SEQ ID NO:34)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:14)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:15)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列QQRSSYPPTF(SEQ ID NO:16)。
5.权利要求1-4任一项的分离的抗独特型抗体,其中该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:54的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:53的序列的轻链可变区。
6.权利要求1-3任一项的分离的抗独特型抗体,其中该分离的抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列DYIML(SEQ ID NO:43)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列NINPYYGSTSYNLKFKG(SEQ ID NO:44)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列WGGNYEGWFAY(SEQ ID NO:42)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列HASQGISSNIG(SEQ ID NO:20)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列HGTNLED(SEQ ID NO:21)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列VQYAQFPLTF(SEQ ID NO:22)。
7.权利要求1-3和6任一项的分离的抗独特型抗体,其中该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:56的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:55的序列的轻链可变区。
8.权利要求1-3任一项的分离的抗独特型抗体,其中该分离的抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:51)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列YISSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:52)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列TIYYGYDDVMDY(SEQ ID NO:50)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:26)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列QQRSGYPPTF(SEQ ID NO:28)。
9.权利要求1-3和8任一项的分离的抗独特型抗体,其中该分离的抗独特型抗体包含包含SEQ ID NO:58的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:57的序列的轻链可变区。
10.权利要求1-9任一项的分离的抗独特型抗体,其中该分离的抗独特型抗体特异性结合该抗PD-L1抗体的至少一种HVR。
11.权利要求1-10任一项的分离的抗独特型抗体,其中该分离的抗独特型抗体是与异源模块或可检测模块缀合的。
12.权利要求11的分离的抗独特型抗体,其中该可检测模块是标记物或生物素。
13.一种包含权利要求1-12任一项的抗独特型抗体的组合物。
14.一种包含权利要求13的组合物的试剂盒。
15.一种编码特异性结合抗PD-L1抗体的抗独特型抗体的分离的核酸,其中该抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:35)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列YISSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:36)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列LVYYDYDDAMDY(SEQ ID NO:34)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:14)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:15)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列QQRSSYPPTF(SEQ ID NO:16)。
16.一种编码特异性结合抗PD-L1抗体的抗独特型抗体的分离的核酸,其中该抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列DYIML(SEQ ID NO:43)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列NINPYYGSTSYNLKFKG(SEQ ID NO:44)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列WGGNYEGWFAY(SEQ ID NO:42)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列HASQGISSNIG(SEQ ID NO:20)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列HGTNLED(SEQ ID NO:21)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列VQYAQFPLTF(SEQ ID NO:22)。
17.一种编码特异性结合抗PD-L1抗体的抗独特型抗体的分离的核酸,其中该抗独特型抗体包含包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3的重链可变区和包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区,其中:
(a)HVR-H1包含氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:51)；
(b)HVR-H2包含氨基酸序列YISSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:52)；
(c)HVR-H3包含氨基酸序列TIYYGYDDVMDY(SEQ ID NO:50)；
(d)HVR-L1包含氨基酸序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:26)；
(e)HVR-L2包含氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；且
(f)HVR-L3包含氨基酸序列QQRSGYPPTF(SEQ ID NO:28)。
18.一种编码权利要求1-10任一项的抗独特型抗体的分离的核酸。
19.一种包含权利要求15-18任一项的核酸的载体。
20.一种包含权利要求19的载体的宿主细胞。
21.权利要求20的宿主细胞,其是真核的。
22.权利要求21的宿主细胞,其是哺乳动物的。
23.权利要求22的宿主细胞,其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
24.权利要求20的宿主细胞,其是原核的。
25.权利要求24的宿主细胞,其是大肠杆菌。
26.一种用于生成抗独特型抗体的工艺,其包含在适合于编码该抗独特型抗体的载体表达的条件下培养权利要求20-25任一项的宿主细胞和回收该抗独特型抗体。
27.一种用于检测生物学样品中的抗PD-L1抗体的方法,其包含:
(a)使该生物学样品接触捕捉剂,其中该捕捉剂是权利要求13的组合物,由此形成免疫复合物；
(b)使来自(a)的免疫复合物接触结合该抗PD-L1抗体的可检测抗体；和
(c)通过检测该可检测抗体来测量结合至该组合物的该抗PD-L1抗体的水平。
28.一种用于检测生物学样品中的抗PD-L1抗体的方法,其包含:
(a)使该生物学样品接触捕捉剂,其中该捕捉剂是结合样品中存在的抗PD-L1抗体的权利要求1-12任一项的抗独特型抗体,由此形成免疫复合物；
(b)使来自(a)的免疫复合物接触结合该抗PD-L1抗体的可检测抗体；和
(c)通过检测该可检测抗体来测量结合至该抗独特型抗体的该抗PD-L1抗体的水平。
29.权利要求28的方法,其中该抗独特型抗体是固定化至固体支持物的且该方法进一步包含将该生物学样品与结合至该抗PD-L1抗体的该固定化的抗独特型抗体的分开的步骤。
30.权利要求29的方法,其中该固定化的抗独特型抗体是与生物素缀合且结合至链霉亲合素包被的微量滴定板的。
31.权利要求28的方法,其中该可检测抗体是结合人或人源化抗体的来自非人物种的抗体。
32.权利要求28的方法,其中该可检测抗体是直接可检测的,或是与辣根过氧化物酶缀合的,或是通过荧光计量或热量计量试剂来检测的。
33.权利要求27-32任一项的方法,其中该生物学样品是自人受试者分离的。
34.权利要求33的方法,其中该人受试者是已经用抗PD-L1抗体治疗的,该抗PD-L1抗体包含:
(a)轻链可变区,其包含:
(i)包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:1)的HVR-L1；
(ii)包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:2)的HVR-L2；
(iii)包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:3)的HVR-L3；和
(b)重链可变区,其包含:
(i)包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:4)的HVR-H1；
(ii)包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的HVR-H2；
(iii)包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:6)的HVR-H3。
35.权利要求28的方法,其中该方法进一步包含使用标准曲线与已知水平的该抗PD-L1抗体相比来测定该抗PD-L1抗体的水平。
36.权利要求27-35任一项的方法,其中该生物学样品是血液,血浆或血清。
37.一种用于特异性检测生物学样品中的抗PD-L1抗体的免疫测定法试剂盒,其包含:
(a)权利要求1-12任一项的抗独特型抗体或权利要求13的组合物；
(b)结合该抗PD-L1抗体的可检测抗体；和
(c)关于检测所述抗PD-L1抗体的用法说明书。
38.权利要求37的试剂盒,其中该试剂盒在用于检测该抗PD-L1抗体的免疫测定法中是有用的。
39.一种用于检测生物学样品中的抗PD-L1抗体的方法,其包含:
(a)使该生物学样品接触权利要求1-12任一项的抗独特型抗体或权利要求13的组合物,在容许该抗独特型抗体结合该抗PD-L1抗体以形成复合物的条件下进行；
(b)通过免疫固定电泳来分析该样品以比较已接触该抗独特型抗体的样品与未接触该抗独特型抗体的样品；
(c)检测该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在；其中已接触该抗独特型抗体的样品和未接触该抗独特型抗体的样品之间迁移的差异指示该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在。
40.一种用于检测生物学样品中的M蛋白的方法,其包含:
(a)使该生物学样品接触权利要求1-12任一项的抗独特型抗体或权利要求13的组合物,在容许该抗独特型抗体结合该抗PDL1抗体以形成复合物的条件下进行；
(b)通过免疫固定电泳来分析该样品以比较已接触该抗独特型抗体的样品与未接触该抗独特型抗体的样品；和
(c)检测该生物学样品中M蛋白的存在。
41.权利要求40的方法,其中步骤(b)导致该抗PD-L1抗体和该抗独特型抗体的复合物与该M蛋白分开。
42.权利要求40-41任一项的方法,其中在步骤(c)之前,该方法进一步包含测定条带是否是M蛋白的步骤,通过测定它的迁移是否受到添加该抗独特型抗体影响来进行。
43.权利要求39-42任一项的方法,其中该生物学样品是血液,尿液或血清。
44.一种用于监测抗PD-L1抗体治疗在受试者中的有效性的方法,其包含:
(a)使生物学样品接触权利要求1-12任一项的抗独特型抗体或权利要求13的组合物,在容许该抗独特型抗体结合该抗PD-L1抗体以形成复合物的条件下进行；其中该生物学样品来自该受试者,且其中该受试者具有多发性骨髓瘤且已经用该抗PD-L1抗体治疗；
(b)通过免疫固定电泳来分析该样品以比较已接触该抗独特型抗体的样品与未接触该抗独特型抗体的样品；
(c)检测该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在,其中已接触该抗独特型抗体的样品和未接触该抗独特型抗体的样品之间迁移的差异指示该生物学样品中该抗PD-L1抗体的存在；和
(d)检测该生物学样品中M蛋白的水平；其中该生物学样品中该M蛋白的水平指示该抗PD-L1抗体治疗的有效性。
45.权利要求44的方法,其中步骤(b)导致该抗PD-L1抗体和该抗独特型抗体的复合物与该M蛋白分开。
46.权利要求44-45任一项的方法,其中在步骤(d)之前,该方法进一步包含测定条带是否是M蛋白的步骤,通过测定它的迁移是否受到添加该抗独特型抗体影响来进行。
47.权利要求44-46任一项的方法,其中该生物学样品是血液,尿液,或血清。
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