CN110006724B - 采用巴氏和革兰氏染色方法检测滴虫用试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用巴氏和革兰氏染色方法检测滴虫用试剂，包括含有高浓度乙醇或/和甲醇或/和丙酮的试剂液，为保护滴虫鞭毛在染色过程中的形态完整性，在其试剂液中添加有1，2丙二醇、丙三醇、异丙醇中任一种或以上三种化合物中任意两种或三种物质混合液构成的保护剂。本发明通过对巴氏染色和革兰氏染色方法中的高浓度（90%以上的乙醇或甲醇或丙酮或以上物质的混合物）试剂进行改良，在保证两种染色方法特性的同时，保护滴虫的鞭毛不受破坏，使滴虫基本形态保持完整，从而提高了巴氏染色和革兰氏染色对滴虫的检测敏感度，增加了两种染色方法在临床上的适用范围。

Description

采用巴氏和革兰氏染色方法检测滴虫用试剂

技术领域

本发明涉及滴虫的临床检测，尤其是涉及一种采用巴氏染色和革兰氏染色方法检测滴虫用的检测试剂。

背景技术

滴虫是一种极微小有鞭毛的原虫生物，种类很多，其中人类主要感染的为阴道毛滴虫。阴道毛滴虫呈梨形或水滴形，约为多核白细胞的2～3倍大小，虫体顶端有鞭毛4根，体部有波动膜，后端有轴柱凸出，尾部有一根鞭毛。

阴道毛滴虫感染是妇科常见疾病的一种，在患者的阴道分泌物，宫颈分泌物以及宫颈液基细胞学样本中均可检测到滴虫的存在。临床上对滴虫进行检测的方法除通常使用的生理盐水镜检法外，也常用巴氏染色和革兰氏染色法对上述三种样本中的滴虫进行形态学检测。然而由于这两种染色方法在检测过程中均存在采用90%以上的高浓度乙醇（或甲醇或丙酮或以上物质的混合物）溶液对样本进行处理的步骤，极易导致构成滴虫鞭毛的主要成分蛋白质变性，鞭毛丧失韧性继而脱落，滴虫基本形态被破坏，极易导致滴虫漏检。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用巴氏染色和革兰氏染色方法检测滴虫用的检测试剂，该检测试剂在保证染色方法特性的同时，可保护滴虫形状完整，从而提高两种染色方法对滴虫的检测敏感度。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的采用巴氏和革兰氏染色方法检测滴虫用试剂，包括含有高浓度乙醇或/和甲醇或/和丙酮的试剂液，为保护滴虫鞭毛在染色过程中的形态完整性，在所述试剂液中添加有1，2丙二醇、丙三醇、异丙醇中任一种或以上三种化合物中任意两种或三种物质混合液构成的保护剂。

所述1，2丙二醇在试剂液中的浓度为5%-35%，所述丙三醇在试剂液中的浓度为5%-25%，所述异丙醇在试剂液中的浓度为5%-35%。

若采用巴氏染色方法时，所用的主要试剂及组分包括：苏木精染液（主要组份为苏木精、无水乙醇、硫酸铝钾溶、氧化汞和冰醋酸，主要溶剂为纯化水或蒸馏水），桔黄G6染液（主要组份为桔黄、磷钨，溶剂为乙醇），染液EA36（主要组份包括亮绿、裨士麦褐、伊红Y、磷钨酸、碳酸锂，溶剂为乙醇）或染液EA50（主要组份包括亮绿、纯甲醇、 伊红Y 、冰醋酸和磷钨酸，溶剂为乙醇），以及盐酸酒精分化液，反蓝液和用于和脱水的乙醇溶液等；

其中在桔黄G6染液、EA36或EA50染液以及用于固定和脱水的乙醇溶液中均添加有由1，2丙二醇、丙三醇、异丙醇中任一种或以上三种化合物中任意两种或三种物质混合液构成的保护剂。

染色流程同常规的巴氏染色方法，基本步骤有：固定、水洗、苏木精染核、盐酸酒精分化、返蓝、桔黄G6染色、酒精漂洗、EA试剂染色、酒精漂洗。

若采用革兰氏染色方法时，所用的主要试剂及组分包括：结晶紫（龙胆紫）染色液（主要组份为结晶紫，草酸铵和乙醇，溶剂为纯化水），碘染色液（主要组份为碘和碘化钾，溶剂为纯化水），脱色液（主要成份为丙酮和乙醇），沙黄（复红）染液（主要组份为沙黄、碱性品红和乙醇，溶剂为纯化水）；

其中在脱色液中添加有由1，2丙二醇、丙三醇、异丙醇中任一种或以上三种化合物中任意两种或三种物质混合液构成的保护剂。

染色方法与常规革兰氏染色方法基本相同，龙胆紫染液初染，碘液媒染，脱色，沙黄复染，应注意脱色时间不宜太长。

本发明的优点在于：通过对巴氏染色和革兰氏染色方法中的高浓度（90%以上的乙醇或甲醇或丙酮或以上物质的混合物）试剂进行改良，在保证两种染色方法特性的同时，保护滴虫的鞭毛不受破坏，使滴虫基本形态保持完整，从而提高了巴氏染色和革兰氏染色对滴虫的检测敏感度，增加了两种染色方法在临床上的适用范围。

附图说明

图1是使用巴氏染色方法采用本发明试剂染色后滴虫患者的白带样本显微镜下图。

图2是与图1同一样本使用常规巴氏染色方法染色后滴虫患者的白带样本显微镜下图。

图3是使用革兰氏染色方法采用本发明试剂染色后滴虫患者的白带样本显微镜下图。

图4是与图3同一样本用常规革兰氏染色方法染色后滴虫患者的白带样本显微镜下图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明方法做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。

实施例1 采用巴氏染色方法检测患者白带样本中的滴虫

一、试剂配制

1、苏木精染液：苏木精5g溶于50ml无水乙醇，硫酸铝钾100g溶于1000ml蒸馏水，混合后煮沸，稍微冷却后加入氧化汞2.5g，再煮沸2min，使用前加冰醋酸20ml，得到试剂A。

2、桔黄G6染液： 取桔黄G(orangeG6) 0.5g，溶于1，2丙二醇和95%乙醇水溶液的混合液（其中1，2丙二醇与95%乙醇水溶液的比例为1:4）100ml中, 加磷钨15mg，得到试剂B。

3、EA50：取3%亮绿水溶液10ml，纯甲醇250ml， 20%伊红Y 水溶液20ml，冰醋酸20ml，磷钨酸2g，无水乙醇500ml，1，2丙二醇200ml，将磷钨酸溶于少量纯化水中与以上其他液体混合、搅拌均匀，得到试剂C。

4、盐酸酒精分化液：蒸馏水300 ml与95%乙醇700 ml混合后加入浓盐酸5 ml混匀，得到试剂D。

5、返蓝液：在1000ml蒸馏水中溶入5ml氨水，混匀后得到试剂E。

6、固定及漂洗用乙醇溶液：取无水乙醇800ml和1，2丙二醇200ml混合，搅拌均匀，得到试剂F。

实际配制时，桔黄G6染液、EA（包括EA36或EA50）染液以及用于固定和脱水的乙醇溶液中所用的保护剂可选择使用1，2丙二醇、丙三醇、异丙醇中任一种，也可以采用以上三种化合物中任意两种或三种物质的混合液，其效果相同。

二、染色方法

1、将待染色涂片置于试剂F中固定10分钟以上时间；

2、将涂片浸入80%乙醇水溶液中45秒，水洗1分钟，甩干；

3、采用试剂A对涂片染色3分钟，水洗1分钟，甩干；

4、将涂片浸入试剂D中分化6秒，水洗1分钟，甩干；

5、将涂片浸入试剂E中处理6秒，水洗甩干；

6、将涂片置于试剂F中漂洗2分钟，水洗甩干；

7、将涂片浸入试剂B中染色3分钟，然后用试剂F漂洗1分钟；

8、将涂片浸入试剂C中染色3分钟，然后用试剂F漂洗1分钟；

9、用中性树脂对涂片封片，备用待检。

三、检测结果

采用100X油镜对上述涂片进行观察，结果如图1所示，滴虫呈水滴形，虫体顶部四根鞭毛清晰可见。

作为对比，将上述同一样本采用常规巴氏染色方法染色后，显微镜下观察结果如图2所示，滴虫的水滴形外观依然保持，但鞭毛结构完全丧失，易与白细胞等混淆。

对比结果证明，在桔黄G6染液、EA50以及固定及漂洗用乙醇溶液中添加了1，2丙二醇化合物后，其滴虫形状完整，极大提高了检测敏感度。

实施例2 采用革兰氏染色方法检测患者样本中的滴虫

一、配制试剂

1、龙胆紫染液：称取结晶紫1g，加入95%乙醇20ml，充分搅拌，使之彻底溶解得到A液；称取草酸铵1g，加入纯化水80ml，充分搅拌使之溶解，得到B液；将A液和B液混合，充分搅拌，静置24h后备用。

2、碘液：先将0.66g碘化钾溶于5ml蒸馏水中，然后加入0.33g碘使之完全溶解,再加蒸馏水至100mL，配成后贮于棕色瓶内备用。

3、脱色液：取丙三醇50ml，丙酮150ml，无水乙醇300ml，将三者混合，充分搅拌使之混匀，最终丙三醇在溶液中的含量为10%。

4、沙黄染液：取沙黄0.25g和碱性品红0.1g，加入10ml 95%乙醇，充分搅拌使之混匀，再加入90ml纯化水，充分搅拌，静置24h后过滤备用。

同样，实际配制时，脱色液中添加的保护剂可采用1，2丙二醇、丙三醇、异丙醇中任一种，也可以采用以上三种化合物中任意两种或三种物质组成的混合液，其效果相同。

二、染色方法

1、将待染色涂片用龙胆紫染液初染15秒，之后水洗；

2、将待染色涂片用碘液酶染15秒，之后水洗；

3、使用脱色液脱色直至涂片区域黑色或深蓝色褪去，之后水洗甩干；

4、将涂片用沙黄溶液复染10秒，水洗，在空气中晾干后待检。

三、检测结果

采用100X油镜对上述涂片进行观察，结果如图3所示，滴虫呈水滴形，虫体顶部四根鞭毛及尾部鞭毛清晰可见。

作为对比，将上述同一样本采用常规革兰氏染色方法染色后，显微镜下观察结果如图4所示，滴虫的水滴形外观基本保持，但鞭毛结构完全丧失，不能轻易分辨。

对比结果证明，在脱色液中添加了丙三醇化合物后，其滴虫形状完整，鞭毛结构清晰，不易出现漏检现象。

实施例3 临床使用统计

收集已确定滴虫感染的临床女性阴道分泌物206例，其中临床确诊为滴虫感染的为53例，其余153例为非滴虫感染样本，将这206例样本每份分别涂片4份，并尽可能保证每片涂片厚度均匀一致，使用本发明实施例1和实施例2所提供的方法分别进行巴氏染色和革兰氏染色制片，同时使用市场上应用较广的某商用革兰氏染色试剂和巴氏染色试剂对剩余两个涂片进行常规巴氏染色和革兰氏染色制片，使用100X油镜对上述四种方法制得的玻片进行观察，根据形态学特征对是否存在滴虫感染进行判读，对数据进行统计处理，所得结果如下表1-4所示：

表1 实施例1染色判读结果与临床诊断结果比较

结论：采用本发明实施例1的方法进行检测，滴虫检测敏感度为83%，特异性为100%。

表2 实施例2染色判读结果与临床诊断结果比较

结论：采用本发明实施例2的方法进行检测，滴虫检测敏感度为96.2%，特异性为100%。

表3 常规巴氏染色判读结果与临床诊断结果比较

结论：采用常规巴氏染色试剂进行检测，滴虫检测敏感度为35.9%，特异性为100%。

表4常规革兰氏染色判读结果与临床诊断结果比较

结论：采用常规革兰氏染色试剂进行检测，滴虫检测敏感度为50.9%，特异性为100%。

由以上实验对比数据可知，本发明所提供的巴氏染色和革兰氏染色试剂对阴道分泌物的滴虫感染检测敏感度较常规巴氏染色试剂和常规革兰氏染色试剂有明显提升，且并未影响常规染色方法原有的高特异性。

Claims (2)

1.一种采用巴氏和革兰氏染色方法检测滴虫用试剂，包括含有高浓度乙醇或/和甲醇或/和丙酮的试剂液，其特征在于：在所述试剂液中添加有1,2丙二醇、丙三醇、异丙醇中任一种、任意两种或三种构成的保护剂；其中：

采用巴氏染色方法时，在桔黄G6染液、EA染液以及用于固定和脱水的乙醇溶液中均添加有所述保护剂；

采用革兰氏染色方法时，在脱色液中添加有所述保护剂。

2.根据权利要求1所述的采用巴氏和革兰氏染色方法检测滴虫用试剂，其特征在于：所述1,2丙二醇在试剂液中的浓度为5%-35%，所述丙三醇在试剂液中的浓度为5%-25%，所述异丙醇在试剂液中的浓度为5%-35%。

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