CN110004153A

CN110004153A - 鸡重组CEBPγ蛋白、其编码DNA序列及应用

Info

Publication number: CN110004153A
Application number: CN201910304047.XA
Authority: CN
Inventors: 郁建锋; 顾志良; 胡悦; 付修虎; 吴炎; 李维亮; 刘雪
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu Institute of Technology
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明公开了一种编码鸡重组CEBPγ蛋白的DNA序列，还公开了含有上述DNA序列的重组表达载体和转基因重组大肠杆菌。本发明还公开了一种鸡重组CEBPγ蛋白及其制备方法与应用。相对现有技术，本发明所提供的鸡Cebpγ的基因DNA序列能在相应的温度和诱导剂浓度下实现其在大肠杆菌中的可溶性表达，重组蛋白的制备方法具有方法易行，操作简便，表达量高，成本低廉，通过本发明所提供的方法，可得到纯度较高的鸡CEBPγ重组蛋白。

Description

鸡重组CEBPγ蛋白、其编码DNA序列及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域中重组基因的原核表达和纯化方法，特别涉及鸡CEBPγ重组蛋白在大肠杆菌中表达和纯化的方法。

技术背景

Mcknight及其同事在1987年于大鼠肝脏中首先发现CEBPs家族，即CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,CEBPs)是一组属于碱性亮氨酸拉链(basicregion leucine zipper,bZIP)家族的转录调控因子，目前已发现6个成员：α、β、γ、δ、ε和ζ，CEBPs有多种功能，它们既可以通过C/EBPs家族成员形成异源多聚体或结合其他转录因子后作用对应的调控元件，从而在特定的组织或细胞中发挥其特异的作用，并形成一个复杂而精细的调控网络，在细胞增殖、分化、信号转导、肿瘤发生以及机体的免疫、应激反应、能量代谢、血液生成等方面发挥重要作用。CEBPγ作为CEBPs家族的一员，它含有靠近C端的一个DNA结合结构域，但缺少CEBPs家族蛋白的反式激活结构域，不能形成同源二聚体，而只能和其它的CEBPs家族成员形成异源二聚体，从而抑制被结合的CEBPs的转录活性，CEBPγ与CEBPβ形成异源二聚体可以促进细胞的增值、抑制衰老。CEBPβ通过PPARγ在脂肪细胞的早期生长和分化过程有着重要作用。在家禽生产中，脂肪沉积主要由脂肪细胞的增加和在脂肪细胞中脂滴的积累引起的细胞增大等原因所造成，脂肪沉积过度沉积会影响动物的健康、生殖繁育、瘦肉产出率，影响生产效率。因此，弄清楚鸡CEBPγ的结构及其在脂肪细胞生长分化中的功能将有利于在遗传育种水平解决鸡在饲养生产过程中由于过多脂肪积累带来的众多不利影响。本发明利用基因工程在大肠杆菌体系中表达鸡重组蛋白CEBPγ，可以深入解析其分子结构和为抗体制备准备重组的抗原，为进一步研究CEBPγ在家禽中的作用提供重要的物质保证。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种鸡CEBPγ重组蛋白的DNA序列。

本发明的另一个目的在于提供一种鸡CEBPγ重组蛋白。

本发明的又一个目的是提供一种含有所述的鸡CEBPγ重组蛋白的DNA序列的重组表达载体。

本发明的又一个目的是提供一种含有所述的鸡CEBPγ重组蛋白的DNA序列的转基因重组大肠杆菌。

本发明的又一个目的是提供一种鸡CEBPγ重组蛋白的制备方法及其应用。

技术方案：为了解决上述问题，本发明提供了一种鸡CEBPγ重组蛋白的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的鸡CEBPγ重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

将上述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达鸡CEBPγ重组蛋白的DNA的重组表达载体。其中，所述大肠杆菌表达载体为pET30a。

一种转基因重组大肠杆菌菌株，所述重组大肠菌株是将所述的重组表达载体转化至BL21(DE3)菌株中，筛选得到转基因重组大肠杆菌菌株。

一种鸡CEBPγ重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)根据GenBank中公布的鸡Cebpγ基因的蛋白质序列，通过优化该基因中的密码子，重新设计其基因的核苷酸序列(具体序列见seq1)，使其适应大肠杆菌的翻译体系的要求；

(2)将合成的鸡CEBPγ多肽的基因片段插入大肠杆菌表达载pET30a，并在C端添加6个His标签，得到重组表达载体pET30a-gCebpγ-hc；

(3)重组表达载体pET30a-gCebpγ-hc转化大肠杆菌BL21(DE3)，并通过卡那霉素筛选得到转基因重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)-pET30a-gCebpγ-hc；

(4)通过对温度和IPTG诱导浓度条件的优化实现鸡CEBPγ重组蛋白的可溶性表达；建立镍柱亲和层析一步法纯化得到高纯度的鸡CEBPγ重组蛋白。

本发明还公开了上述鸡CEBPγ重组蛋白在鸡畜牧研究和生产方面的应用。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明所提供的鸡Cebpγ的基因DNA序列能在相应的温度和诱导剂浓度下实现其在大肠杆菌中的可溶性表达，重组蛋白的制备方法具有方法易行，操作简便，表达量高，成本低廉，通过本发明所提供的方法，可得到纯度较高的鸡CEBPγ重组蛋白。其最主要优势在于：通过鸡Cebpγ基因片段的优化实现、提高了其在大肠杆菌中的表达，并实现了可溶性重组蛋白的表达，通过镍离子亲和层析一步纯化法，可得到高纯度的鸡C/EBPγ重组蛋白。

附图说明

图1：鸡Cebpγ基因优化片段GC含量分析结果(Y轴表示位点GC含量(window size为30bp)，X轴为寡核苷酸残基位点)；

图2：鸡Cebpγ基因优化片段密码子适应指数分析结果(Y轴为密码子在大肠杆菌中的相对使用频率，X轴表示每个密码子在基因片段中对应的位置)；

图3：鸡Cebpγ基因优化后重组蛋白的表达分析结果(M为Premixed ProteinMarker；1～4分别为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L IPTG 37℃条件下诱导4h的总菌裂解物，A为鸡C基因天然片段构建的重组菌，B为鸡C/EBPγ基因优化片段构建的重组菌)；

图4：鸡Cebpγ基因优化后重组蛋白的可溶性表达分析结果(M为PremixedProtein Marker；1为总菌裂解蛋白，2为菌体裂解上清，3为菌体裂解沉淀；A、B、C分别为在18℃条件下，不同浓度IPTG(终浓度依次为0、0.05、1.0mmol/L)的诱导结果)；

图5：鸡CEBPγ重组蛋白纯化结果(M为Premixed Protein Marker；1为BL21(DE3)-pET 30a空白菌株诱导裂解总蛋白(对照)，2为重组菌未诱导的菌体裂解总蛋白，3为重组菌诱导的菌体裂解总蛋白，4为重组菌诱导的菌体裂解上清，5为Ni柱纯化穿柱液，6为洗涤液，7～10分别为不同浓度的咪唑洗脱液(咪唑浓度依次为150、200、250、300mmol/L)；诱导条件：18℃，IPTG终浓度为0.05mmol/L，诱导12h)；

图6：重组蛋白CEBPγ的Western blot鉴定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

实施例1：一种鸡CEBPγ重组蛋白的优化表达及其制备方法

1.鸡Cebpγ基因的的表达序列的优化和合成

根据GenBank数据库提供的的鸡Cebpγ基因(NM_206859.1)的cDNA和蛋白序列，进行序列分析，以蛋白质在大肠杆菌中优势密码子、消除该基因转录成RNA模板二级结构和负性调控序列为原则，对鸡Cebpγ基因的cDNA序列的编码区序列进行优化，详见图1-2，根据图示可见，优化的基因片段的GC含量在51％左右，所选用的密码子偏向大肠杆菌的常用密码子。序列见SEQ ID NO:1，并在5′和3′分别添加Nde I和Xho I酶切位点序列，克隆入pET30a表达质粒，获得重组质粒pET30a-gCebpγ-hc。

SEQ ID NO:1

ATGAGCAAAACCAGCCCGCAAAATACCGCAACCGATGCAAACGGCGTTAGCGTTATCCATACCCAAGCACATAGTAGCGGTCTGCAACAAGTTCCGCAACTGGTTCCGGTTTCTCCGGGTGGTGGCGGTAAAGCAGTTCCGCCGAGTAAACAGGGCAAAAAGAACAGCTTCGTCGACCGCAACTCAGACGAATATCGTCAGCGTCGCGAACGTAACAACATGGCGGTCAAAAAATCCCGCCTGAAAAGCAAACAGAAAGCGCAGGATACCCTGCAACGCGTTACCCAACTGAAAGAAGAGAACGAGCGCCTGGAAGCGAAAATCAAACTGCTGACCAAAGAGCTGAGCGTCCTGAAAGACCTGTTTCTGGAACACGCACATAGCCTGGCAGATAACGTTCA ACCGGTTGGTACCGAAAGCACCACCACCTCTGCAGAAAATAGCGGTCAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

2.鸡Cebpγ基因重组表达菌BL21(DE3)-pET30a-gCebpγ-hc的构建

利用CaCl₂法将重组质粒转化入BL21(DE3)大肠杆菌中，50μg/mL的卡那霉素(kana)抗性筛选。挑取阳性菌落，37℃培养4h后，收集50μL的菌液，100℃加热15min，12,000rpm离心3min，以此裂解菌液为模板，用PCR法进行鉴定。

3.鸡CEBPγ重组蛋白的诱导表达

挑取PCR检测阳性菌接种于5mL含50μg/mL kana的LB培养基中，37℃、225rpm振荡培养12h，以1:25的比例将培养菌液接种至3mL新鲜的LB培养基(含50μg/mL的kana)中，37℃、225rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8，添加不同终浓度的IPTG，在37℃、225rpm振荡继续培养4h，取100μL培养液，12,000rpm离心3min，弃上清，收集菌体，加入100μL 1×SDS上样缓冲液，100℃加热15min，12,000rpm离心3min，取上清，以10％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定，结果如图3所示，Cebpγ基因经优化处理后，重组蛋白的表达量显著增加，而天然基因片段在大肠杆菌中基本没有检测到重组蛋白的表达。于是分别以0.05mmol/L和1.0mmol/L的IPTG诱导BL21(DE3)-pET30a-gCebpγ-hc在低温(18℃)进行重组蛋白诱导表达12h，进行重组蛋白的可溶性表达检测，结果如图4所示，重组蛋白虽然大部分形成了包涵体，但在裂解上清中明显可见重组蛋白，且0.05mmol/L诱导条件下的所得的可溶性重组蛋白明显高于0.1mmol/L所诱导的。

4.鸡CEBPγ重组蛋白的纯化

按0.05mmol/L的IPTG在18℃诱导重组菌表达可溶性CEBPγ蛋白12h，4℃12,000g离心10min，收集菌体沉淀。然后用平衡缓冲液(50mmol/L磷酸缓冲液，0.5mol/L NaCl，1mmol/L MgCl₂，80mmol/L咪唑，1mmol/L PMSF，1mmol/L MgCl₂，0.5％Tween-20，pH 7.2)将菌体洗涤一遍后，用含有2mg/mL溶菌酶的平衡缓冲液(即裂解液)重悬菌体，冰上振荡消化45min后，在550w功率下，超声工作时间2sec，工作间隔4sec，共10min，然后在冰水浴中静置10min后重复上述超声一次。4℃、12,000rpm离心45min；上清用0.45μm滤膜过滤收集上清。用平衡液洗涤平衡Ni-NTA亲和层析柱10个柱体积，将样品流穿Ni-NTA亲和层析柱吸附重组蛋白，以10个柱体积含100mmol/L咪唑的平衡缓冲液洗涤除去非特异性吸附的杂蛋白，然后分别以含150、200、250、300mmol/L咪唑的洗脱液(50mmol/L磷酸缓冲液，0.5mol/L NaCl，pH7.2)洗脱、收集目的蛋白。纯化结果如图5所示，Ni-NTA可以吸附裂解液中的可溶性重组蛋白，当咪唑浓度达到200mmol/L时，吸附的重组蛋白被洗脱流出，且随咪唑的浓度的增加，重组蛋白洗脱增加，纯度在99％以上。

对纯化后的鸡CEBPγ重组蛋白Western blot鉴定，结果如图6所示，其中，1为BL21(DE3)-pET 30a空白菌株诱导裂解总蛋白(对照)，2为重组菌未诱导的菌体裂解总蛋白，3为重组菌诱导的菌体裂解总蛋白，4为重组菌诱导的菌体裂解上清，5为Ni柱纯化穿柱液，6为洗涤液，7～10分别为不同浓度的咪唑洗脱液(咪唑浓度依次为150、200、250、300mmol/L)；一抗为兔抗6×His多肽抗体，检测结果显示在20KDa的位置得到检测条带，说明鸡的CEBPγ重组蛋白诱导表达和纯化成功。

序列表

<110> 常熟理工学院

<120> 鸡重组CEBP γ蛋白、其编码DNA序列及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcaaaa ccagcccgca aaataccgca accgatgcaa acggcgttag cgttatccat 60

acccaagcac atagtagcgg tctgcaacaa gttccgcaac tggttccggt ttctccgggt 120

ggtggcggta aagcagttcc gccgagtaaa cagggcaaaa agaacagctt cgtcgaccgc 180

aactcagacg aatatcgtca gcgtcgcgaa cgtaacaaca tggcggtcaa aaaatcccgc 240

ctgaaaagca aacagaaagc gcaggatacc ctgcaacgcg ttacccaact gaaagaagag 300

aacgagcgcc tggaagcgaa aatcaaactg ctgaccaaag agctgagcgt cctgaaagac 360

ctgtttctgg aacacgcaca tagcctggca gataacgttc aaccggttgg taccgaaagc 420

accaccacct ctgcagaaaa tagcggtcaa ctcgagcacc accaccacca ccactga 477

<210> 2

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Lys Thr Ser Pro Gln Asn Thr Ala Thr Asp Ala Asn Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Ile His Thr Gln Ala His Ser Ser Gly Leu Gln Gln Val Pro

20 25 30

Gln Leu Val Pro Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Lys Ala Val Pro Pro

35 40 45

Ser Lys Gln Gly Lys Lys Asn Ser Phe Val Asp Arg Asn Ser Asp Glu

50 55 60

Tyr Arg Gln Arg Arg Glu Arg Asn Asn Met Ala Val Lys Lys Ser Arg

65 70 75 80

Leu Lys Ser Lys Gln Lys Ala Gln Asp Thr Leu Gln Arg Val Thr Gln

85 90 95

Leu Lys Glu Glu Asn Glu Arg Leu Glu Ala Lys Ile Lys Leu Leu Thr

100 105 110

Lys Glu Leu Ser Val Leu Lys Asp Leu Phe Leu Glu His Ala His Ser

115 120 125

Leu Ala Asp Asn Val Gln Pro Val Gly Thr Glu Ser Thr Thr Thr Ser

130 135 140

Ala Glu Asn Ser Gly Gln His His His His His His

145 150 155

Claims

1.一种编码鸡重组CEBPγ蛋白的DNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种含有权利要求1所述鸡重组CEBPγ蛋白DNA序列的重组表达载体。

3.一种含有权利要求1所述鸡重组CEBPγ蛋白DNA序列的转基因重组大肠杆菌菌株。

4.权利要求1所述鸡重组CEBPγ蛋白DNA序列在制备鸡SIRT1重组蛋白中的应用。

5.一种鸡重组CEBPγ蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.权利要求5所述鸡重组CEBPγ蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据鸡Cebpγ基因编码的氨基酸多肽序列，结合密码子在大肠杆菌中的偏爱性和RNA二级结构的分析，优化鸡Cebpγ基因的cDNA片段；

(2)以步骤(1)中合成的片段构建pET30a-gCebpγ-hc重组表达载体；

(3)构建BL21(DE3)-pET30a-gCebpγ-hc重组菌株；

(4)鸡CEBPγ重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定。

7.权利要求5所述鸡CEBPγ重组蛋白在生产方面的应用。