CN110004043A - 一种单细胞捕获微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单细胞捕获微流控芯片，包括：功能层和盖片层；功能层包括：硅片本体和修饰在硅片本体上的多个功能区；多个功能区至少包括：样品进样及预处理区、捕获功能区和废液处理区；样品进样及预处理区由细胞液流入口、进口储液池、设置有微型分散柱的流入通道组成；捕获功能区由设置有缓冲柱和捕获阱阵列的微型反应池组成；废液处理区由设置有微型分散柱的流出通道、出口储液池及废液流出口组成；细胞液流入口与进口储液池连通；进口储液池借助于流入通道与微型反应池连通；微型反应池借助于流出通道与出口储液池连通；出口储液池与废液流出口连通。本发明提供的微流控芯片能够实现细胞载流液的均匀进样和单个细胞的芯片内捕获。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术领域，尤其涉及一种单细胞捕获微流控芯片。
背景技术
微流控技术自发展以来，广泛应用于理化分析及生物医疗等领域。微流控芯片基于微纳技术为微小尺度的研究提供了良好的平台，由于尺度相近，且分析效率高、通量高等特点，微芯片上的细胞分析具有众多优势，能够为医疗分析、药物筛选、机体监控等方面提供有效的研究基础和精准的分析结果。
在细胞分析中，针对于单细胞的分析在掌控细胞形态，为细胞在体内或离体状态下的精准测定等方向具有重要意义。区别于常规细胞群或者细胞球的组织分析，微器件的重点研究方向在于实现单个细胞的定位及分析，例如在细胞载流液中进行单细胞的捕获，以便于后续的功能性应用。
在现有技术中，有关于细胞捕获的微器件研究广泛。
中国发明专利CN107338183A中描述了一种细胞捕获装置，该装置通过设置过滤层，在过滤层上开有进出口横截面积不同的通孔实现细胞随流液的自动掉入而不容易流出，通过尺寸控制实现每个通孔内存留一个单细胞。但是该装置的功能实现依托于多层结构，因此在微纳加工过程中存在一定技术难点；且在较大流速条件下，由于流向与细胞不在同一垂直高度上，因此容易发生细胞被带出通孔的情况。
中国发明专利CN105441307A中描述了一种单细胞捕获芯片，该芯片通过设置液流层、弹性膜层和驱动机构实现高效的单细胞捕获功能，且实现较强的细胞定位功能，使单细胞不易从位点脱离。但是该芯片的功能实现较为复杂，需要配置驱动机构和弹性膜，在微纳加工工艺过程中需要较大的成本。
美国发明专利US20150004687A1中描述了一种细胞捕获装置，该装置通过设置筐体和过滤器，将过滤器配置于筐体内，实现细胞分散液的导入和CTC的过滤功能。但是该装置并未实现单细胞层次的捕获，通过微细贯通孔的过滤器对CTC进行过滤作用。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对现有存在的技术问题，本发明提供一种单细胞捕获微流控芯片，其芯片加工工艺流程简单，通过设置合理的分散柱、缓冲柱和捕获阱等结构，能够实现细胞载流液的均匀进样和单个细胞的芯片内捕获。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种单细胞捕获微流控芯片，包括：功能层和盖片层；
功能层包括：硅片本体和修饰在硅片本体上的多个功能区；
多个功能区至少包括：样品进样及预处理区、捕获功能区和废液处理区；
样品进样及预处理区由细胞液流入口、进口储液池、设置有微型分散柱的流入通道组成；
捕获功能区由设置有缓冲柱和捕获阱阵列的微型反应池组成；
废液处理区由设置有微型分散柱的流出通道、出口储液池及废液流出口组成；
细胞液流入口与进口储液池连通；
进口储液池借助于流入通道与微型反应池连通；
微型反应池借助于流出通道与出口储液池连通；
出口储液池与废液流出口连通；
盖片层与功能层通过封装组合。
优选地，进口储液池、流入通道、微型反应池、流出通道和出口储液池具有相同的深度H1；
微型分散柱、缓冲柱和捕获阱阵列具有相同的高度H2；
捕获阵列排布形式可根据具体应用进行调整，实现芯片灵活组合，提高应用性。
优选地，进口储液池和出口储液池为圆形或椭圆形。
优选地，流入通道和流出通道内的微型分散柱形状为圆柱体或椭圆柱体；
相邻微型分散柱沿流液方向错位设置。
优选地，深度尺寸H1和高度尺寸H2满足H1＞H2，且H1-H2＜单个细胞的直径。
优选地，缓冲柱为圆柱体、半圆柱体或椭圆柱体。
优选地，设置在靠近微型反应池与流入通道连通口一侧的缓冲柱数量逐列递增；
设置在靠近微型反应池与流出通道连通口一侧的缓冲柱数量逐列递减。
优选地，捕获阱阵列由各列相错布置的多个捕获阱组成；
捕获阱上设有细胞停留区和载流体导流区。
优选地，细胞停留区横向深度为H3，纵向宽度H4，尺寸满足H3≥单个细胞直径，H4＞单个细胞直径；
载流体导流区为缝隙结构，数量N为0～5条，缝隙宽度H5；
2μm＜H5＜单个细胞的直径；
在多条缝隙情况下，最外侧两条缝隙初始夹角0°≤θ＜180°。
优选地，功能层的材质为聚二甲基硅氧烷；
盖片层的材质为聚二甲基硅氧烷或玻璃。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：本发明提供的一种单细胞捕获微流控芯片具有以下有益效果：
(1)本发明中涉及的芯片只有单层，结构简单，大大缩减加工成本，且细胞在流体剪切力条件下能够稳固在捕获阱中，不易流出，功能实现较好。
(2)本发明中提供的微流控芯片能够实现单细胞在芯片内的定位捕获，通过参数设置，在0.1～0.5μl/s的细胞悬浮液入口速度范围内，本芯片的细胞捕获效率达到95％以上，达到细胞稳态捕获后，单次样品消耗量对比同等浓度细胞培养皿培养有效降低90％以上，本芯片应用于药物筛选、细胞研究等领域具有低消耗，高效率的特点。
附图说明
图1为本发明提供的一种单细胞捕获微流控芯片的三维结构示意图；
图2为本发明提供的一种单细胞捕获微流控芯片的三维结构沿图1A-A方向剖面结构示意图；
图3为本发明提供的一种单细胞捕获微流控芯片功能区的捕获阱的结构示意图。
【附图标记说明】
11：功能层；12：盖片层；111：细胞液流入口；112：进口储液池；113：流入通道微型分散柱；114：缓冲柱；115：捕获阱；116：流出通道微型分散柱；117：出口储液池；118：废液流出口。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
如图1所示：本实施例中公开了一种单细胞捕获微流控芯片，包括：功能层11和盖片层12。
其中，功能层11包括：硅片本体和修饰在硅片本体上的多个功能区；
这里所述的多个功能区至少包括：样品进样及预处理区、捕获功能区和废液处理区。
具体地，本实施例中的样品进样及预处理区由细胞液流入口111、进口储液池112、设置有微型分散柱的流入通道组成。
捕获功能区由设置有缓冲柱和捕获阱阵列的微型反应池组成；废液处理区由设置有微型分散柱的流出通道、出口储液池117及废液流出口118组成；细胞液流入口111与进口储液池112连通。
进口储液池112借助于流入通道与微型反应池连通；微型反应池借助于流出通道与出口储液池117连通；出口储液池117与废液流出口118连通；盖片层12与功能层11通过封装组合。
应说明的是：本实施例中所述的微流控芯片能够实现单细胞在芯片内的定位捕获，通过参数设置，在0.1～0.5μl/s的细胞悬浮液入口速度范围内，本芯片的细胞捕获效率达到95％以上，达到细胞稳态捕获后，单次样品消耗量对比同等浓度细胞培养皿培养有效降低90％以上。
将细胞载流液通通过细胞液流入口111进入进口储液池112内，然后进口储液池112内的细胞借助于设置有微型分散柱的流入通道进入微型反应池内，通过设置在微型反应池内的捕获阱115阵列捕获单个细胞，用以试验分析，剩余的废液通过流出通道进入出口储液池117内，最后借助于废液流出口118排出所述微流控芯片。
应补充的是：这里所述的捕获功能区由大阵列捕获阱115组成，能够实现高通量样品输运及高效率细胞捕获；捕获阵列排布形式可根据具体应用进行调整，实现芯片灵活组合，提高应用性。
如图2所示：本实施例中的进口储液池112、流入通道、微型反应池、流出通道和出口储液池117具有相同的深度H1；流入通道微型分散柱113、流出通道微型分散柱116、缓冲柱114和捕获阱115阵列具有相同的高度H2。
捕获阵列排布形式可根据具体应用进行调整，实现芯片灵活组合，提高应用性。
应说明的是：本实施例中所述的进口储液池112和出口储液池117可以设置为圆形或椭圆形。
本实施例中流入通道和流出通道内的微型分散柱形状为圆柱体或椭圆柱体；相邻微型分散柱沿流液方向错位设置。
这里应说明的是本实施例子中的深度尺寸H1和高度尺寸H2满足H1＞H2，且H1-H2＜单个细胞的直径。
上述缓冲柱为圆柱体、半圆柱体或椭圆柱体。
本实施例中设置在靠近微型反应池与流入通道连通口一侧的缓冲柱114数量逐列递增；比如第一列为1，第二列为2或3，第三列为3或4等。
设置在靠近微型反应池与流出通道连通口一侧的缓冲柱114数量逐列递减。与流入通道连通口一侧的设置正好对称布置。
本实施例中捕获阱115阵列由各列相错布置的多个捕获阱115组成；
捕获阱115上设有细胞停留区和载流体导流区。
如图3所示：本实施例中细胞停留区横向深度为H3，纵向宽度H4，尺寸满足H3≥单个细胞直径，H4＞单个细胞直径；载流体导流区为缝隙结构，数量N为0～5条，缝隙宽度H5；2μm＜H5＜单个细胞的直径。
具体地，在多条缝隙情况下，最外侧两条缝隙初始夹角0°≤θ＜180°。
最后，应说明的是：功能层11的材质为聚二甲基硅氧烷；盖片层12的材质为聚二甲基硅氧烷或玻璃。
实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
以下实施例1～3中：
1、单细胞捕获微流控芯片的制备工艺如下：
(1)硅片清洗：硅片标准清洗，放置200℃电热板15min，烘干；
(2)硅片修饰：硅片置于挥发缸中，滴入1～2滴修饰试剂HMDS(Hexamethyldisilazane)，挥发处理时间≥3min；
(3)硅片甩胶：光刻胶倒在处理后的硅片上，依据所需要的图案深度或高度来设置甩胶转速，匀胶后静置1～2min；
(4)硅片曝光：前烘处理通过确定所使用光刻胶的性能来设置前烘时间；曝光过程需要考虑曝光机功率及材料所需计量进行设定曝光时间；曝光过后，确定取出模板确定中烘时间，进行中烘处理；
(5)显影：待放置冷却后，将其放入显影液中；具体时间根据效果设置，过程中显影2～3次，放置通风厨内，用氮气吹干；
(6)脱模剂处理：将硅片放置于挥发缸中，滴入1～2滴修饰试剂tmcs(Trimethylchlorosilane)，挥发处理，模具加工完成。
(7)PDMS胶制备：配胶及匀胶；
(8)修饰：将处理好的硅片放置挥发缸中，以1～2滴修饰剂(甲基氯硅烷)滴入进行修饰过程约3min；
(9)倒胶：使用锡纸在皿内铺匀，放置好硅片模具，将硅片轻轻压实后倒胶，使硅片上的胶无气泡；
(10)干燥：85℃恒温干燥箱内干燥约30min；
(11)剥胶：稍冷却后取出，去除锡纸，小心揭下PDMS，将固化后的PDMS与硅片分离；
(12)切割与打孔：用切割刀沿着芯片外框切割，保证芯片结构完整，打孔器打孔；
(13)清理与镜检：清洗芯片，用显微镜观察芯片通道是否合格；
(14)键合与质检：等离子处理机，处理需要键合的芯片表面，并将被处理的两面贴合，显微镜下检察芯片的键合情况；
(15)烘烤：放入65℃恒温干燥箱内过夜烘烤。
2、样品溶液配置：
(1)细胞液培养液配置：RPMI-1640培养基，胎牛血清，青霉素-链霉素双抗，三者以100:10:1的体积容量配比；
(2)细胞提取：二氧化碳培养箱内取出培养的海拉细胞，加入胰蛋白酶进行细胞消化，将贴壁细胞进行分离，单次用量2ml，对于分离好的混合液进行离心，800r/min离心3分钟去除上清液，加入培养基4ml，得到单次实验细胞悬浮液。
实施例1
用上述方式制备微流控芯片(后面的微流控芯片均简称为芯片)，其中尺寸参数及其他参数为：H1＝H2＝20μm，H3＝16μm，H4＝16μm，H5＝5μm，N＝0。将芯片用注射泵先后通入去离子水和磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行清洗。将细胞载流液通入芯片，控制注射速度为0.1μl/s，将芯片置于显微镜下观察，最终实现单细胞在捕获阱中的捕获。通过本发明的实施方式1，单细胞在捕获阱阵列中的捕获效率达到96％，单次样品消耗量对比同等浓度细胞培养皿培养有效降低90％以上。
实施例2
用上述方式制备微流控芯片，其中尺寸参数及其他参数为：H1＝H2＝20μm，H3＝16μm，H4＝16μm，H5＝5μm，N＝1。将芯片用注射泵先后通入去离子水和磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行清洗。将细胞载流液通入芯片，控制注射速度为0.2μl/s，将芯片置于显微镜下观察，最终实现单细胞在捕获阱中的捕获。通过本发明的实施方式2，单细胞在捕获阱阵列中的捕获效率达到96％，单次样品消耗量对比同等浓度细胞培养皿培养有效降低95％以上。
实施例3
用上述方式制备微流控芯片，其中尺寸参数及其他参数为：H1＝H2＝20μm，H3＝16μm，H4＝16μm，H5＝5μm，N＝2。将芯片用注射泵先后通入去离子水和磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行清洗。将细胞载流液通入芯片，控制注射速度为0.2μl/s，将芯片置于显微镜下观察，最终实现单细胞在捕获阱中的捕获。通过本发明的实施方式3，单细胞在捕获阱阵列中的捕获效率达到98％，单次样品消耗量对比同等浓度细胞培养皿培养有效降低95％以上。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，这些描述只是为了解释本发明的原理，不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种单细胞捕获微流控芯片，其特征在于，
包括：功能层和盖片层；
功能层包括：硅片本体和修饰在硅片本体上的多个功能区；
多个功能区至少包括：样品进样及预处理区、捕获功能区和废液处理区；
样品进样及预处理区由细胞液流入口、进口储液池、设置有微型分散柱的流入通道组成；
捕获功能区由设置有缓冲柱和捕获阱阵列的微型反应池组成；
废液处理区由设置有微型分散柱的流出通道、出口储液池及废液流出口组成；
细胞液流入口与进口储液池连通；
进口储液池借助于流入通道与微型反应池连通；
微型反应池借助于流出通道与出口储液池连通；
出口储液池与废液流出口连通；
盖片层与功能层通过封装组合。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，
进口储液池、流入通道、微型反应池、流出通道和出口储液池具有相同的深度H1；
微型分散柱、缓冲柱和捕获阱阵列具有相同的高度H2。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，进口储液池和出口储液池为圆形或椭圆形。
4.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，
流入通道和流出通道内的微型分散柱形状为圆柱体或椭圆柱体；
相邻微型分散柱沿流液方向错位设置。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，深度尺寸H1和高度尺寸H2满足H1＞H2，且H1-H2＜单个细胞的直径。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，缓冲柱为圆柱体、半圆柱体或椭圆柱体。
7.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，设置在靠近微型反应池与流入通道连通口一侧的缓冲柱数量逐列递增；
设置在靠近微型反应池与流出通道连通口一侧的缓冲柱数量逐列递减。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，捕获阱阵列由各列相错布置的多个捕获阱组成；
捕获阱上设有细胞停留区和载流体导流区。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，
细胞停留区横向深度为H3，纵向宽度H4，尺寸满足H3≥单个细胞直径，H4＞单个细胞直径；
载流体导流区为缝隙结构，数量N为0～5条，缝隙宽度H5；
2μm＜H5＜单个细胞的直径；
在多条缝隙情况下，最外侧两条缝隙初始夹角0°≤θ＜180°。
10.根据权利要求9所述的微流控芯片，其特征在于，功能层的材质为聚二甲基硅氧烷；
盖片层的材质为聚二甲基硅氧烷或玻璃。
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