CN119979711A - 一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码rna的单分子检测试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒及用途，所述单分子检测试剂盒的制备方法为：将piRNA‑36026和lncRNA‑DSCAM‑AS1、哑铃探针‑pi、哑铃探针‑lnc、引物‑pi、引物‑lnc、dNTP混合液、ThermoPol反应缓冲液、Bst DNA聚合酶(大片段)的反应溶液孵育；将反应产物加入含有信号探针1、信号探针2、NEBuffer4反应缓冲液、T7核酸外切酶的反应溶液中，孵育，得到单分子检测试剂盒。本发明利用高效的自动级联机制和高信噪比的单分子检测实现了灵敏的多种ncRNAs的同时检测，具有高灵敏度、良好的选择性和多路分析能力。
Description
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，特别涉及一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒及其制备方法和用途。
背景技术
作为一个主要的公共卫生问题，癌症每年在全世界造成1000多万人死亡，主要原因是诊断晚和肿瘤转移。非编码RNA(ncRNAs)是大量转录的“黑色物质”，不能编码蛋白质信息，它们在复杂的生物过程中起着至关重要的作用。ncRNAs被认为是多种癌症类型的肿瘤抑制因子和致癌驱动因子。根据长度，ncRNAs可分为两大类：短链非编码RNA(<200nt)，包括microRNA(miRNAs)、小干扰RNA(siRNAs)和piwi相互作用RNA(piRNAs)；长链非编码RNA(lncRNAs，>200nt)。早期研究证实，血清和血浆中含有大量来自各种组织/器官的上调或下调的miRNAs，使其成为液体活检策略中非常有价值的生物标志物。近年来，lncRNAs和piRNAs作为癌症诊断、分类和治疗评价的重要生物标志物逐渐受到广泛关注。例如，lncRNAs可以通过竞争性结合miRNA应答元件(MREs)来调节基因表达和RNA剪接事件，从而促进肿瘤细胞的增殖和迁移。lncRNAs也参与病毒感染和随后的抗病毒免疫反应。在转录水平上，piRNAs可以引导Piwi蛋白和辅因子与初级转座子转录物结合，并通过DNA/组蛋白甲基化诱导异染色质的产生，抑制转座子转录。在转录后水平，piRNAs可以指导Piwi蛋白切割转座子mRNA，从而阻止转座子翻译。此外，PIWI-piRNA通路甚至调控lncRNA的表达，导致lncRNA的降解。越来越多的证据表明，lncRNA和piRNA的异常表达水平与多种人类癌症的发病机制有关，如胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌和结直肠癌。值得注意的是，由于lncRNA具有抗RNase A的特性和高稳定性(半衰期为16小时)，lncRNA稳定存在于血液、尿液、唾液、脑脊液和一些细胞源性外泌体中，piRNA3’端的2’-O-甲基化修饰甚至可以保护piRNAs在复杂的生物基质中不被降解/氧化。因此，准确检测多种ncRNAs(如lncRNAs和piRNAs)对癌症生物学和精准医学具有重要意义。
现有的ncRNAs分析策略包括northern印迹法，微阵列，逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和RNA测序，但它们不可避免地受到危险的放射性标记，耗时和劳动密集型程序，大量样本消耗，灵敏度差和复杂的数据分析的影响。为了克服这些限制，几种基于核酸的扩增策略，如T7 RNA聚合酶介导的信号扩增、滚环扩增(RCA)、靶诱导的链间连接反应和杂交链反应(HCR)已被纳入光学和电化学方法中用于ncRNAs检测。尽管这些策略提高了灵敏度，但仍存在一些不可避免的缺点：(1)多酶辅助级联扩增系统依赖于多种酶的良好调节孵育条件(如pH、反应温度和离子浓度)，不可避免地增加了实验的复杂性；(2)涉及多步骤实验方案(如修改、分离和洗涤步骤)可能会导致信号泄漏和再现性差的风险。因此，开发一种灵敏且可靠的方法来同时检测多种ncRNAs是非常必要的。
引物交换反应(PER)由于其简单、可编程和易于控制，在生物传感和生物成像领域是一种强大的扩增策略。PER策略可以实现任意单链DNA(ssDNA)的等温自主合成，仅使用发夹作为催化模板，短DNA引物(7-9nt)和链置换聚合酶(例如，KF聚合酶和Bst DNA聚合酶)，而无需参与多种酶和复杂的探针设计。
发明内容
本发明的目的是提供一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒及用途，通过制备一种单分子检测试剂盒，用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将piRNA-36026和lncRNA-DSCAM-AS1、哑铃探针-pi、哑铃探针-lnc、引物-pi、引物-lnc、dNTP混合液、ThermoPol反应缓冲液、Bst DNA聚合酶(大片段)的反应溶液孵育；
其中，piRNA是与Piwi蛋白相互作用的核糖核酸；
lncRNA是长链非编码核糖核酸；
Bst DNA聚合酶(大片段)是嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶蛋白的一部分，该酶具有5′→3′聚合酶活性，但缺失5′→3′核酸外切酶活性；
ThermoPol反应缓冲液为Bst DNA聚合酶(大片段)产品中自带的反应缓冲液；
dNTP混合液是由超纯dATP、dCTP和dTTP组成的等摩尔溶液；
步骤2，将步骤1的反应产物加入含有信号探针1、信号探针2、NEBuffer4反应缓冲液、T7核酸外切酶的反应溶液中，孵育，得到单分子检测试剂盒；
其中，T7核酸外切酶是一种双链DNA特异性外切酶，从5’到3’方向的线性或缺口双链DNA上催化去除核苷酸；
NEBuffer4反应缓冲液为T7核酸外切酶产品中自带的反应缓冲液。
所述步骤1中，将不同浓度的piRNA-36026和和lncRNA-DSCAM-AS1、10nM哑铃探针-pi、10nM哑铃探针-lnc、100nM引物-pi、100nM引物-lnc、100μM的dNTP混合液、1×ThermoPol反应缓冲液、4U Bst DNA聚合酶(大片段)的20μL反应溶液在37℃下孵育60分钟。
所述步骤2中，将反应产物加入含有300nM信号探针1、300nM信号探针2、1×NEBuffer4反应缓冲液、10U T7核酸外切酶的反应溶液中，在37℃下孵育30min。
所述ThermoPol反应缓冲溶液包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.8。所述NEBuffer4反应缓冲溶液包括500mM Kac，200mM Tris-Ac，100mM Mg(Ac)2，10mM DTT，pH 7.9。
所述piRNA-36026序列为GGC CCCAUG GUG UAAUGG UCAGCACUC。
所述lncRNA-DSCAM-AS1序列为：CUU UGG GAG GCU GAG GCA GG。
所述哑铃探针-pi序列为：ACT AAA TTC AGG GCC TTT TGG CCC TGA ATT TAG TAATAA GAG AGG CCC GAG TGC TGA CCA TTA CAC CAT GGG GCC TCT CTT AT/Inverted dT/。
所述探针哑铃探针-lnc序列为：ATTATTAAC AGG GCC TTT TGG CCC TGT TAATAATTAGTG TAA CTT TGG CCT GCC TCA GCC TCC CAAAGT TAC ACTA/Inverted dT/。
所述探针引物-pi序列为：TTT TTT TCT CTT ATT。
所述探针引物-lnc序列为：TTT TTT TTA CAC TA。
所述探针信号探针1序列为：FAM-TGA ATT TAG TTA TAA GAG A-BHQ1。
所述探针信号探针2序列为：Cy5-TGT TAA TAA TAA GTG TAA-BHQ2。
一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒。
所述的可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒在制备用于检测活细胞和乳腺组织中的多种ncRNAs的单分子检测试剂盒的用途。
所述单分子检测试剂盒能同时定量活细胞和乳腺组织中piR-36026和DSCAM-AS1的表达，并能区分乳腺癌患者和健康人ncRNA的表达水平。
所述单分子检测试剂盒用于灵敏地检测非编码RNA，对于piR-36026的检测限为44.67aM，DSCAM-AS1的检测限为45.71aM。
有益效果：本发明提供了一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒及用途，开发了一种可编程的自动级联机制，用于检测活细胞和乳腺组织中的多种ncRNAs(即piR-36026和DSCAM-AS1)的单分子检测。该分析具有几个明显的优点：(1)输入的目标ncRNAs可以通过PER级联自主且均匀地扩增到功能性ssDNA探针输出中，而无需额外的逆转录，有效地消除了基因组DNA的污染；(2)设计的哑铃探针将靶ncRNA识别与PER级联集成在一个探针中，由于哑铃探针的完美折叠，使该检测具有极低的背景；(3)可编程自动级联机制与单分子成像的集成使该检测具有更高的灵敏度；(4)整个放大机制可在恒定温度下进行，避免了在多个温度之间繁琐切换的必要性。利用自动级联机制的高效率和单分子成像的高信噪比，该方法具有高灵敏度、良好的选择性和多路分析能力。该方法能同时定量活细胞和乳腺组织中piR-36026和DSCAM-AS1的表达，并能区分乳腺癌患者和健康人ncRNA的表达水平。重要的是，通过重编程哑铃探针的识别序列，所提出的检测方法可以用于检测其他癌症相关的ncRNA，为多路检测和早期临床诊断提供新的范例。
附图说明
图1：将可编程自动级联机制与单分子检测相结合实现同时检测多个ncRNA的示意图。
图2：A为由piR-36026引发的PER级联产物12％非变性PAGE分析；B为由DSCAM-AS1启动的PER级联产物12％非变性PAGE分析；C为piR-36026存在时(绿色曲线)和不存在时(浅绿色曲线)FAM荧光发射光谱；D为DSCAM-AS1存在时(红色曲线)和不存在时(浅红色曲线)Cy5荧光发射光谱。
图3：A为不同浓度piR-36026诱导的FAM计数测定；B为FAM计数与piR-36026浓度的对数呈线性关系；C为不同浓度DSCAM-AS1诱导的Cy5计数测定；D为Cy5计数与DSCAM-AS1浓度对数的线性关系。
图4：分别测定由piR-36026+DSCAM-AS1、piR-36026、DSCAM-AS1、miR-210、circMTO1、piR-36743、piR-823、HOTAIR、MALTAL和不含RNA的对照组产生的FAM和Cy5计数。
图5：A为分别测定HCT-116细胞、HepG-2细胞、MCF-7细胞、Hela细胞、A549细胞和MCF-10A细胞响应的FAM(绿色柱)和Cy5(红色柱)计数；B为通过qRT-PCR分别测定HCT-116细胞、HepG-2细胞、MCF-7细胞、Hela细胞、A549细胞和MCF-10A细胞中piR-36026(蓝色列)和DSCAM-AS1(粉色列)的水平；C为FAM计数与piR-36026浓度的线性关系；D为Cy5计数与DSCAM-AS1浓度的线性关系。
图6：A为临床乳腺组织中ncRNA的测定；B和C分别为乳腺癌患者组织和健康人组织中piR-36026(B)和DSCAM-AS1(C)的热图分析；D和E分别为乳腺癌患者组织和健康人组织中piR-36026(D)和DSCAM-AS1(E)的箱形图分析；F为ROC曲线和AUC值显示了该试验对乳腺癌的预测能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更进一步的解释。
试剂和材料：
所有寡核苷酸由生工生物科技有限公司(中国上海)合成并高效液相色谱纯化。Bst DNA聚合酶(大片段)，10×ThermoPol反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.8)，T7核酸外切酶，10×NEBuffer4(500mMKAc,200mM Tris-Ac,100mM Mg(Ac)2，10mM DTT，pH7.9)，dATP，dCTP和dTTP购自新英格兰生物实验室(Ipswich，MA，USA)。二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水购自生工生物科技有限公司(中国上海)。人结肠癌细胞系(HCT-116细胞)、人肝癌细胞系(HepG-2细胞)、人乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)、人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)、人肺腺癌细胞系(A549细胞)、人乳腺正常细胞系(MCF-10A细胞)购自中国科学院上海生物科学研究所细胞库。乳腺患者和健康人的乳腺组织石蜡包埋标本取自南京鼓楼医院(中国南京)，实验经南京鼓楼医院伦理委员会批准。
荧光光谱的检测和实际样品的测量：
反应产物的荧光强度采用FLS-1000荧光光谱仪(英国利文斯顿爱丁堡仪器公司)测定。在激发波长488nm激发波长处测量FAM荧光发射光谱，记录520nm处荧光强度用于定量分析piR-36026。在635nm激发波长处测量Cy5荧光发射光谱，记录662nm荧光强度用于DSCAM-AS1的定量分析。根据制造商的程序，使用miRNeasy FFPE试剂盒从人体组织样本中提取总RNA。将所得提取物转移到新鲜试管中，并立即用于检测piR-36026/DSCAM-AS1的活性。
凝胶电泳：
用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶在1×TBE缓冲液(9mM Tris-HCl,9mM硼酸，0.2mMEDTA,pH 7.9)中，以1×SYBR Gold为荧光指示剂，在110V恒定电压下，在室温下观察50min，对目标诱导的聚合转录产物进行分析。使用ChemiDocTM和ChemiDoc MP成像系统对凝胶进行分析。
本发明开发了一种可编程的自动级联机制，用于实现活细胞和乳腺组织中的多种ncRNA(即piR-36026和DSCAM-AS1)的单分子检测。该分析具有几个明显的优点：(1)输入的目标ncRNAs可以通过PER级联自主且均匀地扩增到功能性ssDNA探针输出中，而无需额外的逆转录，有效地消除了基因组DNA的污染；(2)设计的哑铃探针将靶ncRNA识别与PER级联集成在一个探针中，由于哑铃探针的完美折叠，使该检测具有极低的背景；(3)可编程自动级联机制与单分子成像的集成使该检测具有更高的灵敏度；(4)整个放大机制可在恒定温度下进行，避免了在多个温度之间繁琐切换的必要性。利用自动级联机制的高效率和单分子成像的高信噪比，该方法具有高灵敏度、良好的选择性和多路分析能力。该方法能同时定量活细胞和乳腺组织中piR-36026和DSCAM-AS1的表达，并能区分乳腺癌患者和健康人ncRNA的表达水平。重要的是，通过重编程哑铃探针的识别序列，所提出的检测方法可以用于检测其他癌症相关的ncRNA，为多路检测和早期临床诊断提供新的范例。
实施例1：
一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将不同浓度的piRNA-36026和lncRNA-DSCAM-AS1、10nM哑铃探针-pi、10nM哑铃探针-lnc、100nM引物-pi、100nM引物-lnc、100μM的dNTP混合液、1×ThermoPol反应缓冲液、4U Bst DNA聚合酶(大片段)的20μL反应溶液在37℃下孵育60分钟。
其中，piRNA是与Piwi蛋白相互作用的核糖核酸；
lncRNA是长链非编码核糖核酸；
Bst DNA聚合酶(大片段)是嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶蛋白的一部分。该酶具有5′→3′聚合酶活性，但缺失5′→3′核酸外切酶活性。
ThermoPol反应缓冲液为Bst DNA聚合酶(大片段)产品中自带的反应缓冲液；
dNTP混合液是由超纯dATP、dCTP和dTTP组成的等摩尔溶液。
步骤2，将反应产物加入含有300nM信号探针1、300nM信号探针2、1×NEBuffer4反应缓冲溶液、10U T7核酸外切酶的反应溶液中，在37℃下孵育30min后进行后续测量。
其中，T7核酸外切酶是一种双链DNA特异性外切酶，从5‘到3’方向的线性或缺口双链DNA上催化去除核苷酸；
NEBuffer4反应缓冲液为T7核酸外切酶产品中自带的反应缓冲液。
ThermoPol反应缓冲溶液包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mMMgSO4，1％Triton X-100，pH 8.8。
NEBuffer4反应缓冲溶液包括500mM KAc，200mM Tris-Ac，100mM Mg(Ac)2，10mMDTT，pH 7.9。
piRNA-36026序列为GGC CCCAUG GUG UAAUGG UCAGCACUC。
lncRNA-DSCAM-AS1序列为：CUU UGG GAG GCU GAG GCAGG。
哑铃探针-pi序列为：ACTAAATTCAGG GCC TTT TGG CCC TGAATT TAG TAA TAA GAGAGG CCC GAG TGC TGA CCA TTA CAC CAT GGG GCC TCT CTT AT/Inverted dT/。
探针哑铃探针-lnc序列为：ATTATTAACAGG GCC TTT TGG CCC TGT TAATAA TTAGTGTAACTT TGG CCT GCC TCAGCC TCC CAAAGT TACACTA/Inverted dT/。
探针引物-pi序列为：TTT TTT TCT CTTATT。
探针引物-lnc序列为：TTT TTT TTACAC TA。
探针信号探针1序列为：FAM-TGAATTTAG TTATAAGAGA-BHQ1。
探针信号探针2序列为：Cy5-TGT TAATAATAAGTG TAA-BHQ2。
实施例2：图1描述了单分子检测多种ncRNA的机制。本发明巧妙地为piR-36026和DSCAM-AS1分别设计了两个哑铃探针(哑铃探针-pi和哑铃探针-lnc)、两个线性引物(引物-pi和引物-lnc)和两个线性信号探针(信号探针1和信号探针2)。piR-36026的哑铃探针包含三个功能域，分别是piR-36026的互补域a、引物-pi的结合域b和引物延伸域c。三个连续的G-C对)位于哑铃探针-pi右环域附近的位置，作为停止聚合的停止密码子。加入dATP、dCTP和dTTP(不含dGTP)可以终止引物的延伸，直到聚合过程中遇到第一个鸟嘌呤核糖核苷酸。同样，DSCAM-AS1的哑铃探针包含三个功能域，分别是DSCAM-AS1的互补域a、引物-lnc的结合域b、引物延伸域c和具有三个连续G-C对的停止密码子域。信号探针1(图1，粉色和橙色)和信号探针2(图1，紫色和蓝色)分别在5’端标记荧光团(FAM或Cy5)，在3’端标记猝灭剂(BHQ1或BHQ2)，分别与功能探针1和功能探针2杂交，启动T7外切酶(T7 Exo)辅助的FAM和Cy5荧光团的循环解放。该实验包括两个连续的步骤：(1)目标ncRNA诱导的引物交换反应(PER)和(2)T7 Exo辅助信号探针的再循环切割，以释放FAM和Cy5荧光团。在piR-36026存在的情况下，它可以与哑铃探针-pi的a域结合，暴露引物-pi的b域结合。随后，引物-pi与结构域b杂交，并在Bst DNA聚合酶的帮助下延伸，将新生单链序列c*附加到引物-pi的3'端(新延伸的ssDNA称为功能探针1)，直到链延伸反应在哑铃探针-pi的终止密码子处停止。随后，哑铃探针-pi上的结构域c*通过三向分支迁移的随机游走过程与功能探针1的合成结构域c*竞争，导致功能探针1与哑铃探针-pi自发解离。自由哑铃探针-pi可以与另一个引物-pi结合，诱导下一轮PER，产生丰富的功能探针1。同样，当DSCAM-AS1存在时，它可以与哑铃探针-lnc的结构域a杂交，暴露引物-lnc的结合结构域b，随后诱导PER级联产生大量功能探针2。所得到的功能探针1和2可以分别与信号探针1和2杂交，形成两个双链DNA双链1和2。dsDNA双链1和2中的信号探针1和2可被T7 Exo(一种双链DNA特异性外切酶，可催化去除5’至3’方向的单核苷酸)逐步消化，释放FAM和Cy5分子以及功能探针1和2。值得注意的是，释放的功能探针1和2可以进一步分别与自由的信号探针1和2杂交，启动多轮消化-释放-杂交，最终释放大量FAM和Cy5分子。FAM和Cy5信号可以通过基于TIRF的单分子成像进行简单监测，分别用于定量piR-36026和DSCAM-AS1。然而，在piR-36026和DSCAM-AS1缺失的情况下，哑铃探针的引物结合域被阻断，无法启动自动级联机制。结果，FAM和Cy5信号均未被检测到。
实施例3：验证实验的可行性
本发明进行了凝胶电泳和荧光测量来验证该方法的可行性(图2)。首先，使用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，以SYBR Gold作为荧光指示剂分析PER级联的产物。如图2中A所示，pi-36026与哑铃探针-pi杂交形成双链复合物(图2中A，3道)，其迁移速率比单独的哑铃探针-pi(图2中A，5道)慢，这是后续PER级联的先决条件。哑铃探针-pi+引物-pi+Bst DNA聚合酶未检测到功能探针1的条带(图2中A，2道)，表明未发生PER级联反应。添加piR-36026后，可以看到piR-36026与哑铃探针-pi的杂交带，同时出现功能探针-1带(图2中A，1道)，表明piR-36026可以成功启动PER级联。此外，在缺乏Bst DNA聚合酶的情况下，双链复合体无法启动PER级联(图2中A，4道)。同样，在缺乏DSCAM-AS1的情况下，没有检测到明显的功能探针2带(图2中B，2道)。相反，在DSCAM-AS1存在的情况下，出现了功能探针2的特征带(图2中B，1道)，这表明DSCAM-AS1诱导了PER级联的发生。然而，在没有引物-lnc(图2中B，3道)或Bst DNA聚合酶(图2中B，4道)的情况下，没有观察到功能性探针-2的条带，这表明这些成分在我们的实验中发挥了重要作用。本发明进一步进行了荧光光谱测量。当piR-36026和DSCAM-AS1缺失时，FAM荧光信号(图2中C，浅绿色曲线)和Cy5荧光信号(图2中D，浅红色曲线)均未检测到。而piR-36026产生的FAM和Cy5荧光信号显著增强(图2中C，绿色)曲线)和DSCAM-AS1(图2中D，红色曲线)，提示piR-36026和DSCAM-AS1可以激活PER级联产生丰富的功能探针，诱导T7核酸外切酶辅助的FAM和Cy5分子的循环解放。上述结果证明了该方法同时检测piR-36026和DSCAM-AS1的可行性。
实施例4：灵敏度的检测
为了考察该方法的检测灵敏度，在最佳反应条件下，本发明分别测量了不同浓度的piR-36026和DSCAM-AS1对FAM和Cy5荧光分子的响应。如图3中A所示，随着piR-36026浓度(C)从0增加到1×10-8M，FAM计数(N)呈剂量依赖性增强，在1×10-16到1×10-9M的7个数量级的大动态范围内，FAM计数与piR-36026浓度的对数之间存在良好的线性关系(图3中B)。回归方程为N＝503.28+28.57lg C(R2＝0.998)，检出限为44.67aM。同样，如图4中C所示，随着DSCAM-AS1浓度(C)从0增加到1×10-8M，Cy5计数(N)以浓度依赖的方式提高，并且在从1×10-16到1×10-9M的7个数量级的大动态范围内，Cy5计数与DSCAM-AS1浓度的对数之间获得了良好的线性相关性(图3中D)。回归方程为N＝365.48+20.53lg C(R2＝0.998)，计算出检出限为45.71aM。
实施例5：特异性的检测
通过引入HOTAIR、MALTAL、piR-823、piR-36743、circMTO1和miR-210作为阴性对照，评估该方法的特异性。如图4所示，HOTAIR、MALTAL、piR-823、piR-36743、circMTO1和miR-210存在时，FAM和Cy5荧光信号均未观察到，与不含RNA的对照组相似。相比之下，piR-36026的加入可以诱导FAM荧光信号的显著增强，而不是Cy5荧光信号，而DSCAM-AS1的加入可以诱导Cy5荧光信号的显著增强，而不是FAM荧光信号。当piR-36026和DSCAM-AS1共存时，同时检测到FAM和Cy5荧光信号，表明只有piR-36026和DSCAM-AS1分别特异性识别和切换哑铃探针-pi和哑铃探针-lnc的结构，启动随后的自动级联机制，释放Cy3和Cy5荧光团。这些结果证实了该方法对piR-36026和DSCAM-AS1具有良好的选择性。
实施例6：实际样品分析
为了探索该方法在实际样品分析中的性能，本发明分析了piR-36026和DSCAM-AS1在HCT-116细胞、HepG-2细胞、MCF-7细胞、Hela细胞、A549细胞和MCF-10A细胞等6种细胞系中的表达水平。如图5中A所示，HCT-116细胞、HepG-2细胞、MCF-7细胞、Hela细胞、A549细胞的FAM计数明显高于MCF-10A细胞(图5中A，绿色列)，表明piR-36026在人类癌细胞中高表达。与MCF-10A细胞产生的低Cy5计数相比，DSCAM-AS1在HCT-116细胞、HepG-2细胞、MCF-7细胞、Hela细胞、A549细胞中表达水平较高(图5中A，红色列)，表明DSCAM-AS1在人癌细胞中表达上调。我们进一步将我们的结果与HCT-116细胞、HepG-2细胞、MCF-7细胞、Hela细胞、A549细胞和MCF-10A细胞的同批次提取样品的标准qRT-PCR结果进行比较。图5中B显示，本实施例的结果与qRT-PCR的结果一致。此外，本发明同时检测了从MCF-7细胞中提取的piR-36026和DSCAM-AS1。如图5中C和5中D所示，FAM和Cy5计数(N)分别与MCF-7细胞数(X)的对数在1到100000个细胞范围内呈线性相关。piR-36026法和DSCAM-AS1法的相关方程分别为N＝47.79+36.75lg X(R2＝0.995)和N＝51.63+37.1lg X(R2＝0.995)。piR-36026法和DSCAM-AS1法的检测限计算为1个细胞。这些结果表明，该方法可以在单细胞水平上准确定量多种ncRNA，在临床诊断中具有很大的应用潜力。
实施例7：临床样本分析
为了评估该方法在临床诊断中的适用性，本实施例分别分析了8例乳腺癌患者和5例健康人组织样本中piR-36026和DSCAM-AS1的表达水平(图6中A)。如图6中B所示，乳腺癌组织中的FAM计数远高于健康人组织中的FAM计数。检测到乳腺癌组织产生的平均FAM计数为219.03±20.06，比健康组织产生的平均FAM计数(51.31±9.07)高4.27倍(图6中B)，表明piR-36026在乳腺癌中表达上调。此外，乳腺癌组织反应的Cy5计数明显高于健康组织反应的Cy5计数。检测到乳腺癌组织产生的Cy5平均计数为202.71±11.95，是健康组织产生的Cy5平均计数(60.41±7.57)的3.36倍(图6中B)，表明DSCAM-AS1在乳腺癌中高表达。本实验结果(图中6)与qRT-PCR结果一致。本实施例生成了受试者工作特征(ROC)曲线，以进一步验证该方法的诊断性能。估计piR-36026和DSCAM-AS1的曲线下面积(AUC)值均为1(>0.8)，表明piR-36026和lncRNA-DSCAM-AS1可以作为肿瘤生物标志物准确预测乳腺癌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，将piRNA-36026和lncRNA-DSCAM-AS1、哑铃探针-pi、哑铃探针-lnc、引物-pi、引物-lnc、dNTP混合液、ThermoPol反应缓冲液、Bst DNA聚合酶(大片段)的反应溶液孵育；
其中，piRNA是与Piwi蛋白相互作用的核糖核酸；
lncRNA是长链非编码核糖核酸；
Bst DNA聚合酶(大片段)是嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶蛋白的一部分，该酶具有5′→3′聚合酶活性，但缺失5′→3′核酸外切酶活性；
ThermoPol反应缓冲液为Bst DNA聚合酶(大片段)产品中自带的反应缓冲液；
dNTP混合液是由超纯dATP、dCTP和dTTP组成的等摩尔溶液；
步骤2，将步骤1的反应产物加入含有信号探针1、信号探针2、NEBuffer4反应缓冲液、T7核酸外切酶的反应溶液中，孵育，得到单分子检测试剂盒；
其中，T7核酸外切酶是一种双链DNA特异性外切酶，从5’到3’方向的线性或缺口双链DNA上催化去除核苷酸；
NEBuffer4反应缓冲液为T7核酸外切酶产品中自带的反应缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，将不同浓度的piRNA-36026和和lncRNA-DSCAM-AS1、10nM哑铃探针-pi、10nM哑铃探针-lnc、100nM引物-pi、100nM引物-lnc、100μM的dNTP混合液、1×ThermoPol反应缓冲液、4U Bst DNA聚合酶(大片段)的20μL反应溶液在37℃下孵育60分钟。
3.根据权利要求1所述的一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，将反应产物加入含有300nM信号探针1、300nM信号探针2、1×NEBuffer4反应缓冲液、10U T7核酸外切酶的反应溶液中，在37℃下孵育30min。
4.根据权利要求1所述的一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述ThermoPol反应缓冲溶液包括200mMTris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.8。
5.根据权利要求1所述的一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述NEBuffer4反应缓冲溶液包括500mMKAc，200mM Tris-Ac，100mM Mg(Ac)2，10mM DTT，pH 7.9。
6.根据权利要求1所述的一种可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于：
所述piRNA-36026序列为GGC CCCAUG GUG UAAUGG UCAGCACUC；
所述lncRNA-DSCAM-AS1序列为：CUU UGG GAG GCU GAG GCA GG；
所述哑铃探针-pi序列为：ACT AAA TTC AGG GCC TTT TGG CCC TGA ATT TAG TAA TAAGAG AGG CCC GAG TGC TGA CCA TTA CAC CAT GGG GCC TCT CTT AT/Inverted dT/；
所述探针哑铃探针-lnc序列为：ATTATTAAC AGG GCC TTT TGG CCC TGT TAATAATTAGTG TAA CTT TGG CCT GCC TCA GCC TCC CAAAGT TAC ACTA/Inverted dT/；
所述探针引物-pi序列为：TTT TTT TCT CTT ATT；
所述探针引物-lnc序列为：TTT TTT TTA CAC TA；
所述探针信号探针1序列为：FAM-TGA ATT TAG TTA TAA GAG A-BHQ1；
所述探针信号探针2序列为：Cy5-TGT TAA TAA TAA GTG TAA-BHQ2。
7.一种由权利要求1所述制备方法得到的可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒。
8.权利要求7所述的可编程的自动级联机制用于人乳腺组织中多种非编码RNA的单分子检测试剂盒在制备用于检测活细胞和乳腺组织中的多种ncRNAs的单分子检测试剂盒的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述单分子检测试剂盒能同时定量活细胞和乳腺组织中piR-36026和DSCAM-AS1的表达，并能区分乳腺癌患者和健康人ncRNA的表达水平。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于：所述单分子检测试剂盒用于灵敏地检测非编码RNA，对于piR-36026的检测限为44.67aM，DSCAM-AS1的检测限为45.71aM。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN120505413A (zh) * | 2025-07-15 | 2025-08-19 | 湖南工程学院 | 一种基于引物交换反应和G-四链体检测AKI相关miRNA的探针体系及方法 |
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2025
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