CN1199651C - 一种防治心血管病的中药黄芪有效部位 - Google Patents
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Abstract
一种具有保护心肌损伤作用的黄芪总皂甙，将黄芪乙醇提取物用水溶解，上大孔树脂柱，分别以水及含水乙醇洗脱，合并70%-98%乙醇洗脱液，蒸干得浸膏；用甲醇溶解浸膏，加硅藻土拌匀，硅藻土与浸膏比例为3-1∶1，以无水乙醇热回流提取，所得提取液蒸干，得皂甙提取物，其含总皂甙达85%-90%，总皂甙转移率在80%-85%。
Description
技术领域
本发明通过制备方法的改进，获得具有保护心肌损伤作用的高纯度的黄芪总皂甙。
背景技术
黄芪(Radix astragali)为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，性甘、温，归肺、脾经，补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌。现代化学研究证明黄芪药材中含有皂甙、多糖、黄酮、氨基酸、酚性化合物及微量元素等成分。黄芪皂甙具强心功能可用于治疗心衰，对急性心梗后心功能的恢复及氧自由基的清除具明显作用。尤其是近年来黄芪用于治疗病毒性心肌炎的研究，发现黄芪可抑制柯萨奇病毒的复制，对病毒感染心肌细胞异常电活动有逆转作用，经过比较研究了黄芪不同成分对病毒感染心肌细胞损伤的保护作用，证实了黄芪主要有效成分为黄芪总皂甙。但是黄芪皂甙含量较低，且根部含大量糖类物质，提取分离比较困难。
现有提取分离工艺有：水提法、醇提法、树脂吸附法、正丁醇萃取法与超临界CO2法。为除去药材中的蔗糖、单糖，有用冷浸法(参见：无糖富集有效成分提取物及其制品，CN1171950A)；水提醇沉法(参见：一种精制黄芪注射液制备工艺，CN1273116A)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是通过改进现有的黄芪有效部位黄芪皂甙的提取分离方法，以获得含量高、纯度提高的总皂甙，以确保疗效的稳定，并可具有更明确的质量控制指标。
为解决上述问题，本发明提供如下技术解决方案：
一种黄芪皂甙，其特征在于可用下述方法得到：
1)取黄芪的乙醇提取物浸膏，用水溶解，上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，得黄芪总皂甙粗品；
2)或者，取黄芪的乙醇提取物浸膏，用水溶解，先用0.1N的NaOH饱和的正丁醇萃取，浓缩萃取液至浸膏状，再用水溶解，上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％并70％-98％乙醇洗脱液，得黄芪总皂甙粗品；
3)或者，取黄芪的乙醇提取物浸膏，用甲醇溶解，加硅藻土拌匀，以无水乙醇热回流提取，所得提取液蒸干，得黄芪总皂甙粗品。
所述黄芪皂甙，其特征在于：
将1)中的得到黄芪总皂甙粗品，用水溶解，再次上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，得黄芪总皂甙；
或者，将1)中的得到黄芪总皂甙粗品，用甲醇溶解，加硅藻土拌匀，以无水乙醇热回流提取，所得提取液蒸干，得黄芪总皂甙；
或者，将2)中的得到黄芪总皂甙粗品，用甲醇溶解，加硅藻土拌匀，以无水乙醇热回流提取，所得提取液蒸干，得黄芪总皂甙；
或者，将3)中的得到黄芪总皂甙粗品，用水溶解，上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，得黄芪总皂甙；
或者，将3)中的得到黄芪总皂甙粗品，用水溶解，先用碱水液饱和的正丁醇萃取，如用0.1N的NaOH饱和的正丁醇萃取，浓缩萃取液至浸膏状，再用水溶解，上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，得黄芪总皂甙。
本发明所用大孔树脂柱的型号为D101、AB-8；乙醇提取物浸膏与硅藻土的重量比为1∶1-3；较好的乙醇提取物浸膏与硅藻土的重量比为为1∶2。
用于防治心血管疾病的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1或2中任一项的黄芪皂甙和药学上可接受的载体。
本发明通过所选择的大孔树脂柱层析及一定的洗脱条件，除去黄芪中大量的糖类物质，显著提高了总皂甙的含量。如果两次上大孔树脂柱，可极其显著提高所得浸膏的总皂甙含量。对于中药的色素等常见的影响制剂质量的杂质，一般常用活性碳去除，但本发明实验数据表明用活性碳除去色素等杂质往往大大降低了黄芪皂甙的收率，而本发明采取硅藻土拌匀，以无水乙醇热回流吸附法，去除色素等杂质的效果非常明显，且黄芪皂甙的收率亦高。本发明工艺中总皂甙的提取方式、提取溶剂、加溶剂量、回流时间、提取次数是经过正交设计研究而成，保证了所得到的黄芪总皂甙含量高，转移率大于80％。本发明与现有技术相比，具有总皂甙含量高、成本低、无有机溶剂残留以及生产过程对环境无污染等优点。
本发明的黄芪皂甙具有明显的保护心肌损伤作用。对于药品而言，其治疗组份的纯度与疗效密切相关。本发明通过改进现有的黄芪有效部位黄芪皂甙的提取分离方法，得到总皂甙含量大于80％的黄芪皂甙，纯度的提高，确保了在防治心血管疾病方面的稳定疗效，黄芪皂甙及含黄芪皂甙的药物组合物的质量稳定，质量控制指标明确。
研究黄芪总皂甙(含量大于80％)的最佳工艺，该制备物具有保护心肌损伤的作用。
其研究步骤和详细数据如下：
1.药材
选用蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.varmongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。
2.总皂甙提取方式的影响：
取粉碎成40目的黄芪药材粉末50g，精密称定，分别按下列方法提取：
(1)水提醇沉：取药材50g，加蒸馏水200ml，加热提取3次，每次1.5h，水液离心，上清液合并，浓缩至适量，加95％乙醇沉淀，静置12h，离心，取上清液合并，浓缩得浸膏。
(2)50％醇提液：取药材50g，加50％乙醇200ml，90℃加热回流3次，每次1.5h，合并提取液，浓缩得浸膏。
(3)70％醇提液：取药材50g，加70％乙醇200ml，90℃加热回流3次，每次1.5h，合并提取液，浓缩得浸膏。
(4)95％乙醇提取液：取药材50g，加95％乙醇200ml，90℃加热回流3次，每次1.5h，合并提取液，浓缩得浸膏。
实验证明：浸膏得率为50％醇提液＞70％醇提液＞95％醇提液＞水提醇沉。
3、黄芪总皂甙的分离、纯化、浓缩与干燥工艺
3.1分离与纯化工艺
取蒙古黄芪或膜荚黄芪药材，先将药材粉碎，以50-95％乙醇加热回流提取3次，每次加50-95％乙醇10倍量，提取1.5h/次。合并提取液，得浸膏A。
将浸膏A以适量蒸馏水溶解，上大孔树脂柱，分别以蒸馏水、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、98％乙醇洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干得浸膏B。
将浸膏B以甲醇溶解，加硅藻土拌匀，硅藻土与浸膏比例为3-1∶1，以2∶1为好，用无水乙醇热回流提取3次，所得提取液蒸干，得提取物I，以黄芪甲苷计算，该提取物含总皂甙达85％-90％，总皂甙转移率在80％-85％。
若将此提取物I以蒸馏水溶解，上大孔树脂柱，分别以蒸馏水、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％乙醇洗脱，合并50％-80％乙醇流份，蒸干，得提取物II，以黄芪甲苷计算，该提取物含总皂甙达98％以上，总皂甙转移率在75％-80％。
3.2浓缩与干燥工艺
将70％-98％乙醇洗脱液减压回收溶剂，真空干燥，即得总皂甙部位。
本发明的黄芪总皂甙对培养心肌细胞的保护作用
1、黄芪总皂甙对培养心肌细胞钙超载的影响
(1)黄芪总皂甙对心肌细胞游离钙的影响
黄芪总皂甙单独干预细胞对胞内游离钙离子([Ca2+]i)无影响，但是与异丙肾上腺素同时作用时，黄芪总皂甙可抑制异丙肾上腺素引起的[Ca2+]i的增加。与异丙肾上腺素比较，黄芪总皂甙从低浓度到高浓度(10，100，200mg·ml-1)，分别降低[Ca2+]i39％，40％，51％(P＜0.05)。
(2)黄芪总皂甙对心肌细胞肌浆网钙负荷的影响
黄芪总皂甙单独干预细胞对肌浆网钙负荷(Sarcoplasmic reticulum Calcium load)无影响，异丙肾上腺素可使肌浆网钙负荷增加145％(P＜0.01)，与异丙肾上腺素同时作用时，黄芪总皂甙可抑制异丙肾上腺素引起的肌浆网钙负荷的增加，从低浓度到高浓度分别降低11％(P＞0.05)，35％(P＜0.05)，51％(P＜0.05)。
(3)黄芪总皂甙对心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase活性的影响
黄芪总皂甙单独干预细胞可使肌浆网Ca2+-ATPase活性增加，但与异丙肾上腺素同时作用时，黄芪总皂甙可抑制异丙肾上腺素引起的肌浆网Ca2+-ATPase活性的增加，在高浓度组可抑制34％(P＜0.05)。
2、黄芪总皂甙对培养心肌细胞损伤指标(肌钙蛋白I)的检测
黄芪总皂甙作用于培养心肌细胞，检测上清中心肌细胞损伤指标——肌钙蛋白I(cTnI)，发现与正常对照组比较cTnI无变化，表明黄芪总皂甙对心肌细胞无损伤。
具体实施方式
选用《中华人民共和国药典》(2000年版)收载的下列2种黄芪药材中其中的一种，即：蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。药材的性状特征、理化鉴别特征符合《中华人民共和国药典》(2000年版一部)“黄芪”项下内容。
实施例1
称取黄芪药材20kg，粉碎，过20目筛，加8倍量的50％乙醇，80℃提取3次，每次.5小时。合并提取液，得浸膏A。将浸膏A以适量蒸馏水溶解，以0.1N NaOH饱和的正丁醇萃取3次，合并萃取液，得浸膏B，将浸膏B以蒸馏水溶解，上大孔树脂柱，分别以蒸馏水、、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、98％乙醇洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干，得提取物I，以黄芪甲苷计算，该提取物含总皂甙达75.6％，总皂甙转移率在80.0％。
实施例2
称取黄芪药材20kg，粉碎，过20目筛，加10倍量的95％乙醇，90℃提取3次，每次1.5小时。合并提取液，得浸膏A。将浸膏A以适量蒸馏水溶解，以0.1N NaOH饱和的正丁醇萃取3次，合并萃取液，得浸膏B，将浸膏B以蒸馏水溶解，上大孔树脂柱，分别以蒸馏水、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、98％乙醇洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干得浸膏C。将浸膏C以甲醇溶解，加硅藻土拌匀，硅藻土与浸膏比例为2∶1，以无水乙醇热回流提取3次，所得提取液蒸干，得提取物I，以黄芪甲苷计算，该提取物含总皂甙达85.2％，总皂甙转移率在72.5％。
实施例3
称取黄芪药材20kg，粉碎，过20目筛，加10倍量的70％乙醇，80℃提取3次，每次1.5小时。合并提取液，得浸膏。将此浸膏以适量蒸馏水溶解，上大孔树脂柱，分别以蒸馏水、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、98％乙醇洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干得浸膏B。将浸膏B以甲醇溶解，加硅藻土拌匀，硅藻土与浸膏比例为2∶1，以无水乙醇热回流提取3次，所得提取液蒸干，得提取物I，以黄芪甲苷计算，该提取物含总皂甙达83.4％，总皂甙转移率在81.2％。
实施例4
称取黄芪药材20kg，粉碎，过20目筛，加12倍量的50％乙醇，90℃提取3次，每次1.5小时。合并提取液，得浸膏，将此浸膏以适量蒸馏水溶解，上大孔树脂柱，分别以蒸馏水、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、98％乙醇洗脱，合并40％-98％乙醇洗脱液，蒸干得提取物I，以黄芪甲苷计算，该提取物含总皂甙达74.8％，总皂甙转移率在85.1％。
Claims (5)
1、一种黄芪皂甙，可用下述方法得到：
1)取黄芪的乙醇提取物浸膏，用水溶解，上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干，得黄芪总皂甙粗品；
2)或者，取黄芪的乙醇提取物浸膏，用水溶解，先用碱水液饱和的正丁醇萃取，浓缩萃取液至浸膏状，再用水溶解，上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干，得黄芪总皂甙粗品；
3)或者，取黄芪的乙醇提取物浸膏，用甲醇溶解，加硅藻土拌匀，以无水乙醇热回流提取，所得提取液蒸干，得黄芪总皂甙粗品；
将得到的黄芪皂甙粗品，经下述方法处理：
将1)中的得到黄芪总皂甙粗品，用水溶解，再次上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干，得黄芪总皂甙；
或者，将1)中的得到黄芪总皂甙粗品，用甲醇溶解，加硅藻土拌匀，以无水乙醇热回流提取，所得提取液蒸干，得黄芪总皂甙；
或者，将2)中的得到黄芪总皂甙粗品，用甲醇溶解，加硅藻土拌匀，以无水乙醇热回流提取，所得提取液蒸干，得黄芪总皂甙；
或者，将3)中的得到黄芪总皂甙粗品，用水溶解，上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干，得黄芪总皂甙；
或者，将3)中的得到黄芪总皂甙粗品，用水溶解，先用0.1N的NaOH饱和的正丁醇萃取，浓缩萃取液至浸膏状，再用水溶解，上大孔树脂柱，用水与含水乙醇梯度洗脱，合并70％-98％乙醇洗脱液，蒸干，得黄芪总皂甙。
2、根据权利要求1所述黄芪皂甙，其特征在于：大孔树脂柱的型号为D101、AB-8；用于萃取的正丁醇饱和的碱水液为0.1N的NaOH。
3、根据权利要求1所述黄芪皂甙，其特征在于：乙醇提取物浸膏与硅藻土的重量比为1∶1-3。
4、根据权利要求3所述黄芪皂甙，其特征在于：乙醇提取物浸膏与硅藻土的重量比为为1∶2。
5、用于防治心血管疾病的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1的黄芪皂甙和药学上可接受的载体。
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