[go: up one dir, main page]

CN119954917A - 作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台 - Google Patents

作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台 Download PDF

Info

Publication number
CN119954917A
CN119954917A CN202411849786.4A CN202411849786A CN119954917A CN 119954917 A CN119954917 A CN 119954917A CN 202411849786 A CN202411849786 A CN 202411849786A CN 119954917 A CN119954917 A CN 119954917A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bont
toxin
amino acid
vaccine
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202411849786.4A
Other languages
English (en)
Inventor
J·T·巴比里
E·A·约翰逊
S·佩莱特
W·H·泰普
A·普莱兹佩斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medical College of Wisconsin
Wisconsin Alumni Research Foundation
Original Assignee
Medical College of Wisconsin
Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medical College of Wisconsin, Wisconsin Alumni Research Foundation filed Critical Medical College of Wisconsin
Publication of CN119954917A publication Critical patent/CN119954917A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0015—Combination vaccines based on measles-mumps-rubella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供了工程改造的无催化性无毒性破伤风毒素变体，以低剂量使用所述破伤风毒素变体的方法，和保护性疫苗，其无毒性且比其对应的化学灭活的类毒素而言效力更高。另外，本文提供了结合疫苗运载体，其包含工程改造的破伤风毒素变体，以及用这些结合疫苗引发T细胞依赖性免疫记忆应答的方法，其能作为单一疫苗靶向广谱的微生物病原体。

Description

作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月15日提交的美国临时申请第62/599,444号的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
关于联邦资助研究的声明
本发明是用NIH-NIAID授予的资助号R01 AI030162和AI118389的政府资助完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
肉毒神经毒素(BoNT)是人类已知的最具毒性的物质，是肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)以及丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和巴氏梭菌(Clostridium baratii)的选择菌株产生的蛋白质毒素(Hill和Smith，2013；Johnson和Montecucco，2008)。BoNT合成为150kDa双链蛋白，由通过二硫键连接的100kDa重链(HC)和50kDa轻链(LC)组成。HC进一步分为N末端结构域(HN)和C末端结构域(HC)，N末端结构域有助于将LC转运到细胞质中，C末端结构域识别并结合神经元细胞上的细胞表面受体(Montal，2010)。一旦进入细胞，LC就会特异性裂解一部分可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)，从而使神经递质释放失活(Montecucco和Schiavo，1993，Trends in biochemical sciences 18,324-327；Schiavo等，1995)。先前使用实验疫苗保护“有风险”的人群抵抗肉毒，但由于其性能减弱，不再使用该化学灭活的BoNT类毒素疫苗。而且常规的破伤风毒素片段疫苗由于其抗原性和免疫效力差也不理想。因此，在本领域仍然需要无催化性无毒性的破伤风和肉毒毒素变体，以用作佐剂和结合疫苗。
发明内容
本文提供了破伤风毒素的重组无催化性无毒性变体形式，以及该变体毒素的用途。本文所述的数据显示相比天然破伤风毒素和先前所述的破伤风变体显著降低的毒性。我们设想了几种独立的工程改造突变，其灭活破伤风毒素的固有毒性，而且可组合产生安全有效的疫苗，包括但不限于通过除去底物亲和力或降低反应速率而消除催化活性，消除受体结合，抑制移位能力(potential)，或干扰毒素结构域间切割或二硫键打断，以及其他毒素中毒的其他步骤等。本文描述了实验，其中我们工程改造了具有宿主受体结合性减弱且催化性减弱的毒素。这些数据表明了包含了所选独立突变的重组毒素的能力，所述独立突变使其无毒并适用作疫苗或结合疫苗，而不需要化学交联以减少毒性。
在第一个方面，本文提供了修饰的破伤风毒素多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95％相同性且在位置R372和Y375的每一个都具有突变的序列，还包括在选自E334、K768、R1126和W1289的两个或更多个位置处的突变，其中每个位置根据SEQ ID NO:1编号，所述多肽与SEQ ID NO:1的毒性和受体结合相比具有减弱的催化活性，易位和受体结合。位置R372处的氨基酸R可被氨基酸A替代，位置Y375处的Y可被氨基酸F替代。突变可包括R372A,Y375F,E334Q,R1226L,和W1289A。修饰多肽还可包含共价连接的糖类，其中多肽是多肽-糖偶联物。修饰的多肽可由SEQ ID NO:2编码。
在一些情况下，突变可包含R372A,Y375F,E334Q,K768A,R1226L,和W1289A。修饰的多肽可由SEQ ID NO:5编码。在一些情况下，修饰的多肽还可包含在位置L231和Y26中一或两者处突变，其中每个位置根据SEQ ID NO:1编号。位置L231和Y26中一或两者处的突变包括L231K和Y26A。修饰的多肽可由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7编码。
在另一个方面，本文提供了包含本文所述的修饰多肽和药学上可接受的运载体的组合物。
在一个方面，本文提供了减少患者产生破伤风的风险的方法，包括通过对患者施用治疗有效量的本文所述的修饰多肽以引发免疫应答。在一些情况下，修饰多肽用作佐剂。在一些情况下，修饰多肽用作疫苗。
通过以下描述可以清楚地了解本发明的上述和其他方面和优势。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示了本发明的优选实施方式。这类实施方式不必然代表本发明的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。
附图说明
图1说明了用于评估宿主对接种的免疫应答的重组蛋白质。(上图)显示了用于该研究的BoNT衍生物的示意图。当说明时，用两个表位(His6和Strep)纯化蛋白。包括3XFLAG(3XF)和两个连续血凝素(2HA)表位用于细胞研究。用BoNT/A1(PDB:3BTA)的结晶结构确定结构域连接。每个示意图上的单氨基酸命名表示引入的氨基酸取代，用于减少催化(LC)或受体结合(HCC)。注意，用单链BoNT和LCHCN免疫。(下图)4μg指定蛋白质进行SDS-PAGE和考马斯蓝染色。泳道:1,M-BoNT/A1；2,M-BoNT/A1胰蛋白酶切割和还原的；3,M-LCHCN/A1；4.M-LCHCN/A1胰蛋白酶切割和还原的；5,LC/A1RY；6,HCC/A1W；和7,TeNTRY。分子量标记蛋白质(kDa)的迁移如左侧泳道所示。注意在泳道2中切割的HC跑胶于约80kDa处，这在其他实验中也有显示，归因于酪蛋白切割HC的带状区域。
图2是用M-BoNT/A1或M-BoNT/A1W接种且用天然BoNT/A2(一种异源亚型)攻击的小鼠血清的ELISA。用M-BoNT/A1(上图)或M-BoNT/A1W(下图)接种小鼠，在106LD50天然BoNT/A2攻击前收集血清。表明在攻击中存活(A)或未存活(D)的小鼠。进行ELISA，测定M-BoNT/A1；M-LCHCN/A1；LC/A1RY；HCC/A1W；TeNTRY；和无蛋白对照(Con)的血清抗体滴度(1:20,000稀释度)。用山羊α-小鼠IgG-HRP(1:20,000稀释)，使用TMB试剂检测结合的小鼠抗体。用稀硫酸终止反应并在450nm处读数。数据表示成来自以双重复进行的两次独立实验的M-BoNT/A1接种后5只(A)小鼠和4只(D)小鼠的平均值，以及在M-BoNT/A1W接种后3只(A)和6只(D)小鼠的平均值，并标注了标准偏差。如本文所述进行统计分析：P,.05＝*.
图3是用BoNT衍生物接种并用天然BoNT/A1攻击的小鼠的血清ELISA。用M-BoNT/A1W(0.3μg),M-LCHCN/A1(0.2μg),M-LCHCN/A1(0.2μg)+HCC/A1W(0.1μg),或HCC/A1W(0.3μg)接种小鼠。在BoNT攻击前获得血清。ELISA测定M-BoNT/A1；M-LCHCN/A1；LC/A1RY；HCC/A1W；TeNTRY；和无蛋白对照(Con)的血清抗体滴度(1:30,000稀释度)。用山羊α-小鼠IgG-HRP(1:20,000稀释)，使用TMB试剂检测结合的小鼠抗体。用稀硫酸终止反应并在450nm处读数。数据表示成来自表1实验3的在BoNT/A1攻击中存活下来的小鼠的10个独立血清的平均值，其在设双重复进行的两次独立实验中分析，标出了标准偏差；不同之处在于用HCC/A1W接种的小鼠，其中数据来自天然BoNT/A1攻击的7只存活小鼠(A)或3只未存活小鼠(D)。滴度范围内的变异是由于个体小鼠之间不同的抗体滴度造成的，而不是由于ELISA重复中的变异。如方法部分所述进行统计分析：P<0.05＝*,0.01＝**,0.001＝***,和0.0001＝****。
图4是用M-BoNT衍生物接种并在天然BoNT/A1攻击中存活下来的个体小鼠的血清ELISA。用M-BoNT/A1；M-LCHCN/A1；LC/A1RY；HCC/A1W作为抗原，ELISA(1:30,000稀释)分析用BoNT/A1W(#7和#3),HCC/A1W(#78)和LCHCN/A1(#21,#24,和#25)接种并在天然BoNT/A1攻击中存活下来的个体小鼠在BoNT攻击前获得的血清。用山羊α-小鼠IgG-HRP(1:20,000稀释)，使用TMB试剂检测结合的小鼠抗体。用稀硫酸终止反应并在450nm处读数。数据表示成设双重复进行的两次独立实验的平均值，并标出了标准偏差。
图5显示了人诱导性多能干细胞(hiPSC)中SNAP25的天然BoNT/A1切割的血清中和。分析BoNT攻击前从用M-BoNT/A1W(#7和#3),HCC/A1W(#78)和M-LCHCN/A1(#21,#24,和#25)接种并在BoNT/A1攻击中存活下来的个体小鼠获得的血清的中和天然BoNT/A1的能力。将人诱导性多能干细胞(hiPSC)衍生的神经元以30000-40000细胞/孔的密度接种到涂覆有聚-L-鸟氨酸和Matrigel的平板上，维持在iCell神经元培养基中7天，然后进行中和试验。为了检测小鼠血清中的中和抗体，将2pM天然BoNT/A1与系列稀释的无菌过滤的血清合并，在培养基中37℃孵育1小时。用“无抗体”缓冲液作为对照。在每个hiPSC衍生神经元孔中加入50μl的各抗体-毒素混合物，至少设双重复；细胞在37℃5％CO2中孵育24小时。从细胞中吸出毒素/抗体，细胞裂解物进行PAGE，然后用Western印迹分析SNAP-25切割(Pellett等.,2007；Pellett等.,2010)。用密度测定法定量切割和未切割的SNAP-25，通过与“无抗体”对照比较确定保护％。用GraphPad Prism 6软件和非线性回归，可变斜率和四参数估计IC50值。
图6是用M-BoNT/A1W接种且在BoNT/A1攻击中存活下来的小鼠血清的代表性ELISA。用ELISA如方法部分所述分析来自在BoNT/A1攻击中存活下来的小鼠用BoNT/A1W接种的血清，采用标注的抗原。值是设双重复进行的代表性测定的平均值，标出了标准偏差。
图7显示了M-BoNT/A1W比起M-LCHCN/A1或LCHCN/A1+HCC/A1W的免疫原性更强。用ELISA分析用M-BoNT/A1(0.3μg),M-LCHCN/A1W(0.2μg),或M-LCHCN/A1(0.2μg)+HCC/A1W(0.1μg)接种并在106LD50 BoNT/A1中存活下来的个体小鼠的血清中针对M-BoNT/A1,M-LCHCN/A1,LC/A1RY,HCC/A1W,TeNTRY,或无蛋白(Con)的抗体。数据表示成来自表1试验3的10份在BoNT/A1攻击中存活下来的小鼠的独立血清的平均值，其设双重复在两次独立试验中进行，标出了标准偏差。如方法部分所述进行统计分析：P<0.05＝*,0.01＝**,0.001＝***,和0.0001＝****。
图8是编码野生型破伤风梭菌(Clostridium tetani)毒素(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
图9是编码2M-TT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
图10是编码5M-TeNT(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
图11是编码6M-TeNT(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列。
图12是编码7M-TeNT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。
图13是编码8M-TeNT(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。
图14显示了K768介导破伤风毒素中的轻链易位。(左图)TT767DKE(WT),TT767AAA,TT767RKK,或TT767DAE与神经元孵育，并用报告子(β-内酰胺酶)CCF2切割测定易位。(右图)TT和BT在767DKE处的对齐。注意在毒素之间的保守赖氨酸(K)。
图15是TeNTRY PDB:5n0b的结晶结构。灭活了4种TT功能：轻链E234Q,R373A,Y376F(Zn++结合),L231K(VAMP-2切割)和Y26A(VAMP-2结合),K768A(LC转座)和R1226L和W1289A(受体结合)。
发明详述
已通过一个或多个优选的实施方式描述了本发明，但应理解，除了明确描述的那些方案之外，许多等同方案、替代方案、变化方案和修改方案是可能实现的并在本发明范围内。
本文所述的方法和组合物至少部分基于发明人对同时是非催化性和不能结合神经元细胞。如下文段落和实施例中所述，破伤风毒素和肉毒毒素(BoNT)具有阻碍催化和受体结合的工程改造缺陷，提供了毒素介导疾病的疫苗开发的平台。例如，用修饰的破伤风毒素检测到无毒性，而BoNT通过工程改造的突变使得催化性和受体结合能力丧失。另外，这样修饰的毒素适合作为疫苗，来抵抗肉毒神经毒素攻击。
组合物
优选本文遗传修饰的毒素包括在相对于野生型毒素的多个靶点进行遗传修饰，其中这样的修饰消除残余毒性并提高安全性，将在下文进一步展开。虽然BoNt和破伤风毒素对不同的底物和受体起作用，但发明人确定免疫细胞摄取无催化性无受体结合性的BoNT形式(在本文中称作“M-BoNTW”)并产生与采用无催化性BoNT(“M-BoNT”)所观察到的情况相似的中和免疫反应。基于该观察结果，确定了其他独立突变位点以工程改造其他无催化性、无受体结合的毒素变体。当如本文所述修饰时，得到的工程改造的无催化性无受体结合性的毒素适用作疫苗和结合疫苗平台。
不受任何特定作用机制理论限制，在破伤风毒素和肉毒毒素内的独立位点工程改造的突变使得毒素蛋白不能通过独立机制表达毒性，因此提供了对毒性的意外遗传回复的容错(fail-safe)性。这样的性质有利于用变体毒素作为疫苗抵抗破伤风和肉毒，并作为结合疫苗平台。
因此，本文提供了重组灭活的细菌毒素，其不可逆地是无毒性的，功效更强，且比目前化学灭活的类毒素更容易产生和操纵，因此提供了改良的疫苗和结合疫苗运载体。在第一个方面，本文提供了细菌蛋白毒素(例如破伤风毒素和肉毒神经毒素)的重组无催化性无毒性修饰形式的分离制备物，其中修饰的毒素是全长毒素，包含至少4个氨基酸取代，使得蛋白质不能通过独立机制表达毒性。“制备物”指相对于其天然存在形式强化或纯化的任何浓度的毒素多肽。优选制备物是基本纯的，或与其他成分组合成药物制备物。在一些情况下，本发明的制备物可包括一种或多种佐剂或运载体，其可与毒素多肽序列偶联，帮助刺激免疫系统。在其他情况下，制备物本身具有佐剂活性，能有效增强结合抗原或共同施用的抗原的免疫应答。
本文所用的“毒素”指有害或有毒物质(例如细胞毒素)，其在一些微生物的代谢和生长过程中作为细胞或组织的固有部分(例如内毒素)，作为胞内或胞外产物(外毒素)，或是其组形成或产生。本文所用的术语“修饰的毒素”指毒素的无催化性无毒性变体形式，其中通过基因工程改造(例如非天然存在的，人造的)修饰多肽毒素的氨基酸序列使毒素无催化性和无毒性。在示范性实施例中，修饰的毒素是梭菌属细菌(例如艰难梭菌(C.difficile),诺维氏梭菌(C.novyi),索氏梭菌(C.sordellii),产气荚膜梭菌(C.perfringens),破伤风杆菌(C.tetani),和肉毒杆菌(C.botulinum))产生的经遗传工程改造，或是修饰的变体。毒素可以是重组的、合成的、融合蛋白部分(包括例如抗原、或多肽(例如His6)，其促进融合蛋白纯化)，其与抗原共价偶联，和/或化学交联到抗原上。在一些情况下，无催化性无毒性的毒素形式被称为类毒素。类毒素缺乏毒性，但维持其抗原性及其免疫能力。
本文所用的术语“减弱的毒性”指相对于包含特定蛋白活性组分(例如野生型TT)的第一组合物，包含修饰形式的特定蛋白活性组分的第二组合物可以比对第一组合物而言是致命的剂量的相同或更大的剂量水平施给哺乳动物，而不会导致哺乳动物死亡。减弱的毒性包括用本领域实践人员所知的方法可检测的毒性部分或完全消除。另外，减弱的毒性包括减弱的全身性毒性(即静脉给药后)或肌肉内给药后的减弱毒性。
在一些实施方式中，制备物包括修饰的破伤风毒素。通常如本文修饰的破伤风毒素显示与SEQ ID NO:1所示的野生型破伤风毒素多肽相比有一种或多种改变的性质，例如显著下降的催化活性和受体结合活性。在一些实施方式中，本文所述的修饰的破伤风毒素比起野生型破伤风毒素毒性低至少1,000,000倍。
表1：作为疫苗和结合疫苗的示范性毒素M-BoNT/A1W和5M-TeNT具有多个功能上独立的突变
突变的残基(抑制的功能) M-BoNT/A1W 5M-TeNT
E(催化) E224A E334Q
R(催化) R363A R372A
Y(催化) Y366F Y375F
R(受体结合) 野生型 R1226L
W(受体结合) W1266A W1289A
在一些实施方式中，制备物包含修饰的破伤风毒素，其在氨基酸残基372和375具有突变，还在残基334、1226和1289中的一个或多个具有突变，其中残基位置的编号相对于SEQ ID NO:1所示的全长野生型破伤风神经毒素(破伤风杆菌(Clostridium tetani)CN3911；GenBank登录号X06214)。在一些实施方式中，残基372和375处的氨基酸突变是R372A和Y375F,修饰的毒素还包括至少一个选自E334Q、R1226L和W1289A的突变。在一些例子中，修饰的毒素包括5个突变(R372A,Y375F,E334Q,R1226L,和W1289A)，根据SEQ ID NO:1编号，本文称作“5M-TeNT”或“5M-TT”。参见表1。在一些情况下，5M-TeNT由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列编码。
在一些实施方式中，破伤风毒素具有修饰的易位结构域。例如768位的赖氨酸位于连接两个长α螺旋的环内。该单氨基酸突变为丙氨酸(A)灭活或阻止轻链易位。在一些情况下，在5M-TT修饰毒素中加入K768A突变以产生6M-TT，其中得到的修饰毒素在6个位置包括独立突变(见表2和3)。在一些例子中，修饰的毒素包括6个突变(R372A,Y375F,E334Q,K768A,R1226L,和W1289A)，根据SEQ ID NO:1编号，本文称作“6M-TeNT”或“6M-TT”。在一些情况下，6M-TeNT由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列编码。不受任何特定机制或理论限制，6M-TT的疫苗效力预期比5M-TT高，但应比5M-TT的逆转率低。在5M-TT的D767、K768或E769中的一个或多个加入突变将使得遗传工程改造的疫苗更完全灭活，除了破坏催化和受体结合域的功能性外，还使得易位结构域功能灭活。
表2：包含多个功能独立的突变的示范性毒素6M-TeNT，作为疫苗和结合疫苗
在一些实施方式中，破伤风毒素经修饰抑制VAMP-2切割。例如，231位亮氨酸残基的突变(例如亮氨酸突变为赖氨酸(K))灭活毒素对VAMP-2切割的催化活性。在一些情况下，在6M-TT修饰毒素中加入L231K突变以产生7M-TT，其中得到的修饰破伤风毒素在7个位置包括独立突变(表3)。在一些例子中，修饰的毒素包括8个独立突变(R372A,Y375F,E334Q,R1226L,W1289A,K768A,和L231K)，根据SEQ ID NO:1编号，本文称作“7M-TeNT”或“7M-TT”。在一些情况下，7M-TeNT由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列编码。
在一些实施方式中，破伤风毒素经修饰抑制VAMP-2结合。例如，26位的酪氨酸(Y)残基突变(例如酪氨酸突变为丙氨酸(A))灭活毒素的VAMP-2结合能力。在一些情况下，在7M-TT修饰毒素中加入Y26A突变以产生8M-TT，其中得到的修饰破伤风毒素在8个位置包括独立突变(表3)。在一些例子中，修饰的毒素包括8个独立突变(R372A,Y375F,E334Q,R1226L,W1289A,K768A,L231K,和Y26A)，根据SEQ ID NO:1编号，本文称作“8M-TeNT”或“8M-TT”。在一些情况下，8M-TeNT由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列编码。
在一些情况下，修饰的破伤风毒素在残基位置372,275,334,768,1226,1289,231,和/或26处包括其他氨基酸取代。例如，可取代所列氨基酸的氨基酸包括逆转原始残基的电荷或疏水性的取代，保守氨基酸取代，和使得原始残基缺失的取代。
如本领域技术人员熟知的，用保守性氨基酸取代改变多肽的一级结构可能不会显著改变多肽的活性，因为插入序列的氨基酸的侧链可以形成与取代的氨基酸侧链类似的键合及接触。甚至当取代是在对确定多肽构型关键的区域中时也是如此。
保守氨基酸取代是本领域公认的取代，用一种氨基酸取代另一种具有类似特征的氨基酸。可通过修饰核苷酸序列引入编码保守取代的核苷酸改变来实现保守性氨基酸取代。例如，每种氨基酸可描述成具有以下特征中的一种或多种：带正电、带负电、脂族、芳族、极性、疏水性和亲水性。保守取代包括在各组中氨基酸之间的取代。酸性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺。碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸；脂族氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。芳族氨基酸包括苯丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。极性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸。还可用相对大小描述氨基酸，其中丙氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸被认为是小氨基酸。
在一些情况下，可以提供非保守取代，如果这些取代不破坏多肽内表位的三级结构，例如，不破坏多肽的免疫原性(例如抗原性)且不恢复毒性。
在一些实施方式中，修饰的破伤风毒素包含氨基酸残基372和375位的突变，还包括在残基334、1226、和1289中的一个或多个处的突变，其中修饰的毒素与另一种肽缀合或偶联，如下所述，用于合适的治疗方法。有利的是，本公开内容的修饰的破伤风毒素在用作疫苗或佐剂时并不需要用福尔马林解毒。在一些情况下，在修饰的破伤风毒素中加入少量福尔马林(～0.04％)或另一种固定或稳定化剂(例如福尔马林、戊二醛、β-丙内酯等)作为稳定剂，但其量比通常使用的(～0.4％)更小(例如小一个数量级)，来去除野生型破伤风毒素(或未按本文所述修饰的破伤风毒素)的毒性，以形成“破伤风类毒素”。
在一些实施方式中，本文所述的修饰毒素还包括分子例如糖类、蛋白质或肽(例如抗原)和化学基团。特别是，本文提供了重组的无催化性无毒性变体毒素形式(例如修饰的破伤风毒素和修饰的肉毒神经毒素)，其进一步修饰以包括缀合或化学连接(例如交联)的糖类。如此，与糖类缀合的修饰毒素提供了用作T细胞依赖性免疫原的平台。在一些情况下，可将其他分子或基团(例如抗原)作为“货物”与交联分子进一步连接。
在一些例子中，修饰的缀合糖类的毒素包括5个突变(R372A,Y375F,E334Q,R1226L,和W1289A)，根据SEQ ID NO:1编号，本文称作“TeNT(CB)”。在一些例子中，修饰的缀合糖类的BoNT毒素包括4个突变(E224A,R363A,Y366F,和W1266A)，根据UniProtKB/Swiss-Prot:P10845.4编号，本文称作“BoNT(CB)”。在一些情况下，糖类与修饰的毒素通过化学交联缀合。共价连接多糖与多肽，例如毒素的常见化学反应包括但不限于还原性氨化，氰化缀合以及碳二亚胺反应。在其他情形中，用其他合成方法，例如Chu等.,1983.Infect andImmun.40(1):245-256中所述的方案制备糖类-毒素偶联物。
本文所用的术语“糖类”指包括多糖、寡糖和其他糖类聚合物，包括单糖。通常多糖具有约10到2,000或以上的重复单元，优选约100-1900个重复单元。寡糖通常有约2-10个重复单元，至约15,20,25,30,或35到约40或45个重复单元。在一些情况下，适用于与本文提供的毒素偶联的糖类包括但不限于具有羧基的多糖。在这些情形中，具有羧基的多糖能通过所述羧基的硫醇衍生物与修饰的毒素偶联。
本文使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指包含氨基酸残基，主要通过共价酰胺键结合在一起的聚合物。术语“蛋白质”指包括所有以上定义。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。本文中，这些术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸通过共价肽键相连。蛋白质或肽可分离自天然有机体，由重组技术产生，或由本领域技术人员已知的合成生产技术生产。
在一些情况下，间隔子部分可用作修饰毒素和连接的分子之间的间隔子臂桥。间隔子部分可以具有任何各种分子结构，包括但不限于葡聚糖、聚谷氨酸和寡肽。
可通过比对序列确定氨基酸序列之间的序列相同性。当经比较的序列中的等价位置被相同的氨基酸占据，那么分子在该位置是相同的。将比对评为相同性百分数是经比较序列共有位置上相同氨基酸数量的函数。当比较序列时，最佳比对可能需要在一条或多条序列中引入缺口，以考虑序列中可能的插入和缺失。序列比较方法可使用缺口罚分，从而对于在比较序列中相同数量的相同分子，具有尽可能少的缺口，显示两条经比较序列之间更高相关性的序列可以比具有很多缺口的序列实现更高评分。最大相同性百分数的计算涉及产生最佳比对，并考虑缺口罚分。如上所述，序列相同性百分数可使用Needleman-Wunsch通用序列比对工具使用缺省参数设定确定，其在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi,对公众提供。Needleman-Wunsch算法出版在J.Mol.Biol.(1970)卷48:443-53。
可用常规合成仪合成制备本发明的多肽和核酸。另外，也可用重组DNA技术生产，并可掺入合适的表达载体，然后用于转化合适宿主细胞，例如原核细胞如大肠杆菌。培养转化的宿主细胞并从其中分离多肽。
在另一个实施方式中，本发明是编码修饰毒素制备物的核酸序列和与上述核苷酸序列所组成的核酸分子以高严谨条件杂交的其他核酸序列。在一个具体实施方式中，本文提供了编码修饰破伤风毒素的DNA序列，修饰的破伤风毒素在氨基酸残基372和375具有突变，还在残基334,1226,和1289的一个或多个具有突变，或是本文所述的修饰的催化结构域。在一些情况下，编码修饰破伤风毒素的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本文所用的术语“严谨条件”指本领域熟知的参数。例如，核酸杂交参数可见汇编这些方法的文献，例如：《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratoryManual),J.Sambrook,等编,第二版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),纽约冷泉港,1989,或《新编分子生物学方案》(Current Protocols inMolecular Biology),F.M.Ausubel等编,约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约。更具体地，本文使用的高严谨条件指在杂交缓冲液(3.5xSSC,0.02％ Ficoll,0.02％聚乙烯吡咯烷酮,0.02％牛血清白蛋白,25mM NaH2PO4(pH 7),0.5％ SDS,2mM EDTA)中于65℃杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠,pH 7；SDS是十二烷基磺酸盐；EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，转移有DNA的膜在室温下于2xSSC中洗涤，然后在达68℃，例如,55℃,60℃,65℃或68℃在0.1-0.5xSSC/0.1xSDS中洗涤。或者，高严谨条件可用市售杂交缓冲液，例如ExpressHybTM缓冲液(Clontech)进行，使用厂商提供的杂交和洗涤条件。
还应理解本发明利用表达载体中的序列以及转染宿主细胞和细胞品系，不论这些是原核(大肠杆菌)或真核(例如树突细胞、CHO细胞、COS细胞、酵母表达系统、在昆虫细胞中重组杆状病毒表达)。表达载体需要相关序列，即上述的序列与启动子可操作性连接。
在另一方面，本文提供了免疫原性组合物，其包含本文所述的修饰毒素，其在引入宿主后将在宿主以后被产生该蛋白质的同一微生物(例如破伤风杆菌)攻击时使宿主具有免疫力。在优选实施方式中，免疫原性组合物是疫苗，其包含本文所述的修饰毒素，还包含赋形剂和/或稀释剂，适合组合物被施给需要针对破伤风杆菌或肉毒杆菌或其纯化毒素导致的疾病进行免疫接种的个体。
本文所用的术语“疫苗”指包括抗原的组合物。疫苗还可包括生物制备物，其改善对特定疾病的免疫力。疫苗通常可包含一种试剂，称作抗原，其代表致病微生物，该试剂通常可用微生物弱化或灭活形式，其毒素或其表面蛋白之一制备。抗原可刺激身体免疫系统识别试剂作为外来物，并“记住”它，从而免疫系统能更轻易识别并破坏以后遇到的任何这些微生物。类似地，修饰的毒素制剂，联合针对其他病原体的疫苗能够作为疫苗佐剂“增强”对感兴趣病原体的免疫应答。佐剂可根据其物理化学性质或作用机制分类。两大类佐剂包括直接作用于免疫系统的化合物，例如刺激免疫应答的细菌毒素，和能够以受控形式促进抗原递呈并作为运载体的分子。
选择合适的疫苗组分在本领域技术人员常规能力范围内。例如，本发明的疫苗组合物可用药学上可接受的赋形剂或稀释剂常规配制，例如水性溶剂，非水性溶剂，非毒性赋形剂例如盐、防腐剂、缓冲液等。非水性溶剂的示例是丙二醇，聚乙二醇，植物油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性溶剂包括水、醇/水性溶剂，盐水溶液，腹膜内载体例如氯化钠，林格氏(Ringer's)葡萄糖等。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化物、螯合剂和惰性气体。能通过常规技术调节疫苗组合物的各种组分的pH和确切浓度。
在一些情况下，本文所述的制备物可包括纯化修饰的毒素，包括部分毒素复合物。在一些实施方式中，所述制剂可进一步包含已知稳定BoNT和破伤风毒素蛋白的稳定剂。合适的稳定剂是本领域已知的，并且包括但不限于例如人或牛血清白蛋白，明胶，重组白蛋白，如美国公开US2005/0238663中所述(其内容通过引用全文纳入本文)等。
术语“受试者”和“患者”可互换使用地指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿动物等，其将成为特定治疗的接受者。通常，术语“对象”和“患者”在本文中可互换使用地指人类对象。
本发明的制备物可以治疗有效量给药。术语“有效量”或“治疗有效量”指在接受抗体或疫苗的对象中诱导免疫应答，其足以预防由于病原体(包括病毒或细菌)感染导致的疾病体征或症状，包括不良健康影响或并发症。可诱导体液免疫力或细胞介导的免疫力，或同时诱导两者。可例如直接通过抗体滴度的测定，淋巴细胞增殖试验，或直接通过监测野生型毒株攻击后的体征和症状评估动物对疫苗的免疫原性应答。可通过测定例如临床体征如死亡率、发病率、温度数值、总体生理状况和对象的总体健康和表现来评估疫苗赋予的保护性免疫力。治疗有效的疫苗量可根据使用的具体制剂，或对象的状况改变，也可由医师决定。
本发明的制剂可以以治疗有效量给药，这取决于所需的治疗类型。确定用于个体治疗的合适剂量或剂量范围的方法是本领域技术人员已知的。对于本文提供的方法，本发明的制剂可以通过实现预期目的或本领域技术人员认为合适的任何方式给予。在一个示例性的实施方式中，使用例如微型泵系统以单一剂量或在适当时以连续给药的形式给予修饰毒素剂。在某些情况下，修饰毒素制剂以液体剂型或冻干剂型提供，其例如在给药前重建。
本文使用的术语“受保护的”指免疫患者抵抗疾病或病况。可通过施用含有抗原的疫苗导致免疫。特别是在本发明中免疫的患者受到保护免于破伤风病或其症状。
在一个实施方式中，合适剂量是约1μg到20μg。
本文所述的修饰毒素的制剂合适的给药途径包括但不限于直接注射。在一些实施方式中，每剂都经肌肉内施用。
目前技术提供的药物的剂量、毒性和治疗效力可用标准药物学方法在细胞培养物或实验动物中确定，例如确定LD50(对于50％群体的致死剂量)和ED50(对于50％群体有效的治疗剂量)。毒性和疗效的剂量比例是治疗指数并且可以表达为比例LD50/ED50。
本文所用的“治疗有效量”指给予对象用于治疗疾病时足以实现疾病治疗的化合物的用量。根据所述化合物、治疗的疾病状态、治疗的疾病严重程度、所述对象的年龄和相对健康状态、给药路径和方式、主治医生或兽医从业者的判断、和其他因素，所述“治疗有效量”可以改变。就本发明目的而言，“治疗”或“处理”描述了以对抗疾病、病症、或紊乱为目的对患者的管理和护理。该术语包括预防性治疗或处理(即预防)和缓解性治疗或处理。
可通过调节施用的偶联修饰Tet毒素平台，调整本文所述的结合传递平台以靶向特定病况或疾病。
方法
在另一个方面，本文提供了工程改造具有减弱的毒性和提高的性能的疫苗和结合疫苗的方法。该方法包括遗传修饰多结构域蛋白毒素的结构域内的特定氨基酸残基，使得毒素不能在靶细胞(例如神经元)上通过催化活性或受体结合活性表达毒性，不能易位，且回复毒性形式的能力减弱。通过改变多种独立的蛋白质功能，本文提供的方法有利地提供了作为强大疫苗和结合疫苗的理想候选物的全长毒素，其基本上没有使蛋白质回复毒性的能力。本文所用的术语“效力”指由合适的实验室检测或通过准确控制的临床数据指示的影响保护性免疫力的疫苗的特定能力或本领。换言之，效力是疫苗的强度量度。
在一些情况下，获得具有提高的作为疫苗的效力的工程改造的细菌蛋白类毒素的方法包括或基本由以下步骤组成：选择编码多结构域细菌蛋白毒素的氨基酸序列的每个结构域的一个或多个氨基酸位置，其中选择每个位置来灭活与每个结构域相关的蛋白质功能，其中结构域包括两个或更多个催化结构域，易位结构域，受体结合结构域和底物结合结构域；用非天然氨基酸残基在每个所选位置取代天然氨基酸残基，从而使所述取代灭活与所述结构域相关的一个或多个蛋白质功能；和在宿主细胞中表达编码全长细菌蛋白质毒素的核酸序列，该毒素包含取代的非天然氨基酸残基，从而使表达的蛋白质显示催化活性、受体结合活性，易位活性或底物结合活性相对于包含天然氨基酸的全长细菌蛋白毒素部分或完全丧失。
选择用于修饰的氨基酸残基包括分析蛋白质序列(例如一级氨基酸序列)或结构信息，以鉴定细菌蛋白毒素每个结构域的个体功能性氨基酸残基。优选，所选的残基是每个功能域(例如催化结构域，易位结构域，受体结合结构域，底物结合结构域)的一个或多个个体氨基酸残基，其能经修饰但不使得全长蛋白质丧失稳定性，也不丧失免疫原性。可通过任何合适的方法评估蛋白稳定性。在一些情况下，通过测定酪蛋白敏感性3测试修饰的毒素的稳定性，通过测定小鼠模型中对修饰毒素接种的免疫应答测试修饰毒素的免疫原性4。
可用任何合适的方法，例如x射线晶体学，电子显微镜，核磁共振质谱，计算机蛋白质结构建模或其组合获得蛋白质结构信息。在一些情况下，可用感兴趣的细菌蛋白毒素的晶体结构鉴定例如毒素功能域之间的相互作用以及相关蛋白毒素之间的功能保守残基。例如，用白喉毒素为例，从先前的研究文献中鉴定出涉及催化、底物结合、易位和受体结合的氨基酸残基，工程改造入编码白喉毒素的基因，以产生突变的白喉毒素基因，其编码在毒素的四个功能域的每一个中的多个独立突变，基于白喉毒素晶体结构内的氨基酸序列比对。编码突变白喉毒素的核酸序列将转化入大肠杆菌，重组产生蛋白并测试其毒性丧失，稳定性的维持，和保留的免疫原性。
例如，可通过分析野生型细菌蛋白毒素的晶体结构确定域间和域内分子相互作用。可以使用众所周知的方法，例如定点诱变，PCR介导的诱变和总基因合成，以及本领域已知的其它方法来实现取代突变。例如在下面的实施例中显示了诱变方案的说明性方法。在一些情况下，用定点诱变产生单氨基酸残基处的突变。在一些情况下，可用软件程序例如PrimerX(可从万维网的bioinformatics.org/primerx/获得)设计位点特异性诱变的寡核苷酸引物。可用任何合适的方法例如聚合酶链式反应将野生型细菌蛋白毒素基因克隆入表达载体，作为诱变的模板。可用核酸测序确认诱变。在一些情况下，编码修饰蛋白毒素的多核苷酸位于表达载体内。在一些情况下，载体在宿主细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、真核细胞)中。已知许多对于原核和真核细胞的表达载体和系统，选择合适系统只是选择问题。本发明修饰蛋白产物的表达和纯化可由本领域技术人员轻易实现。见例如Sambrook等.,"分子克隆-实验手册(Molecular cloning-A Laboratory Manual)，第二版"。
方法能用于几乎任何细菌蛋白毒素，也称作外毒素，它们是细菌分泌的多结构域蛋白，在许多情况下，代表了具有催化性作用并显示底物特异性的酶。细菌蛋白毒素包括但不限于肉毒柑橘毒素、破伤风毒素、志贺氏菌毒素、白喉毒素、百日咳鲍特杆菌(Bordetellapertussis)毒素、大肠杆菌热不稳定毒素LT，炭疽杆菌(Bacillus anthracis)毒素，假单胞菌外毒素A，炭疽毒素致死因子(LF),霍乱肠毒素,和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)脱落素B。表4列出了示范性细菌蛋白，其中晶体结构信息能用于设计遗传工程改造的重组、无毒性、高性能的类毒素，其对于疫苗和结合疫苗特别有利。
表4：具有多个独立功能域和解析结构的细菌蛋白毒素
在一些情况下，选择独立的灭活性修饰来破坏一个或多个细菌蛋白毒素的催化结构域，底物结合结构域，易位结构域和受体结合结构域。例如，白喉毒素是细菌蛋白毒素，长535个氨基酸。灭活催化(E149S),底物结合(H21A),易位(E349K,E362K),和受体结合(K516A,K526A,H391A)功能中涉及的氨基酸残基将得到无毒性但效力强大的白喉疫苗。
然而应理解，该方法能用于几乎所有具有多功能域(例如效应结构域)的蛋白，其氨基酸序列和/或晶体结构信息是可得的，可基于已知的结构功能性质确定灭活修饰。
在一些实施方式中，在重链C末端(HCC)引入阻碍宿主受体活性的遗传修饰。为了阻碍催化活性，将基因修饰通过SNARE复合物引入轻链中神经递质释放所需或重要的氨基酸残基处。
本文所述的和引用的技术和方法是通常熟知并由本领域技术人员常用的，例如广泛施用的如Ausubel等.,《新编分子生物学方案》(Current Protocols in MolecularBiology),威利跨学科出版公司(Wiley Interscience Publishers),(1995)所述的分子克隆方法。如果合适，使用市售试剂盒和试剂的方法通常根据厂商确定的方案和/或参数进行，除非另外说明。
试剂盒。
在另一个方面，本文提供了对对象施用疫苗或佐剂的试剂盒，其包含本文所述的修饰毒素疫苗。在一个实施方式中，试剂盒包含修饰毒素的一定形式(例如本文所述的修饰的破伤风毒素)。试剂盒还可包含说明书，使得用户能够进行对对象接种抵抗破伤风杆菌导致的疾病，由其是由破伤风毒素导致的疾病的发生。在一个实施方式中，配制、传递和储藏本发明修饰的毒素以在生理条件中使用。合适的药物运载体包括但不限于例如盐水溶液(例如0.9％氯化钠)，磷酸盐缓冲盐水，乳酸林格氏液等。
“说明材料”表示发表物、记录、图表、或任何其他表达媒介，其用于传递针对本文所述目的之一的本发明药物组合物的实用性。例如，可将试剂盒的说明材料附着至含有本发明的容器，或与含有本发明的容器一起运输。另外，说明材料还可与容器分开运输，或以电子接触形式在网站上提供，为了说明材料和生物相容性水凝胶可以由接受者协同使用。
在本说明书和权利要求书中，术语“包括”和“包含”是开放式的术语，应被解释为表示“包括但不限于”。...这些术语涵盖了限定性更强的术语“主要由……组成”和“由……组成”。
除非上下文另有明确说明，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、和“具有”可以互换使用。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。本文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括描述和公开所述出版物报道的可与本发明联合使用的化学物质、设备、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不是先于这些公开内容的在先发明。
在考虑以下非限制性实施例的基础上，能够更完整地理解本发明。
实施例
实施例1：M-BoNT/A1和M-BoNT/A1W的分离和表征
该实施例描述了全长BoNT，经工程改造在催化和受体结构中有缺陷，保护免于106LD50的天然BoNT/A1攻击。这些数据表明遗传改造的毒素具有多个通过独立机制减弱毒性的突变，作为平台策略能开发针对肉毒中毒和其他毒素介导疾病的疫苗。
材料和方法：
生物安全性和生物安全：在威斯康星大学麦迪逊分校进行的试验由学校的生物安全委员会批准。此外，在由联邦特选代理程序批准进行该研究的实验室中进行试验，实验人员经过适合性评估并遵从学校政策和实践。动物试验根据威斯康星大学麦迪逊分校的动物护理委员会指导批准和进行。卫生和人服务部确定编码三个LC突变((E224A/R363A/Y366F),称作M)的BoNT/A基因和蛋白质产物不符合选择代理的调节定义，允许生产M-BoNT/A而不用选择代理注册(§73.3HHS选择试剂和毒素42CFR 73.3(e)(1)。
肉毒神经毒素从肉毒杆菌菌株A-hyper,Kyoto-F,CDC A3(由Susan Maslanka和Brian Raphael提供,疾病控制和预防中心)和A661222通过标准毒素纯化方法(Jacobson等.,2011；Lin等.,2010；Malizio等.,2000；Tepp等.,2012)纯化BoNT/A1,/A2,/A3和/A5。从CDC41370 B2tox-(由菌株CDC41370修饰，仅产生BoNT/A6)毒素用先前所述的方法(Pellett等.,2016)纯化BoNT/A6。通过光谱和SDS-PAGE分析(Whitemarsh等，2013)确定毒素纯度。纯化的毒素-20℃储藏在包含40％甘油的磷酸缓冲盐中，直到使用。如前所述，使用标准腹膜内小鼠生物测定法(MBA)确定5种亚型制剂的活性(Hatheway,1988；Schantz,1978)。每种毒素的半致死剂量定义为1只小鼠的LD50单位(U)。BoNT/A亚型的比活力为：8pg/U(A1),7.9pg/U(A2),17pg/U(A3),7.3pg/U(A5),和5.9pg/U(A6)。
重组BoNT衍生物：HCC/A1(W1266A)(HCC/A1W),LC/A1(R363A/Y366F)(LC/A1RY),LCHCN/A1(E224A/R363A/Y366F)(M-LCHCN/A1),BoNT/A1(E224A/R363A/Y366F)(M-BoNT/A1),BoNT/A1(E224A/R363A/Y366F/W1266A)(M-BoNT/A1W)和无催化性破伤风毒素(R372A/Y375F)(TeNTRY)的制备如先前所述进行(Przedpelski等.,2013)。简单说，大肠杆菌在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上37℃过夜生长。培养物接种入含有卡那霉素的LB培养基(400ml)，37℃振摇3-6小时，达到OD600约0.6，加入1.0mM IPTG，然后振摇16℃过夜培养。收集细胞，将沉淀悬浮在裂解缓冲液(20mM Tris(pH 7.9),500mM NaCl,5mM咪唑,核酸酶,DNA酶,和蛋白酶抑制剂)(Sigma)中。用弗式压碎器破碎细胞，离心澄清，滤过0.45μm无表面活性剂醋酸纤维素膜(Thermo Fischer)。裂解物进一步通过串联重力流动层析纯化，使用Ni2 +-NTA树脂(Qiagen),对氨基苄基脒琼脂(Sigma),和Strep-tactin超流高通量树脂(IBA-LifeSciences)。纯化的蛋白质透析入10mM Tris(pH 7.9),200mM NaCl,和40％甘油中，储藏在-20℃。用于该研究的重组蛋白质如图1所示。编码M-BoNT/A1W的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示(见图9)。
疫苗攻击：用HCC/A1W,M-LCHCN/A1,M-BoNT/A1,或M-BoNT/A1W以所示浓度混合等体积的铝胶(Alhydrogel)作为佐剂腹膜内免疫雌性ICR小鼠(18-22g)组。用未经胰蛋白酶消化的M-BoNT/A1和M-BoNT/A1W作为疫苗。在第1和14日施用疫苗，在第21日上颌放血收集血液，用BoNT/A1,BoNT/A2,或BoNT-/A2,/A3,/A5,A6混合物如所示在第26日攻击小鼠。如所示，在每个试验中使用至少八只小鼠一组。用双尾配对斯氏t检验评估结果的统计学相关性，p＝0.05。
ELISA：将BoNT衍生物或TeNTRY(250ng/孔)加到高蛋白结合96孔板(Corning)的0.1ml涂覆缓冲液,50mM Na2CO3(pH 9.6)中，4℃孵育过夜。然后用含有0.05％吐温20的0.3ml磷酸缓冲盐(PBS)洗涤平板三次，室温(RT)用含有1％(重量/体积)牛血清白蛋白(BSA)的0.2ml PBS封闭30分钟。RT孵育平板1小时，加入来自各接种小鼠的指定稀释度的血清(1:20,000或1:30,000)，溶于含有1％(重量/体积)BSA(0.1ml)的PBS。用含有0.05％吐温20的0.3ml PBS洗涤三次以后，平板在RT与山羊α-小鼠IgG-辣根过氧化物酶(IgG-HRP稀释1:20,000；Thermo)在含有1％(重量/体积)BSA的PBS中孵育1小时。用含有0.05％吐温20的0.3ml PBS洗涤平板三次，然后与0.1ml/孔的四甲基联苯胺(TMB；Thermo Ultra TMB)作为底物一起孵育。10分钟后，用0.1ml 0.1M H2SO4终止反应，在450nm读吸光度。用α-HA和αFLAG抗体测定结合抗原的对照ELISA显示每个抗原内正确表位的存在在15％以内(数据未显示)。对于ELISA,对各分析血清组(N＝10)基于免疫和/或攻击条件用双尾未配对斯氏t检验进行统计分析，P<0.05＝*,0.01＝**,0.001＝***,和0.0001＝****(GraphPad Prism 7)。各血清通过至少两次独立ELISA进行分析，设双重复。基于对几份个体血清的评估来分析1:20,000-1:30,000倍数稀释的小鼠血清。从对用M-BoNT/A1接种在BoNT/A1攻击中存活下来的小鼠的剂量依赖性ELISA建立血清稀释。代表性ELISA如图6所示。
检测中和抗体的基于细胞的试验：如先前所述(Whitemarsh等.,2012)进行基于细胞的中和试验。简单说，根据厂商指示将人诱导性多能干细胞(hiPSC)衍生的神经元(Cellular Dynamics International,威斯康星州)接种到涂覆有聚-L-鸟氨酸和MatrigelTM的96孔TPP板(Midwest Scientific,密苏里州)上，密度为约35,000-40,000细胞/孔，维持在iCel神经元培养基(Cellular Dynamics International,威斯康星州)上，7天后用于中和试验。为了检测小鼠血清中的中和抗体，将2pM BoNT/A1与系列稀释的无菌过滤的血清合并，在培养基中37℃孵育1小时。不含血清的BoNT/A1用作“无抗体”参照，来自无免疫力小鼠的血清作为对照。用不含毒素的血清作为阴性对照。在每个hiPSC衍生神经元孔中分别加入50μl的各抗体-毒素混合物，至少设双重复；细胞在37℃5％CO2中孵育24小时。从细胞中吸出毒素/抗体，细胞裂解物制备在50μl十二烷基硫酸锂(LDS)样品缓冲液(LifeTechnologies)中。如先前所述(Pellett等.,2007；Pellett等.,2010)用蛋白质印迹分析细胞裂解物的SNAP-25切割。用PhosphaGlo试剂(KPL,马里兰州盖瑟斯堡)和Fotodyne/FOTO/Analyst FX显像系统(Harland,威斯康星州)获得图像。用TotalLab Quant软件(Fotodyne,Harland,威斯康星州)通过密度测定法分析切割(24kDa)对未切割(25kDa)SNAP-25信号。通过与“无抗体”对照比较确定保护百分数，用GraphPad Prism 6软件和非线性回归可变斜率和四参数估计IC50。
结果
M-BoNT/A1对于远交小鼠或培养物中的细胞无毒性。
腹膜内注射10μg胰蛋白酶处理或未经胰蛋白酶处理的M-BoNT/A1/小鼠(ICR)未导致可观察的肉毒中毒体征，说明M-BoNT/A1比起天然BoNt/A1毒性低至少一百万倍。另外，将人iPSC衍生的神经元与80nM M-BoNT/A1孵育，未得到可检测的SNAP-25切割，而与50fM天然BoNT/A1孵育切割SNAP-25，基于细胞试验说明毒性低至少一百万倍(数据未显示)。
M-BoNT/A1和M-BoNT/A1W是比HCC/A1W是更有保护性的疫苗。
对远交ICR小鼠(n＝8-10)进行疫苗攻击，以反映宿主内的天然免疫差异(Rai等.,2009),使用初次免疫然后一次增强免疫。由于先前研究显示HCC/A1(W1266A)(HCC/A1W)在肉毒中毒的小鼠模型中与HCC/A1具有相似疫苗效力(Przedpelski等.,2013),M-BoNT/A1W也进行了工程改造。用0.3μg/小鼠单链M-BoNT/A1W或0.2μg/小鼠M-LCHCN/A1接种的小鼠受到保护，抵抗106LD50天然BoNT/A1或105LD50的BoNT/A亚型混合物(2.5x 104LD50各A2,A3,A5,A6)的攻击，或对于106LD50天然BoNT/A2(一种异源亚型)的攻击有部分保护作用(表4)。用0.1μg/只小鼠HCC/A1W接种的小鼠对103LD50天然BoNT/A1或天然BoNT/A2的攻击有部分保护。这些数据表明在等摩尔剂量下，M-BoNT/A1W和M-LCHCN/A1疫苗比起HCC/A1W疫苗对毒素的保护强1000倍。用等重剂量的疫苗进行比较，用0.3μg/只小鼠HCC/A1W接种的小鼠对105LD50天然BoNT/A1或105LD50天然BoNT/A亚型混合物有部分保护作用。这表明甚至在等浓度(HCC3倍摩尔过量)下，M-BoNT/A1W和M-LCHCN/A1对于同源和异源BoNT/A攻击有更好的保护作用。M-BoNT/A1W和M-BoNT/A1疫苗在保护上未显示不同，表明另做“受体结合”突变并不影响疫苗效力。总体上M-BoNT/A1,M-BoNT/A1W和M-LCHCN/A1疫苗比HCC/A1W更强。通过将神经元暴露于BoNT/A1或BoNT/A6的系列稀释液中72小时，然后完全去除细胞外毒素，并在培养基中进一步孵育，对于人类iPSC衍生神经元进一步研究了对于培养的神经元的作用持续时间。在第3、39和70天收获每个稀释系列的细胞，设三重复，并在每个时间点确定SNAP-25裂解的EC50。对于BoNT/A6，在第3、39和70天时，EC50值分别为约0.04、0.7和1U/50μl/孔(32、560和800fM)(图2)。对于BoNT/A1，在第3、39和70天，EC50值为约0.7、6.3和28U/50μl/孔(分别为313、2940和12,880fM)(图2)。从随时间变化的EC50值确定的这些hiPSC衍生神经元中BoNT/A1和/A6的半衰期对于BoNT/A1和/A6而言是相似的，分别约为12天和14天(图2)。综上所述，这些结果表明，与其他BoNT/A亚型相似，BoNT/A6具有长的作用持续时间。
在远交小鼠中对BoNT疫苗的抗体应答在质和量上都有变化。
M-BoNT/A1W和M-BoNT/A1免疫提供了对105LD50 BoNT/A2的完全保护和对106LD50天然BoNT/A2(一种异源亚型)的部分保护(表5)。ELISA分析接种小鼠的抗体应答，显示在天然BoNT/A2攻击中存活或未存活的小鼠具有对BoNT和LCHCN相似的显性抗体滴度，统计学上没有显著不同(图2)。因此，对天然BoNT/A2攻击的部分保护可能是由于BoNT/A亚型之间中和表位组成的具体差异，而不是由于接种的小鼠对传递的疫苗产生免疫效应能力的差异造成的。
各血清ELISA以分析接种的小鼠的抗体应答，使用LCA1RY,HCC/A1W,M-LCHCN/A1,或M-BoNT/A1海参毒素(holotoxin)作为结合底物。每组接种的小鼠内的抗体应答在组内从量和性质上都有差异。接种M-BoNT/A1W的小鼠(图3左下方)显示了对BoNT(平均滴度2.2(范围1.3-2.6))和LCHCN(平均滴度1.7(范围0.8-2.4))的显著抗体滴度。小鼠之间对HCC的滴度有差异(平均滴度0.41(范围0.07–1.83))。对LC的滴度没有超过对照，表明大部分抗体应答直接针对HC。滴度范围内的变异(variance)是由于个体小鼠之间不同的抗体滴度造成的，而不是由于ELISA重复中的变异。观察到对M-BoNT/A1免疫的相似免疫应答(数据未显示)。用M-LCHCN/A1接种的小鼠(图3左上方)也对BoNT和LCHCN有显著抗体滴度,但平均滴度低于用M-BoNT/A1W免疫的小鼠。用M-LCHCN/A1+HCC/A1W接种的小鼠与用M-BoNT/A1W免疫的小鼠在性质上有相似的抗体滴度概况，量上与用M-LCHCN/A1单独免疫的小鼠相当(图7)。用HCC/A1W接种的小鼠具有对HCC的抗体滴度，其与BoNT/A1攻击存活相关(图3，下右图)。用M-BoNT/A1W接种的小鼠具有对TeNTRY有限的抗体滴度(图3)，表明观察到的抗体应答是BoNT特异性的。
经BoNT攻击存活下来的个体接种小鼠的血清性质对用M-BoNT/A1W,M-LCHCN/A1,或HCC/A1W接种且经天然BoNT/A1攻击存活下来的小鼠的个体血清的分析显示了几种代表性的对接种的免疫应答(图4)。由于我们先前的研究(Przedpelski等.,2013Infect Immun.81(7):2638-44)没有对M-LCHCN/A1免疫的抗体应答表征，分析了来自三只LCHCN/A1接种小鼠的血清。ELISA结果显示用M-BoNT/A1W接种的小鼠具有对BoNT和LCHCN(#7)或对BoNT,LCHCN,和HCC(小鼠#3)的显著抗体滴度。用M-LCHCN/A1接种的小鼠显示对BoNT和LCHCN(小鼠#21,#24,和#25)的显著抗体应答,而用HCC/A1W免疫并在BoNT/A1攻击中存活下来的小鼠具有对HCC(小鼠#78)的显著抗体应答。总体上对TeNTRY的抗体应答很低，表明ELISA中检测到的免疫反应性对BoNT特异。
BoNT/A和HCC疫苗引发比LCHCN疫苗更强的中和抗体应答。
用hiPSC衍生的神经元通过基于细胞的试验测定接种的小鼠中的中和抗体。从等摩尔免疫攻击的各免疫组中，合并10个血清并在基于细胞的试验中测试其中和BoNT/A1诱导切割SNAP25的能力。M-BoNT/A1W接种的合并库在中和方面效力最强，具有0.004的IC50值，其比HCC/A1W接种的合并库和M-LCHCN/A1+HCC/A1W免疫的合并库低约2倍，比M-LCHCN/A1接种的合并库低约5倍(数据未显示)。HCC和M-BoNT/A1接种的小鼠中中和抗体滴度的相似性是令人惊讶的，因为毕竟M-BoNT/A1疫苗保护的小鼠对毒性攻击的保护比HCC疫苗要高>1,000倍。为了对此进一步研究，还测定了基于细胞试验中6个代表性个体血清中和BoNT/A1切割SNAP25的能力(图5)。总的来说，6个血清中每一个中和BoNT/A1作用在血清滴度中有约10倍的差异。HCC/A1W免疫(小鼠#78)和M-BoNT/A1W免疫(小鼠#3)的血清(含有对HCC的显著抗体应答(图4)是BoNT/A1切割SNAP-25最强的抑制剂。缺乏可检测HCC抗体应答的血清(小鼠#7,#21,#24,和#25)在已知SNAP-25切割中效果较差。因此，在该试验中，具有HCC表位的疫苗比LCHCN疫苗引发更高的“中和性/阻断性抗体”反应。总的来说，这些数据表明BoNT/A1的HCC结构域比HC或LC结构域引发更强的中和/封闭抗体反应，但HCN和(可能的)LC结构域在体内保护中发挥主要作用。
讨论
在肉毒中毒的远交小鼠模型中，M-BoNT/A1,M-BoNT/A1W和M-LCHCN/A1疫苗比HCC/A1W更强。对来自在BoNT/A1攻击中存活下来的接种小鼠的血清的评估显示与LCHCN内中和表位的存在一致的对LCHCN的共同反应。M-BoNT/A1W引发与M-BoNT/A1类似的保护性免疫应答的能力显示宿主细胞结合的下降对疫苗效力并没有不良影响。因此，经工程改造，在催化和受体结合域都有缺陷的全长BoNT代表了一种开发针对肉毒中毒和其他毒素介导疾病的疫苗的新平台策略。Collier及同事(Killeen等.,1992)显示能产生第二位点突变，其部分逆转遗传灭活的白喉毒素，用于疫苗开发测试。另外，Smith及同事近来的研究揭示了比仅减少几个基于BoNT的疫苗血清型的催化能力更高的减毒需求(Webb等.,2017)。
在先前的研究中，LCHCN被认为是BoNT疫苗候选物(Shone等.,2009)。通过大肠杆菌发酵大量生产LCHCN，对于低剂量BoNT攻击(103LD50的BoNT)是有效的单剂疫苗。在该报道中，我们观察到LCHCN与其他BoNT疫苗候选物直接通过初次免疫和一次增强后比较是强疫苗，并确认了LCHCN内中和表位的存在(Shone等.,2009)。Dolly和同事鉴定了LC特异性单克隆抗体(Mab)，其防止BoNT/A作用(Cenci Di Bello等.,1994),然而Marks和同事鉴定了BoNT/A中和单克隆抗体，其具有LC功能，抑制SNARE切割(Cheng等.,2009)，以及靶向HCN并中和几种BoNT血清型的mAb(Garcia-Rodriguez等.,2011)。总的说，这些研究表明BoNT免疫引发中和LCHCN结构域内表位的抗体生成。由于M-BoNT/A1W比M-LCHCN/A1引发更高抗体应答(图7),且确定了HCC在培养细胞中产生具有更高中和/阻断滴度的抗体，预期包括HCC的疫苗例如M-BoNT/A1W能更有效地在“高剂量”接触的场景下比LCHCN或HCC疫苗衍生物保护性更高。
HCC是常见的开发针对肉毒中毒的疫苗的结构域，如先前研究中构建的利用DNA和病毒载体以及基于蛋白的疫苗，显示HCC中和滴度(Clayton等.,1995)和生产的便利(Baldwin等.,2008)。Smith及同事在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达HCC，并报道了HC(c)引发的保护性免疫(Byrne和Smith,2000)，随后报道了由重组HCC/A和HCC/B(rBVA/B)组成的二价疫苗，其正在临床实验(Webb和Smith,2013)。大肠杆菌(E.coli)也能用作BoNT疫苗开发的异源宿主，包括生产针对BoNT攻击的几种血清型(A-G)HCC-疫苗(Baldwin等.,2008)。为了增强疫苗效力，在HCC中引入突变以封闭宿主受体结合，其中HCC W保留疫苗效力(Przedpelski等.,2013)。虽然生产的方便使得HCC成为了一种有吸引力的疫苗平台，但目前的研究显示M-BoNT/A1W是比HCC/A1W更强的疫苗。Atassi及其同事的发现对此支持。他们用来自对BoNT治疗抗性的宫颈肌张力障碍患者的血清检测了LC和HCN内的免疫表位(Atassi等.,2011；Dolimbek等.,2007),这和BoNT的LCHCN的免疫原性一致。
Smith和同事近来的研究(Webb等.,2017)报道了催化性灭活的BoNT在一次免疫后比相应的HCC显示对1000LD50毒素攻击更高的效力。Smith同事所述的攻击实验测定了毒素攻击阈值，其与测定毒素攻击终点的保护的目前研究不同。数据显示在两种情况下(用于阈值或终点测定对毒素攻击的保护)，全长BoNT疫苗都比其相对HCC亚基强。催化和宿主受体结合有缺陷的M-BoNT/A1W在对亚基的终点毒素攻击中是有效的。通过灭活多个功能位点来降低由于细胞结合或输入的可能毒性，利用M-BoNT/A1W作为疫苗候选物克服了单独遗传灭活催化功能可能不能提供全长BoNT疫苗开发的充分安全性的忧虑(Webb等.,2017)。
虽然利用HCC作为针对肉毒中毒的疫苗候选物已经确立(Baldwin等.,2008；Henderson,2006),目前的研究显示BoNT的多结构域衍生物比起HCC更强。M-BoNT/A1W引发对LCHCN的共同显著抗体反应，但在远交小鼠中的HCC抗体反应有差异。同时减少催化和受体结合的能力支持用M-BoNT/A1W作为针对肉毒中毒的疫苗平台。针对BoNT/A亚型混合物的保护确认了该疫苗的广谱中和能力。在该研究中用作疫苗的M-BoNT/A1W并未加工成活化的双链形式，且在小鼠或细胞中未检测到毒性，提示单链M-BoNT/A1W是安全有效的疫苗。
实施例2-赖氨酸768TeNT变体中断裂轻链易位的表征
这部分描述了TT易位结构域中封闭轻链(LC)易位的单氨基酸点突变的首次鉴定和表征。K768在LC易位中的作用的鉴定首次提供了灭活TT的独立活性的机会，以及通过类比BT(见表6)，催化、易位和受体结合，用于重组疫苗开发。
我们近来用破伤风毒素鉴定了易位结构域中编码的轻链(LC)易位中的限速步骤。赖氨酸(K)768位于连接两条长α-螺旋(螺旋12-13和螺旋16-17)的环中。定点诱变鉴定了点突变K768A，位于连接易位结构域的两条长α螺旋的环内，其抑制易位(图12)。细胞研究显示M-TT(K768A)不结合神经元膜，其支持了膜渗透中环的作用。对比实验显示K768A突变不抑制TT在宿主细胞中的结合，进入，运输，或孔形成，且不抑制轻链(LC)和重链(HC)被胰蛋白酶切割，表明突变不干扰总体M-TT结构并提示了环在轻链易位中的直接作用。其他实验表明K768A不是pH引发物的组分。这是首个易位结构域内轻链易位所需的单氨基酸，提示了两条长α-螺旋(螺旋12-13和螺旋16-17)在毒素-膜相互作用中的作用。其他实验证明D767/E769A突变也导致破伤风毒素易位缺陷，使得D767/E769补偿K768和/或额外抑制破伤风毒素中的LC易位。
在肉毒毒素(BT)和TT疫苗中工程改造独立突变(见表6)将使得毒素作用的三个功能的每一个失活：催化、易位和受体结合，因此增强疫苗安全性。多重独立突变指数减少毒素效力，增强疫苗安全性而不干扰蛋白质结构和可能的免疫原性，并在大规模生产中减少逆转可能性。
实施例3-作为低剂量保护疫苗的工程改造的M－破伤风毒素(M-TT)
与BT结构类似，破伤风毒素(TT)是AB毒素，其包含N-末端结构域(催化轻链LC)和C-末端结构域(易位和受体结合重链，HC)。TT的Zn++结合口袋内的两个氨基酸突变(R372A,Y375F)得到2M-TT，其与天然破伤风毒素相比抑制Zn++结合和降低毒性达125,000-倍。2M-TT氨基酸序列列于SEQ ID NO:2,核苷酸序列列于SEQ ID NO:3。在进一步降低毒性的最初实验中，基于E234稳定H233加入进一步抑制Zn++结合的一个额外突变(E234Q)，其直接协调Zn++结合。接着，通过工程改造两个独立突变(R1226L,W1289A)抑制神经元与双重神经节苷脂受体结合，产生5M-TT(见表7)。作为原理证据，我们用一个额外突变工程改造了6M-TT以抑制LC易位(K768A)(图14)。6M-TT包含在以下每个破伤风毒素功能中的突变：催化，易位和受体结合。从大肠杆菌中以约6mg/升培养物批次纯化6M-TT。用20μg单链或双链6M-TT注射四只小鼠中的每一只，都不显示任何破伤风症状。因此，6M-TT是可溶性，良好表达的无毒蛋白质。
6M-TT将依次进一步被工程改造，通过在位点Y26和L231位置引入突变来抑制VAMP-2的结合和切割，产生7M-TT和8M-TT。基于先前显示L231突变减少kcat而不影响VAMP-2亲和力的研究选择L231，而且L231K突变不影响LC的整体结构9。基于HCR/T的S7口袋内的位点选择Y26，证明Y26A突变降低LC/T与VAMP-2的亲和力9(见表7)。8M-TT和中间产物(6M-TT和7M-TT)进行圆二色性法测定二级结构，胰蛋白酶敏感性以测定整体对比稳定性，以及质谱分析测定蛋白质组成42。
由于我们现在已知6M-TT是作为可溶蛋白产生的，高度表达，而且注射20μg对小鼠无毒，首次在人神经元细胞实验中评估了6M-TT、7M-TT和8M-TT的毒性，在细胞进入后分析VAMP-2切割并在细胞裂解物中分析VAMP-2的切割64。如果未检测到切割或细胞毒性，则在小鼠模型中确定为无体内毒性，使用雌性ICR小鼠(18-22g，5只小鼠/组)(表8)。
初始实验将在小鼠腹膜内注射20,50,250,或1000μg 8M/TT/小鼠(1000μg重量相当于4X 107LD50野生型破伤风毒素)65。经注射的小鼠将在小鼠生物实验中就3天存活评分，并在长达14天内观察任何显示TT病理性的症状，包括体重不增加，应激体征，器官损伤和破伤风症状。测试雄性小鼠以研究性别差异。
用0.01-0.1μg优化M-TT或等量化学灭活的破伤风类毒素免疫远交雌性ICR小鼠(每组8只)，在第14天进行增强接种(表9)。在第26日，对小鼠放血，在第30日用103-106U破伤风毒素攻击小鼠。为了研究长期保护，接种小鼠维持180天，用TT攻击测试免疫应答的持续。存活3天的小鼠被评为受保护。如先前所述6通过ELISA测试攻击前获得的血清的抗-TT以及针对培养神经元的破伤风毒素中毒的中和能力，作为VAMP-2切割的抑制71-72。测试雄性小鼠以确保无性别差异。
我们预期每个引入的独立LC点突变将对催化活性造成倍数下降，且在M-TT毒性中也反映了下降，因为LC突变抑制催化中的独立步骤。我们预期这些LC或HC突变不会影响蛋白质稳定性或免疫原性，因为先前对其作为在LC-TT或HC-TT中个体突变的作用已经进行了研究。注射1000μg 8M-TT对我们的小鼠模型不会有毒性，而8M-TT可能与化学灭活TT相比具有更强的中和免疫应答，从而能实现用8M-TT低剂量免疫。
近来的综述估计目前结合疫苗仅能实现一部分可能的免疫效力4。微生物病原体的研究继续鉴定需要与蛋白质类毒素结合以产生有效的T细胞依赖性免疫应答的其它免疫原。这些包括但不限于脑膜炎球菌的荚膜,15真菌,16,和肺炎球菌17-18。另外，合成聚糖提供了天然多糖的疫苗的具有前景的未来替代品，前者的纯度和含量有相当差异20-22。破伤风类毒素是多糖的免疫原性载体蛋白23。基于我们对TT结构功能性质以及破伤风毒素作为化学灭活类毒素的基础信息，的了解，以及全世界持续对破伤风疫苗的需求，破伤风毒素是开发这些下一代重组结合疫苗的最佳候选物之一。安全、易生产和保护性重组TT疫苗的产生首次实现了对重组全长无毒性TT作为结合疫苗载体的分析。目前对于结合疫苗载体，包括破伤风类毒素的保护性质缺乏了解73。重组无毒M-TT可用作几种常用抗原的载体，以确保当与M-TT结合时相对于化学灭活的TT对抗原的免疫应答增强。
寡糖和M-TT结合的方案遵循出版的Lees实验方案74。简单说，用LV-1微流计将多糖(PS)还原为分子量为100-300kDa。PS制备成在水中5mg/ml，用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP，0.5mg/mg)活化74。加入等重量的蛋白质(5mg/ml)，溶液维持在pH9。通过尺寸排阻层析(SEC)HPLC监测反应，并用过量甘氨酸淬灭。用SEC纯化偶联物，用SEC-Multi-Angle光散射测定分子量。经鉴定的多糖和肽将与8M-TT交联：(i)B组链球菌(GBS)多糖血清型Ia,Ib,II,III,IV和IV；(2)聚-β-(1-6)-N-乙酰基-葡糖胺(PNAG)，其作为针对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae),嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),和洋葱克雷伯氏菌(Burkholderia cepacia)复合物(BCC)的候选广谱疫苗介导生物膜形成45；(3)肽目前在流感疫苗中测试。
用0.01-0.1μg偶联优化M-TT或等量化学灭活的破伤风类毒素免疫远交雌性ICR小鼠(每组8只)，在第14天进行增强接种(表10)。在第26日，对小鼠放血，在第30日用103-106U破伤风毒素攻击小鼠。为了研究长期保护，接种小鼠维持180天，用TT攻击测试免疫应答的持续。存活3天的小鼠被评为受保护。如前所述通过ELISA测试攻击前获得的血清抗偶联物和抗TT6 74。测试雄性小鼠的性别差异。
PNAG寡糖，GBS多糖和流感肽将分别与8M-TT疫苗偶联。随后的实验将组合GBS和PNAG以产生多重多糖偶联物-8M-TT疫苗。接着，组合流感肽和PNAG产生多重肽-多糖偶联物-8M-TT疫苗。这些实验将测试8M-TT作为疫苗运载体的效力。
预计各结合疫苗PNAG-8M-TT,GBS-8M-TT,和肽-8M-TT将引发与偶联物-化学灭活的TT疫苗类似的对偶联物的免疫应答和对TT更强的免疫应答。我们还预期对8M-TT疫苗内多糖和肽的免疫应答将引发与各抗原与8M-TT偶联时类似的免疫应答。我们预期对8M-TT的免疫应答将与天然TT攻击的保护相关。
参考文献
1.Rappuoli,R.,包含重组白喉毒素的疫苗诱导早期和长效保护.Biologicals1999,27(2),99-102.
2.Agnolon,V.；Bruno,C.；Leuzzi,R.；Galletti,B.；D'Oro,U.；Pizza,M.；Seubert,A.；
O'Hagan,D.T.；Baudner,B.C.,佐剂增强针对TdaP疫苗的效力:MF59和单磷脂A的临床前评估A.Int J Pharm 2015,492(1-2),169-76。
3.Nabel,G.J.,设计明日疫苗.N Engl J Med 2013,368(6),551-60.
4.Rappuoli,R.,糖偶联疫苗：原理和机制.Sci Transl Med 2018,10(456).
5.Drake,J.W.；Charlesworth,B.；Charlesworth,D.；Crow,J.F.,自发突变的速率.Genetics 1998,148(4),1667-86.
6.Przedpelski,A.；Tepp,W.H.；Zuverink,M.；Johnson,E.A.；Pellet,S.；Barbieri,J.T.,增强基于毒素的疫苗对抗肉毒.Vaccine 2018.
7.Chen,S.；Kim,J.J.；Barbieri,J.T.,肉毒神经毒素血清型A的底物识别机制.JBiol Chem 2007,282(13),9621-7.
8.Weisemann,J.；Stern,D.；Mahrhold,S.；Dorner,B.G.；Rummel,A.,肉毒神经毒素血清型A通过与肉毒神经毒素B突触结合蛋白不同的机制识别其蛋白受体SV2.Toxins(巴塞尔)2016,8(5).
9.Chen,S.；Karalewitz,A.P.；Barbieri,J.T.,对梭菌神经毒素的不同催化活性的观察Biochemistry 2012,51(18),3941-7.
10.Chen,C.；Fu,Z.；Kim,J.J.；Barbieri,J.T.；Baldwin,M.R.,神经节苷脂作为破伤风神经毒素的高亲和力受体J Biol Chem 2009,284(39),26569-77.
11.疾控中心,C.；对儿童普遍推荐的预防和疫苗影响—美国,1990-1998.MMWRMorb Mortal Wkly Rep 1999,48(12),243-8.
12.Rappuoli,R.；Podda,A.；Pizza,M.；Covacci,A.；Bartoloni,A.；deMagistris,M.T.；Nencioni,L.,针对百日咳的新疫苗开发进展.Vaccine 1992,10(14),1027-32.
13.疾控中心：预防，疫苗中的硫柳汞:美国儿科协会和公共卫生署的联合声明.MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1999,48(26),563-5.
14.Van Nuffel,A.M.；Benteyn,D.；Wilgenhof,S.；Corthals,J.；Heirman,C.；Neyns,B.；Thielemans,K.；Bonehill,A.,三混物(Trimix)-树突细胞治疗的静脉和皮下治疗在化疗难治阶段的IV-M1c黑色素瘤病人中导致广谱T细胞反应和可持续的肿瘤反应.Cancer Immunol Immunother 2012,61(7),1033-43.
15.Wang,N.Y.；Pollard,A.J.,B型脑膜炎疫苗的新篇章.Crit Rev Microbiol2017,1-17.
16.Specht,C.A.；Lee,C.K.；Huang,H.；Tipper,D.J.；Shen,Z.T.；Lodge,J.K.；Leszyk,J.；Ostroff,G.R.；Levitz,S.M.,在用含有碱性隐球菌提取物的聚糖颗粒接种后针对实验性隐球菌病的保护.MBio 2015,6(6),e01905-15.
17.Feikin,D.R.；Elie,C.M.；Goetz,M.B.；Lennox,J.L.；Carlone,G.M.；Romero-Steiner,S.；Holder,P.F.；O'Brien,W.A.；Whitney,C.G.；Butler,J.C.；Breiman,R.F.,响应7价疫苗和/或23价多糖疫苗的定量和功能性功能性抗体应答在HIV感染成人中的随机化尝试.Vaccine 2001,20(3-4),545-53.
18.Wang,Y.；Li,J.；Wang,Y.；Gu,W.；Zhu,F.,23-价肺炎多糖疫苗在健康和特定人群中的效果和实际应用Hum Vaccin Immunother 2017,1-10.
19.Kumai,T.；Lee,S.；Cho,H.I.；Sultan,H.；Kobayashi,H.；Harabuchi,Y.；Celis,E.,优化肽疫苗以诱导强抗肿瘤CD4T细胞应答.Cancer Immunol Res 2017,5(1),72-83.
20.Travassos,L.R.；Taborda,C.P.,巴西副球菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)的线性表位和其他人系统性真菌病的真菌药作为疫苗候选物.FrontImmunol 2017,8,224.
21.Ye,X.,合成聚糖和糖模拟物：天然多糖的有前进的替代物.Chemistry 2017.
22.Guazzelli,L.；McCabe,O.；Oscarson,S.,新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)血清型C荚膜多糖部分结构的合成.Carbohydr Res 2016,433,5-13.
23.Perry,C.M.,脑膜炎组C和Y和嗜血菌B破伤风类毒素结合疫苗(HibMenCY-TT；MenHibrix((R))):综述.Drugs 2013,73(7),703-13.
24.Killeen,K.P.；Escuyer,V.；Mekalanos,J.J.；Collier,R.J.,重组类毒素的逆转：部分补偿活性位点缺失的白喉毒素突变.Proc Natl Acad Sci U S A 1992,89(13),6207-9.
25.Dressler,D.,肉毒毒素药物：简短历史和展望.J Neural Transm(Vienna)2016,123(3),277-9.
26.疾控中心；预防，CDC暂定调查针对偶发接触肉毒毒素的工人的五价(ABCDE)肉毒类毒素疫苗的公告.MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2011,60(42),1454-5.
27.Koepke,R.；Sobel,J.；Arnon,S.S.,婴儿肉毒中毒的全球发病,1976-2006.Pediatrics2008,122(1),e73-82.
28.Schwarz,P.J.；Arnon,S.S.,婴儿肉毒中毒的肉毒免疫球蛋白到来-一年和一次海湾战争后.West J Med 1992,156(2),197-8.
29.Payne,J.R.；Khouri,J.M.；Jewell,N.P.；Arnon,S.S.,用于治疗婴儿肉毒中毒的人肉毒免疫球蛋白的效力：药证颁发后的第一个12年.J Pediatr 2017.
30.Sundeen,G.；Barbieri,J.T.,针对肉毒的疫苗.Toxins(Basel)2017,9(9).
31.Smith,L.A.,肉毒中毒及其预防疫苗.Vaccine 2009,27Suppl 4,D33-9.
32.Fan,Y.；Garcia-Rodriguez,C.；Lou,J.；Wen,W.；Conrad,F.；Zhai,W.；Smith,T.J.；Smith,L.A.；Marks,J.D.,三种单克隆抗体组合强烈中和多种肉毒神经毒素血清型F亚型.PLoS One 2017,12(3),e0174187.
33.Lou,J.；Geren,I.；Garcia-Rodriguez,C.；Forsyth,C.M.；Wen,W.；Knopp,K.；Brown,J.；Smith,T.；Smith,L.A.；Marks,J.D.,人肉毒神经毒素抗体通过酵母杂交进行轻链洗牌而亲和成熟.Protein Eng Des Sel 2010,23(4),311-9.
34.Lou,J.；Wen,W.；Conrad,F.；Meng,Q.；Dong,J.；Sun,Z.；Garcia-Rodriguez,C.；
Farr-Jones,S.；Cheng,L.W.；Henderson,T.D.；Brown,J.L.；Smith,T.J.；Smith,L.A.；
Cormier,A.；Marks,J.D.,一个三表位抗体基本再现了三种单克隆抗体组合在中和肉毒神经毒素血清A中的效力.Toxins(巴塞尔)2018,10(2).
35.Webb,R.P.；Smith,T.J.；Smith,L.A.；Wright,P.M.；Guernieri,R.L.；Brown,J.L.；Skerry,J.C.,重组肉毒神经毒素Hc亚基(BoNT Hc)和催化灭活的肉毒梭菌海胆蛋白(ciBoNT HPs)作为疫苗候选物预防肉毒中毒.Toxins(巴塞尔)2017,9(9).
36.Cohn,A.C.；MacNeil,J.R.；Harrison,L.H.；Lynfield,R.；Reingold,A.；Schaffner,W.；Zell,E.R.；Plikaytis,B.；Wang,X.；Messonnier,N.E.；活性细菌核心调查,T.；MeningNet调查,P.,一剂脑膜炎结合疫苗的效力和持续保护.Pediatrics 2017,139(2).
37.Isturiz,R.E.；Hall-Murray,C.；McLaughlin,J.M.；Snow,V.；Schmoele-Thoma,B.；Webber,C.；Thompson,A.；Scott,D.A.,用于预防小于50岁的肺炎疾病的肺炎球菌结合疫苗.Expert Rev Vaccines 2017,1-11.
38.破伤风疫苗：WHO意见书-2017年2月.Wkly Epidemiol Rec 2017,92(6),53-76.
39.Woldeamanuel,Y.W.,埃塞尔比亚的破伤风：揭示一种完全疫苗可防疾病的危害。Curr Neurol Neurosci Rep 2012,12(6),655-65.
40.世卫组织，电子地址,s.w.i.,破伤风疫苗：WHO意见书，2017年2月-建议.Vaccine2018,36(25),3573-3575.
41.Blum,F.C.；Tepp,W.H.；Johnson,E.A.；Barbieri,J.T.,破伤风毒素的多个结构域直接进入原生神经元。Traffic 2014,15(10),1057-65.
42.Blum,F.C.；Przedpelski,A.；Tepp,W.H.；Johnson,E.A.；Barbieri,J.T.,重组全长无毒性破伤风神经毒素进入Neuro-2a细胞.Infect Immun 2014,82(2),873-81.
43.Masuyer,G.；Conrad,J.；Stenmark,P.,破伤风毒素解饿够揭示了pH介导的结构域动力学.EMBO Rep 2017,18(8),1306-1317.
44.Klein,N.P.；Abu-Elyazeed,R.；Baine,Y.；Cheuvart,B.；Silerova,M.；Mesaros,N.,流感嗜血菌b型和脑膜炎奈瑟氏菌血清型C以及Y-破伤风类毒素结合疫苗与人轮状病毒、甲肝和13价肺炎结合疫苗共同施用的免疫原性和安全性：婴儿中III期随机多中心研究的结果Hum Vaccin Immunother 2018,1-12.
45.Skurnik,D.；Cywes-Bentley,C.；Pier,G.B.,靶向保守微生物表面多糖PNAG的主动和被动免疫卓越的广泛效力.Expert Rev Vaccines 2016,15(8),1041-53.
46.McGuirk,P.；Mills,K.H.,病原体特异性调控T细胞引起对感染性疾病免疫力中Th1/Th2的典范漂移.Trends Immunol 2002,23(9),450-5.
47.Moyron-Quiroz,J.E.；McCausland,M.M.；Kageyama,R.；Sette,A.；Crotty,S.,天花疫苗诱导早期中和IgM应答。Vaccine 2009,28(1),140-7.
48.Mayer,S.；Laumer,M.；Mackensen,A.；Andreesen,R.；Krause,S.W.,针对破伤风类毒素的免疫应答分析：Elispot实验对特异性T辅助细胞盘点Immunobiology 2002,205(3),282-9.
49.Oshima,M.；Hayakari,M.；Middlebrook,J.L.；Atassi,M.Z.,肉毒神经毒素A型的免疫识别：T细胞识别区域和针对毒素保护性H(C)片段(残基855-1296)的抗体.MolImmunol1997,34(14),1031-40.
50.Dolimbek,G.S.；Dolimbek,B.Z.；Aoki,K.R.；Atassi,M.Z.,肉毒神经毒素A的重链HN结构域(残基449-549)在两个高应答小鼠品系中的抗体作图和T细胞识别概貌.Immunol Invest 2005,34(2),119-42.
51.Clayton,M.A.；Clayton,J.M.；Brown,D.R.；Middlebrook,J.L.,用大肠杆菌中的合成基因表达的肉毒梭菌神经毒素血清型A的重组片段保护性接种.Infect Immun1995,63(7),2738-42.
52.Nencioni,L.；Volpini,G.；Peppoloni,S.；Bugnoli,M.；De Magistris,T.；Marsili,I.；
Rappuoli,R.,白喉毒素突变体PT-9K/129G在甲醛处理后的性质.Infect Immun1991,59(2),625-30.
53.Zuverink,M.；Chen,C.；Przedpelski,A.；Blum,F.C.；Barbieri,J.T.,异源报告子确定破伤风毒素链间二硫键在轻链易位中的作用.Infect Immun 2015,83(7),2714-24.
54.Johnson,B.D.；Becker,E.E.；Truitt,R.L.,供体T亚组延迟输注后抑制物抗宿主和抑制物抗白血病反应.Biol Blood Marrow Transplant 1999,5(3),123-32.
55.Keller,J.E.,新福尔马林解毒肉毒神经毒素类毒素的表征.Clin VaccineImmunol2008,15(9),1374-9.
56.Sikorra,S.；Henke,T.；Galli,T.；Binz,T.,VAMP/突触结合蛋白切割梭菌神经毒素的底物识别机制.J Biol Chem 2008,283(30),21145-52
57.Chen,S.；Barbieri,J.T.,肉毒神经毒素血清型E对SNAP25多口袋识别.J BiolChem 2007,282(35),25540-7.
58.Lacy,D.B.；Stevens,R.C.,梭菌神经毒素的序列同源性和结构分析.Journalof molecular biology 1999,291(5),1091-104.
59.Rummel,A.；Hafner,K.；Mahrhold,S.；Darashchonak,N.；Holt,M.；Jahn,R.；Beermann,S.；Karnath,T.；Bigalke,H.；Binz,T.,肉毒神经毒素C、E和F通过保守结合位点结合神经节苷脂，然后利用SV2的三个同种型作为第二受体刺激依赖性摄取肉毒神经毒素F.J Neurochem 2009,110(6),1942-54.
60.Agarwal,R.；Binz,T.；Swaminathan,S.,肉毒神经毒素血清型F轻链的结构分析：底物结合和抑制物设计上的应用.Biochemistry 2005,44(35),11758-65.
61.Berntsson,R.P.；Peng,L.；Dong,M.；Stenmark,P.,与肉毒神经毒素B结合的双重受体结构.Nat Commun 2013,4,2058.
62.Fu,Z.；Chen,C.；Barbieri,J.T.；Kim,J.J.；Baldwin,M.R.,糖基化SV2和神经节苷脂作为肉毒神经毒素血清型F的双重受体.Biochemistry 2009,48(24),5631-41.
63.Strotmeier,J.；Mahrhold,S.；Krez,N.；Janzen,C.；Lou,J.；Marks,J.D.；Binz,T.；
Rummel,A.,破伤风神经毒素A中突触小泡糖蛋白2受体结合位点的鉴定.FEBSLett 2014,588(7),1087-93.
64.Pellett,S.；Tepp,W.H.；Lin,G.；Johnson,E.A.,肉毒神经毒素FA型的底物切割和作用持续("H,HA").Toxicon 2017.
65.Gill,D.M.,细菌毒素：致死量表.Microbiol Rev 1982,46(1),86-94.
66.Halperin,B.A.；Morris,A.；Mackinnon-Cameron,D.；Mutch,J.；Langley,J.M.；
McNeil,S.A.；Macdougall,D.；Halperin,S.A.,破伤风-白喉-无细胞百日咳疫苗在育龄妇女和产后妇女中的抗体应答动力学Clin Infect Dis 2011,53(9),885-92.
67.Halliwell,G.,蛋白水解酶对肉毒梭菌A型毒素的作用.Biochem J 1954,58(1),4-8.
68.Schmidt,J.J.；Sathyamoorthy,V.；DasGupta,B.R.,肉毒神经毒素A型的重链和轻链的部分氨基酸序列.Biochem Biophys Res Commun 1984,119(3),900-4.
69.Rao,K.N.；Kumaran,D.；Binz,T.；Swaminathan,S.,破伤风神经毒素的催化结构域的结构分析.Toxicon 2005,45(7),929-39.
70.Chen,C.；Fu,Z.；Kim,J.J.；Barbieri,J.T.；Baldwin,M.R.,神经节苷脂作为破伤风神经毒素的高亲和力受体The Journal of biological chemistry 2009,284(39),26569-77.
71.Pellett,S.；Tepp,W.H.；Lin,G.；Johnson,E.A.,肉毒神经毒素FA型的底物切割和作用持续("H,HA").Toxicon 2018,147,38-46.
72.Pellett,S.；Tepp,W.H.；Johnson,E.A.；Sesardic,D.,用hiPSC衍生的神经元在基于神经元细胞的BoNT检测试验中作为终点的ELISA评估.J Pharmacol ToxicolMethods2017,88(Pt 1),1-6.
73.Broker,M.；Berti,F.；Schneider,J.；Vojtek,I.,多糖偶联物疫苗蛋白载体作为“负价态”-效力和限制.Vaccine 2017,35(25),3286-3294.
74.Lees,A.；Nelson,B.L.；Mond,J.J.,用可1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐活化可溶性多肽，用于蛋白-多肽结合疫苗和免疫试剂.Vaccine 1996,14(3),190-8.
应理解上述说明书、附图以及其描述部分是为了说明而不是为了限制本发明。本发明的许多主题和变化对于本领域技术人员根据本公开是有启示的。所有这些主题和变化都在本文考量之内。例如，当本发明与各种上面描述的示范性实施例联合描述时，各种替代形式，修饰，变体，改良和/或基本的等价物，不管是已知的或者是稀少的，或目前未预见，对于本领域至少有普通能力的人员是清楚的。可进行各种改变，而不未被本发明的主旨和范围。因此，本发明意欲包括所有已知和以后开发的替代形式，修饰，改变，改进和/或与示范性实施方式基本等价的实施方式。

Claims (5)

1.一种获得作为疫苗的具有提高效力的工程改造的细菌蛋白类毒素的方法，该方法包括：
在编码多结构域细菌蛋白毒素的氨基酸序列的每个结构域中选择一个或多个氨基酸位置，其中选择每个位置以灭活与每个结构域相关联的蛋白质功能，其中结构域包含催化结构域，易位结构域，受体结合结构域和底物结合结构域中的两个或更多个；
在每个所选位置用非天然氨基酸残基取代天然氨基酸残基，其中取代灭活与结构域相关联的一种或多种蛋白质功能；和
在宿主细胞中表达编码全长细菌蛋白毒素的核酸序列，该毒素包含取代的非天然氨基酸残基，从而使表达的蛋白质与包含天然氨基酸的全长细菌蛋白毒素相比显示部分或完全丧失的催化活性，受体结合活性，易位活性或底物结合活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中选择包括基于细菌蛋白毒素的一级序列或结构鉴定个体功能性氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述结构用x射线晶体学，电子显微镜，核磁共振显微镜，计算机蛋白质结构建模或其组合获得。
4.如权利要求1所述的方法，其中选择包括鉴定可被修饰但不会使全长蛋白质去稳定或丧失免疫原性的个体氨基酸残基。
5.如权利要求1所述的方法，其中取代包括定点诱变。
CN202411849786.4A 2017-12-15 2018-12-17 作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台 Pending CN119954917A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762599444P 2017-12-15 2017-12-15
US62/599,444 2017-12-15
PCT/US2018/066033 WO2019118974A2 (en) 2017-12-15 2018-12-17 Modified clostridial neurotoxins as vaccines and conjugate vaccine platforms
CN201880081008.1A CN111479821B (zh) 2017-12-15 2018-12-17 作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880081008.1A Division CN111479821B (zh) 2017-12-15 2018-12-17 作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN119954917A true CN119954917A (zh) 2025-05-09

Family

ID=66819031

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202411849786.4A Pending CN119954917A (zh) 2017-12-15 2018-12-17 作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台
CN201880081008.1A Active CN111479821B (zh) 2017-12-15 2018-12-17 作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880081008.1A Active CN111479821B (zh) 2017-12-15 2018-12-17 作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11491239B2 (zh)
EP (1) EP3723784A4 (zh)
JP (2) JP7494115B2 (zh)
CN (2) CN119954917A (zh)
WO (1) WO2019118974A2 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11491239B2 (en) * 2017-12-15 2022-11-08 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Modified clostridial neurotoxins as vaccines and conjugate vaccine platforms
CN120661638A (zh) * 2018-07-31 2025-09-19 斯诺雷托克斯私人有限公司 聚乙二醇化的破伤风神经毒素和张力减退的治疗
US12344635B2 (en) 2020-03-24 2025-07-01 The Medical College Of Wisconsin, Inc. COVID-19 vaccine
CN117062829A (zh) 2020-05-30 2023-11-14 普迈生物有限公司 用于包埋covid-19疫苗的破伤风疫苗平台
US20230405104A1 (en) * 2020-10-20 2023-12-21 Shanghai Reinovax Biologics Co., Ltd Proteoglycan conjugate and application thereof
CN114958887B (zh) * 2021-02-26 2024-10-25 重庆誉颜制药有限公司 一种经修饰的毒素多肽的制备方法
CN115192702B (zh) * 2022-06-22 2025-07-15 上海赛伦生物技术股份有限公司 一种破伤风修饰性mRNA疫苗及其制备方法
CN115304673B (zh) * 2022-06-24 2024-10-01 上海赛伦生物技术股份有限公司 一种马抗破伤风特异性免疫球蛋白F(ab’)2的纯化方法及其应用
WO2026015556A1 (en) * 2024-07-08 2026-01-15 The Medical College Of Wisconsin, Inc. BoNT AND TeNT POLYPEPTIDE FRAGMENTS AND/OR VARIANTS, COMPOSITIONS, POLYNUCLEOTIDES, VACCINES, AND CONJUGATE VACCINE PLATFORMS

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1232304C (zh) * 1996-03-23 2005-12-21 财团法人阪大微生物病研究会 破伤风毒素功能性片段抗原和破伤风疫苗
GB9914861D0 (en) * 1999-06-25 1999-08-25 Imperial College Tetanus toxin polypeptides
KR100876060B1 (ko) * 1999-08-25 2008-12-26 알러간, 인코포레이티드 활성화가능한 재조합 신경독
US20030118598A1 (en) 2000-02-08 2003-06-26 Allergan, Inc. Clostridial toxin pharmaceutical compositions
US8853360B2 (en) * 2010-06-23 2014-10-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Engineered botulinum neurotoxin C1 with selective substrate specificity
US11491239B2 (en) * 2017-12-15 2022-11-08 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Modified clostridial neurotoxins as vaccines and conjugate vaccine platforms

Also Published As

Publication number Publication date
EP3723784A4 (en) 2022-01-12
WO2019118974A4 (en) 2019-10-31
US20240139332A1 (en) 2024-05-02
WO2019118974A2 (en) 2019-06-20
WO2019118974A3 (en) 2019-08-15
US20200384120A1 (en) 2020-12-10
JP2023123432A (ja) 2023-09-05
JP7494115B2 (ja) 2024-06-03
CN111479821A (zh) 2020-07-31
EP3723784A2 (en) 2020-10-21
JP2021506824A (ja) 2021-02-22
CN111479821B (zh) 2024-12-31
US11491239B2 (en) 2022-11-08
JP7797441B2 (ja) 2026-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111479821B (zh) 作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台
US8883172B2 (en) Chemically modified peptides with improved immunogenicity
Webb et al. Production of catalytically inactive BoNT/A1 holoprotein and comparison with BoNT/A1 subunit vaccines against toxin subtypes A1, A2, and A3
AU2013211973B2 (en) Vaccines against clostridium difficile comprising recombinant toxins
CN103974718A (zh) 基于艰难梭菌毒素的疫苗
US20130345398A1 (en) Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy
US7037680B2 (en) Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy
US20070104737A1 (en) Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy
US20150273042A1 (en) Pilus proteins and compositions
US7820411B2 (en) Escherichia coli-derived vaccine and therapy against botulism
US8153397B2 (en) Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy
AU2002228887A1 (en) Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy
WO2026015556A1 (en) BoNT AND TeNT POLYPEPTIDE FRAGMENTS AND/OR VARIANTS, COMPOSITIONS, POLYNUCLEOTIDES, VACCINES, AND CONJUGATE VACCINE PLATFORMS
US20060141572A1 (en) Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination