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CN119948162A - 用于治疗高胆固醇血症和/或心血管疾病的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗高胆固醇血症和/或心血管疾病的组合物和方法 Download PDF

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CN119948162A
CN119948162A CN202380068247.4A CN202380068247A CN119948162A CN 119948162 A CN119948162 A CN 119948162A CN 202380068247 A CN202380068247 A CN 202380068247A CN 119948162 A CN119948162 A CN 119948162A
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CN
China
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rna
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Application number
CN202380068247.4A
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石复辛
曹文虎
陈业
刘欢乐
邱涵
廖乐祺
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Ruizheng Gene Suzhou Co ltd
Original Assignee
Ruizheng Gene Suzhou Co ltd
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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Abstract

本申请描述了用于治疗患有高胆固醇血症和/或心血管疾病的受试者的组合物和方法。

Description

用于治疗高胆固醇血症和/或心血管疾病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年9月22日提交的PCT/CN2022/120376的优先权，PCT/CN2022/120376的发明名称为“COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OFHYPERCHOLESTEROLEMIA AND/OR CARDIOVASCULAR DISEASE”，其内容通过引用完全并入本申请。
技术领域
本申请涉及用于治疗与前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)相关的高胆固醇血症和/或心血管疾病的组合物和方法。
序列表
本申请包含已提交的序列表，该序列通过引用全部结合在本申请中。该序列表是xml版本，在2023年10月8日生成，命名为“53333-0005WO1”，大小为1,172,853字节。
背景技术
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种丝氨酸蛋白酶，其在胆固醇稳态中发挥调节作用，主要是通过降低质膜上肝脏和肝外的低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)水平从而增加血浆低密度脂蛋白(LDL)胆固醇而进行调节。PCSK9在许多组织和细胞类型中普遍表达，但在肝、小肠和肾中表达最为丰富。PCSK9也在动脉壁(如内皮细胞)、平滑肌细胞和巨噬细胞中高度表达，具有可以调节血管稳态和动脉粥样硬化的局部效应。PCSK9与LDL颗粒的受体结合，LDL颗粒通常在细胞外液中运送3,000至6,000个脂肪分子(包括胆固醇)/颗粒。肝和其他细胞膜上的LDLR与细胞外液中的LDL颗粒结合并起始将其从细胞外液摄入到细胞中，从而降低LDL颗粒的浓度。如果PCSK9的活性受到抑制(例如通过突变或药物干预)，更多的LDLR循环再利用并且存在于细胞表面上，从而将LDL颗粒从细胞外液中去除。因此，抑制PCSK9或降低PCSK9的丰度可以降低血液中LDL颗粒的浓度。
在人类患者中，PCSK9的变体可降低或增加循环胆固醇。例如，与高胆固醇血症相关的PCSK9功能获得性突变(如R218S、F216L和D374Y)会导致成熟PCSK9在弗林蛋白酶裂解基序RFHR(SEQ ID NO:974)处的加工全部或部分丧失。与此相反，与低胆固醇血症相关的PCSK9功能缺失性突变(如A443T和C679X)会导致亚细胞定位异常和对弗林蛋白酶裂解敏感性增加(A443T)或PCSK9无法离开内质网(C679X)。
因此，人们一直在探索PCSK9抑制剂用于治疗高胆固醇血症的可能的用途。基于抗体的治疗剂阿利西尤单抗(alirocumab)和依洛尤单抗(evolocumab)已在III期临床试验中进行了研究。此外，还研究了用于抑制PCSK9的基于RNAi的治疗剂。虽然这些抑制PCSK9的治疗剂取得了令人鼓舞的结果，但仍需要能对PCSK9产生持久抑制作用的疗法来治疗高胆固醇血症和心血管疾病。
发明内容
本申请涉及使用CRISPR/Cas系统减少PCSK9基因表达的组合物和方法，从而显著减少或消除例如肝、小肠、肾或血管组织中突变型PCSK9蛋白或野生型PCSK9蛋白的产生。本申请至少部分基于以下发现：具有高编辑效率的新型向导RNA(gRNA)可以敲除或敲低突变型或野生型PCSK9基因表达，从而为高胆固醇血症和/或心血管疾病提供持久的治疗。
在第一个方面，本申请描述了一种向导RNA，其包含：
a)选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列；
b)选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸；或
c)与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
在第二个方面，本申请描述了一种载体，其包含编码一个或多个向导RNA的一个或多个核酸，其中所述一个或多个向导RNA包含：
a)选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的一个或多个序列；
b)选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的一个或多个序列的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸；或
c)与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的一个或多个序列。
在第三个方面，本申请描述了一种组合物，其包含：
(i)编码向导RNA的核酸，或包含编码向导RNA的核酸的载体，其中所述向导RNA包含：
a)选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列；
b)选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸；或
c)与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列；以及
(ii)RNA引导的DNA结合剂、编码RNA引导的DNA结合剂的核酸、或包含编码RNA引导的DNA结合剂的核酸的载体。
在第四个方面，本申请描述了一种修饰人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因和/或诱导PCSK9基因内的双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括将本申请的组合物施用于细胞，其中该组合物识别并裂解PCSK9靶序列。
在第五个方面，本申请描述了一种治疗受试者的高胆固醇血症和/或心血管疾病的方法、降低受试者循环中的LDL水平的方法、降低受试者的动脉粥样硬化风险的方法和/或治疗或预防受试者的冠状动脉疾病的方法，包括向有需要的受试者的细胞施用本申请的组合物，其中该组合物识别并裂解PCSK9靶序列，从而减少所述受试者的一种或多种组织的细胞中的PCSK9的表达和/或丰度、减少所述受试者循环中的LDL水平、降低所述受试者的动脉粥样硬化风险、治疗或预防所述受试者的冠状动脉疾病和/或治疗所述受试者的高胆固醇血症和/或心血管疾病。
在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂包括Cas核酸酶或Cas切口酶。在一些实施方案中，所述编码RNA引导的DNA结合剂的核酸是包含SEQ ID NO:902或903所示的核酸序列的Cas9核酸。在一些实施方案中，所述编码RNA引导的DNA结合剂的核酸是包含SEQ IDNO:941-953、954-960和963-972中一个或多个所示的多核苷酸序列的编码Cas9的核酸。在一些实施方案中，所述RNA引导的DNA结合剂是包含SEQ ID NO:901所示的氨基酸序列的Cas9。在一些实施方案中，Cas核酸酶是2类Cas核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是Cas9、Cpfl、C2cl、C2c2和C2c3或其修饰蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸酶是酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶或金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9核酸酶或其修饰蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸酶来自II型CRISPR/Cas系统。
在一些实施方案中，本申请的组合物用于编辑前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因。在一些实施方案中，编辑计算为被编辑的细胞群的百分比(编辑百分比)。在一些实施方案中，约30％至99％的细胞群被编辑。在一些实施方案中，编辑百分比为30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％的细胞群。
在一些实施方案中，本申请的组合物增加低密度脂蛋白受体(LDLR)在至少一种组织或器官的细胞质膜上的丰度。在一些实施方案中，所述组织或器官是肝、小肠、肾或血管组织。在一些实施方案中，本申请的组合物降低受试者循环中LDL胆固醇的量。在一些实施方案中，在施用组合物后8周测定循环中LDL胆固醇。在一些实施方案中，将循环中LDL胆固醇与阴性对照或施用所述组合物之前在所述受试者中测定的水平进行比较。在一些实施方案中，循环中LDL胆固醇相对于相应的阴性对照或施用所述组合物之前在所述受试者中测定的水平降低至少20％。
在一些实施方案中，组合物被施用或递送至少一次。在一些实施方案中，施用或递送以下述间隔进行：(a)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天；或(b)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周；或(c)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个月；或(d)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在一些实施方案中，向导RNA与存在于人PCSK9基因中的靶序列至少部分互补。在一些实施方案中，靶序列位于人PCSK9基因的外显子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中。在一些实施方案中，向导RNA序列与PCSK9基因正链中的靶序列互补。在一些实施方案中，向导RNA序列与PCSK9负链中的靶序列互补。在一些实施方案中，第一引导序列与PCSK9基因正链中的第一靶序列互补，并且其中所述组合物还包含与PCSK9基因负链中的第二靶序列互补的第二引导序列。
在一些实施方案中，向导RNA包含crRNA，并且还包含tracrRNA(trRNA)或其一部分，其中所述tracrRNA(trRNA)包含SEQ ID NO:904所示的核苷酸序列，其中所述trRNA可操作地与所述crRNA连接。
在一些实施方案中，向导RNA为双向导RNA(dgRNA)。在一些实施方案中，向导RNA为单向导RNA(sgRNA)。在一些实施方案中，向导RNA包含至少一种修饰。在一些实施方案中，所述至少一种修饰包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键、2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸或DNA-RNA混杂物(DNA-RNA hybrid)。在一些实施方案中，所述至少一种修饰包括在所述向导RNA的5'端的前五个核苷酸中的一个或多个处和/或在所述向导RNA的3'端的最后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。在一些实施方案中，所述至少一种修饰包括所述向导RNA的至少50％核苷酸的修饰。
在一些实施方案中，sgRNA包含与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％相同的引导序列。在一些实施方案中，sgRNA包含SEQ IDNO:593-888中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，sgRNA包含与SEQ ID NO:593-888中任一个所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，向导RNA与脂质纳米颗粒(LNP)缔合。在一些实施方案中，所述组合物是药物制剂并且还包含药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，所述组合物降低受试者的心血管疾病风险或预防受试者的心血管疾病。在一些实施方案中，所述组合物降低受试者的动脉粥样硬化风险或预防受试者的动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述组合物降低受试者的血管组织中动脉粥样硬化斑块形成的风险或预防受试者的血管组织中动脉粥样硬化斑块形成。
在一些实施方案中，施用所述组合物导致PCSK9基因中一个或多个核苷酸的缺失或插入。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸的缺失或插入诱导PCSK9基因中的移码或无义突变。在一些实施方案中，在约20％至约30％的细胞的PCSK9基因中诱导移码或无义突变。在一些实施方案中，细胞是肝细胞、肾细胞、肠上皮细胞或血管上皮细胞。在一些实施方案中，在所述PCSK9基因中发生的一个或多个核苷酸的缺失或插入比脱靶位点中的多至少50倍或更多。
在一些实施方案中，所述组合物降低所述受试者细胞中的PCSK9蛋白的水平。在一些实施方案中，PCSK9蛋白的水平降低至少30％。在一些实施方案中，测量血清、血浆、血液或脑脊液中PCSK9蛋白的水平。在一些实施方案中，测量肝细胞、肾细胞、肠表皮细胞或血管表皮细胞中的PCSK9蛋白的水平。
在一些实施方案中，所述组合物增加受试者细胞质膜上LDL受体蛋白的水平。在一些实施方案中，所述LDL受体蛋白的水平增加至少10％。在一些实施方案中，测量肝细胞、肾细胞、肠表皮细胞或血管表皮细胞中的LDL受体蛋白的水平。
在一些实施方案中，所述组合物降低受试者循环中的LDL胆固醇的水平。在一些实施方案中，在一些实施方案中，测量血清、血浆或血液中的LDL胆固醇的水平。
在一些实施方案中，所述受试者具有高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症或高胆固醇血症家族史。在一些实施方案中，所述受试者具有心血管疾病、家族性心血管疾病或心血管疾病家族史。在一些实施方案中，所述受试者具有动脉粥样硬化、家族性动脉粥样硬化或动脉粥样硬化家族史。在一些实施方案中，所述受试者表现出动脉粥样硬化斑块的心血管症状。在一些实施方案中，所述受试者表现出冠状动脉疾病的心血管症状。
在一些实施方案中，所述受试者表达野生型PCSK9或具有选自由以下突变组成的组的一个或多个突变的PCSK9：R46L、S127R、Y142X、R218S、F216L、D374Y、A443T或C679X。在一些实施方案中，所述受试者对于野生型PCSK9是纯合的。
在一些实施方案中，在施用本申请的组合物后，所述受试者表现出高胆固醇血症的症状的改善、稳定或变化减缓。在一些实施方案中，使用血脂检测(lipid panel)来测量高胆固醇血症的改善、稳定或变化减缓。在一些实施方案中，所述受试者表现出高胆固醇血症、心血管疾病、冠状动脉疾病或动脉粥样硬化的症状的改善、稳定或变化减缓。
在一些实施方案中，组合物或药物制剂经由病毒载体施用。在一些实施方案中，组合物或药物制剂经由脂质纳米颗粒施用。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文描述了用于本申请的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的，并不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均以引用的方式全文并入。如有冲突，则以本说明书(包括定义)为准。
本文描述的方法和材料的其它特征和优点将从以下详细描述和附图以及权利要求书中显而易见。
附图说明
图1显示靶向HepG2细胞中人PCSK9基因的多种sgRNA的编辑效率图。
图2显示Cos-7细胞中与Cas9 mRNA一起递送的人PCSK9 sgRNA的EC50和最大编辑的图。
图3显示在原代食蟹猴肝细胞(PCH)细胞中与Cas9 mRNA一起递送的人PCSK9sgRNA的EC50和最大编辑的图。
图4显示Huh7细胞中与包含各种改造的非翻译区(UTR)的Cas9mRNA一起递送的人PCSK9 sgRNA的EC50和最大编辑的图。
图5显示Huh7细胞中与包含各种改造的编码序列的Cas9 mRNA一起递送的人PCSK9sgRNA的EC50和最大编辑的图。
具体实施方式
本申请描述了用于编辑人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因的组合物和方法。本申请所述的组合物和方法用于治疗患有与PCSK9相关的高胆固醇血症和/或心血管疾病的受试者。
在详细描述本教导之前，应理解，本申请不限于特定组合物或工艺步骤，因为这些可能会发生变化。应注意，如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个缀合物”包括多个缀合物，提及“一个细胞”包括多个细胞，诸如此类。
定义
除非另有说明，本文中使用的下列术语和短语应具有下列含义：
如本文所用，术语“核酸”是指具有核苷或核苷类似物的多聚体化合物，这些核苷或核苷类似物具有沿主链连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物，包括常规RNA、DNA、混杂RNA-DNA和作为其类似物的聚合物。术语“核酸”、“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任意长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸，或其类似物。以下是核酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、通过连锁分析定义的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。该术语还涵盖具有合成骨架的核酸样结构，参见例如Eckstein,1991；Baserga等人,1992；Milligan,1993；WO 97/03211；WO 96/39154；Mata,1997；Strauss-Soukup,1997；和Samstag,1996。多核苷酸可以包含一个或多个修饰核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。
核酸主链可以由多种键组成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA，诸如国际专利公开号WO1995032305中所述的那些)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键中的一种或多种，或其组合。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖或具有取代基(例如2'甲氧基或2'卤化物取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(例如，修饰的尿苷，诸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷等)；肌苷；嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮或氮杂嘌呤、脱氮或氮杂嘧啶、在5或6位具有取代基的嘧啶碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲氨基嘌呤、06-甲基鸟嘌呤、4-硫代嘧啶、4-氨基嘧啶、4-二甲基肼嘧啶和04-烷基嘧啶；(参见例如，美国专利号5,378,825和国际专利公开号WO1993013121)。有关一般性讨论，参见The Biochemistry ofthe Nucleic Acids 5-36,Adams等人编，第11版，1992年)。核酸可以包括一个或多个“脱碱基”残基，其中主链在聚合物的一个或多个位置不包括含氮碱基(参见例如，美国专利号5,585,481)。核酸可以仅包含常规RNA或DNA糖、碱基和键，或者可以包括常规组分和替代物(例如，具有2'甲氧基键的常规碱基，或包含常规碱基和一个或多个碱基类似物两者的聚合物)。核酸包括“锁核酸”(LNA)，其是包含一个或多个LNA核苷酸单体的类似物，其中双环呋喃糖单元锁定在RNA模拟糖构象中，从而增强对互补RNA和DNA序列的杂交亲和力(Vester和Wengel,2004,Biochemistry 43(42):13233-41)。RNA和DNA具有不同的糖部分，并且可以通过RNA中尿嘧啶或其类似物和DNA中胸腺嘧啶或其类似物的存在而有所不同。
如本文所用，术语“向导RNA”是指CRISPR RNA(crRNA)和tracr RNA(trRNA)的组合。“向导RNA”可与“gRNA”或“向导”互换使用。crRNA和trRNA可以缔合为单个RNA分子(单向导RNA，sgRNA)或在两个单独的RNA分子(双向导RNA，dgRNA)中。“向导RNA”或“gRNA”可以指每种类型，即sgRNA或dgRNA。trRNA可以是天然存在的序列，或者trRNA序列可以与天然存在的序列相比具有修饰或变异。向导RNA可以包括本文所述的修饰的RNA。
如本文所用，“引导序列”是指向导RNA内的序列，其与靶序列互补并且用于将向导RNA引导至靶序列以便通过RNA引导的DNA结合剂进行结合或修饰(例如，裂解)。“引导序列”也可称为“靶向序列”或“间隔序列”。引导序列的长度可为约20个碱基对，例如，在酿脓链球菌(即Spy Cas9)和相关的Cas9同源物/直系同源物的情况下。更短或更长的序列也可用作引导序列，例如，长度为15、16、17、18、19、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列和靶序列在序列上可以彼此100％互补或相同。在其他实施方案中，引导序列和靶序列可以包含至少一个错配。例如，引导序列和靶序列可以包含1、2、3或4个错配，其中靶向序列的总长度为至少17、18、19、20或更多个碱基对。在一些实施方案中，引导序列和靶序列可以包含1-4个错配，其中引导序列包含至少17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列和靶序列可以包含1、2、3或4个错配，其中引导序列包含至少20个核苷酸。
在一些实施方案中，向导RNA包含具有引导序列(例如，来自表4的引导序列)的crRNA，并且还包含核苷酸序列GUU UUA GAG CUA UGC UGU UUU G(SEQ ID NO:889)，其中SEQ ID NO:889紧接在所述引导序列的3’端。在一些实施方案中，crRNA是选自SEQ ID NO:297-592所示的核苷酸序列的任何crRNA。在一些实施方案中，向导RNA包含SEQ ID NO:297-592所示的任一crRNA核苷酸序列。
在一些实施方案中，向导RNA包含crRNA并且还包含tracrRNA(trRNA)序列，该tracrRNA(trRNA)序列包含SEQ ID NO:904所示的核苷酸序列或其部分。AAC AGC AUA GCAAGU UAA AAU AAG GCU AGU CCG UUA UCA ACU UGA AAA AGU GGC ACC GAG UCG GUG CUUUUU UU(SEQ ID NO:904)。
在一些实施方案中，向导RNA包含额外的核苷酸以形成sgRNA，例如，在引导序列的3'端之后具有以下示例性核苷酸序列：GUU UUA GAG CUA GAA AUA GCA AGU UAA AAU AAGGCU AGU CCG UUA UCA ACU UGA AAA AGU GGC ACC GAG UCG GUG CUU UU(SEQ ID NO:890)，以5'至3'方向。在一些实施方案中，sgRNA是选自SEQ ID NO:593-888所示的核苷酸序列的任何sgRNA。在一些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO:593-888所示的核苷酸序列中的任一个。在一些实施方案中，gRNA由SEQ ID NO:593-888所示的核苷酸序列中的任一个组成。
在一些实施方案中，向导RNA包含与trRNA共价连接的SEQ ID NO:889的一部分。例如，向导RNA包含的引导序列(例如，来自表4的引导序列)连接至GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:905)，其进一步连接至trRNA(SEQ ID NO:904或其一部分)。例如，向导RNA包含的引导序列(例如，来自表4的引导序列)连接至GUU UUA GAG CUA(SEQ ID NO:905)，其进一步连接至核苷酸序列AUA GCA AGU UAA AAU AAG GCU AGU CCG UUA UCA ACU UGA AAA AGU GGC ACCGAG UCG GUG CUU UU(SEQ ID NO:906)。
Cas蛋白的靶向序列包括基因组DNA的正链和负链(即给定序列和该序列的反向互补序列)，原因在于Cas蛋白的核酸底物是双链的。因此，当引导序列被称为“与靶序列互补”时，应理解为引导序列可以引导向导RNA与靶序列的反向互补序列结合。因此，在其中引导序列与靶序列的反向互补序列结合的一些实施方案中，除了引导序列中用U替代T之外，引导序列与靶序列的某些核苷酸(例如，不包括原间隔区相邻基序(PAM)的靶序列)相同。
如本文所用，“RNA引导的DNA结合剂”是指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性是序列特异性的并且取决于RNA的序列。示例性RNA引导的DNA结合剂(诸如国际专利申请号WO2020198697中描述的那些结合剂，其全部内容并入本文)包括Cas切口酶及其失活形式，诸如dCas DNA结合剂”。
如本文所用，术语“Cas”是指任何使用引导分子可操作地进行基因编辑的Cas蛋白。“Cas核酸酶”还涵盖Cas切口酶，和内切酶缺陷或失活的Cas(dCas)DNA结合剂。Cas切口酶和dCas DNA结合剂可以包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物，其Cas10、Csml或Cmr2亚基，I型CRISPR系统的Cascade复合物，其Cas3亚基，和2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”是具有RNA引导的DNA结合活性的单链多肽，诸如Cas9核酸酶或Cpfl核酸酶。2类Cas核酸酶包括2类Cas切口酶(例如，H840A、D10A或N863A变体)，其还具有RNA引导的DNA切口酶活性，以及2类dCas DNA结合剂，其中切口酶活性被失活。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如，K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白及其修饰。Cpfl蛋白，Zetsche等人,Cell,163:1-13(2015)，与Cas9同源，并含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpfl序列以引用的方式全部并入。参见，例如，Zetsche，表SI和S3。“Cas9”涵盖Spy Cas9、本文列出的Cas9变体及其等效物。参见，例如，Makarova等人，Nat Rev Microbiol，13(11):722-36(2015)；Shmakov等人，Molecular Cell，60:385-397(2015)。
dCas DNA结合剂可用于CRISPR干扰(CRISPRi)以及CRISPR激活(CRISPRa)。在CRISPRi中，dCas9与其DNA靶标结合但不裂解它。不受理论的束缚，据信Cas9单独结合将阻止细胞的转录机器接近启动子，从而抑制基因表达。另一方面，dCas9结合靶DNA的能力可用于激活，即CRISPRa。转录激活因子与dCas9融合，其可在不改变DNA序列的情况下激活基因表达。在一些实施方案中，dCas DNA结合剂与阻遏物融合，所述阻遏物诸如Krüppel相关盒(KRAB)。
本文使用的“修饰尿苷”是指具有与尿苷相同的氢键受体且与尿苷具有一个或多个结构差异的核苷，包括但不限于脱氧胸苷。在一些实施方案中，修饰尿苷是取代尿苷，即，其中一个或多个非质子取代基(例如，烷氧基，如甲氧基)取代质子的尿苷。在一些实施方案中，修饰尿苷是假尿苷。在一些实施方案中，修饰尿苷是取代假尿苷，即，其中一个或多个非质子取代基(例如，烷基，如甲基)取代质子的假尿苷，例如，Nl-甲基假尿苷。在一些实施方案中，修饰尿苷是取代尿苷、假尿苷或取代假尿苷中的任一种。
如本文所用，如果第一序列与第二序列的比对显示第二序列整体上X％或更多的位置与第一序列匹配，则认为第一序列“包含与第二序列至少X％相同的序列”。例如，序列AAGA包含与序列AAG具有100％同一性的序列，因为由于与第二序列的所有三个位置都匹配，比对将产生100％同一性。RNA和DNA之间的差异(通常是尿苷与胸苷的交换或反之亦然)以及核苷类似物(诸如修饰尿苷)的存在不会导致多核苷酸之间的同一性或互补性差异，只要相关核苷酸(诸如胸苷、尿苷或修饰尿苷)与相同的互补核苷酸结合即可(例如，腺苷是所有的胸苷、尿苷或修饰尿苷的互补物；另一个例子是胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，它们都以鸟苷或修饰鸟苷作为互补物)。因此，例如，序列5’-AXG(其中X是任何修饰尿苷，诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被认为与AUG 100％相同，因为两者都与同一序列(5’-CAU)完全互补。示例性比对算法是Smith-Waterman和Needleman-Wunsch算法，它们是本领域众所周知的。本领域技术人员将理解对于要比对的给定序列对，选择哪种算法和参数设置是合适的；对于长度通常相似且氨基酸的预期同一性>50％或核苷酸的预期同一性>75％的序列，使用EBI在www.ebi.ac.uk网络服务器上提供的Needleman-Wunsch算法界面的默认设置的Needleman-Wunsch算法通常是合适的。
如本文所用，术语“mRNA”是指作为RNA或修饰RNA的多核苷酸，其包括可翻译成多肽的开放阅读框(即，可作为通过核糖体和氨基酰化tRNA翻译的底物)。mRNA可包括具有核糖残基或其类似物(例如2’-甲氧基核糖残基)的磷酸-糖骨架。在一些实施方案中，核酸磷酸-糖骨架的糖基本上由核糖残基、2’-甲氧基核糖残基或其组合组成。
如本文所用，术语“PCSK9”是指前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertase subtilisin/kexin type 9)，它是PCSK9基因的表达产物。人类野生型PCSK9序列可在NCBI Gene ID:255738；Ensembl:ENSG00000169174获得。PCSK9在加工前蛋白中包含四个主要组分：信号肽(氨基酸残基1-30)；N末端前结构域(残基31-152)；催化结构域(残基153-425)；C末端结构域(残基426-692)，其进一步分成三个模块(Du F等人.Novel domaininteraction regulates secretion of proprotein convertase subtilisin/kexintype 9(PCSK9)protein.J Biol Chem.2011Dec 16；286(50):43054-61.)。PCSK9基因位于细胞遗传学位置1p32.3并且包含共14个可以选择性剪接的外显子。PCSK9蛋白是枯草溶菌素样前蛋白转化酶家族成员，该家族包括加工通过分泌途径的调控或组成性分支运输的蛋白和肽前体的酶。编码的蛋白在ER中在其前片段内经历自催化加工事件，并以非活性蛋白酶的形式组成性分泌到细胞外基质和反面高尔基网中。它在肝、肠、血管上皮和肾组织中表达，并护送特定受体进入溶酶体降解。它在胆固醇和脂肪酸代谢中发挥作用。该基因中的突变与常染色体显性家族性高胆固醇血症有关。选择性剪接产生多种转录本变体。本文所用的“突变型PCSK9”所指的PCSK9的基因产物(即PCSK9蛋白)与PCSK9的野生型氨基酸序列相比，在PCSK9的氨基酸序列中发生了变化。与患者LDLR水平相关的PCSK9突变形式包括例如R46L、S127R、Y142X、R218S、F216L、D374Y、A443T和C679X。
本文所用的“低密度脂蛋白(LDL)”是指包含多种蛋白(如约80-100种蛋白)的颗粒，这些蛋白转移脂质通过水性流体，从而使细胞可利用脂质进行受体介导的内吞。单个LDL颗粒的直径可能是约220-275埃，通常每个颗粒运输约3,000至约6,000个脂质分子，其大小因颗粒内所含脂质分子的数量和组成而异。例如，LDL颗粒可携带胆固醇、磷脂和甘油三酯的混合物。本领域众所周知，血液中检测到的LDL水平升高与心血管疾病风险增加相关。
本文所用的“低密度脂蛋白受体(LDLR)”是指一种介导LDL颗粒内吞的细胞表面受体。例如，LDLR识别嵌入LDL颗粒外部磷脂层的载脂蛋白B100。LDLR蛋白由人类基因组19号染色体上的LDLR基因编码。众所周知，LDLR的功能与胆固醇代谢有关，而LDLR的破坏会增加与胆固醇代谢有关的疾病风险。
本文所用的“高胆固醇血症”是指受试者血液中胆固醇水平高于正常水平。正常血液胆固醇水平是通过实验室分析得出的数字。正常或理想的胆固醇水平定义为每分升血液中胆固醇含量低于200mg(mg/dL)。如果血液中胆固醇含量在200至239mg/dL范围内，则被认为处于边缘水平。升高的胆固醇水平为240mg/dL或以上，但正常和异常胆固醇水平之间没有绝对的截点，必须结合其他健康状况和风险因素来考虑胆固醇值。升高的血液胆固醇被认为是高胆固醇血症。
本文所用的“家族性高胆固醇血症”是指一种遗传形式的高胆固醇血症，例如，其可能由高胆固醇血症的多基因风险升高或增加高胆固醇血症风险的遗传性单基因突变引起。本领域已知家族性高胆固醇血症可能是遗传的，例如，以常染色体显性或常染色体隐性方式遗传。
本文所用的“动脉粥样硬化”是指脂肪、胆固醇和其他物质在动脉壁内和动脉壁上的堆积。这种堆积称为斑块。斑块会导致动脉狭窄，阻碍血液流动。斑块还可能破裂，导致血栓。
如本文所用，术语“病理突变”是指使基因产物(例如PCSK9蛋白)更有可能导致、促进、促成或无法抑制疾病(诸如高胆固醇血症或心血管疾病)发展的突变。
如本文所用，“插入/缺失”是指由插入到多核苷酸序列中或从中缺失的多个核苷酸组成的插入/缺失突变。例如，插入/缺失可能在靶核酸的双链断裂(DSB)位点发生。
如本文所用，“敲低”是指特定基因产物(例如，蛋白质、mRNA或两者)表达的减少。蛋白质的敲低可以通过检测组织或细胞群分泌的蛋白质(例如，在血清或细胞培养基中)或通过检测敲低之前和之后来自感兴趣的组织或细胞群的蛋白质的总细胞量来测量。测量mRNA敲低的方法在本领域中是已知的，并且包括对从感兴趣的组织或细胞群中分离的mRNA进行测序。在一些实施方案中，“敲低”可以指特定基因产物表达的一些损失，例如，细胞群(包括体内细胞群，诸如在组织中存在的细胞群)转录的mRNA的量减少或表达或分泌的蛋白质的量减少。
如本文所用，“靶序列”是指靶基因中与gRNA的引导序列具有互补性的核酸序列。靶序列和引导序列的相互作用使得RNA引导的DNA结合剂与靶序列结合，并可能在靶序列内产生切口或裂解(取决于结合剂的活性)。
如本文所用，“治疗”或“处理”是指在施用或应用针对所公开的病况的治疗剂后，所述病况的至少一种症状得到改善、缓解或减轻。该术语包括抑制病况或疾病、阻止其发展、缓解病况或疾病的一种或多种症状、治愈病况或疾病、或预防病况或疾病的一种或多种症状复发。在本申请的上下文中，高胆固醇血症和/或心血管疾病的治疗可以包括缓解高胆固醇血症和/或心血管疾病的症状。如果治疗导致病况的病理学减少，则称使用本申请的组合物的治疗已“治疗”该病况。
如本文所用，术语“脂质纳米颗粒”(LNP)是指包含多个(即，多于一个)脂质分子的颗粒，这些脂质分子通过分子间力彼此物理缔合。LNP可以是例如微球(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”——层状相脂质双层，在一些实施方案中，基本上是球形的——并且在更具体的实施方案中，可以包含水性核心，例如，包含大部分RNA分子)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。另参见，例如WO2015006747、WO2016118724、WO2021026358、WO2017173054和WO2019067992，它们的内容通过引用整体并入本文。本领域技术人员已知的能够向受试者递送核苷酸的任何LNP均可与向导RNA和编码本文所述的RNA引导的DNA结合剂的核酸一起使用。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指生物上可接受的气态、液态或固态制剂，或它们的混合物，其适用于一种或多种施用途径、体内递送或接触。“药学上可接受的”组合物是不会造成生物学或其他不良影响的材料，例如，该材料可以施用于受试者而不会引起显著的不良生物学效应。
如本文所用，“输注”是指主动施用一种或多种药剂，输注时间例如约为30分钟至12小时。在一些实施方案中，一种或多种药剂包括LNP，例如具有编码本文所述的RNA引导的DNA结合剂(诸如Cas9)的mRNA和本文所述的gRNA。
术语“约”或“大约”意指本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差，这部分取决于如何测量或确定该值。在一些实施方案中，“约”是指例如正负不到5％的差别(例如，正负不到1％、不到0.5％或不到0.1％)。
数字范围包括定义该范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测量值和可测量值应理解为近似值。此外，“包含(comprise,comprises,comprising)”、“含有(contain,contains,containing)”和“包括(include，includes，including)”的使用并非旨在限制。应理解，前述一般描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不限制教导。
除非上述说明书中特别指出，否则说明书中记载“包括”各种部件的实施方案也应理解为“由所述部件组成”或“基本上由所述部件组成”；说明书中记载“由各种部件组成”的实施方案也应理解为“包括”或“基本上由所述部件组成”；说明书中记载“基本上由各种部件组成”的实施方案也应理解为“由所述部件组成”或“包括”所述部件(这种互换性不适用于这些术语在权利要求中的使用)。除非上下文另有明确说明，否则术语“或”以包含性含义使用，即等同于“和/或”。
靶向PCSK9基因的组合物和方法
本文公开了用于靶向PCSK9基因的方法的组合物。本文公开的方法诱导受试者的PCSK9基因内的双链断裂(DSB)、修饰细胞或受试者的PCSK9基因、治疗受试者的与PCSK9相关的高胆固醇血症和/或心血管疾病、降低受试者细胞中的PCSK9丰度、增加受试者细胞表面上LDLR的丰度、和/或减少受试者循环中的LDL水平。在一些实施方案中，所公开的组合物和方法抑制PCSK9基因的转录和PCSK9蛋白的翻译，从而防止PCSK9在组织中的积聚。一般而言，所公开的组合物包含：靶向PCSK9的向导RNA(其本身或在载体中)，和RNA引导的DNA结合剂，或编码RNA引导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)的核酸。用此类方法和组合物治疗的受试者可以具有野生型或非野生型PCSK9基因序列，诸如，例如患有高胆固醇血症或家族性高胆固醇血症的受试者，其中所述患者可能携带遗传的PCSK9突变。在一些实施方案中，通过输注施用组合物0.5-6小时。在一些实施方案中，通过皮下注射施用组合物。在一些实施方案中，通过鞘内注射施用组合物。
A.向导RNA(gRNA)
所公开的方法和组合物中使用的向导RNA包含靶向PCSK9基因的引导序列。靶向PCSK9基因的示例性引导序列示于表4中的SEQ ID NO:1-296。在本文所述的向导RNA组合物和方法中有用的引导序列示于表4和整个申请中。
表4中的每个引导序列还可包含额外的核苷酸以形成crRNA，例如，在引导序列的3'端紧接着以下示例性核苷酸序列：GUU UUA GAG CUA UGC UGU UUU G(SEQ ID NO:889)。在sgRNA的情况下，表4的引导序列还可包含额外的核苷酸以形成sgRNA，例如，在引导序列的3'端紧接着以下示例性核苷酸序列，其中sgRNA具有定制设计的短crRNA组件，随后是trRNA组件：GUU UUA GAG CUA GAA AUA GCA AGU UAA AAU AAG GCU AGU CCG UUA UCA ACUUGA AAA AGU GGC ACC GAG UCG GUG CUU UU(SEQ ID NO:890)，方向为5'至3'。
SEQ ID NO:890以5'到3'方向附着于引导序列的3'端。可用于本申请的组合物和方法的sgRNA序列在表5中描述。
在一些实施方案中，sgRNA被修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含在下面的SEQ IDNO:907中所示的修饰模式，其中N是任何天然或非天然核苷酸，并且其中所有的N包含了如本文所述的引导序列，并且修饰的sgRNA包含以下序列：mN*mN*mN*NNN NNN NNN NNN NNNNNG UUU UAG AmGmCm UmAmGm AmAmAm UmAmGm CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAUCAmAm CmUmUm GmAmAm AmAmAm GmUmGm GmCmAm CmCmGm AmGmUm CmGmGm UmGmCm U*mU*mU*mU(SEQ ID NO:907)，其中“N”可以是任何天然或非天然核苷酸；*＝PS键；'m'＝2'-O-Me核苷酸。尽管把N替换为向导的核苷酸，但修饰仍保留在SEQ ID NO:907中。也就是说，尽管向导的核苷酸替换了“N”，但前三个核苷酸是2'OMe修饰的，并且第一和第二个核苷酸之间、第二和第三个核苷酸之间以及第三和第四个核苷酸之间有硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，gRNA序列具有WO2016164356和WO2016089433中描述的修饰模式，WO2016164356和WO2016089433每一个均整体地并入本文中。
在一些实施方案中，gRNA包含引导序列，其将RNA引导的DNA结合剂(可以是核酸酶(例如Cas核酸酶，诸如Cas9))引导至PCSK9中的靶DNA序列。gRNA包括具有表4中所示的引导序列的crRNA。所述gRNA包括具有表4中所示的SEQ ID NO:1-296的任一引导序列的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的引导序列。在一些实施方案中，所述gRNA包含引导序列，所述引导序列具有与表4中所示的SEQ ID NO:1-296的引导序列中任一个的至少16、17、18、19或20个连续核苷酸具有约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。所述gRNA还可包含tracr RNA(trRNA)。在本文描述的每种组合物和方法实施方案中，crRNA和trRNA可以缔合成为单个RNA(sgRNA)，或者可以位于单独的RNA上(dgRNA)。在sgRNA的情况下，crRNA和trRNA组件可以共价连接，例如，经由磷酸二酯键或其他共价键共价连接。
在本文所述的每个组合物、用途和方法实施方案中，向导RNA可以包含两个RNA分子，作为“双向导RNA”或“dgRNA”。dgRNA包含第一RNA分子，该第一RNA分子包含具有例如表4中所示的引导序列的crRNA，以及具有trRNA的第二RNA分子。第一和第二RNA分子可以不共价连接，但可以通过crRNA和trRNA的一部分之间的碱基配对形成RNA双链体。
在本文所述的每个组合物、用途和方法实施方案中，向导RNA可包含单个RNA分子作为“单一向导RNA”或“sgRNA”。sgRNA可包含具有表3中所示的引导序列的crRNA(或其一部分)，该引导序列与trRNA共价连接。sgRNA可包含表4中所示的SEQ ID NO:1-296的任一引导序列的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，crRNA和trRNA经由接头共价连接。在一些实施方案中，sgRNA经由crRNA和trRNA的一部分之间的碱基配对形成茎环结构。在一些实施方案中，crRNA和trRNA通过作为非磷酸二酯键的一个或多个键共价连接。
在一些实施方案中，trRNA可包含源自天然存在的CRISPR/Cas系统的trRNA序列的全部或部分。在一些实施方案中，trRNA包含截短的或修饰的野生型trRNA。trRNA的长度取决于所使用的CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，trRNA包含或由5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或超过100个核苷酸组成。在一些实施方案中，trRNA可包含某些二级结构，诸如，例如，一个或多个发夹或茎环结构，或一个或多个突出结构。在一些实施方案中，该组合物包含gRNA，所述gRNA包含与表4中所示的SEQ ID NO:1-296的任一引导序列的至少16、17、18、19或20个连续核苷酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的引导序列。
在一些实施方案中，所述组合物包含具有选自SEQ ID NO:1-296的引导序列的向导RNA。具有选自SEQ ID NO:1-296的引导序列的向导RNA可以是化学修饰的sgRNA，诸如末端修饰的RNA。具有选自SEQ ID NO:1-296的引导序列的向导RNA可以是dgRNA，诸如化学修饰的dgRNA。
在其他实施方案中，所述组合物包含至少一种(例如，至少两种)具有选自SEQ IDNO:1-296的引导序列中的任意两种或更多种的引导序列的gRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含至少两种gRNA，每种gRNA包含与SEQ ID NO:1-296的任一核酸至少90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的引导序列。
在一些实施方案中，gRNA是具有SEQ ID NO:593-888中任一个的sgRNA。在一些实施方案中，gRNA是具有SEQ ID NO:593-888中任一个的sgRNA，但没有本申请中描述的修饰(即，未修饰的SEQ ID NO:593-888)。在一些实施方案中，gRNA是具有SEQ ID NO:593-888中任一个的sgRNA，但具有至少一种化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰的SEQ ID NO:593-888具有5'和/或3'端修饰。在一些实施方案中，gRNA是具有SEQ ID NO:593-888中任一个的sgRNA，但具有SEQ ID NO:907所示的修饰模式。
本文提供的向导RNA可用于识别(例如，杂交)PCSK9基因中的靶序列。例如，PCSK9靶序列可被提供的具有向导RNA的Cas核酸酶识别和裂解。因此，RNA引导的DNA结合剂(诸如Cas核酸酶)可由向导RNA引导至PCSK9基因的靶序列，其中向导RNA的引导序列与靶序列杂交，并且RNA引导的DNA结合剂(诸如Cas核酸酶)裂解靶序列。
在一些实施方案中，一个或多个向导RNA的选择基于PCSK9基因内的靶序列来确定。例如，一个或多个向导RNA基于PCSK9基因的外显子1-14或5’UTR或3’UTR中的任一个内的靶序列。
不受任何特定理论的束缚，基因某些区域中的突变(例如，由于核酸酶介导的DSB而发生的插入/缺失导致的移码突变)可能比该基因其他区域中的突变更难以容忍，因此，DSB的位置是可能导致的蛋白质敲低的数量或类型的重要因素。在一些实施方案中，使用与PCSK9内的靶序列互补或具有互补性的gRNA将RNA引导的DNA结合剂引导至PCSK9基因中的特定位置。在一些实施方案中，gRNA被设计为具有与PCSK9的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13或外显子14中的靶序列互补或具有互补性的引导序列。在一些实施方案中，在约10％、约15％、约20％、约25％、约30％至约35％的细胞的PCSK9基因中诱导移码或无义突变。
B.gRNA的修饰
在一些实施方案中，gRNA是经化学修饰的。具有一个或多个经过修饰的核苷或核苷酸的gRNA被称为“经修饰的”gRNA或“经化学修饰的”gRNA，以描述存在一个或多个非天然和/或天然存在的组分或构型，这些组分或构型用于替代或补充典型的A、G、C和U残基。在一些实施方案中，用非典型核苷或核苷酸合成修饰的gRNA，在此称为“修饰的”。修饰的核苷和核苷酸可以包括以下一项或多项：(i)改变(例如，替换)磷酸二酯主链键中的一个或两个非连接磷酸氧和/或一个或多个连接磷酸氧(示例性主链修饰)；(ii)改变(例如，替换)替换核糖的成分(例如核糖上的2'羟基)(示例性糖修饰)；(iii)用“去磷酸化”接头全面替换磷酸部分(示例性主链修饰)；(iv)修饰或替换天然存在的核碱基，包括用非典型核碱基修饰或替换(示例性碱基修饰)；(v)替换或修饰核糖-磷酸主链(示例性主链修饰)；(vi)寡核苷酸3'端或5'端的修饰，例如去除、修饰或替换末端磷酸基团或者缀合部分、帽子或接头(这种3'或5'帽子修饰可以包括糖和/或主链修饰)；以及(vii)修饰或替换糖(示例性糖修饰)。
可以组合诸如上述的化学修饰以提供具有可具有两个、三个、四个或更多种修饰的核苷和核苷酸(统称为“残基”)的修饰gRNA。例如，修饰残基可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一些实施方案中，gRNA的每个碱基都被修饰，例如，所有碱基都具有修饰的磷酸基团，诸如硫代磷酸酯基团。在某些实施方案中，gRNA分子的所有或基本上所有磷酸基团都被硫代磷酸酯基团取代。在一些实施方案中，修饰gRNA在RNA的5'端或附近包含至少一个修饰残基。在一些实施方案中，修饰gRNA在RNA的3'端或附近包含至少一个修饰残基。
在一些实施方案中，gRNA包含一个、两个、三个或更多个修饰残基。在一些实施方案中，修饰的gRNA中至少5％(例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)的位置是修饰的核苷或核苷酸。
未经修饰的核酸可能易于被例如细胞内核酸酶或血清中的核酸酶降解。例如，核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。因此，在一个方面，本文所述的gRNA可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如，以引入对细胞内或血清型核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，本文所述的修饰的gRNA分子在体内和离体引入细胞群时可以表现出降低的先天免疫反应。术语“先天免疫反应”包括对外源核酸(包括单链核酸)的细胞反应，其涉及诱导细胞因子表达和释放(特别是干扰素)以及细胞死亡。
在主链修饰的一些实施方案中，修饰残基的磷酸基团可以通过用不同的取代基替换一个或多个氧来修饰。此外，修饰残基(例如修饰核酸中存在的修饰残基)可以包括用本文所述的修饰磷酸基团全面替换未修饰磷酸部分。在一些实施方案中，磷酸主链的主链修饰可以包括导致不带电接头或具有不对称电荷分布的带电接头的改变。
修饰的磷酸基团的例子包括硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷磷酸、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未修饰的磷酸基团中的磷原子是非手性的。但是，用上述原子或原子团之一替换其中一个非桥接氧可以使磷原子具有手性。立体异构磷原子可以具有“R”构型(此处为Rp)或“S”构型(此处为Sp)。还可以通过将桥接氧(即连接磷酸酯和核苷的氧)替换为氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)来修饰主链。替换可以发生在任一连接氧处或两个连接氧处。
在某些主链修饰中，磷酸基团可被不含磷的连接体取代。在一些实施方案中，带电磷酸基团可被中性部分取代。可取代磷酸基团的部分的例子包括但不限于，例如，甲基膦酸酯、羟基氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲氧基甲基亚氨基。
还可以构建能够模拟核酸的构架，其中磷酸接头和核糖被核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物取代。此类修饰可以包括主链和糖修饰。在一些实施方案中，核碱基可以由替代主链连接。实例可以包括但不限于，吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。
修饰的核苷和修饰的核苷酸可以包括对糖基团的一个或多个修饰，即糖修饰。例如，2'羟基(OH)可以被修饰，例如，用许多不同的“氧”或“脱氧”取代基替换。在一些实施方案中，对2'羟基的修饰可以增强核酸的稳定性，因为羟基不再能够去质子化以形成2'-醇盐离子。
2'羟基修饰的例子可以包括烷氧基或芳氧基(OR，其中“R”可以是，例如，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，0(CH2CH20)nCH2CH20R，其中R可以是，例如，H或任选取代的烷基，并且n可以是0至20的整数(例如，0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16和4至20)。在一些实施方案中，2'羟基修饰可以是2'-O-Me。在一些实施方案中，2'羟基修饰可以是2'-氟修饰，其用氟化物取代2'羟基。在一些实施方案中，2'羟基修饰可以包括“锁定”核酸(LNA)，其中2'羟基可以通过例如Ci-6亚烷基或Ci-6杂亚烷基桥连接到相同核糖的4'碳，其中示例性桥可以包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；O-氨基(其中氨基可以是，例如，NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、0(CH2)n-氨基(其中氨基可以是，例如，NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。在一些实施方案中，2'羟基修饰可以包括“解锁”核酸(UNA)，其中核糖环缺少C2'-C3'键。在一些实施方案中，2'羟基修饰可以包括甲氧基乙基(MOE)(OCH2CH2OCH3，例如，PEG衍生物)。
“脱氧”2'修饰可以包括氢(即脱氧核糖，例如在部分dsRNA的突出部分)；卤素(例如溴、氯、氟或碘)；氨基(其中氨基可以是，例如NEE；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-氨基(其中氨基可以是，例如，如本文所述)、-NHC(0)R(其中R可以是，例如，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基硫代烷基；硫代烷氧基；以及烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以任选地被例如如本文所述的氨基取代。
糖修饰可以包括糖基团，该糖基团还可以包含一个或多个具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型的碳。因此，修饰的核酸可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。修饰的核酸还可以包括脱碱基糖。这些脱碱基糖还可以在一个或多个组成糖原子处进一步修饰。修饰的核酸还可以包括一个或多个L形式的糖，例如L-核苷。
本文所述的可掺入至修饰核酸中的修饰核苷和修饰核苷酸可包括修饰碱基，也称为核碱基。核碱基的例子包括但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。这些核碱基可被修饰或完全替换，以提供可掺入到修饰核酸中的修饰残基。核苷酸的核碱基可独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。在一些实施方案中，核碱基可包括例如碱基的天然存在和合成衍生物。
在采用双向导RNA的实施方案中，crRNA和tracr RNA中的每一个都可以包含修饰。此类修饰可以位于crRNA和/或tracr RNA的一端或两端。在具有sgRNA的实施方案中，sgRNA的一端或两端的一个或多个残基可以进行化学修饰，或者整个sgRNA可以进行化学修饰。某些实施方案包括5'端修饰。某些实施方案包括3'端修饰。在某些实施方案中，向导RNA分子的单链突出端中的一个或多个或所有核苷酸是脱氧核苷酸。
在一些实施方案中，gRNA可以具有一个或多个修饰。在一些实施方案中，修饰包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
在一些实施方案中，gRNA是DNA-RNA混杂物。在一些实施方案中，向导RNA是混杂DNA-RNA向导。在一些实施方案中，混杂DNA-RNA向导包括选自SEQ ID NO:908-940的序列。在一些实施方案中，sgRNA的至少一部分是混杂DNA-RNA向导。示例性的DNA-RNA混杂引导序列提供在下表1中。对于在下表1中提供的序列，“d”表示在字母“d”后的碱基是脱氧核糖核苷酸，而前面没有“d”的字母是核糖核苷酸。
表1:示例性的DNA-RNA混杂引导序列
术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”可用于表示已用2’-O-Me修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，所述向导RNA包括具有选自SEQ ID NO:1-296的引导序列和SEQ ID NO:890的核苷酸的sgRNA，其中SEQ ID NO:890的核苷酸位于引导序列的3'端，并且其中引导序列可以如SEQ ID NO:907所示进行修饰。
gRNA修饰的更多例子例如在WO2020198697、WO2016164356和WO2016089433中示出，它们通过引用整体并入本文中。
C.PAM序列
PAM，也称为原间隔区相邻基序，是与gRNA的一部分互补的短特异性序列，位于Cas核酸酶切割所必需的靶DNA序列之后。PAM位于向导RNA靶向的DNA序列下游约2-8个核苷酸处，Cas切割其上游3-4个核苷酸。PAM序列在下表2-3中举例说明。本申请中的PAM可以是表2-3中的任一个序列或本领域已知的任何其他序列。
表2：合成spCas9变体的PAM
N是A、G、C或T。
表3：不同Cas9物种的PAM
Cas9物种 PAM序列
酿脓链球菌(Sp) NGG(SEQ ID NO:891)
金黄色葡萄球菌(Sa) NGRRN(SEQ ID NO:896)
脑膜炎奈瑟氏菌(Nm或Nme) NNNNGATT(SEQ ID NO:897)
空肠弯曲杆菌(Cj) NNNNRYAC(SEQ ID NO:898)
嗜热链球菌(St) NNAGAAW(SEQ ID NO:899)
齿垢密螺旋体(Td) NAAAAC(SEQ ID NO:900)
N是A、G、C或T。
D.RNA引导的DNA结合剂
任何具有编码RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)的开放阅读框的核酸可在组合物或方法中与本文公开的任何gRNA组合。在一些实施方案中，具有编码RNA引导的DNA结合剂的开放阅读框的核酸是mRNA。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂以其氨基酸形式(即作为蛋白质)施用。在一些实施方案中，编码RNA引导的DNA结合剂的核酸是本文所述载体的一部分。编码RNA引导的DNA结合剂的核酸可具有WO2020198697中所述的任何特征，该申请通过引用全文并入本文。
在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的RNA引导的DNA结合剂是2类Cas核酸酶。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂具有双链核酸内切酶活性。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂包括Cas核酸酶，诸如2类Cas核酸酶(其可以是例如II、V或VI型Cas核酸酶)。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpfl、C2cl、C2c2和C2c3蛋白及其修饰。
Cas9核酸酶的例子包括酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌和其他原核生物的II型CRISPR系统的那些(参见例如下一段中的列表)及其修饰(例如工程化或突变)版本。参见，例如US2016/0312198A1；US2016/0312199A1。Cas核酸酶的其他例子包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物或其Cas10、Csml或Cmr2亚基；以及I型CRISPR系统的Cascade复合物或其Cas3亚基。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以来自IIA型、IIB型或IIC型系统。有关各种CRISPR系统和Cas核酸酶的讨论，参见例如Makarova等人,Nat.Rev.Microbiol.9:467-477(2011)；Makarova等人,Nat.Rev.Microbiol,13:722-36(2015)；Shmakov等人,MolecularCell,60:385-397(2015)。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂是Cas切口酶，例如Cas9切口酶。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂是酿脓链球菌Cas9核酸酶。
RNA引导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)可来源的非限制性示例性物种包括但不限于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、链球菌属(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特氏菌(Sutterella wadsworthensis)、γ-变形菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter Jejuni)、多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、产绿色链霉菌、浅粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、浅粉红链孢囊菌、酸热脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌属(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝球藻属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcussp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、德根斯制氨菌(Ammonifexdegensii)、贝氏热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、脱硫杆菌(CandidatusDesulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobiusthermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、Allochromatium vinosum、海杆菌属(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、华氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、Ktedonobacter racemifer、甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沐节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻(Nostoc sp.)、大节旋藻(Arthrospira maxima)、宽胞节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、CampylobacterZari、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌ND2006和Acaryochloris marina。
在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自新凶手弗朗西斯氏菌的Cpfl核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌属的Cpfl核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自毛螺菌科细菌ND2006的Cpfl核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、毛螺菌科细菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门菌(Peregrinibacteria bacterium)、俭菌超门细菌(Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌属(Smithella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、候选白蚁甲烷支原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、稻田氏钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)的Cpfl核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpfl核酸酶。
野生型Cas9具有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域裂解非靶DNA链，而HNH结构域裂解DNA靶链。在一些实施方案中，Cas9核酸酶包含一个以上的RuvC结构域和/或一个以上的HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9核酸酶是野生型Cas9。在一些实施方案中，Cas9能够诱导靶DNA中的双链断裂。在某些实施方案中，Cas核酸酶可以裂解dsDNA的一条或两条链。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以裂解单链DNA。在一些实施方案中，Cas核酸酶可能不具有DNA切口酶活性。示例性Cas9氨基酸序列作为SEQ ID NO:901提供。
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV(SEQ ID NO:901)。
示例性的Cas9 mRNA ORF序列(包括起始密码子和终止密码子)作为SEQ ID NO:902提供。
AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG(SEQ ID NO:902)
适于包含在融合蛋白中的示例性的Cas9 mRNA编码序列作为SEQ ID NO:903提供。
GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC(SEQ ID NO:903)
在一些实施方案中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区域被不同蛋白质的一部分取代。在一些实施方案中，Cas核酸酶结构域可以被来自不同核酸酶(诸如Fok1)的结构域替代。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是修饰的核酸酶。
在其他实施方案中，Cas核酸酶可来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是I型CRISPR/Cas系统的Cascade复合物的组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是Cas3蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些实施方案中，Cas核酸酶是改造的Cas核酸酶。在一些实施方案中，编码Cas核酸酶的核酸包括改造的5’非翻译区、3’非翻译区、编码区或编码polyA尾的序列中的一个或多个。在一些实施方案中，编码Cas核酸酶的核酸包含含有SEQ ID NO:941-947中任一个的5’非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，编码Cas核酸酶的核酸包含含有SEQ ID NO:948-953中任一个的3’非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，编码Cas核酸酶的核酸包含含有SEQID NO:954-960中任一个的编码区(CDS)。在一些实施方案中，编码Cas核酸酶的核酸包含含有SEQ ID NO:963-972中任一个的polyA尾。在一些实施方案中，将改造的Cas核酸酶与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的一个或多个向导RNA一起提供至细胞。
E.gRNA功效的确定
在一些实施方案中，gRNA的功效在与其他成分(例如编码RNA引导的DNA结合剂的核酸，诸如本文所述的任何一种)一起递送时确定。在一些实施方案中，确定了gRNA与编码RNA引导的DNA结合剂的核酸的组合的功效。
如本文所述，使用本文公开的RNA引导的DNA核酸酶和向导RNA可导致DNA双链断裂，从而在细胞机器修复时产生插入/缺失(indel)突变形式的错误。许多因插入/缺失引起的突变会改变阅读框或引入提前终止密码子，因此产生无功能蛋白质。
在一些实施方案中，特定gRNA或组合的功效基于体外模型确定。在一些实施方案中，体外模型是HEK293细胞。在一些实施方案中，体外模型是HUH7人肝癌细胞。在一些实施方案中，体外模型是HepG2细胞。在一些实施方案中，体外模型是原代人肝细胞。在一些实施方案中，体外模型是原代啮齿动物肝细胞。在一些实施方案中，体外模型是原代食蟹猴肝细胞。关于使用原代人肝细胞，可使用市售的原代人肝细胞来提供实验之间的更大一致性。在一些实施方案中，确定体外模型(例如，在原代人肝细胞中)中发生缺失或插入的脱靶位点的数量，例如，通过分析体外转染Cas9mRNA和向导RNA的原代人肝细胞的基因组DNA进行。在一些实施方案中，这种确定包括分析体外转染Cas9 mRNA和向导RNA的原代人肝细胞的基因组DNA。以下工作实施例中提供了此类确定的示例性程序。
在一些实施方案中，在多个体外细胞模型中确定特定gRNA或组合的功效，以进行gRNA选择过程。在一些实施方案中，对选定gRNA的数据进行细胞系比较。在一些实施方案中，在多个细胞模型中进行交叉筛选。
在一些实施方案中，特定gRNA或组合的功效基于体内模型确定。在一些实施方案中，体内模型是啮齿动物模型。在一些实施方案中，啮齿动物模型是小鼠，其表达人类PCSK9基因，所述人类PCSK9基因可以是突变的人类PCSK9基因。在一些实施方案中，体内模型是非人类灵长类动物，例如食蟹猴。
在一些实施方案中，通过PCSK9的编辑百分比来测量向导RNA或组合的功效。在一些实施方案中，将PCSK9的编辑百分比与实现PCSK9蛋白敲低所需的编辑百分比进行比较，例如，在体外模型的情况下在细胞或细胞培养基中或在体内模型的情况下在血清、细胞或组织中进行。在一些实施方案中，编辑百分比为细胞群的30％至99％。在一些实施方案中，编辑百分比为细胞群的30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％。在一些实施方案中，编辑百分比为30％-95％、40％-90％或50％-85％、30％-60％、40％-80％、50％-75％、60％-90％。
在一些实施方案中，向导RNA或组合的功效通过靶细胞类型的基因组内脱靶序列处的插入/缺失的数量和/或频率来测量。在一些实施方案中，提供了有效的向导RNA和组合，其在细胞群中和/或相对于靶位点处插入/缺失的产生频率以非常低的频率(例如，<5％)在脱靶位点处产生插入/缺失。因此，本申请提供了向导RNA，其在靶细胞类型(例如，肝细胞)中不表现出脱靶插入/缺失形成，或在细胞群中和/或相对于靶位点处插入/缺失的产生频率产生<5％的脱靶插入/缺失形成频率。在一些实施方案中，本申请提供了向导RNA和组合，其在靶细胞类型(例如，肝细胞)中不表现出任何脱靶插入/缺失形成。
在一些实施方案中，提供了在少于20个脱靶位点处产生插入/缺失的向导RNA和组合，例如，通过本文所述的一种或多种方法评估。在一些实施方案中，提供了在少于或等于4、3、2或1个脱靶位点处产生插入/缺失的向导RNA和组合，例如，通过本文所述的一种或多种方法评估。在一些实施方案中，脱靶位点不发生在靶细胞(例如，肝细胞)基因组中的蛋白质编码区中。
在一些实施方案中，检测基因编辑事件，诸如靶DNA中形成插入/缺失(“indel”)突变和同源性定向修复(HDR)事件，利用标记引物的线性扩增并分离标记的扩增产物(下文称为“LAM-PCR”或“线性扩增(LA)”方法)，如WO2018/067447或Schmidt等人,Nature Methods4:1051-1057(2007)中所述。
在一些实施方案中，检测基因编辑事件，诸如在靶DNA中形成插入/缺失(“indel”)突变和同源性定向修复(HDR)事件，还包括对线性扩增产物或进一步的扩增产物进行测序。测序可以包括本领域技术人员已知的任何方法，包括下一代测序，以及将线性扩增产物或进一步的扩增产物克隆到质粒中并对质粒或质粒的一部分进行测序。示例性的下一代测序方法在例如Shendure等人，Nature 26:1135-1145(2008)中进行了讨论。在其他方面，检测基因编辑事件，诸如在靶DNA中形成插入/缺失(“indel”)突变和同源定向修复(HDR)事件，还包括对线性扩增产物或进一步的扩增产物进行数字PCR(dPCR)或液滴数字PCR(ddPCR)，或将线性扩增产物或进一步的扩增产物与设计用于鉴定具有同源定向修复(HDR)模板序列的DNA的核酸探针接触并检测已与线性扩增产物或进一步的扩增产物结合的探针。在一些实施方案中，该方法还包括确定HDR模板在靶DNA中的位置。
在一些实施方案中，通过细胞(包括来自组织的细胞)中的PCSK9量来测量gRNA或组合的功效。在一些实施方案中，使用蛋白质印迹法测量细胞中的PCSK9量。在一些实施方案中，使用的细胞是HUH7细胞。在一些实施方案中，使用的细胞是原代人肝细胞。在一些实施方案中，使用的细胞是从动物获得的原代细胞。在一些实施方案中，将PCSK9的量与甘油醛3-磷酸脱氢酶GAPDH(一种管家基因)的量进行比较，以控制细胞数量的变化。
在一些实施方案中，与在施用组合物之前在受试者中检测到的细胞中PCSK9相比，PCSK9的量减少了30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％。在一些实施方案中，与在施用组合物之前在受试者中检测到的细胞中PCSK9相比，PCSK9的量减少了30％-95％、40％-90％或50％-85％、30％-60％、40％-80％、50％-75％或60％-90％。
在一些实施方案中，通过受试者循环中LDL的水平或量来测量gRNA或组合的功效。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法来测量受试者循环中LDL的水平或量。例如，受试者的LDL可以使用血脂检测来测量，血脂检测可以包括总胆固醇、LDL胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇和甘油三酯的测量(Cooper GR等人.Blood lipidmeasurements.Variations and practical utility.JAMA.1992Mar 25；267(12):1652-60.)。
在一些实施方案中，与施用组合物之前受试者循环中的LDL相比，受试者循环中的LDL减少了30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％。在一些实施方案中，与施用组合物之前受试者循环中的LDL相比，受试者循环中的LDL减少了30％-95％、40％-90％或50％-85％、30％-60％、40％-80％、50％-75％或60％-90％。
F.治疗方法
在一些实施方案中，本申请提供了一种治疗高胆固醇血症和/或心血管疾病的方法，所述方法包括施用包含具有SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的向导RNA、或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA、或SEQ ID NO:297-592的任一个或多个crRNA的组合物。在一些实施方案中，施用具有SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的gRNA、或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA，以治疗高胆固醇血症和/或心血管疾病。向导RNA与本文描述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述的LNP中施用，诸如具有CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如胆固醇)、隐形脂质(stealth lipid，例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如DSPC)的LNP。
在一些实施方案中，本申请提供了一种在PCSK9基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括施用具有本文所述的向导RNA(例如具有SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列)或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA的组合物。在一些实施方案中，施用gRNA，诸如SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列，以识别并结合PCSK9基因。向导RNA与本文所述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸(例如mRNA)或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸。在一些实施方案中，提供了一种在PCSK9基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含向导RNA(诸如化学修饰的向导RNA)，所述向导RNA包含SEQ ID NO:1-296中的任一个或多个引导序列，或所述组合物包含SEQ ID NO:593-888中的任一个或多个sgRNA。在一些实施方案中，施用SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA或包含SEQ ID NO:1-296中的任一个或多个引导序列的gRNA，以在PCSK9基因中诱导DSB。向导RNA与本文所述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述的LNP中施用，诸如包含CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施方案中，提供了一种修饰PCSK9基因的方法，所述方法包括施用包含本文所述的向导RNA(例如，具有SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列)或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA的组合物。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的gRNA，或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA，以修饰PCSK9基因。向导RNA与本文所述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述LNP中施用，诸如包含CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施方案中，提供了一种修饰PCSK9基因的方法，所述方法包括施用包含向导RNA(所述向导RNA包含SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列)或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA的组合物。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的gRNA，或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA，以修饰PCSK9基因。向导RNA与本文描述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述的LNP中施用，诸如包含CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施方案中，提供了一种治疗高胆固醇血症和/或心血管疾病的方法，所述方法包括施用包含本文所述的向导RNA(例如具有SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列)或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA的组合物。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的gRNA，或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA，以治疗高胆固醇血症和/或心血管疾病。向导RNA与本文描述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述的LNP中施用，诸如包含CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施方案中，本申请描述了一种降低受试者循环中LDL水平的方法，所述方法包括施用如本文所述的向导RNA(例如具有SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的向导RNA)或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA。在一些实施方案中，施用包含SEQID NO:1-296的任一个或多个引导序列的gRNA或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA，以降低受试者循环中LDL水平和/或预防受试者血管组织的动脉粥样硬化。gRNA与本文描述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述的LNP中施用，诸如包含CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施方案中，本申请描述了提供一种降低受试者动脉粥样硬化风险的方法，所述方法包括施用如本文所述的向导RNA(例如，包含SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的向导RNA)或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的gRNA，或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA，以减少或预防受试者血管组织中动脉粥样硬化的发生。gRNA与本文描述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述的LNP中施用，诸如包含CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施方案中，本申请描述了一种治疗或预防受试者的冠状动脉疾病的方法，所述方法包括施用包含本文所述的向导RNA(例如具有SEQ ID NO:1-296的任一个或多个引导序列的向导RNA)或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA的组合物。在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防受试者的冠状动脉疾病的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:593-888中的任一个或多个sgRNA的组合物。在一些实施方案中，施用包含SEQ IDNO:1-296的任一个或多个引导序列的gRNA或SEQ ID NO:593-888的任一个或多个sgRNA，以治疗或预防受试者的冠状动脉疾病。gRNA与本文描述的编码RNA引导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶(例如Cas9))的核酸或载体一起施用。RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述的LNP中施用，诸如包含CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施方案中，gRNA包括表4的引导序列，与RNA引导的DNA核酸酶(诸如从核酸翻译的Cas核酸酶)一起使用诱导DSB，并且修复期间的非同源末端连接(NHEJ)导致PCSK9基因中的突变。在一些实施方案中，NHEJ导致核苷酸的缺失或插入，从而诱导PCSK9基因中的移码或无义突变。
在一些实施方案中，施用向导RNA和编码RNA引导的DNA结合剂的核酸(例如，在本文提供的组合物中)降低受试者细胞中(例如，受试者的肝、肠、肾或血管上皮组织中)的PCSK9丰度，并因此降低受试者循环中的LDL水平。
在一些实施方案中，降低受试者细胞中的PCSK9丰度包括降低受试者的一种或多种组织(诸如肝、肠、肾或血管上皮组织)的细胞中的PCSK9丰度。在一些实施方案中，血管上皮组织包括血管，例如，动脉。在一些实施方案中，降低受试者细胞中的PCSK9丰度是基于测量受试者循环中的LDL水平(例如，通过血脂测量)推断的。在一些实施方案中，受试者一个或多个组织的细胞中的PCSK9丰度可以导致受试者循环中LDL水平降低，例如，当在施用所述组合物后8周测量时。
在一些实施方案中，与施用组合物之前受试者细胞中的PCSK9丰度相比，受试者细胞中的PCSK9丰度降低30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％。在一些实施方案中，与施用组合物之前受试者细胞中的PCSK9丰度相比，受试者细胞中的PCSK9丰度降低30％-95％、40％-90％或50％-85％、30％-60％、40％-80％、50％-75％或60％-90％。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者是牛、猪、猴、羊、狗、猫、鱼或家禽。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物或家畜动物。
在一些实施方案中，提供了本文所述的一种或多种向导RNA(例如包括表4中的一种或多种引导序列(例如，在本文提供的组合物中))和本文所述的编码RNA引导的DNA结合剂的核酸(例如mRNA)用于制备用于治疗具有高胆固醇血症和/或心血管疾病的人类受试者的药物的用途。RNA引导的DNA结合剂可以是Cas9，例如酿脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，向导RNA是经过化学修饰的。
在一些实施方案中，包含向导RNA和核酸的组合物通过静脉内施用。在一些实施方案中，包含向导RNA和核酸的组合物被施用到肝循环中。
在一些实施方案中，单次施用包含本文提供的向导RNA和核酸的组合物足以敲低突变蛋白(例如，突变的PCSK9)的表达。在一些实施方案中，单次施用包含本文提供的向导RNA和核酸的组合物足以敲除细胞群中突变蛋白的表达。在其他实施方案中，多于一次地施用包含本文提供的向导RNA和核酸的组合物可以有利于通过累积效应最大化编辑。例如，本文提供的组合物可以施用2、3、4、5次或更多次，诸如2次。施用可以间隔一段时间，例如，1天至2年，诸如1至7天、7至14天、14天至30天、30天至60天、60天至120天、120天至183天、183天至274天、274天至366天或366天、2年、5年或10年。
在一些实施方案中，施用的组合物的有效量在0.01至20mg/kg(mpk)范围内，例如0.01至0.1mpk、0.1至0.3mpk、0.3至0.5mpk、0.5至1mpk、1至2mpk、2至3mpk、3至5mpk、5至10mpk或0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、5、6、8、10、15或20mpk。在一些实施方案中，施用的组合物的量为2-4mg/kg，诸如2.5-3.5mg/kg。在一些实施方案中，施用的组合物的量为约3mg/kg。
在一些实施方案中，在递送后1年、2年、3年、4年、5年或10年评估使用本文所述的组合物治疗的疗效。在一些实施方案中，通过测量治疗前后受试者循环中的LDL水平来评估使用本文所述组合物治疗的疗效。在一些实施方案中，在1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月时观察到通过降低受试者循环中的LDL水平评估的使用所述组合物治疗的疗效。在一些实施方案中，受试者循环中的LDL水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一些实施方案中，治疗减缓、阻止或逆转疾病进展。
在一些实施方案中，治疗减缓或阻止心血管疾病的进展。在一些实施方案中，治疗减缓或阻止冠状动脉疾病的进展。在一些实施方案中，治疗减缓或阻止动脉粥样硬化的进展。在一些实施方案中，治疗导致心血管疾病的症状的改善、稳定或变化减缓。
在一些实施方案中，治疗的疗效通过增加的受试者的生存时间测量。
附加治疗
在一些实施方案中，描述了联合疗法，其包括施用如本文所述的任一种gRNA(例如包括表4中公开的任一种或多种引导序列)和编码如本文所述的RNA引导的DNA结合剂的核酸(诸如本文所述的编码酿脓链球菌Cas9的核酸(例如，mRNA)或载体)(例如，在本文提供的组合物中)，以及适合于缓解高胆固醇血症和/或心血管疾病症状的附加疗法。
在一些实施方案中，附加疗法是用于高胆固醇血症和/或心血管疾病的治疗。在一些实施方案中，高胆固醇血症和/或心血管疾病的治疗是他汀，例如，阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)或辛伐他汀(simvastatin)。在一些实施方案中，高胆固醇血症和/或心血管疾病的治疗是胆固醇吸收抑制剂，例如，依折麦布(ezetimibe)。在一些实施方案中，高胆固醇血症和/或心血管疾病的治疗是贝派地酸(bempedoic acid)。在一些实施方案中，高胆固醇血症和/或心血管疾病的治疗是胆酸结合树脂，例如，考来烯胺(cholestyramine)、考来维仑(colesevelam)或考来替泊(colestipol)。
在一些实施方案中，联合疗法包括施用包括表4中公开的任一个或多个引导序列的任一种gRNA和编码RNA引导的DNA结合剂的核酸(例如，在本文提供的组合物中)以及靶向PCSK9和/或抑制PCSK9的抗体。在一些实施方案中，抗体是能够进一步降低PCSK9丰度由此促进从循环中去除LDL胆固醇的抗体组合物。在一些实施方案中，抗体是依洛尤单抗、伯考赛珠单抗(bococizumab)或阿利西尤单抗。在一些实施方案中，抗体组合物在包括表4中公开的任一个或多个引导序列的任一种gRNA(例如，在本文提供的组合物中)之后施用。在一些实施方案中，抗体组合物在用本文提供的任何gRNA组合物治疗后定期施用。
在一些实施方案中，联合疗法包括施用包括表4中公开的任一个或多个引导序列的任一种gRNA和编码本文所述的RNA引导的DNA结合剂的核酸(例如，在本文提供的组合物中)以及靶向PCSK9或突变型PCSK9的siRNA。在一些实施方案中，siRNA是能够进一步降低或消除野生型或突变型PCSK9表达的任何siRNA。在一些实施方案中，siRNA是药物英克西兰(inclisiran)。在一些实施方案中，siRNA在包含表4中公开的任一个或多个引导序列的任一种gRNA和编码RNA引导的DNA结合剂的核酸(例如，在本文提供的组合物中)之后施用。在一些实施方案中，在用本文提供的任何gRNA组合物治疗后定期施用siRNA。
在一些实施方案中，联合疗法包括施用包括本文所述的任一个或多个引导序列(例如，在表4中公开的)的任一种gRNA和编码本文所述的RNA引导的DNA结合剂的核酸(例如，在本文提供的组合物中)以及靶向PCSK9或突变型PCSK9的反义核苷酸。在一些实施方案中，反义核苷酸是能够进一步降低或消除野生型或突变型PCSK9表达的任何反义核苷酸。在一些实施方案中，反义核苷酸在包括表4中公开的任一个或多个引导序列的任一种gRNA和编码RNA引导的DNA结合剂的核酸(例如，在本文提供的组合物中)之后施用。在一些实施方案中，在用本文提供的任何gRNA组合物治疗后定期施用反义核苷酸。
在前述任一实施方案中，表4中公开的引导序列，和/或向导RNA可以是经过化学修饰的向导RNA。
在一些实施方案中，本文所述方法包括输液预防剂。在一些实施方案中，在基因编辑组合物之前向受试者施用输液预防剂。在一些实施方案中，在施用核酸组合物之前8-24小时或1-2小时向受试者施用输液预防剂。
在一些实施方案中，输液预防剂包含皮质类固醇。在一些实施方案中，输液预防剂包含皮质类固醇、退热药(例如，口服对乙酰氨基酚(也称为扑热息痛)，其可以减轻疼痛和发烧和/或抑制COX酶和/或前列腺素)、HI阻滞剂或H2阻滞剂中的一种或多种或全部。在一些实施方案中，输液预防剂包含静脉内用皮质类固醇(例如，地塞米松8-12mg，诸如10mg，或等效物)和退热药(例如，口服对乙酰氨基酚或扑热息痛500mg)。在一些实施方案中，HI阻滞剂(例如苯海拉明50mg或等效物)和/或H2阻滞剂(例如雷尼替丁50mg或等效物)口服施用。在一些实施方案中，HI阻滞剂(例如苯海拉明50mg或等效物)和/或H2阻滞剂(例如雷尼替丁50mg或等效物)通过静脉内施用。在一些实施方案中，在输注核酸组合物之前1-2小时通过静脉内施用输液预防剂。
在一些实施方案中，静脉内用HI阻滞剂和/或静脉内用H2阻滞剂被口服等效物替代。输液预防剂可用于减少与施用核酸组合物相关的不良反应。在一些实施方案中，输液预防剂作为施用核酸组合物之前所需的预用药施用。皮质类固醇、输液预防剂和本文所述的含有向导RNA的组合物的剂量、频率和施用方式可以独立控制。
所公开方法中使用的皮质类固醇可根据本领域已知的方案(例如美国FDA批准的方案)施用。在一些实施方案中，例如施用给人类受试者或用于人类受试者，皮质类固醇的施用量范围可以为约0.75mg至约25mg。在一些实施方案中，例如施用给人类受试者或用于人类受试者，皮质类固醇的施用量范围可以为约0.01-0.5mg/kg，诸如0.1-0.40mg/kg或0.25-0.40mg/kg。
在一些实施方案中，皮质类固醇在本文所述的含有向导RNA的组合物之前施用。在一些实施方案中，皮质类固醇在本文所述的含有向导RNA的组合物之后施用。在一些实施方案中，皮质类固醇与本文所述的含有向导RNA的组合物同时施用。在一些实施方案中，在施用含有向导RNA的组合物之前或之后施用多个剂量的皮质类固醇。在一些实施方案中，在施用皮质类固醇之前或之后施用多个剂量的含有向导RNA的组合物。在一些实施方案中，施用多个剂量的皮质类固醇和多个剂量的含有向导RNA的组合物。
如果适当，可以将一个剂量的皮质类固醇作为至少两个亚剂量以适当的间隔分开施用。在一些实施方案中，在施用本文所述的含有向导RNA的组合物之前施用至少两次皮质类固醇。在一些实施方案中，在施用本文所述的含有向导RNA的组合物之后一个剂量的皮质类固醇施用至少两次。在一些实施方案中，以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周；或者前述任意两个值所限定的范围内的时间量的间隔施用皮质类固醇(例如，在施用本文所述的含有向导RNA的组合物之前、同时和/或之后)。在一些实施方案中，在施用本文所述的含有向导RNA的组合物之前以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周；或前述任意两个值所限定的范围内的时间量的间隔施用皮质类固醇。在一些实施方案中，在施用本文所述的含有向导RNA的组合物之后以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周；或由前述任意两个值所限定的范围内的时间量的间隔施用皮质类固醇。
在一些实施方案中，皮质类固醇施用至少两次。在一些实施方案中，皮质类固醇施用至少三次。在一些实施方案中，皮质类固醇施用至少四次。在一些实施方案中，皮质类固醇施用最多五次、六次、七次、八次、九次或十次。第一剂量可以是口服的，而第二剂量或后续剂量可以是肠胃外施用，例如输注。备选地，第一剂量可以是肠胃外施用，而第二剂量或后续剂量可以是口服施用。
在一些实施方案中，在经静脉内施用本文所述的含有向导RNA的组合物之前口服施用皮质类固醇。在一些实施方案中，在经静脉内施用本文所述含有向导RNA的组合物时或之后口服施用皮质类固醇。
在一些实施方案中，皮质类固醇是地塞米松。在一些实施方案中，地塞米松在输注核酸组合物前1-2小时经静脉内施用。在一些实施方案中，在输注核酸组合物前1-2小时经静脉内施用8-12mg、诸如10mg的量的地塞米松。在一些实施方案中，在输注核酸组合物前8至24小时口服施用地塞米松。在一些实施方案中，在输注核酸组合物前8至24小时口服施用8-12mg、诸如8mg的量的地塞米松。在一些实施方案中，在输注核酸组合物之前8至24小时，口服施用8-12mg、诸如8mg的量的地塞米松，并且在输注核酸组合物之前1-2小时，经静脉内施用8-12mg、诸如10mg的量的地塞米松。
核酸组合物的递送
在一些实施方案中，本文所述的核酸组合物包含gRNA和编码RNA引导的DNA结合剂的核酸(作为RNA或在一个或多个载体上编码)，所述核酸组合物配制在脂质纳米颗粒(LNP)中或通过脂质纳米颗粒(LNP)施用；参见，例如，WO2017173054A1和WO2019067992A1，它们的内容通过引用整体并入本文。本领域技术人员已知的能够向受试者递送核苷酸的任何LNP均可与本文所述的向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸一起使用。
在一些实施方案中，向导RNA和编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸在本文所述的LNP中施用，诸如包含CCD脂质(例如，胺脂质，诸如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如，PEG脂质，诸如PEG2k-DMG)和任选的中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
本文公开了用于RNA(包括CRISPR/Cas载荷)的LNP制剂的各种实施方案。此类LNP制剂可以包括(i)CCD脂质，诸如胺脂质，(ii)中性脂质，(iii)辅助脂质，和(iv)隐形脂质，诸如PEG脂质。LNP制剂的一些实施方案包括胺脂质，以及辅助脂质、中性脂质和隐形脂质(诸如PEG脂质)。在一些实施方案中，LNP制剂包括少于1％的中性磷脂。在一些实施方案中，LNP制剂包括少于0.5％的中性磷脂。“脂质纳米颗粒”可以是包含多个(即多于一个)脂质分子的颗粒，这些脂质分子通过分子间力物理地彼此关联。本文公开的LNP制剂中可以使用的CCD脂质、胺脂质、中性脂质和其他脂质在WO2020198697、WO2015006747、WO2016118724和WO2021026358中进行了描述，它们均分别以全文并入本文中。
可用于递送本申请的组合物的更多技术包括利用可生物降解聚合物、脂质体、病毒样颗粒或纳米颗粒进行包封的技术。在一些实施方案中，本申请的组合物以任何合适的递送媒介物施用，包括但不限于聚合物、工程化病毒颗粒(例如，腺相关病毒)、外泌体、脂质体、超荷电蛋白、可植入装置或红细胞。合适的递送方法在US10851357、US10709797和US20170349914中描述，它们中每个的全文并入本文中。
实施例
除非另有说明，本申请的方法和组合物的实践采用分子生物学(包括重组技术)、细胞培养、免疫学、细胞生物学和生物化学的常规技术，这些技术完全在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所解释，诸如“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”,第二版(Sambrook,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“AnimalCell Culture”(Freshney,1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of ExperimentalImmunology”(Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller andCalos,1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987)；“PCR:ThePolymerase Chain Reaction”,(Mullis,1994)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,1991)。这些技术适用于本申请的方法和组合物。以下部分将讨论用于特定实施方案的特别有用的技术。下文进一步描述的材料、试剂和方法用于下列实施例中。下列实施例中描述的实施方案不限制权利要求书的范围。
实施例1.向导RNA序列的设计
初始向导设计使用常用计算工具和工作流程、人类参考基因组(例如，GRCh38)和用户定义的靶基因组区(例如，PCSK9)完成。确定引导序列(即，gRNA)的第一步是扫描感兴趣区域中的PAM。然后，根据许多标准(切割效率和结合特异性评分，GC含量、poly-T和自由能)对候选向导进行排序，所述标准期望确保高靶向切割效率和低脱靶可能性。共产生靶向PCSK9(ENST00000302118.5)外显子1-12的编码区的296个sgRNA。这些向导中大约10％在食蟹猴(Macaca fascularis)的参考基因组中是100％同源的。引导序列和基因组坐标提供在表4中。
所选的引导序列显示在表4中。下表4显示了设计靶向PCSK9基因的该296个引导序列。相对应的sgRNA显示在表5中。
表4：引导序列
表5：与表4中的引导序列相对应的crRNA和sgRNA序列
对表5所示的296个sgRNA序列(SEQ ID NO:593-888)进行了进一步的体外和体内测定测试。
实施例2.靶标分析
靶向效率分析：使用深度扩增子测序评估靶向切割效率。使用内部计算工具和工作流程，对由本文公开的基因编辑系统引入的靶向突变进行列举和显现。对与所选靶标区域相关的编码和非编码元件的编辑效果进行了评估。
此外，还对脱靶裂解进行了评估。例如，还在PHH、Huh7和HepG2细胞系中进行了基于细胞的基于寡核苷酸插入的测定(Tasi等人，2015)。选择dsODN插入效率高的位点，使用基于扩增子的下一代测序技术进行进一步分析，以更精确地评估脱靶编辑。
Cas9蛋白和sgRNA的体外递送
HepG2细胞系。在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养人肝细胞癌细胞系HepG2。在电转前24小时，将细胞以1,000,000-1,500,000个细胞/孔的密度接种在6孔板中或以8,000-22,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。使用Celetrix电转仪(Celetrix,CTX-1500A)按照供应商的方案对细胞进行电转。使用含有Cas9核酸酶(5-50pmol)、sgRNA(10-500pmol)的RNP复合物和Celetrix缓冲液对细胞进行电转。
Cas9 mRNA和sgRNA的体外递送
HepG2细胞系。在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养人肝细胞癌细胞系HepG2。在电转前24小时，将细胞以1,000,000-1,500,000个细胞/孔的密度接种在6孔板中，或以8,000-22,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。使用Lipofectamine MessengerMAX(ThermoFisher，目录号LMRNA003)按照供应商的方案转染细胞。用含有1-500ng Cas9mRNA、2-1,000ng sgRNA和Lipofectamine MessengerMAX的脂质复合物转染细胞。
Huh7细胞系。在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养人肝细胞癌细胞系Huh7。在电转前24小时，将细胞以500,000-1,500,000个细胞/孔的密度接种在6孔板中，或以5,000-15,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。使用Lipofectamine MessengerMAX(ThermoFisher，目录号LMRNA003)按照供应商的方案转染细胞。用含有1-500ng Cas9mRNA、2-1,000ng sgRNA和Lipofectamine MessengerMAX的脂质复合物转染细胞。
Cos-7细胞系。在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养绿猴肾细胞系Cos-7。在电转前24小时，将细胞以5,000-15,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。使用Lipofectamine MessengerMAX(ThermoFisher，目录号LMRNA003)按照供应商的方案转染细胞。用含有1-500ng Cas9 mRNA、2-1,000ng sgRNA和Lipofectamine MessengerMAX的脂质复合物转染细胞。
原代肝细胞。根据供应商的方案培养原代人肝细胞(PHH)和原代食蟹猴肝细胞(PCH)(BioIVT)。简言之，将细胞解冻并重悬在添加补充剂的肝细胞解冻培养基中，然后对于人肝细胞以100g离心10分钟，对于食蟹猴肝细胞以80g离心4分钟。弃去上清液，将沉淀的细胞重悬在添加补充剂包的肝细胞接种培养基中。计数细胞并将其接种在Bio-coat胶原蛋白I包被的多孔板(ThermoFisher，目录号877272)上：以60,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，或以125,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中，或以270,000个细胞/孔的密度接种在6孔板中。让接种的细胞在37℃和5％CO2气氛的组织培养箱中沉降并贴壁生长6或24小时。
培养后检查细胞是否形成单层，并用含有无血清补充剂包的肝细胞培养基更换培养基。
基因组DNA分离。对于体外研究，转染后72小时收获转染细胞。使用QuickExtractDNA提取液(LGC Lucigen,目录号QE09050)，按照供应商的方案从6孔板/24孔板/96孔板的每个孔中提取基因组DNA。所有DNA样本均进行后续Sanger测序分析，如本文所述。
对于体内研究，使用FastPure血液/细胞/组织/细菌DNA分离微型试剂盒(Vazyme，目录号DC112)，按照供应商的方案从小鼠肝脏匀浆物提取基因组DNA。
Sanger测序分析
为了定量确定基因组中靶位置的编辑效率并快速筛选出潜在的gRNA，利用Sanger测序来鉴定基因编辑引入的编辑效率。
围绕感兴趣基因(例如PCSK9)内的靶位点设计引物，并扩增感兴趣的基因组区域。
在3730xl DNA分析仪(ThermoFisher，目录号3730XL)上按照供应商的方案进行Sanger测序。使用在线分析工具分析原始测序文件(.ab1)以确定编辑效率。
下一代测序(NGS)分析
为了定量确定基因组中靶位置处的编辑效率和模式，利用测序来鉴定基因编辑引入的插入和缺失的存在。
围绕感兴趣基因(例如PCSK9)内的靶位点设计引物，并扩增感兴趣的基因组区域。
根据供应商(Illumina)的方案，进行了额外的PCR以添加用于测序的化学剂。使用Illumina NovaSeq 6000仪器对扩增子进行测序。将得到的读数与参考基因组(例如，人类参考基因组(hg38)、食蟹猴参考基因组(mf5)、大鼠参考基因组(rn6)或小鼠参考基因组(mm10))进行比对，比对之前消除低质量分数的读数。将包含读数的所得文件映射到参考基因组(BAM文件)，其中选择与感兴趣靶标区域重叠的那些读数，并计数野生型读数的数量和包含插入、取代或缺失的读数的数量。
编辑百分比(例如，“编辑效率”或“编辑百分数”或“插入/缺失频率”)定义为具有插入/缺失(“插入缺失”)或取代的序列读数总数/包括野生型读数在内的序列读数的总数。
用于细胞研究的PCSK9 ELISA分析。
收集并分离细胞(HepG2或Huh7)裂解液，然后使用人PCSK9 ELISA试剂盒(Abcam，目录号ab209884)按照制造商的方案测定PCSK9的表达水平。简言之，在测量人PCSK9时，用试剂盒样品稀释液将样品连续稀释，最终稀释倍数为5,000倍。将100uL已制备好的标准曲线样本或稀释后的血清样本加入ELISA板中，室温下孵育30分钟，然后用提供的洗涤缓冲液洗涤3次。然后，在每个孔中加入100uL检测抗体，室温下孵育20分钟，再洗涤3次。加入100uL底物，室温下孵育10分钟，然后加入100ul终止液。在Spectramax M5读板器上测量内容物的吸光度，并使用SoftmaxPro 7.0版软件进行分析。PCSK9水平通过4参数逻辑拟合的标准曲线计算得出，以血清中的ng/mL或相对对照(媒介物处理)细胞的敲低百分比表示。
sgRNA合成
在192-YiBo固相合成仪上合成sgRNA。使用可控孔玻璃(CPG)作为固体支持物，使用TBDMS修饰的磷酰胺在每个循环中加入每个单体。合成过程结束后，将sgRNA从CPG上裂解下来，进行去保护处理。纯化在AKTA纯化机中进行。
在其他实验中，sgRNA是从Genscript、General Biosystem或synthego等供应商订购的。如果要比较sgRNA的效力或脱靶情况，则每次实验都使用来自同一供应商且纯度相似的sgRNA。
mRNA密码子优化
004R序列由Genscript使用其内部算法进行优化，以用于优化的人类蛋白质生产和促进基因合成的低GC含量。Seq311和Seq204来自US11697806B2，以供比较。K1-1、K4-8、K8-1和K10-2是根据高密码子适应指数(CAI)和低最小自由能(MFE)进行优化的。由于计算MFE需要全长mRNA，所有测试序列都包含相同的5′UTR(5′UTR HSD，TCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTT GCAGGCCTTATTC，SEQ ID NO：961)、3′UTR(3′UTR ALB，CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA，SEQ ID NO:962)和核定位序列(G3S-NLS)。所有经过密码子优化的CDS与相同的UTR按下述进行比较。
mRNA质粒构建和体外转录(IVT)
将不同的序列元件(如UTR、CDS、polyA，见序列表)进行PCR扩增或从头合成，并克隆到用于产生Cas9 mRNA的原始质粒(Genscript、General Biosystem或GENEWIZ)中。质粒中的PolyA长度由基因合成提供商通过sanger验证，与设计的数量相差小于3。
使用线性化质粒模板和T7 RNA聚合酶进行体外转录，产生含有N1-甲基假尿嘧啶的带帽和多腺苷酸化的Cas9 mRNA。转录本浓度由260nm处吸光度(Nanodrop)测定，转录本由Bioanalyzer(Agilent)通过毛细管电泳分析。
质谱法测定PolyA长度
为了检测polyA mRNA的长度，全长mRNA被RNA酶T1t裂解，以切断鸟嘌呤核糖核苷酸的3'-磷酸基与相邻核糖核苷酸的5'-羟基之间的磷酸二酯键。这一过程会从母体mRNA分子中释放出一个短的polyA片段。然后使用生物素-抗生物素蛋白磁珠对释放的polyA片段进行纯化。然后用质谱仪分析该polyA片段的分子量分布。
LNP体内递送
需要用于将CRISPR/Cas的蛋白质和核酸组分递送至细胞(诸如患者的细胞)的组合物。特别是，具有可用于体外和体内递送的有用特性、能够稳定和递送RNA组分的组合物是令人感兴趣的。
在此，我们提供了具有有用特性的基于脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，特别是用于递送CRISPR/Cas基因编辑组分的组合物。LNP组合物包含：RNA组分；和脂质组分，其中脂质组分包含：(1)约45-55摩尔％胺脂质；(2)约9-11摩尔％中性脂质；和(3)约1-5摩尔％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分是辅助脂质，并且其中LNP组合物的N/P比为3至8。
除非另有说明，每项研究均使用6-15周龄的PCSK9人源化小鼠。对动物进行称重并根据体重分组，以根据组平均体重制备给药溶液。通过尾静脉给药LNP，每只动物0.2ml的体积(大约10ml/千克体重)。每天观察动物以监测状态。在所示的时间点通过隐静脉或心脏穿刺采集血液。在采集血液后收集肝组织并立即放置在-80℃以用于进一步的分析。
动物研究中使用的PCSK9 ELISA分析
采集血液并分离血清。使用人KCSK9 ELISA试剂盒(Abcam，目录号ab209884)按照供应商的方案测量总人PCSK9血清水平。
实施例3.sgRNA序列筛选
在HepG2细胞中进行PCSK9向导RNA筛选
如实施例2所述，将靶向人PCSK9基因的sgRNA递送至HepG2。确定包含每个引导序列的sgRNA的编辑百分比，然后根据最高编辑百分比对引导序列进行排序。编辑数据列于下表6中。数据以图形方式显示在图1中。
表6：在HepG2细胞中使用Cas9蛋白和sgRNA的PCSK9编辑数据
实施例4.sgRNA在Cos-7和PCH细胞中的剂量反应
如实施例2所述，将靶向人和猴PCSK9的sgRNA和Cas9 mRNA递送到Cos-7和PCH细胞中，以8个点的两倍剂量反应曲线进行。如实施例2所述，在处理后72小时将细胞裂解进行编辑分析。对于包含每个引导序列的sgRNA确定编辑百分比，然后基于EC50值和最大编辑百分比，对引导序列排序。关于引导序列在Cos-7和PCH细胞中的剂量反应曲线显示在图2和图3中。EC50值和最大编辑百分比列在下面的表7和表8中。
表7显示测试的人PCSK9 sgRNA和Cas9 mRNA对Cos-7的EC50和最大编辑(作为剂量反应曲线)。数据以图形方式显示在图2中。
表7：在用Cas9 mRNA和sgRNA处理的Cos-7细胞的PCSK9编辑数据
名称 EC50(nM) 最大编辑(％)
P9-hc-026 0.221 87
P9-hc-028 0.439 97
P9-hc-162 0.217 96
P9-hc-023 1.158 89
下表8显示测试的人PCSK9 sgRNA和Cas9 mRNA对PCH的EC50和最大编辑(作为剂量反应曲线)。数据以图形方式显示在图3中。
表8：在用Cas9 mRNA和sgRNA处理的PCH细胞的PCSK9编辑数据
实施例5.表型分析
细胞内PCSK9的ELISA分析
如实施例2所述，用Cas9 mRNA和sgRNA转染HepG2和Huh7细胞。将转染的细胞汇集物保持在组织培养中，并传代用于进一步分析。在转染后第5天，收集细胞裂解物并如之前所述通过ELISA进行分析。
计算PCSK9蛋白的减少百分比。在将PCSK9水平针对加扰对照标准化后确定PCSK9蛋白的减少百分比。结果显示在下面的表9和10中。
表9：HepG2细胞中PCSK9蛋白的减少百分比。
表10：Huh7细胞中PCSK9蛋白的减少百分比。
实施例6：在PHH中筛选sgRNA序列
将原代人肝细胞(PHH)在解冻培养基(Gibco，目录号CM7500)中解冻。离心后，弃掉上清液，将沉淀的细胞重悬在添加补充剂包的肝细胞接种培养基(William’s E Mediumplus Plating Supplements CM3000,Thermofisher)中，以35,000个细胞/孔的密度接种在胶原蛋白包被的平板24孔板(Stem cell technologies，目录号100-0365)中。让接种的细胞在37℃和5％CO2气氛的组织培养箱中沉降并贴壁生长4-6小时。将培养基更换为William’s E Medium plus Maintenance Supplements CM4000(Thermofisher)，使用至实验结束。使用RNAiMax试剂(Thermofisher)以500ng的cas9 mRNA(Trilink)和100ng的sgRNA(Synthego)进行转染。三天后，将细胞用QuickExtractTMDNA提取溶液(Lucigen，目录号QE0905T)裂解，并扩增靶向的基因组区域进行NGS测序。PCSK9蛋白减少和基因编辑效率的结果显示在下表11中。
表11：在原代人肝细胞中的PCSK9蛋白减少和基因编辑效率
实施例7.在PHH中的sgRNA编辑效率
将来自另一个供体的原代人肝细胞(PHH)在含有10％ FBS和1％Pen/Strep的InvitroGRO CP培养基中解冻，并以27,000个细胞/孔的密度接种在胶原蛋白包被的平板24孔板中。在4-6小时后，将培养基更换为InvitroGRO CP培养基。使用RNAiMax试剂(Thermofisher)以500ng的cas9mRNA和250ng的sgRNA(Genscript)进行转染。转染后当天，将培养基更换为1％ Pen/Strep InvitroGRO CP培养基，直至在转染后3天收集细胞时。基因编辑结果显示在下表12中。
表12：在原代人肝细胞中的PCSK9的基因编辑效率
名称 基因编辑效率
P9-hc-212 65
P9-hc-095 63
P9-hc-162 58
P9-hc-023 58
P9-hc-028 53
P9-hc-026 52
P9-hc-223 51
P9-hc-010 37
P9-hc-026 32
实施例8.在HepG2中通过dsDNA插入测定进行的脱靶分析
使用基于双链(dsDNA)插入的测定来筛选由Cas9和相应的gRNA裂解的潜在基因组脱靶位点。在37℃和5％ CO2将HepG2细胞保持在补充有10％FBS(OPCEL)的MEM(Gibco)中。在4D-Nuclefector(LONZA,X-unit)中用200pmol的dsDNA、35pmol的Cas9(NEB,EnGen SpyCas9 NLS)蛋白和200pmol的gRNA(Genscript)电转1百万个HepG2细胞。提取基因组DNA并加工用于在NextSeq 6000测序仪中进行NGS测定(例如，参见Tsai等人,NatureBiotechnology 33,187-197；2015)。每个潜在脱靶位点的dsDNA掺入效率计算为在该位点的读数除以在靶向位点(PCSK9)的读数。将前30个脱靶位点的效率总和除以靶向位点的效率总和(top 30off/on)并将其用作半定量读数用于比较不同gRNA之间的脱靶潜力。总脱靶位点数目和最高dsODN掺入效率的前五个位点列在下面的表13和表14中，其代表两次独立的重复实验。
表13:HepG2细胞中的dsDNS掺入效率和前5个脱靶位点
表14:HepG2中的dsDNS掺入效率和前5个脱靶位点
实施例9.在PHH中通过dsDNA插入测定进行的脱靶分析
将原代人肝细胞(PHH)在解冻培养基(Gibco，目录号CM7500)中解冻。离心后，弃掉上清液，将沉淀的细胞重悬在添加补充剂包的肝细胞接种培养基(William’s E Mediumplus Plating Supplements CM3000,Thermofisher)中，以35,000个细胞/孔的密度接种在胶原蛋白包被的平板24孔板(Stem cell technologies，目录号100-0365)中。让接种的细胞在37℃和5％CO2气氛的组织培养箱中沉降并贴壁生长4-6小时。此后，将培养基更换为William’s E Medium plus Maintenance Supplements CM4000(Thermofisher)，使用至实验结束。使用RNAiMax试剂(Thermofisher)以500ng的cas9 mRNA(Trilink)、5pmol dsDNA和100ng的sgRNA(Synthego)进行转染。三天后，用OceanNano Tech PureBind基因组DNA分离试剂盒提取基因组DNA，并加工用于在NextSeq 2000测序仪中进行NGS测定(例如，参见Tsai等人,Nature Biotechnology 33,187-197；2015)。将前30个脱靶位点的效率总和除以靶向位点的效率总和(top 30off/on)并将其用作半定量读数用于比较不同gRNA之间的脱靶潜力。总脱靶位点数目和最高dsODN掺入效率的前五个位点列在下表15中。
表15:PHH中的dsDNS掺入效率和前5个脱靶位点
实施例10.在PHH中通过基于扩增子的NGS进行sgRNA的脱靶分析
将原代人肝细胞(PHH)在含有10％ FBS和1％ Pen/Strat的InvitroGRO CP培养基中解冻，并以270,000个细胞/孔的密度接种在胶原蛋白包被的平板24孔板中。在4-6小时后，将培养基更换为InvitroGRO CP培养基。使用1.5μL RNAiMax试剂(Thermofisher)以400ng的cas9 mRNA和200ng的sgRNA(Genscript)进行转染。转染后当天，将培养基更换为1％ Pen/Strep InvitroGRO CP培养基，直至在转染后3天收集细胞时。用QuickExtractDNA提取溶液(Lucigen)提取基因组DNA。通过用Taq Pro Multiplex DNA聚合酶(Vazyme)的PCR扩增在靶向位点和排在前面的脱靶位点的编辑。PCR产物用VAHTSDNA纯化珠(Vazyme)进行纯化，并在Illumina Novaseq6000平台测序。脱靶位点编辑效率除以同一实验中靶向效率，以针对不同转染效率标准化。排在前面的脱靶位点的编辑效率除以靶向编辑效率，显示在下表16中。
表16：排在前面的脱靶位点的编辑效率除以靶向编辑效率
gRNA OT1 OT2 OT3 OT4 OT5 OT6 OT7
P9-hc-063 26.20％ 0.10％ 0.20％ 0.10％ 2.30％ 0.00％ 1.20％
P9-hc-175 13.40％ 3.90％ 0.10％ 0.00％ 0.00％ 0.10％ 0.00％
P9-hc-023 2.60％ 0.60％ 0.30％ 0.00％ N/A N/A N/A
P9-hc-082 1.60％ 0.10％ 0.10％ 0.20％ 0.10％ N/A N/A
P9-hc-010 1.10％ 0.50％ 0.20％ N/A N/A N/A N/A
P9-h-057 0.50％ 0.30％ 0.60％ 0.30％ 3.20％ 0.50％ N/A
P9-hc-212 0.30％ 0.30％ N/A N/A N/A N/A N/A
P9-hc-026 0.20％ 1.60％ 1.80％ 0.10％ N/A N/A N/A
P9-hc-223 0.20％ 0.00％ 0.00％ 0.00％ 0.00％ N/A N/A
P9-hc-028 0.10％ 0.10％ 0.20％ 0.00％ N/A N/A N/A
P9-hc-043 0.10％ 0.00％ 0.00％ N/A N/A N/A N/A
P9-hc-162 0.10％ 0.10％ 0.10％ N/A N/A N/A N/A
P9-hc-095 0.00％ 0.00％ 0.00％ N/A N/A N/A N/A
实施例11.在Huh7细胞中DNA-RNA混杂gRNA的靶向/脱靶编辑效率
将Huh7细胞以8,000个细胞/孔接种在96孔板中。使用0.4μL RNAiMax试剂(Thermofisher)以100ng的cas9 mRNA和100ng的sgRNA(有或没有脱氧核糖核苷酸替换)(General Biosystems)进行转染。转染后三天收集细胞。用QuickExtract DNA提取溶液(Lucigen)提取基因组DNA。通过用Taq Pro Multiplex DNA聚合酶(Vazyme)的PCR扩增在靶向位点和排在前面的脱靶位点的编辑。PCR产物用VAHTSDNA纯化珠(Vazyme)纯化，并在illumina Novaseq6000平台上测序。靶向位点和排在前面的脱靶位点的编辑效率列在下表17中。
表17：靶向位点和排在前面的脱靶位点的编辑效率
实施例12.在PHH细胞中DNA-RNA混杂gRNA的靶向/脱靶编辑效率
将原代人肝细胞(PHH)在含有10％ FBS和1％ Pen/Strat的InvitroGRO CP培养基中解冻，并以130,000个细胞/孔接种在胶原蛋白包被的平板48孔板中。在4-6小时后，将培养基更换为InvitroGRO CP培养基。使用0.75μL RNAiMax试剂(Thermofisher)以250ng的cas9 mRNA和250ng的sgRNA(General BioL)进行转染。转染后当天，将培养基更换为1％Pen/Strep InvitroGRO CP培养基，直至在转染后3天收集细胞时。用QuickExtract DNA提取溶液(Lucigen)提取基因组DNA。通过用Taq Pro Multiplex DNA聚合酶(Vazyme)的PCR扩增在靶向位点和排在前面的脱靶位点的编辑。PCR产物用VAHTSDNA纯化珠(Vazyme)进行纯化，并在illumina Novaseq6000平台测序。靶向位点和排在前面的脱靶位点的编辑效率列在下表18中。
表18:靶向位点和排在前面的脱靶位点的编辑效率
gRNA ON OT1 OT2 OT3 OT4 OT5
P9-hc-023 65.7％ 2.2％ 0.6％ 0.3％ 0.0％ N/A
P9-hc-023-seq5 60.0％ 0.3％ 0.3％ 0.3％ 0.0％ N/A
P9-hc-023-seq9 58.9％ 0.2％ 0.3％ 0.3％ 0.0％ N/A
P9-hc-023-seq10 36.4％ 0.1％ 0.3％ 0.3％ 0.0％ N/A
P9-hc-023-seq11 39.3％ 0.1％ 0.3％ 0.3％ 0.0％ N/A
P9-hc-028-seq1 53.4％ 0.3％ 0.1％ 0.2％ 0.0％ N/A
P9-hc-028-seq4 33.8％ 0.1％ 0.0％ 0.1％ 0.0％ N/A
P9-hc-028-seq5 50.2％ 0.3％ 0.0％ 0.1％ 0.0％ N/A
P9-hc-028-seq6 50.8％ 0.2％ 0.0％ 0.1％ 0.0％ N/A
P9-hc-082 44.1％ 1.0％ 0.1％ 0.0％ 0.2％ 0.1％
P9-hc-082-seq4 39.0％ 0.1％ 0.0％ 0.0％ 0.1％ 0.0％
P9-hc-082-seq6 22.1％ 0.0％ 0.0％ 0.0％ 0.1％ 0.0％
P9-hc-082-seq7 22.5％ 0.0％ 0.0％ 0.0％ 0.1％ 0.0％
P9-hc-162 45.6％ 0.2％ 0.1％ 0.2％ N/A N/A
P9-hc-162-seq2 45.6％ 0.2％ 0.1％ 0.2％ N/A N/A
P9-hc-162-seq3 54.4％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ N/A N/A
P9-hc-162-seq5 55.3％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ N/A N/A
P9-hc-162-seq6 54.4％ 0.0％ 0.0％ 0.1％ N/A N/A
P9-hc-212 60.8％ 1.2％ 0.2％ N/A N/A N/A
P9-hc-212-seq2 56.6％ 0.4％ 0.1％ N/A N/A N/A
P9-hc-212-seq3 53.8％ 0.3％ 0.2％ N/A N/A N/A
P9-hc-212-seq6 49.3％ 0.3％ 0.3％ N/A N/A N/A
实施例13.在Huh7和PHH细胞中不同Cas9 mRNA元件的作用
在Huh7细胞中的UTR筛选。如实施例2所述，将靶向人PCSK9的sgRNA P9-hc-162和包含不同UTR的Cas9 mRNA递送至Huh7细胞，以8-12个点的两倍剂量反应曲线进行。在处理后72小时裂解细胞，如实施例2所述用于编辑分析。然后，基于EC50值和最大编辑百分比列出UTR元件。在Huh7细胞中关于引导序列的剂量反应曲线显示在图4中。EC50值和最大编辑百分比列在下表19中。
表19：包含不同UTR的Cas9 mRNA的效率
Name EC50(nM) 最大编辑(％)
ART-UTR-16 0.797 96.83
ART-UTR-37 0.994 96.66
ART-UTR-21 0.721 95.51
ART-UTR-23 0.628 95.42
ART-UTR-26 0.576 95.68
ART-UTR-28 0.725 96.17
ART-UTR-33 1.094 95.32
使用MFE和CAI的CDS设计。考虑三个因素：高CAI、低MFE和中等GC含量，设计CDS。使用相同的UTR和核定位信号序列来计算MFE和进行细胞实验。设计的CDS的特征列在下表20中。在所设计的CDS之间的相似性百分比列在下表21中。CDS的序列在下表22中作为SEQ IDNO:954-960提供。
表20:设计的CDS的特征
MFE(kcal/mol) CAI评分 GC含量(％)
ART-CDS-K1-1 -1824 0.923 58.6
ART-CDS-K4-8 -1776 0.968 59.5
ART-CDS-S311 -1745 0.992 61.8
ART-CDS-K10-2 -1742 0.991 60.3
ART-CDS-K8-1 -1729 0.990 60.2
ART-CDS-004R -1412 0.910 52.6
ART-CDS-S204 -1169 0.865 50.4
表21:设计的CDS的相似性百分比
表22:CDS设计的序列
CDS变体在Huh7细胞中的功效。如实施例2所述，将具有种子序列NTLA-2001(AAAGGCUGCUGAUGACACCU,SEQ ID NO:973)的sgRNA和包含不同CDS的Cas9 mRNA递送至Huh7细胞，以4个点的4倍重复进行。在处理后72小时裂解细胞，如实施例2所述用于编辑分析。编辑效率列在下表23中。
表23:包含不同CDS的cas9 mRNA变体的编辑效率
所选的CDS变体在Huh7细胞中的功效。如实施例2所述，将靶向人PCSK9的gRNA P9-hc-162和包含不同CDS的Cas9 mRNA递送至Huh7细胞，以4个点的四倍剂量反应曲线或8-10点的两倍剂量反应曲线进行。在处理后72小时裂解细胞，如实施例1所述用于编辑分析。然后，基于EC50值和最大编辑百分比列出CDS元件。在Huh7细胞中关于引导序列的剂量反应曲线显示在图5中。EC50值和最大编辑效率列在下表24中。
表24:在Huh7中包含所选的CDS的cas9 mRNA变体的编辑效率
名称 EC50 最大编辑％
ART-CDS-004R 0.865 86.2
ART-CDS-K1-1 0.266 93.8
ART-CDS-K4-8 0.348 92.9
ART-CDS-K10-2 0.226 94.1
所选的CDS变体在PHH细胞中的功效。将原代人肝细胞(PHH)在含有10％ FBS和1％Pen/Strat的InvitroGRO CP培养基中解冻，并以13,000个细胞/孔的密度接种在胶原蛋白包被的平板48孔板中。4-6小时后，将培养基更换为InvitroGRO CP培养基。使用RNAiMax试剂(Thermofisher)以从每孔200ng的cas9 mRNA(Levostar)和100ng的ART-001-g091 sgRNA开始的两倍稀释进行转染。转染后当天，将培养基更换为包含10％ FBS和1％Pen/Strep的InvitroGRO CP培养基。再过两天后，收集细胞用于基因编辑效率分析，作为表达的读数，显示在下表25中。
表25:在PHH中包含所选的CDS的cas9 mRNA变体的编辑效率
总RNA ng ART-CDS-K1-1 ART-CDS-K10-2 ART-CDS-K4-8 ART-CDS-004R
37.5 31.3 39.8 37.7 34.4
75 58.1 60.0 59.1 53.6
150 71.7 71.7 74.4 70.7
300 74.7 71.3 76.8 67.0
合理设计polyA尾以使其尺寸分布更精确
在Huh7细胞中评价PolyA序列的合理设计。将Huh7细胞以8,000个细胞/孔接种在96孔板中。使用0.4μL RNAiMax试剂(Thermofisher)以100ng的cas9 mRNA和100ng的sgRNA(NTLA-2001)(Genscript)进行转染。转染后三天收集细胞。用QuickExtract DNA提取溶液(Lucigen)提取基因组DNA。通过用Taq Pro Multiplex DNA聚合酶(Vazyme)的PCR扩增在靶向位点的编辑。PCR产物用VAHTSDNA纯化珠(Vazyme)纯化，并在Illumina Novaseq6000平台上测序。在Huh7细胞中包含不同polyA尾设计的cas9mRNA变体的编辑效率显示在下表26中。不同polyA尾设计的序列在下表27中作为SEQ ID NO:963-972提供。
表26：在Huh7细胞中包含不同polyA尾设计的cas9 mRNA变体的编辑效率
表27:polyA尾设计的序列
通过质谱确定mRNA中polyA尾的长度分布
如方法部分所述，分析不同设计的mRNA的polyA尾。polyA长度的分布偏离在质粒中的预测尺寸，显示在表28中，作为总检测事件的百分比。在末端添加G或GG减小尺寸分布宽度和峰值与预测峰的偏差。
表28:mRNA中polyA的长度分布
与预测尺寸的偏差 pA-3Seg pA-3SegG pA-3SegGG
-2 1.7
-1 3.5 8.6 5.8
0 8.5 17.3 15.6
+1 14.5 23.1 24.0
+2 18.4 21.4 19.6
+3 16.9 14.8 14.7
+4 13.8 10.0 14.1
+5 10.7 7.7 4.6
+6 8.8
+7 2.5
+8 2.4
在PHH细胞中评价PolyA序列的合理设计。将原代人肝细胞(PHH)在含有10％FBS和1％Pen/Strat的InvitroGRO CP培养基中解冻，并以13,000个细胞/孔的密度接种在胶原蛋白包被的平板48孔板中。4-6小时后，将培养基更换为InvitroGRO CP培养基。使用RNAiMax试剂(Thermofisher)以250ng的cas9 mRNA和250ng的sgRNA(General Biosystem)进行转染。转染后当天，将培养基更换为补充10％FBS的1％Pen/Strep InvitroGRO CP培养基，直到转染后3天收集细胞时。在PHH细胞中包含不同polyA尾设计的Cas9 mRNA变体的编辑效率显示在下表29中。
表29：在PHH细胞中包含不同polyA尾设计的Cas9 mRNA变体的编辑效率
gRNA(ng) pA51C8A pA60C8A pA60C20A pA100 pA120 pA-3SegG pA-3SegGG
7.8 16.3 15.6 17.7 13.7 12.7 未测试 19.1
15.6 27.1 26.2 30.4 27.3 26.3 未测试 29.3
31.3 38.7 40.6 39.8 32.7 37.6 未测试 36.9
62.5 44.7 42.3 45.3 46.2 38.9 38.1 41.5
125.0 53.5 49.2 51 53.8 39.7 45.1 44
250.0 53.2 52.5 22.3 56.6 34 44.1 51.2
实施例14.在人源化PCSK9小鼠中体内评价sgRNA
改造人源化PCSK9小鼠，使得内源性鼠Pcsk9基因座的区域缺失并用直系同源的人PCSK9序列替换，从而使得该基因座编码人PCSK9蛋白。这些关于PCSK9基因人源化的小鼠用包含2:1重量比例的Cas9 mRNA(SEQ ID NO:902)和如下表30所示的sgRNA的LNP制剂给药。所述LNP包含ALC-0315、DSPC、胆固醇和PEG2k-DMG。给药水平为1mg/kg或0.3mg/kg(以总RNA含量计)，通过静脉内注射进行。给药单独的媒介物(包含7.5％蔗糖的20mM Tris缓冲液)的小鼠作为阴性对照。
表30：在人源化PCSK9小鼠中体内评价sgRNA的实验设计
肝脏编辑结果使用设计用于扩增感兴趣的区域进行NGS分析的引物确定，血清人PCSK9蛋白的敲低使用特异性人PCSK9 ELISA试剂盒按上文所述进行检测。每组的肝脏基因编辑和血清PCSK9蛋白敲低的结果显示在下表31中。PCSK9基因的编辑和后续的蛋白敲低用一系列sgRNA(包括P9-hc-162、P9-hc-212、P9-h-057、P9-hc-082和P9-hc-023)证明。使用每种sgRNA，对于肝脏基因编辑和血清PCSK9蛋白减少都观察到清楚的剂量反应。由于测序读数的数量低，一些数据没能获得。
表31：对于sgRNA筛选的肝脏PCSK9基因编辑和血清PCSK9(％KD)结果
实施例15.在人源化PCSK9小鼠中体内评估DNA/RNA混杂sgRNA设计
改造人源化PCSK9小鼠，使得内源性鼠Pcsk9基因座的区域缺失并用直系同源的人PCSK9序列替换，从而使得该基因座编码人PCSK9蛋白。这些关于PCSK9基因人源化的小鼠用2:1重量比例的Cas9 mRNA(SEQ ID NO:902)和如下表32所示的sgRNA给药。LNP包含ALC-0315、DSPC、胆固醇和PEG2k-DMG。给药水平为0.6mg/kg或0.2mg/kg(以总RNA含量计)，通过静脉内注射进行施用。作为阴性对照的对应基因型的小鼠给药单独的媒介物(包含7.5％蔗糖的20mM Tris缓冲液)。
表32：在人源化PCSK9小鼠中体内评估DNA/RNA混杂sgRNA的实验设计
血清人PCSK9蛋白的敲低用特异性人PCSK9 ELISA试剂盒按上文所述进行检测。每组的血清PCSK9蛋白减少显示在下表33中。使用一些sgRNA(包括P9-hc-162、P9-hc-162-seq5、P9-hc-162-seq6、P9-hc-023和P9-hc-023-seq9)证明了蛋白敲低的功效。
表33：对于sgRNA筛选的血清PCSK9(％KD)结果
实施例16.在人源化PCSK9小鼠中体内评价UTR设计
改造人源化PCSK9小鼠，使得内源性鼠Pcsk9基因座的区域缺失并用直系同源的人PCSK9序列替换，从而使得该基因座编码人PCSK9蛋白。这些关于PCSK9基因人源化的小鼠用2:1重量比例的包含不同UTR序列(下表34中所示的SEQ ID NO:941-953)的Cas9 mRNA和如下表35所示的sgRNA P9-hc-162(SEQ ID NO:805)给药。LNP包含ALC-0315、DSPC、胆固醇和PEG2k-DMG。给药水平为1mg/kg或0.3mg/kg(以总RNA含量计)，通过静脉内注射进行(N＝1只/组)。作为阴性对照的对应基因型的小鼠给药单独的媒介物(包含7.5％蔗糖的20mMTris缓冲液)。
表34：Cas9 mRNA的UTR序列
表35：在人源化PCSK9小鼠中体内筛选UTR的实验设计
肝脏编辑结果使用设计用于扩增感兴趣的区域进行NGS分析的引物确定，血清人PCSK9蛋白的敲低使用特异性人PCSK9 ELISA试剂盒按上文所述进行检测。每组处理后7天的肝脏基因编辑和血清PCSK9蛋白敲低的结果显示在下表36中。PCSK9序列的有效编辑和蛋白敲低用所测试的包含具有不同UTR序列(包括ART-UTR-21、ART-UTR-26、ART-UTR-28、ART-UTR-28和ART-UTR-37)的Cas9 mRNA的LNP证明。
表36：不同UTR设计的基因编辑效率和血清PCSK9蛋白减少
实施例17.在人源化PCSK9小鼠中体内评不同CDS设计
改造人源化PCSK9小鼠，使得内源性鼠Pcsk9基因座的区域缺失并用直系同源的人PCSK9序列替换，从而使得该基因座编码人PCSK9蛋白。这些关于PCSK9基因人源化的小鼠用2:1重量比例的包含一系列CDS设计(在表22中作为SEQ ID NO:954-960提供)的Cas9 mRNA和如下表37所示的sgRNA P9-hc-162(SEQ ID NO:805)给药。LNP包含ALC-0315、DSPC、胆固醇和PEG2k-DMG，摩尔比例为49.5:9.5:38.5:2.5。给药水平为0.3mg/kg或0.1mg/kg(以总RNA含量计)，通过静脉内注射进行(N＝1只/组)。作为阴性对照的对应基因型的小鼠给药单独的媒介物(包含7.5％蔗糖的20mM Tris缓冲液)。
表37：在人源化PCSK9小鼠中体内评价不同CDS设计的实验设计
肝脏编辑结果使用设计用于扩增感兴趣的区域随后进行NGS分析的引物评估。另外，血清人PCSK9蛋白的减少使用特异性人PCSK9 ELISA试剂盒按上文所述进行检测。每组处理后7天的肝脏基因编辑和血清PCSK9蛋白敲低的结果显示在下表38中。PCSK9序列的有效编辑和蛋白敲低用所有测试的CDS序列证明。
表38：不同CDS设计的基因编辑和血清PCSK9减少的功效
其他实施方案
应当理解，前述描述旨在说明而不是限制所附权利要求书的范围。其他方面、优点和修改均在所附权利要求书的范围内。

Claims (108)

1.一种向导RNA，其包含：
a.选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列；
b.选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸；或
c.与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
2.一种载体，其包含编码一个或多个向导RNA的一个或多个核酸，其中所述一个或多个向导RNA包含：
a.选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的一个或多个序列；
b.选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的一个或多个序列的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸；或
c.与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的一个或多个序列。
3.一种组合物，其包含：
(i)编码向导RNA的核酸，或包含编码向导RNA的核酸的载体，其中所述向导RNA包含：
a.选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列；
b.选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸；或
c.与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列；和
(ii)RNA引导的DNA结合剂、编码RNA引导的DNA结合剂的核酸，或包含编码RNA引导的DNA结合剂的核酸的载体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂包括Cas核酸酶或Cas切口酶。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的组合物，其中所述编码RNA引导的DNA结合剂的核酸是包含SEQ ID NO:902、903、941-953、954-960和963-972中一个或多个所示的多核苷酸序列的Cas9编码核酸。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是包含SEQID NO:901所示的氨基酸序列的Cas9。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为2类Cas核酸酶。
8.根据权利要求4或7所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为Cas9、Cpfl、C2cl、C2c2和C2c3或其修饰蛋白。
9.根据权利要求4、7或8中任一项所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶或金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9核酸酶或其修饰蛋白。
10.根据权利要求4、7、8或9中任一项所述的组合物，其中所述Cas核酸酶来自II型CRISPR/Cas系统。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的组合物，其用于编辑前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述编辑计算为被编辑的细胞群的百分比(编辑百分比)。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中约30％至99％的细胞群被编辑。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中编辑百分比为30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％的细胞群。
15.根据权利要求3-14中任一项所述的组合物，其中所述组合物降低受试者循环中的LDL水平。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述受试者循环中的LDL水平在施用所述组合物后8周测定。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述受试者循环中的LDL水平与阴性对照或施用所述组合物之前在所述受试者中测定的水平进行比较。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述受试者循环中的LDL水平相对于相应的阴性对照或施用所述组合物之前在所述受试者中测定的水平降低至少20％。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少一次。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述施用或递送以下述间隔进行：
(a)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天；或
(b)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周；或
(c)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个月；或
(d)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
21.根据权利要求3-20中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA与存在于人PCSK9基因中的靶序列至少部分互补。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述靶序列位于人PCSK9基因的外显子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述向导RNA序列与PCSK9基因正链中的靶序列互补。
24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述向导RNA序列与PCSK9负链中的靶序列互补。
25.根据权利要求21所述的组合物，其中第一引导序列与PCSK9基因正链中的第一靶序列互补，并且其中所述组合物还包含与PCSK9基因负链中的第二靶序列互补的第二引导序列。
26.根据权利要求3-25中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA包含crRNA，并且还包含tracrRNA(trRNA)或其一部分，其中所述tracrRNA(trRNA)包含SEQ ID NO:904所示的核苷酸序列，其中所述trRNA可操作地与所述crRNA连接。
27.根据权利要求3-26中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA为双向导RNA(dgRNA)。
28.根据权利要求3-27中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA为单向导RNA(sgRNA)。
29.根据权利要求3-28中任一项所述的组合物，其中向导RNA包含至少一种修饰。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键、2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸或DNA-RNA混杂物。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括在所述向导RNA的5'端的前五个核苷酸中的一个或多个处和/或在所述向导RNA的3'端的最后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
32.根据权利要求29所述的组合物，其中所述至少一种修饰包括所述向导RNA中至少50％核苷酸的修饰。
33.根据权利要求28所述的组合物，其中所述sgRNA包含与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％相同的引导序列。
34.根据权利要求28所述的组合物，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:593-888中任一项所示的核苷酸序列。
35.根据权利要求28所述的组合物，其中所述sgRNA包含与SEQ ID NO:593-888中任一项所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
36.根据权利要求3-35中任一项所述的组合物，其中所述sgRNA与脂质纳米颗粒(LNP)缔合。
37.根据权利要求3-36中任一项所述的组合物，其中所述组合物为药物制剂，并且还包含药学上可接受的载剂。
38.根据权利要求3-37中任一项所述的组合物，其中所述组合物减少或预防受试者血管组织中的动脉粥样硬化。
39.根据权利要求3-38中任一项所述的组合物，其中施用所述组合物导致PCSK9基因中一个或多个核苷酸的缺失或插入。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中一个或多个核苷酸的缺失或插入诱导PCSK9基因中的移码或无义突变。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中在约20％至约30％或更多的细胞的PCSK9基因中诱导移码或无义突变。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述细胞为肝细胞、肾细胞、肠上皮细胞或血管上皮细胞。
43.根据权利要求39所述的组合物，其中在PCSK9基因中发生的一个或多个核苷酸的缺失或插入比脱靶位点中的多至少50倍或更多。
44.根据权利要求3-43中任一项所述的组合物，其中施用所述组合物增加所述受试者的细胞中的LDLR水平。
45.根据权利要求3-44中任一项所述的组合物，其中测量所述受试者的血液中的LDL水平。
46.根据权利要求3-45中任一项所述的组合物，其中所述受试者患有高胆固醇血症和/或心血管疾病。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述受试者患有家族性高胆固醇血症。
48.根据权利要求46或47所述的组合物，其中所述受试者表现出动脉粥样硬化的症状。
49.根据权利要求3-48中任一项所述的组合物，其中所述受试者表达具有选自由以下突变组成的组的一个或多个突变的PCSK9：R46L、Y142X、R218S、F216L、D374Y、A443T或C679X。
50.根据权利要求3-49中任一项所述的组合物，其中在施用后，所述受试者表现出高胆固醇血症和/或心血管疾病的症状的改善、稳定或变化减缓。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中使用血脂检测或患者报告的结果来测量高胆固醇血症和/或心血管疾病的症状的改善、稳定或变化减缓。
52.根据权利要求3-51中任一项所述的组合物，其中所述组合物或药物制剂通过病毒载体施用。
53.根据权利要求3-52中任一项所述的组合物，其中所述组合物或药物制剂通过脂质纳米颗粒施用。
54.一种修饰人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因和/或诱导PCSK9基因内双链断裂(DSB)的方法，其包括将权利要求3-53中任一项所述的组合物施用到细胞中，其中所述组合物识别并裂解PCSK9靶序列。
55.一种降低受试者的血液LDL水平和/或治疗受试者的高胆固醇血症和/或心血管疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求3-53中任一项所述的组合物，其中所述组合物识别并裂解PCSK9靶序列，从而降低所述受试者的血液LDL水平和/或治疗所述受试者的高胆固醇血症和/或心血管疾病。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其用于编辑PCSK9基因的用途。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的DNA结合剂包括Cas核酸酶或Cas切口酶。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的方法，其中编码所述RNA引导的DNA结合剂的核酸是包含SEQ ID NO:902、903、941-953、954-960和963-972中一个或多个所示的核酸序列的Cas9编码核酸。
59.根据权利要求54-58中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的DNA结合剂是包含SEQ ID NO:901所示的氨基酸序列的Cas9。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述Cas核酸酶为2类Cas核酸酶。
61.根据权利要求57或60所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9、Cpfl、C2cl、C2c2和C2c3或其修饰蛋白。
62.根据权利要求57、60或61所述的方法，其中所述Cas核酸酶为酿脓链球菌Cas9核酸酶或金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶或其修饰蛋白。
63.根据权利要求57、60、61或62所述的方法，其中所述Cas核酸酶来自II型CRISPR/Cas系统。
64.根据权利要求54-63中任一项所述的方法，其用于编辑前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因的用途。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述编辑计算为被编辑的细胞群的百分比(编辑百分比)。
66.根据权利要求65所述的方法，其中约30％至99％的细胞群被编辑。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述编辑百分比为30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％的细胞群。
68.根据权利要求54-67中任一项所述的方法，其中所述组合物降低至少一种组织或器官的细胞中的PCSK9丰度并且增加至少一种组织或器官的细胞中的LDLR丰度。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述至少一种组织或器官选自肝、肾、肠上皮或血管上皮。
70.根据权利要求54-69中任一项所述的方法，其中所述组合物降低至少一种组织或器官的细胞中的LDLR丰度并且增加至少一种组织或器官的细胞中的LDLR丰度，并且降低血液中的LDL水平。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述血液中的LDL水平在所述组合物施用后8周测定。
72.根据权利要求71所述的方法，其中将所述血液中的LDL水平与阴性对照或施用所述组合物之前在所述受试者中测定的水平进行比较。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述血液中的LDL水平相对于相应的阴性对照或施用所述组合物之前在所述受试者中测定的水平减少至少20％。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述组合物施用或递送至少一次。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述施用或递送以下述间隔进行：
(a)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天；或
(b)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周；或
(c)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个月；或
(d)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
76.根据权利要求54-75中任一项所述的方法，其中所述向导RNA与存在于人PCSK9基因中的靶序列至少部分互补。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述靶序列位于人PCSK9基因的外显子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述向导RNA序列与PCSK9基因正链中的靶序列互补。
79.根据权利要求76所述的方法，其中所述向导RNA序列与PCSK9负链中的靶序列互补。
80.根据权利要求76所述的方法，其中第一引导序列与PCSK9基因正链中的第一靶序列互补，并且其中所述组合物还包含与PCSK9基因负链中的第二靶序列互补的第二引导序列，反之亦然。
81.根据权利要求54-80中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含crRNA，并且还包含tracrRNA(trRNA)或其一部分，其中所述tracrRNA(trRNA)包含SEQ ID NO:904所示的核苷酸序列，其中所述trRNA可操作地与所述crRNA连接。
82.根据权利要求54-80中任一项所述的方法，其中所述向导RNA为双向导RNA(dgRNA)。
83.根据权利要求54-81中任一项所述的方法，其中所述向导RNA为单向导(sgRNA)。
84.根据权利要求54-83中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含至少一种修饰。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述至少一种修饰包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键或2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述至少一种修饰包括在所述向导RNA的5'端的前五个核苷酸中的一个或多个处和/或在所述向导RNA的3'端的最后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述至少一种修饰包括所述向导RNA中至少50％核苷酸的修饰。
88.根据权利要求83所述的方法，其中所述sgRNA包含与选自SEQ ID NO:915、933、934、1-296、908-914、916-932和935-940的序列至少90％相同的引导序列。
89.根据权利要求83所述的方法，其中所述sgRNA包含选自SEQ ID NO:593-888中任一个所示的核苷酸序列。
90.根据权利要求83所述的方法，其中所述sgRNA包含与SEQ ID NO:593-888中任一个所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
91.根据权利要求54-90中任一项所述的方法，其中所述向导RNA与脂质纳米颗粒(LNP)缔合。
92.根据权利要求54-91中任一项所述的方法，其中所述组合物为药物制剂，并且还包含药学上可接受的载剂。
93.根据权利要求54-92中任一项所述的方法，其中施用所述组合物导致PCSK9基因中一个或多个核苷酸的缺失或插入。
94.根据权利要求93所述的方法，其中一个或多个核苷酸的缺失或插入诱导PCSK9基因中的移码或无义突变。
95.根据权利要求94所述的方法，其中在约20％至约30％或更多的细胞的PCSK9基因中诱导移码或无义突变。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述细胞为肝细胞、肾细胞、肠上皮细胞或血管上皮细胞。
97.根据权利要求93所述的方法，其中在PCSK9基因中发生的一个或多个核苷酸的缺失或插入比脱靶位点中的多至少50倍或更多。
98.根据权利要求54-97中任一项所述的方法，其中施用所述组合物增加所述受试者的细胞中的LDLR水平。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述受试者的细胞中的LDLR水平增加至少10％。
100.根据权利要求99所述的方法，其中测量所述受试者的血液中的LDL水平。
101.根据权利要求54-100中任一项所述的方法，其中所述受试者患有高胆固醇血症和/或心血管疾病。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述受试者患有家族性高胆固醇血症。
103.根据权利要求101或102所述的方法，其中所述受试者表现出动脉粥样硬化的症状。
104.根据权利要求54-103中任一项所述的方法，其中所述受试者表达具有选自由以下突变组成的组的一个或多个突变的PCSK9：R46L、Y142X、R218S、F216L、D374Y、A443T和C679X。
105.根据权利要求104所述的方法，其中在施用后，所述受试者表现出高胆固醇血症和/或心血管疾病的症状的改善、稳定或变化减缓。
106.根据权利要求105所述的方法，其中使用血脂检测或患者报告的结果来测量高胆固醇血症和/或心血管疾病的症状的改善、稳定或变化减缓。
107.根据权利要求54-106中任一项所述的方法，其中所述组合物或药物制剂经由病毒载体或经由脂质纳米颗粒施用。
108.根据权利要求54-107中任一项所述的组合物在制备用于治疗患有高胆固醇血症和/或心血管疾病的人类受试者的药物中的用途。
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