CN119930576A

CN119930576A - 具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物、组合物及其应用

Info

Publication number: CN119930576A
Application number: CN202411546840.8A
Authority: CN
Inventors: 刘栋
Original assignee: Hangzhou Tianjijishi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Tianjijishi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-11-01
Filing date: 2024-10-31
Publication date: 2025-05-06
Also published as: WO2025092886A1

Abstract

本申请公开了一种具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物、组合物及其应用。本申请中，提供了一类具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物，经验证对皮肤的刺激性极低，具有优异的渗透能力和较高的稳定性，不仅能够显著清除活性氧、降低氧化应激，还能缓解皮肤炎症，具有很好的保护和修复皮肤细胞的能力，可作为化妆品新原料使用。

Description

具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物、组合物及其应用

交叉引用声明

本专利申请要求于2023年11月01日提交的、申请号为2023114494701、发明名称为“具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物、组合物及其应用”的中国专利申请的优先权，上述申请的全文以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别涉及具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物、组合物及其应用。

背景技术

保护及修复受损肌肤，通常是护肤品或化妆品需要具备的一个重要功能。造成皮肤受损的因素包括素水平、过度暴晒、雾霾以及饮食不当等。皮肤发生炎症和受损，容易导致肤质粗糙、色沉、胶原蛋白减少以及皮肤抗氧化能力下降，长期容易加速皮肤衰老。有研究表明，淬灭ROS、清除有害氧自由基能够缓解皮肤炎症并修复受损皮肤。现有的化妆品中，维生素C、维生素E、烟酰胺和熊果苷等传统抗氧化剂虽具有一定ROS清除能力，但仍存在严重的刺激性、稳定性弱以及皮肤渗透性差等问题。

因此，开发高渗透性的、刺激性弱的、能够淬灭ROS、清除有害氧自由基和缓解皮肤炎症的化妆品新原料具有重要价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物。

本发明的另一目的在于提供一种组合物。

本发明的另一目的在于提供一种缓解皮肤炎症的方法。

本发明的另一目的在于提供一种使皮肤细胞中活性氧减少的方法。

本发明的另一目的在于提供上述化合物或组合物的用途。

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种具有如下通式I所示的结构的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，

其中，X为氧或无；

R¹和R²各自独立地为氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、-N-C(O)R^1-1、-NR^aR^b、-CH₂C(O)OR^1-2、苯基、-OC(O)R^1-3、-OCH₂OC(O)R^1-4、卤素、氰基、硝基、-C(O)R^1-5或-C(O)OR^1-6；

R^1-1、R^1-2、R^1-3、R^1-4、R^1-5和R^1-6各自独立地为氢、C_1-6烷基、卤素取代的C_1-6烷基或-NR^aR^b；

R^a和R^b独立地为氢、C_1-6烷基或卤素取代的C_1-6烷基。

在一些优选的方案中，X为氧。

在一些优选的方案中，R¹和R²各自独立地为氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、-N-C(O)R^1-1、-NR^aR^b、-CH₂C(O)OR^1-2、苯基、-OC(O)R^1-3或-OCH₂OC(O)R^1-4。

在一些优选的方案中，R¹和R²各自独立地为羟基、C_1-6烷氧基、

在一些优选的方案中，所述C_1-6烷基为C_1-4烷基；更优选地，所述C_1-4烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。

在一些优选的方案中，所述C_1-6烷氧基为C_1-4烷氧基；更优选地，C_1-4烷氧基为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。

在一些优选的方案中，所述卤素为氟、氯、溴或碘。

在一些优选的方案中，所述卤素取代的C_1-6烷基为卤素取代的C_1-4烷基；更优选为卤素取代的甲基、卤素取代的乙基、卤素取代的正丙基、卤素取代的异丙基、卤素取代的正丁基、卤素取代的异丁基或卤素取代的叔丁基。

在一些优选的方案中，R¹为羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、更优选地，R¹为羟基、甲氧基、

在一些优选的方案中，R²为羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、更优选地，R²为羟基、甲氧基、

在一些优选的方案中，R^1-3为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或更优选地，R^1-3为异丙基、叔丁基或

在一些优选的方案中，R^1-4为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或更优选地，R^1-4为叔丁基。

在一些优选的方案中，所述化合物选自以下任一种：

在一些优选的方案中，所述化合物不为

本发明的第二方面，提供了一种组合物，所述组合物包括本发明第一方面所述的化合物其盐、立体异构体或溶剂化物；以及化妆品可接受的辅料。

本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述的化合物其盐、立体异构体或溶剂化物、或本发明第二方面所述的组合物在制备化妆品中的用途。

本发明的第四方面，提供了一种缓解皮肤炎症的方法，所述方法包括步骤：向受试对象施用本发明第一方面所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物；或者，向受试对象施用本发明第二方面所述的组合物。

本发明的第五方面，提供了一种使皮肤细胞中活性氧减少的方法，所述方法包括步骤：向受试对象施用本发明第一方面所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物；或者，向受试对象施用本发明第二方面所述的组合物。

本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

本发明提供了一类具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物，经验证对皮肤的刺激性极低，具有优异的渗透能力和较高的稳定性，不仅能够显著清除活性氧、降低氧化应激，还能缓解皮肤炎症，具有很好的保护和修复皮肤细胞的能力，可作为化妆品新原料使用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。

图1是根据本发明实施例中每组选取一只代表性的斑马鱼的行为轨迹图；

图2是根据本发明实施例中每组斑马鱼20min内的运动总距离统计图；

图3是根据本发明实施例中每组斑马鱼20min内的运动平均速度统计图；

图4是根据本发明实施例中每组斑马鱼神经丘处炎症细胞染色代表性图；

图5是根据本发明实施例中每组斑马鱼神经丘处炎症细胞数量统计图；

图6是根据本发明实施例中I-8对斑马鱼伤口修复的影响；

图7是根据本发明实施例中各组斑马鱼尾鳍面积统计；

图8是根据本发明实施例中I-8对斑马鱼伤口处炎症细胞数量的影响图；

图9是根据本发明实施例中各组伤口处炎症细胞数量统计图。

图10是根据本发明实施例中斑马鱼体内ROS含量，其中白线区域为斑马鱼卵黄囊(ROS定量区域)，括号中的数值为I-8浓度，单位μg/mL；

图11是根据本发明实施例中斑马鱼体内ROS含量统计；

图12是根据本发明实施例中斑马鱼体内β-半乳糖苷酶活性图片，β-半乳糖苷酶染色后组织呈现蓝绿色，比较背鳍上箭头指向的组织，箭头数量越多，代表蓝绿色越深，β-半乳糖苷酶活性越高；

图13是根据本发明实施例中斑马鱼体内β-半乳糖苷酶活性统计；

图14是根据本发明实施例中斑马鱼体内抗氧化抗衰老相关基因表达的统计；

图15是根据本发明实施例中化合物I-8能够下调HaCaT的TNF-α；

图16是根据本发明实施例中化合物I-8能够下调HaCaT的IL-8；

图17是根据本发明实施例中化合物I-8能够下调HaCaT的IL-1β；

图18是根据本发明实施例中化合物I-8能够下调HaCaT的EP2；

图19是根据本发明实施例中化合物I-8能够下调HaCaT的TRPV1；

图20是根据本发明实施例中化合物I-8清除ROS；

图21是根据本发明实施例中化合物I-8提高I型胶原蛋白的分泌；

图22是根据本发明实施例中化合物I-8上调COL3A1基因表达；

图23是根据本发明实施例中化合物I-8上调COL4A1基因表达；

图24是根据本发明实施例中化合物I-8上调COL7A1基因表达；

图25是根据本发明实施例中化合物I-8上调LAMA5基因表达。

具体实施方式

由于传统的化妆品用抗氧化剂稳定性差，对施用条件要求苛刻，例如白天见光分解，仅能夜间施用；皮肤渗透性差，经常需要高浓度大量施用才能见效，部分个体常常没有效果；此外这些抗氧化剂还具有强刺激性，部分脆弱皮肤需要严格控制用量，否则容易引发严重的过敏和炎症反应。本发明人经过广泛而深入的研究，开发了一类具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子多酚化合物，这些化合物刺激性低、渗透性好、稳定性高，并且能够显著淬灭活性氧物种(ROS)、清除有害氧自由基、消除氧化应激、缓解皮肤炎症并舒缓和修复受损皮肤细胞。此类化合物及其盐、立体异构体或溶剂化物可作为化妆品新原料，有代替现有的抗氧化剂的潜力。

化合物

本发明涉及一类具有磺酸或亚磺酸内酯结构的小分子化合物，其结构如下通式I所示：

上述通式I中，X为氧或无。基于进一步提升化合物稳定性和渗透能力的有益效果，X为氧。

R¹和R²

R¹的数量为0-4个，例如0、1、2、3或4个。作为R¹，可以为氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、-N-C(O)R^1-1、-NR^aR^b、-CH₂C(O)OR^1-2、苯基、-OC(O)R^1-3、-OCH₂OC(O)R^1-4、卤素、氰基、硝基、-C(O)R^1-5或-COO R^1-6；并且，R^1-1、R^1-2、R^1-3、R^1-4、R^1-5和R^1-6各自独立地为氢、C_1-6烷基、卤素取代的C_1-6烷基或-NR^aR^b；R^a和R^b独立地为氢、C_1-6烷基或卤素取代的C_1-6烷基。在优选的实施方式中，R¹为氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、-N-C(O)R^1-1、-NR^aR^b、-CH₂C(O)OR^1-2、苯基、-OC(O)R^1-3或-OCH₂OC(O)R^1-4。

同样地，R²的数量为0-4个，例如0、1、2、3或4个。作为R²，可以为氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、-N-C(O)R^1-1、-NR^aR^b、-CH₂C(O)OR^1-2、苯基、-OC(O)R^1-3、-OCH₂OC(O)R^1-4、卤素、氰基、硝基、-C(O)R^1-5或-COO R^1-6；并且，R^1-1、R^1-2、R^1-3、R^1-4、R^1-5和R^1-6各自独立地为氢、C_1-6烷基、卤素取代的C_1-6烷基或-NR^aR^b；R^a和R^b独立地为氢、C_1-6烷基或卤素取代的C_1-6烷基。在优选的实施方式中，R²为氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、-N-C(O)R^1-1、-NR^aR^b、-CH₂C(O)OR^1-2、苯基、-OC(O)R^1-3或-OCH₂OC(O)R^1-4。

在本发明更优选的实施方式中，上述的R^1-3为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或更优选地，R^1-3为异丙基、叔丁基或R^1-4为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或更优选地，R^1-4为叔丁基。

R¹和R²的数量可以相等或不等，在优选的实施方式中，R¹和R²的数量相等。

R¹和R²的取代位置不作限定，但在优选的实施方式中，R¹和R²的位置分别为联苯环4以及4’位(如本发明特定的实施方式中I-8所示)。如发明中所使用的，联苯环的位置编号规则为：并且磺酸或亚磺酸内酯结构中O原子与2’上的碳共价相连，S原子与2上的碳共价相连，氧原子和硫原子彼此共价键合形成内酯结构。

基于促进化合物清楚活性氧和缓解验证的优异效果，在更优选的实施方式中，R¹和R²中至少一个具有向母环供给电子的能力，优选地均具有向目标供给电子的能力。例如R¹和R²各自独立地为羟基、C_1-6烷氧基、所示的供电子基。更优选地，R¹和R²为羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、在本发明特定的实施方式中，R¹为羟基、甲氧基、在本发明特定的实施方式中，R²为羟基、甲氧基、

在本发明特定的几个实施方式中，化合物的具体结构如下表所示，其中化合物I-1～I-12以及I-17和I-18相比I-13～I-16来说具有更优的渗透能力。

表

组合物

本发明还涉及含有本发明的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物的组合物。本发明组合物可以是化妆品组合物或外用制剂。

如本发明中所使用的，术语“化妆品”指的是以涂抹、喷洒或其他类似的方法，施用于人体表面(如表皮、毛发、口唇等)起到清洁、保养、美化、或消除不良气味的产品，该产品对施用部位有缓和作用。

作为化妆品组合物时，本发明的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物的组合物在化妆品组合物中作为化妆品有益剂，此外组合物中还包括用以稀释、分散化妆品有益剂或作为其载体使用，以便在将组合物施用到皮肤上时促进其分布的化妆品上可接受的媒介。

这些媒介可以是水性、无水或乳液，油性载体在水和乳化剂存在下会形成作为载体的乳液体系。优选地，组合物是水性的或乳液，尤其是油包水或水包油乳液，优选水包油乳液。化妆品组合物通常为但不限于液体剂、霜剂或乳剂的形式。在优选的实施方式中，以水作为载体形成化妆品组合物。在优选的实施方式中，化妆品组合物还包括除水外的载体，例如油、脂、蜡类油质基质(例如椰子油、棕榈油、橄榄油、蓖麻油、水貂油、蛇油、硅油及其衍生物、牛脂、羊毛脂及其衍生物、巴西棕榈蜡、鲸蜡、蜂蜡、液体石蜡、凡士林、微晶石蜡、角鲨烷、脂肪酸、脂肪醇和酯等)，粉质基质(例如滑石粉、高岭土、锌白粉、钛白粉、膨润土、硬脂酸镁、硬脂酸锌、碳酸钙、碳酸镁、磷酸氢钙等)，和溶剂基质(例如醇类、小分子酮类、醚类、小分子酯类)。

在本发明的化妆品组合物中，还可添加化妆品可接受的辅料。术语“化妆品可接受的辅料”指的是对化妆品的成形、稳定或赋予色、香以及其它特性起作用的物质。例如防腐剂(如苯甲酸及其衍生物、三氯叔丁醇、氯二甲酚、水杨酸及其衍生物、山梨酸及其衍生物、咪唑烷基脲、苯基乙醇等)、抗氧化剂(如丁基羟基茴香醚、叔丁基羟基茴香醚、维生素E、没食子酸丙酯等)、保湿剂(如甘油、丙二醇、山梨醇、聚乙二醇、乳酸、乳酸钠、吡咯烷酮羧酸钠、透明质酸、水解胶原蛋白、甲壳质及其衍生物、葡萄糖酯)、防晒剂(钛白粉、氧化锌、氨基苯甲酸酯及其衍生物、水杨酸及其衍生物、二苯甲酮等)、表面活性剂(卵磷脂、皂角苷、烷基苷等)、抗氧化剂、着色剂(如有机合成颜料偶氮系、蒽醌系等，或无机颜料如氧化锌、二氧化钛、三氧化二铁、氢氧化亚铁、三氧化二铬、四氧化三铁等，或天然色素辣椒红、高粱红、花色素苷等)、香精(天然或调和香料，如龙涎香、海狸香、麝香、灵猫香、玫瑰油、薄荷油、留兰香油、薰衣草油、茴香油等)、水溶性高分子、螯合剂(如乙二胺四乙酸二钠及其衍生物)和薄膜剂(如聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸酯乳液、透明质酸、聚甘油-2异硬脂酸酯等)等。

本发明的化妆品组合物中，各原料和辅料添加量不作限制。

化合物或组合物的用途

本发明还涉及上述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，或含有上述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物的组合物的用途，用于：(i)制备化妆品；(ii)缓解皮肤炎症；(iii)使皮肤细胞中活性氧减少；和/或(iv)修复受损皮肤。

如本文所用，术语“皮肤”包括面部、颈部、胸部、背部、手臂、腋窝、臂部、手、腿和头皮上的皮肤。如本文所用，化妆品有益剂是指包括这样的组分，该组分(a)在局部施用后改善面部或身体特征如皮肤特征，(b)有益于面部或身体特征如皮肤特征，或者(c)：(a)和(b)二者。优选的实施方式中，化合物或化妆品组合物用于局部应用。

缓解皮肤炎症和/或使皮肤细胞中活性氧减少和/或修复受损皮肤的方法

本发明还涉及(a)缓解皮肤炎症和/或(b)使皮肤细胞中活性氧减少和/或(c)修复受损皮肤的方法，包括步骤，向受试对象施用上述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物；或者，向受试对象施用上述的组合物。施用方式为非肠道施用；优选外用，例如涂抹、外敷，局部适量涂于皮肤、粘膜等。

术语

如本发明中所使用的，术语“烷基”指线性或带支链的饱和单价烃基，其中该烷基可任选地被一个或多个取代基取代。在特定的实施方式中，烷基是具有1至20(C_1-20)、1至15(C_1-15)、1至12(C_1-12)、1至10(C_1-10)或1至6(C_1-6)个碳原子的线性饱和单价烃基，或者具有3至20(C_3-20)、3至15(C_3-15)、3至12(C_3-12)、3至10(C_3-10)或3至6(C_3-6)个碳原子的带支链饱和单价烃基。此处所用的线性C_1-6和带支链C_3-6烷基基团也称为“低级烷基”。烷基基团的范例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基(包括所有同分异构形式)、正丙基、异丙基、丁基(包括所有同分异构形式)、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基(包括所有同分异构形式)以及己基(包括所有同分异构形式)。例如，C_1-6烷基指具有1至6个碳原子的线性饱和单价烃基或者具有3至6个碳原子的带支链饱和单价烃基。在一个实施方式中，该烷基是本文别处描述的任选地取代的烷基。在一些实施方式中，C_1-6烷基为C_1-4烷基，C_1-4烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在另一些实施方式中，C_1-6烷基中任一个或几个氢被卤素取代。在另一些实施方式中，卤素取代的C_1-6烷基为卤素取代的C_1-4烷基。在另一些实施方式中，卤素取代的C_1-4烷基为卤素取代的甲基、卤素取代的乙基、卤素取代的正丙基、卤素取代的异丙基、卤素取代的正丁基、卤素取代的异丁基或卤素取代的叔丁基。

如本发明中所使用的，术语“烷氧基”指稳定的直链或支链，或者环状的烃基，或其组合，其由所示数量的碳原子和一个或多个(在一个实施方式中为一至三个)O原子组成。烷氧基的范例包括，但不限于-O-CH₃、-O-CH₂-CH₃、-O-CH₂-CH₂-CH₃、-O-CH-(CH₃)₂和-O-CH₂-CH₂-O-CH₃。在一个实施方式中，该烷氧基是本文别处描述的任选地取代的烷氧基。在一些实施方式中，该烷氧基为C_1-6烷氧基。在一些实施方式中该烷氧基为C_1-4烷氧基。在一些实施方式中，该烷氧基为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。在另一些实施方式中，C_1-6烷氧基中任一个或几个氢被卤素取代。在另一些实施方式中，卤素取代的C_1-6烷氧基为卤素取代的甲氧基、卤素取代的乙氧基、卤素取代的正丙氧基、卤素取代的异丙氧基、卤素取代的正丁氧基、卤素取代的异丁氧基或卤素取代的叔丁氧基。

如本发明中所使用的，术语“卤素”为氟、氯、溴或碘。

如本发明中所使用的，“(O)”为＝O结构，如-NH-C(O)-为酰胺基，-OC(O)-为酰氧基、-C(O)-为羰基。

如本文中所使用的，术语“氢”包括质子(1H)、氘(2H)、氚(3H)和/或其混合物。在此处所述的化合物中，一个或多个被氢占据的位置可被氘和/或氚富集。该种同位素富集类似物可通过由商业来源获得的合适的同位素标记起始原料制备得到或者由已知的文献步骤制备得到。

如本文中所使用的，术语“羟基”指-OH。

如本文中所使用的，术语“氨基”指-NH₂。

如本文中所使用的，术语“氰基”指-CN。

如本文中所使用的，术语“硝基”指-NO₂。

术语“取代”指的是具有替代该分子上的氢或一种或多种非氢原子的取代基的部分。

如本文所用，术语“溶剂合物”指溶剂与本发明所提供化合物或其盐相互作用形成的化合物。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。

通用合成步骤一

通用合成步骤二

通用合成步骤三

通用合成步骤四

实施例1：化合物I-8的合成与表征

中间体2的合成将2-碘-5-甲氧基苯酚(0.73g，2.92mmol，1.2eq)、DMAP(0.03g，0.24mmol，0.1eq)溶到DCM(5.00mL)和吡啶(10.00mL)中，降至0℃搅拌均匀，再将化合物1(0.50g，2.43mmol，1eq)溶于DCM(5.00mL)中，然后将该溶液缓慢滴加至反应体系中，控温在0℃，滴加完毕后让体系自然升温至室温，反应过夜。LC-MS显示原料反应完全，停止搅拌，加水和DCM萃取，分出有机相，浓缩，硅胶柱纯化(PE：EA＝10：1)，得中间体2(0.96g，2.23mmol，94.61％yield，93.42％purity)为黄色油状。LC-MS：[M+1]⁺＝421。

中间体3(即I-17)的合成将化合物2(0.2g，0.48mmol，1eq)，Pd(Pivate)₂(0.015g，0.048mmol，0.1eq)，TBAB(0.18g，0.57mmol，1.2eq)，乙酸钾(0.14g，1.43mmol，3eq)溶到DMAc(2.00mL)中，氮气充分置换，升至60℃，氮气保护下搅拌反应过夜，LC-MS监测反应结束，过滤，EA萃取，浓缩，硅胶柱纯化(PE：EA＝1：1)，得中间体3(0.12g，0.42mmol，88.49％yield，93.32％purity)为白色固体。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.76(d,J＝2.8Hz,1H),7.74(d,J＝2.7Hz,1H),7.43(d,J＝2.7Hz,1H),7.28–7.23(m,1H),6.93(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.84(d,J＝2.6Hz,1H),3.91(s,3H),3.87(s,3H).LC-MS：[M+1]⁺＝293。

化合物I-8的合成将化合物3(1.00g，3.42mmol，1eq)溶到DCM(20.00mL)中，降至0℃，氮气保护下缓慢滴加BBr₃(1.0M in DCM，13.68mmol，13.68mL，4eq)，控温在0℃，滴加完毕后让体系自然升温至室温，反应过夜，LC-MS监测反应结束，冰水淬灭，EA和DCM萃取，浓缩，硅胶柱纯化(PE：EA＝1：1)，得化合物I-8(0.25g，0.95mmol，27.78％yield，100％purity)为淡黄色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.92(d,J＝8.8Hz,1H),7.27–7.22(m,2H),6.87(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),6.78(d,J＝2.4Hz,1H).LC-MS：[M-1]^-＝263。

实施例2：化合物I-11的合成与表征

在实施例1中，从化合物2合成化合物3的反应中还生成了化合物3’。化合物3’经同样的脱甲基步骤可得化合物I-11。LC-MS：[M-1]^-＝263。

实施例3：化合物I-13的合成与表征

将化合物I-8(130mg，0.49mmol)，DMAP(6mg，0.05mmol)和DIEA(254mg,1.97mmoL)溶到THF(5mL)中，降温至0℃，然后将二甲氨基甲酰氯(212mg，1.97mmoL)缓慢滴加至反应体系中，控温在0℃，加料完毕后让体系自然升温至室温，反应过夜，浓缩，硅胶柱纯化(DCM：EA＝100：5)，得I-13(90mg，yield 45.01％)为白色固体。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.33(d,J＝8.8Hz,1H),8.30(d,J＝8.8Hz,1H),7.92(d,J＝2.4Hz,1H),7.74(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),7.45(d,J＝2.3Hz,1H),7.34(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),3.08(d,J＝6.2Hz,6H),2.94(d,J＝2.8Hz,6H).LCMS:m/z＝407.1(M+H⁺,ESI).

实施例4：化合物I-14和I-15的合成与表征

采用实施例3中的合成方法，同样以I-8为原料，将二甲氨基甲酰氯替换为异丁酰氯或特戊酰氯，可得I-14和I-15，均为白色固体。I-14:LCMS:m/z＝405(M+H⁺,ESI).I-15：¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.24(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(dd,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.83(t,J＝8.0Hz,1H),7.75(dd,J＝8.3,1.3Hz,1H),7.54(d,J＝2.4Hz,1H),7.38(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),1.35(s,9H),1.32(s,9H).LCMS:m/z＝433(M+H⁺,ESI).

实施例5：化合物I-1的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-1：LCMS:m/z＝247(M-H⁺,ESI).

实施例6：化合物I-2的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-2：LCMS:m/z＝295(M-H⁺,ESI).

实施例7：化合物I-3的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-3：LCMS:m/z＝247(M-H⁺,ESI).

实施例8：化合物I-4的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-1：LCMS:m/z＝311(M-H⁺,ESI).

实施例9：化合物I-5的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-5：LCMS:m/z＝279(M-H⁺,ESI).

实施例10：化合物I-6的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-6：LCMS:m/z＝295(M-H⁺,ESI).

实施例11：化合物I-7的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-7：LCMS:m/z＝295(M-H⁺,ESI).

实施例12：化合物I-9的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-9：LCMS:m/z＝263(M-H⁺,ESI).

实施例13：化合物I-10的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-10：LCMS:m/z＝279(M-H⁺,ESI).

实施例14：化合物I-12的合成与表征

根据通用合成步骤一和二，采用实施例1中的合成方法，以化合物为原料，制备得化合物I-12：LCMS:m/z＝247(M-H⁺,ESI).

实施例15：化合物I-16的合成与表征

根据通用合成步骤四，以化合物I-3和为原料，制备得化合物I-16：LCMS:m/z＝493(M+H⁺,ESI).

实施例16：化合物I-18的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得中间体4：

中间体4经氢化脱除苄基保护，制备得化合物I-18：LCMS:m/z＝293(M-H⁺,ESI).

实施例17：化合物I-19的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得化合物I-19：¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.95(s,1H),10.67(s,1H),8.58(d,J＝8.9Hz,1H),7.32–7.29(m,1H),7.28–7.26(m,1H),7.26–7.23(m,1H),6.98(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),6.90(dd,J＝8.1,1.2Hz,1H).LCMS:m/z＝263(M-H⁺,ESI).

实施例18：化合物I-20的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得化合物I-20：¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.77(s,1H),10.46(s,1H),10.22(s,1H),8.45–8.43(d,1H),7.25-7.24(d,1H),7.21–7.18(dd,1H),6.45–6.44(d,1H),6.28-6.27(d,1H).LCMS:m/z＝279(M-H⁺,ESI).

实施例19：化合物I-21的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得中间体5：

中间体5经氢化脱除苄基保护，制备得化合物I-21：¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.48(s,1H),8.07(d,J＝8.7Hz,1H),7.99(d,J＝8.7Hz,1H),7.48–7.41(m,2H),6.89(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.81(d,J＝2.4Hz,1H),3.90(s,3H).LCMS:m/z＝277(M-H⁺,ESI).

实施例20：化合物I-22的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得中间体6：

中间体6经氢化脱除苄基保护，制备得化合物I-22：¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.04(s,1H),8.67(d,J＝9.0Hz,1H),7.49(d,J＝2.8Hz,1H),7.44(dd,J＝9.1,2.9Hz,1H),7.30(t,J＝8.2Hz,1H),7.01(dd,J＝8.3,1.2Hz,1H),6.92(dd,J＝8.1,1.1Hz,1H),3.91(s,3H).LCMS:m/z＝277(M-H⁺,ESI).

实施例21：化合物I-23的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得化合物I-23：LCMS:m/z＝277(M-H⁺,ESI).

实施例22：化合物I-24的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得化合物I-24：LCMS:m/z＝281(M-H⁺,ESI).

实施例23：化合物I-25的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得化合物I-25：LCMS:m/z＝297(M-H⁺,ESI).

实施例24：化合物I-26的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得化合物I-26：LCMS:m/z＝277(M-H⁺,ESI).

实施例25：化合物I-27的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得化合物I-27：LCMS:m/z＝281(M-H⁺,ESI).

实施例26：化合物I-28的合成与表征

根据通用合成步骤一，以化合物为原料，制备得化合物I-28：LCMS:m/z＝297(M-H⁺,ESI).

测试例1：斑马鱼模型评价化合物舒缓刺痛和舒缓抗炎的功效

实验动物：发育3dpf(days post fertilization，受精后天数)的健康野生AB系斑马鱼

舒缓刺痛的功效评价：取健康AB系斑马鱼，将其随机分成：空白对照、造模、阳性对照与样品组。空白对照组斑马鱼使用胚胎培养水处理；造模组斑马鱼使用造模药(100μMSDS，十二烷基硫酸钠)处理；阳性对照斑马鱼同时使用造模药与阳性药物(200μM积雪草苷溶液)处理；样品组斑马鱼同时使用造模药与不同浓度待测样品(高、中、低浓度)处理。连续作用一定时间后，利用行为分析仪记录斑马鱼行为轨迹，统计分析其运动总距离与速度的变化，结果呈现在图2～4中。SDS使斑马鱼刺痛，促使其运动剧烈，因此与空白对照组相比，造模组运动总距离与平均速度均显著增加。图2的行为轨迹图中，黑色线条是斑马鱼在孔内的行为轨迹，越多越乱，说明斑马鱼运动越剧烈。

舒缓抗炎的功效评价：同上描述，造模药为40μM硫酸铜，阳性药为200μM积雪草苷，I-8浓度为66.6、22.2、7.4μg/mL，如上所述处理斑马鱼后，对其体内炎症细胞进行染色，计数神经丘处炎症细胞数量，并作统计学分析，结果呈现在图5～6中。

结论：当I-8的作用浓度为22.2、66.6和200μg/mL时，它具有一定的舒缓刺痛功效。当I-8的作用浓度为7.4、22.2和66.6μg/mL时，它具有一定的舒缓炎症功效。

测试例2：利用Franz扩散池评价化合物渗透入皮肤的能力

实验材料：一月龄巴马香猪背部皮肤，厚度0.8～1.0mm；0.1mg/mL待测化合物溶液，溶剂50mM Sodium Phosphate Buffer(PB)缓冲溶液，含20％乙醇。

实验过程：

1.吸取400uL待测化合物溶液，加入到供给池，三重复

2.将约7600uL 50mM PB缓冲溶液加入到相应的接收池中

3.待测化合物在32℃下渗透2h和6h

4.在2h和6h时间点，用含20％乙醇的50mM PB缓冲溶液清洗皮肤，取下渗透部位的皮肤并匀浆，加入含内标的乙腈溶液

5.离心，取上清液100uL加入到100uL纯净水中，混合均匀后用LC-MS/MS定量分析

实施例化合物渗透入皮肤的定量检测结果如下表2：

表2

化合物I-8具有较好的皮肤渗透能力，在6小时内可达到10ug/g的渗透量。

测试例3：斑马鱼模型评价化合物修复功效

修复伤口的功效评价：以发育3dpf的健康AB系斑马鱼为实验动物，将其随机分成空白对照组、造模组、阳性对照组和样品组。空白对照组斑马鱼使用培养水处理；模型组斑马鱼切尾鳍后使用培养水处理；阳性对照与样品组斑马鱼切尾鳍后分别使用600μg/mL透明质酸及不同浓度I-8处理(1，3，9μg/mL)。将上述各组仔鱼置于28.5℃的恒温培养箱中，连续避光处理48h，其中每24h换液一次。应用Image-Pro Plus软件计算各组斑马鱼尾鳍面积，使用GraphPad软件对数据进行统计分析。结果呈现在图7～8中。

修复抗炎的功效评价：同上描述，将各组仔鱼置于28.5℃的恒温培养箱中，连续避光处理24h，应用中性红标记鱼体内炎症细胞，计数断尾处炎症细胞的数量，使用GraphPad软件对数据进行统计分析。结果呈现在图9～10中。

结论：如图7～8所示，与空白对照组相比，造模组斑马鱼尾鳍虽有再生，但面积显著减小。当使用浓度为1，3，9μg/mL的I-8分别作用斑马鱼断尾模型后，与造模组相比，斑马鱼尾鳍面积均有所增加，且具有显著的统计学意义。该结果提示，当I-8的作用浓度为1，3，9μg/mL时，它可进一步促进尾鳍组织的再生，具有一定的修复伤口功效。如图9～10所示，与空白对照组相比，造模组斑马鱼断尾处炎症细胞数量显著增加。当使用浓度为1，3，9μg/mL的I-8分别作用斑马鱼断尾模型后，与造模组相比，伤口处炎症细胞数量均有所减少，且具有显著的统计学意义。该结果提示，当I-8的作用浓度为1，3，9μg/mL时，它具有一定的修复炎症功效。

测试例4：与尿石素A(Urolithin A)对比在水相缓冲液中的动力学溶解度

实验方法：取30μL待测化合物的10mM DMSO储备液置于溶解度样品板中(两重复)，再加入970μL水相缓冲液到上述孔板中，封板膜封板，25℃下1100rpm振摇板子2h。转移溶解度孔板中的样品至过滤板中，过滤后得滤液。转移10μL滤液与10μL DMSO一起加入980μL甲醇中，再用甲醇:水(1:1)稀释10倍，所的样品用LC-MS/MS进行分析，得到Area(filtered)。另取10mM待测化合物DMSO储备液，用DMSO稀释至300μM，转移10μL此300μM DMSO溶液和10μL水相缓冲液一起加入980μL甲醇中，再用甲醇:水(1:1)稀释10倍，所的样品用LC-MS/MS进行分析，得到Area(std)。按如下公式计算动力学溶解度：

其中DF为稀释系数。

化合物	动力学溶解度(μM)
		尿石素A(Urolithin A)	98.76
I-8	>300*

*实际溶解度大于300μM时无法测得精确的动力学溶解度数值

结论：与对比化合物尿石素A(Urolithin A)相比，I-8具有较好的溶解度，克服了尿石素A水溶性差而难以进行外用制剂开发的问题。

测试例5：利用斑马鱼模型评价化合物抵抗氧化的功效

实验动物：发育48hpf(huors post fertilization，受精后小时数)健康野生AB系斑马鱼

抵抗氧化的功效评价：以发育48hpf的野生AB系斑马鱼为实验动物，4μM甲萘醌为造模药，通过化学诱变法构建斑马鱼氧化衰老模型。岩藻黄素为阳性对照化合物，不同浓度I-8分别作用斑马鱼氧化衰老模型22h后，对鱼体内的活性氧自由基(Reactive OxideSpecies，ROS)含量、β-半乳糖苷酶活性、三个抗氧化抗衰老相关基因(Cu/Zn-sod、Mn-sod、ampk)的表达变化分别进行检测，并作统计学分析。

实验过程中造模药与阳性化合物、I-8共同分散在斑马鱼的培养水中，上述各组仔鱼置于28.5℃的恒温培养箱中，连续避光处理22h。应用Cell ROX^TMDeep Red荧光探针与β-半乳糖苷酶染色试剂盒，分别对鱼体内的ROS和β-半乳糖苷酶进行特异标记，使用Image-Pro Plus软件定量着色强度。提取全鱼RNA后，通过荧光实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)技术，在mRNA水平对鱼体内Cu/Zn-sod、Mn-sod、ampk三个基因的表达变化进行检测。使用GraphPad软件对上述数据进行统计分析。结果呈现在图10～14中。

结论：如图10～13所示，与空白对照组相比，甲萘醌连续作用斑马鱼22h后，鱼体内ROS含量与β-半乳糖苷酶活性均显著增加，且具有一定的统计学意义。由于甲萘醌是一种氧化剂，可通过细胞内还原酶系统产生不稳定的半醌，进而生成大量ROS，加速机体衰老，而β-半乳糖苷酶是一种细胞溶酶体中的水解酶，其活性的升高是细胞老化的显著特征。当使用浓度为22.2μg/mL的I-8作用斑马鱼氧化衰老模型后，与造模组相比，鱼体内ROS含量与β-半乳糖苷酶活性均有所下调，且具有显著的统计学意义。该结果提示，当I-8的作用浓度为22.2μg/mL时，它具有一定的抗氧化功效。

如图14所示，当使用浓度为2.5、7.5和22.2μg/mL的I-8分别作用斑马鱼氧化衰老模型后，与造模组相比，Cu/Zn-sod和Mn-sod两个基因的表达均有所上调，且具有统计学意义。当使用浓度为2.5μg/mL的I-8作用斑马鱼氧化衰老模型后，与造模组相比，ampk基因的表达有所上调，且具有一定的统计学意义。

上述结果提示，当I-8的作用浓度为2.5、7.5和22.2μg/mL时，可逆转甲萘醌诱导的Cu/Zn-sod和Mn-sod两个基因的异常表达；作用浓度为2.5μg/mL时，可逆转甲萘醌诱导的ampk基因的异常表达。

炎症是一种生理反应，它保护身体免受各种伤害，如物理伤害、病原体、有毒化学物质暴露和紫外线照射。炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进和水肿。各类炎症介质在急性和慢性炎症发生过程中扮演着关键角色，如白细胞介素-1α(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)等。PGE2是体内产生最多的前列腺素，它的产生始于花生四烯酸。花生四烯酸先被环氧化酶(COX)转化为前列腺素H2(PGH2)后，进一步被前列腺素E合酶催化生成PGE2。最终，PGE2通过作用于四种E类前列腺素(EP)受体EP1-4中的发挥以炎症为主的生物学功能。其中，EP2受体都与Gs蛋白偶联，主要通过腺苷酸环化酶触发的cAMP-PKA-CREB途径发出信号。也有研究证明可以通过靶向EP2受体开发选择性小分子拮抗剂以缓解由EP2受体介导的下游病理过程，以开发新一代抗炎疗法。

另外，TRPV1受体是一种伤害感受器，能够被化学物质(辣椒素)、伤害性热刺激和酸化等多种因素激活。TRPV1广泛存在与C类感觉神经传入纤维及角质形成细胞中。TRPV1受体被激活后，单价和二价阳离子(主要为Ca²⁺)进入细胞，触发动作电位，传入高级中枢系统，产生灼烧痛感。因此，通过受试物作用后，阻断或抑制TRPV1受体蛋白的表达，有助于缓解灼烧痛感，达到舒缓的目的。因此，可以通过检测样品处理后角质形成细胞中TRPV1基因表达量，以此维度指标初步判定样品是否具有舒缓功效。

下述的测试例6-1和6-2，利用永生化角质形成细胞(HaCaT)和UVB建立模型，将待测化合物作用于HaCaT后检测TNF-α、IL-8、IL-1β和EP2的表达量；利用永生化角质形成细胞(HaCaT)和辣椒素建立模型，将待测化合物作用于HaCaT后检测TRPV1的表达量，以此进行多维度评估受试物舒缓的作用。

测试例6-1：检测UVB辐射后HaCaT的TNF-α、IL-8、IL-1β和EP2基因表达

1)细胞接种：将HaCaT以6×105个/孔接种于6孔板，于培养箱(37℃、5％ CO2)中培养12h，分别设置正常对照组(0mJ/cm2+溶媒对照)、模型对照组(80mJ/cm2+溶媒对照)、低浓度组(80mJ/cm2+低浓度化合物)、中浓度组(80mJ/cm2+中浓度化合物)、高浓度组(80mJ/cm2+高浓度化合物)。

2)UVB造模：UVB辐射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在孔中加入1mL D’Hanks，使之浸没细胞，对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行UVB造模(80mJ/cm2)；

3)给药：各试验组中分别加入含有不同浓度和化合物的DMEM培养基中继续培养24h；

4)培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总RNA，合成cDNA，利用q-PCR检测β-actin和目的基因的基因表达。

5)用β-actin作为基因表达的内参，计算目的基因的RNA相对表达量。

RNA相对表达量＝2^△△C(t)

△C(t)＝C(t)_目的基因-C(t)_β-actin

测试例6-2：检测辣椒素刺激后HaCaT的TRPV1基因表达

1)细胞接种：将HaCaT以6×105个/孔接种于6孔板，于培养箱(37℃、5％ CO2)中培养12h，分别设置正常对照组(0μM辣椒素+溶媒对照)模型对照组(0μM辣椒素+溶媒对照)、低浓度组(15μM辣椒素+低浓度化合物)、中浓度组(15μM辣椒素+中浓度化合物)、高浓度组(15μM辣椒素+高浓度化合物)。

2)诱导及给药：弃掉6孔板中的培养液，开展给药操作。根据以上药物分组加入含有受试物和辣椒素贮备液的培养液，每孔1mL。给药完毕后将24孔板放置在培养箱中(37℃、5％CO2)培养24h±2h。

3)孵育结束后，D-Hanks轻柔冲洗细胞一次或两次，正常对照组加入新鲜培养基，样品组加入含相应浓度化合物的新鲜培养基，37℃，5％ CO₂培养24h。

RNA相对表达量＝2^△△C(t)

△C(t)＝C(t)_目的基因-C(t)_β-actin

如图15～图19所示，化合物I-8能够下调TNF-α、IL-8、IL-1β、EP2和TRPV1的表达量，并呈剂量依赖趋势。提示化合物I-8具有舒缓功效。

测试例7：利用HaCaT人永生化角质形成细胞评价化合物的抗氧化功效

生物体进行呼吸代谢等氧化反应会产生活性自由基，在正常机体环境下，自由基具有稳定的清除系统，使得机体自由基含量保持较低浓度的平衡。氧化应激(OxidativeStress,OS)是指机体由于受到内源性和(或)外源性刺激，使得体内氧化与抗氧化作用间的平衡失常，自由基产生过多。过多的自由基在体内产生一系列负面作用，可氧化损伤生物分子，并进一步引起细胞死亡和组织损伤等。生物体内，除极微量的ROS被机体利用外，几乎所有的ROS都应当及时被清除。中波红斑效应紫外线(UVB)(280-319nm)辐射损伤是引起皮肤光老化最重要的因素，主要损伤皮肤角质形成细胞(HaCaT)，具体表现为光产物积累、ROS上升及氧化损伤加剧等。生物体在长期的进化过程中形成了一套完整的抗氧化体系，使自由基的产生与消除处于动态平衡，是生物体的一种适应性机制，主要成员包括抗氧化酶、抗氧化剂以及分隔过渡金属的蛋白等，它们均可特异性地限制机体的氧化损伤。因此，可以通过检测UVB辐射后角质形成细胞中ROS清除率，以此维度评价待测化合物的抗氧化功效。下述测试例7，利用HaCaT人永生化角质形成细胞评价化合物的抗氧化功效。

测试例7：检测UVB辐射后HaCaT的ROS含量

1)细胞接种：将HaCaT以2×10⁴个/孔接种于96孔板，于培养箱(37℃、5％ CO₂)中培养12h，分别设置对照组(120mJ/cm²+溶媒对照)、低浓度组(120mJ/cm²+低浓度化合物)、中浓度组(120mJ/cm²+中浓度化合物)、高浓度组(120mJ/cm²+高浓度化合物)；

2)UVB造模：UVB辐射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在孔中加入50μL D’Hanks，使之浸没细胞，对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行UVB造模；3)给药：各试验组中分别加入含有不同浓度化合物的DMEM培养基中继续培养24h；

4)ROS荧光探针转载：按照1:1000的稀释比例，采用PBS稀释DCFH-DA至终浓度为10μmol/L。除裸细胞孔外，弃掉其余孔中的培养基，用PBS清洗3次后，每孔加入200μLDCFH-DA工作液，CO₂培养箱孵育30min，孵育结束后，PBS清洗各孔内细胞3次；

5)荧光分析。将待测96孔板置于荧光酶标仪检测台上，设置入射光波长525nm，激发光波长488nm，读数分析。

实验结果：如图20所示，化合物I-8能够清除ROS，并呈剂量依赖趋势。提示化合物I-8具有抗氧化功效。

随着年龄增长，人类皮肤会逐渐出现萎缩(变薄)、脆弱、色素沉着不良和伤口愈合延迟。皮肤脆弱部分归因于半桥粒的变化和真表皮连接处的各类胶原蛋白(CollagenⅠ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅶ)或层粘连蛋白(如LN-5)表达下调。LN-5已经被证实是皮肤、角膜、结膜以及其他组织基底膜的锚状纤维的组成成分。LN-5通过整合素和蛋白聚糖的介导，参与细胞之间的相互作用，从而在细胞的粘附、生长、迁移和分化中起着至关重要的作用。皮肤皱纹的出现与胶原蛋白和层粘连蛋白的正常合成和表达密切相关。因此上述胶原蛋白含量和LN-5的增加则可以达到一定抵抗皱纹产生的作用，在皮肤衰老过程中起着重要的作用。因此，通过ELISA检测表皮细胞(成纤维细胞)CollagenⅠ蛋白水平，通过Real-Time PCR检测表皮细胞(角质形成细胞)Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ和LN-5的转录水平，以评价的待测化合物紧致抗皱功效。下述测试例8-1和8-2利用HaCaT人永生化角质形成细胞和HSF人皮肤成纤维细胞评价化合物的抗皱功效。

测试例8-1：检测HSF人皮肤成纤维细胞的I型胶原蛋白表达

1)细胞接种：将细胞接种96孔平板，2×10⁴个细胞/孔(37℃、5％ CO₂)，培养24h。

2)给药：弃掉96孔板中的培养液，开展给药操作。样品组加入含有化合物的培养液，对照组加入不含化合物的细胞培养液，每孔200μL。给药完毕后将96孔板放置在培养箱中(37℃、5％CO₂)培养24h±2h。

3)I型胶原蛋白检测：孵育结束之后收集细胞上清，使用人I型胶原酶联免疫试剂盒进行I型胶原蛋白含量的测定。

测试例8-2：检测HaCaT人永生化角质形成细胞的CollagenⅢ，Ⅳ，Ⅶ和LN-5基因表达水平

1)细胞接种：将表皮细胞用以1×10⁶个细胞/孔接种于6孔板，于培养箱(37℃、5％CO₂)中培养12h，分别设置对照组(0％化合物)、低浓度组(低浓度化合物)、中浓度组(中浓度化合物)和高浓度组(高浓度化合物)。

2)给药：针对试验分组，加入含有不同浓度和化合物的DMEM培养基中继续培养24h；

3)收集细胞：培养结束后，收集细胞样，进行后续CollagenⅢ，Ⅳ，Ⅶ和LN-5表达检测。

如图21～图25所示，化合物I-8能够提高I型胶原蛋白的分泌，上调COL3A1、COL4A1、COL7A1和LAMA5基因表达，并呈剂量依赖趋势。提示化合物I-8具有抗皱功效。

测试例9：检测和计算各化合物对UVB辐射后HaCaT细胞的ROS清除率

利用测试例7中的实验方法，根据下面公式计算各化合物对UVB辐射后HaCaT细胞的ROS清除率，结果列于表1。

其中S：荧光强度

表1.

化合物(含量)	ROS清除率-％	化合物(含量)	ROS清除率-％
				I-1(0.0025％)	5	I-14(0.0025％)	29
I-2(0.0025％)	41	I-15(0.0025％)	27
				I-3(0.0025％)	6	I-16(0.0025％)	38
I-4(0.0025％)	37	I-17(0.0025％)	2
				I-5(0.0025％)	31	I-18(0.0025％)	21
I-6(0.0025％)	28	I-19(0.0025％)	19
				I-7(0.0025％)	40	I-20(0.0025％)	37
I-8(0.00015625％)	12	I-21(0.0025％)	8
				I-8(0.000625％)	22	I-22(0.0025％)	9
I-8(0.0025％)	26	I-23(0.0025％)	34
				I-9(0.0025％)	11	I-24(0.0025％)	31
I-10(0.0025％)	15	I-25(0.0025％)	29
				I-11(0.0025％)	12	I-26(0.0025％)	36
I-12(0.0025％)	33	I-27(0.0025％)	35
				I-13(0.0025％)	35	I-28(0.0025％)	30

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims

1.一种具有如下通式I所示的结构的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，

其中，X为氧或无；

R¹和R²各自独立地为氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、-N-C(O)R^1-1、-NR^aR^b、-CH₂C(O)OR^1-2、苯基、-OC(O)R^1-3、-OCH₂OC(O)R^1-4、卤素、氰基、硝基、-C(O)R^1-5或-COO R^1-6；

R^a和R^b独立地为氢、C_1-6烷基或卤素取代的C_1-6烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，其特征在于，X为氧。

3.根据权利要求1所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，其特征在于，所述C_1-6烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；

和/或，所述C_1-6烷氧基为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基；

和/或，所述卤素为氟、氯、溴或碘；

和/或，所述卤素取代的C_1-6烷基为卤素取代的甲基、卤素取代的乙基、卤素取代的正丙基、卤素取代的异丙基、卤素取代的正丁基、卤素取代的异丁基或卤素取代的叔丁基。

4.根据权利要求1所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，其特征在于，R¹和R²各自独立地为氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、-N-C(O)R^1-1、-NR^aR^b、-CH₂C(O)OR^1-2、苯基、-OC(O)R^1-3或-OCH₂OC(O)R^1-4。

5.根据权利要求1所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，其特征在于，R¹和R²各自独立地为氢、羟基、C_1-6烷氧基、

其中，R^1-3和R^1-4分别独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或

6.根据权利要求1所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，其特征在于，R¹和R²分别独立地为羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、

7.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，其特征在于，所述化合物选自以下任一种：

8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-7中任一项所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物；以及化妆品可接受的辅料。

9.如权利要求1-7中任一项所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物，或如权利要求8所述的组合物在制备化妆品中的用途。

10.一种缓解皮肤炎症和/或使皮肤细胞中活性氧减少的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

向受试对象施用如权利要求1-7中任一项所述的化合物、其盐、立体异构体或溶剂化物；或者，向受试对象施用如权利要求8所述的组合物。