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CN119909166B - 虹鳟核酸疫苗佐剂及其应用 - Google Patents

虹鳟核酸疫苗佐剂及其应用

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Abstract

本发明涉及虹鳟核酸疫苗佐剂，所述的佐剂包括聚二硫化合物和由聚二硫化合物递送的环二鸟苷酸。本发明还涉及所述的虹鳟核酸疫苗佐剂在制备虹鳟IHNV病毒核酸疫苗的应用。基于STING激动剂‑‑‑c‑di‑GMP和聚二硫化合物(CPD)递送载体发展了一种虹鳟核酸疫苗佐剂，即c‑di‑GMP+CPD复合物，从而实现虹鳟核酸疫苗的降本增效，聚二硫化合物(CPD)可高效递送环二鸟苷酸，并具备较好的稳定性，c‑di‑GMP+CPD复合物具备作为虹鳟免疫佐剂的潜力，可明显增强虹鳟核酸疫苗的免疫保护效果，降低疫苗使用剂量。

Description

虹鳟核酸疫苗佐剂及其应用
技术领域
本发明涉及免疫防控技术领域，尤其涉及一种虹鳟核酸疫苗佐剂及其应用。
背景技术
传染性造血器官坏死病(infectious haematopoietic necrosis，IHN)是一种严重危害鲑鳟类的病毒性疾病，该疾病的病原体是IHNV，暴发后可造成高达80％-100％的死亡率，是我国冷水鱼养殖业发展面临的主要瓶颈。申请人在此之前设计了一款可有效增强虹鳟免疫保护效果、抵抗IHNV病毒的DNA疫苗(WU D,et al.Aquaculture.2023,572:739555，CN118903403A)，但应用剂量较高，无法满足水产养殖业低价疫苗的需求，因此需开发适用于虹鳟核酸疫苗的佐剂，提高疫苗效力，降低使用剂量。
环二鸟苷酸(c-di-GMP)是一种STING激动剂，其可与细胞体内STING蛋白结合，刺激细胞释放多种细胞因子，如干扰素、IL-6和TNF-α等，同时还可以通过激活NF-κB等典型炎症途径调节机体的免疫应答。目前c-di-GMP作为佐剂，已广泛应用于哺乳动物的亚单位疫苗、灭活疫苗等(GALLOVIC M D,et al.Journal of Controlled Release.2022,347:356-368.)(HANSON M C,et al.Journal of Clinical Investigation.2015,125(6):2532-2546.)。然而，虹鳟鱼是一类变温性的低等脊椎动物，与哺乳动物相比，其免疫应答系统存在一定差异，因此，c-di-GMP是否对虹鳟乃至鱼类有免疫刺激效果有待考究。
c-di-GMP是一种亲水的核酸小分子，在自然条件下无法穿过细胞膜激活STING通路，递送载体的加入有助于解决该问题。目前，递送载体可分为纳米脂质体颗粒(LNP)、聚合物类载体、蛋白类载体、病毒类载体等，其中LNP是核酸物质递送的主流。由于鱼类养殖对疫苗成本敏感，成本较高的LNP并不适用，因此需开发适用于鱼类且成本可控的递送载体。
聚二硫化合物(CPD)是一种类似于聚精氨酸的聚合物载体，其带正电荷的胍基促进载体在细胞表面附近积累，二硫化物骨架可通过二硫交换机制促进载体进膜，进入细胞后，CPD可在内源性谷胱甘肽催化下快速解聚，释放货物(GUO J,et al.ACS CentralScience.2021,7:990-1000.)。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供一种虹鳟核酸疫苗佐剂及其应用。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种虹鳟核酸疫苗佐剂，其主要特点是，所述的佐剂包括聚二硫化合物和由聚二硫化合物递送的环二鸟苷酸。
较佳地，所述的聚二硫化合物和环二鸟苷酸的质量比为4:1至10:1。
较佳地，所述的虹鳟核酸疫苗为抗IHNV病毒的虹鳟DNA疫苗。
本发明的第二方面提供了所述的虹鳟核酸疫苗佐剂在制备虹鳟IHNV病毒核酸疫苗的应用。
本发明的有益效果在于：基于STING激动剂---c-di-GMP和聚二硫化合物(CPD)递送载体发展了一种虹鳟核酸疫苗佐剂，即c-di-GMP+CPD复合物，从而实现虹鳟核酸疫苗的降本增效，聚二硫化合物(CPD)可高效递送环二鸟苷酸，并具备较好的稳定性，c-di-GMP+CPD复合物具备作为虹鳟免疫佐剂的潜力，可明显增强虹鳟核酸疫苗的免疫保护效果，降低疫苗使用剂量。
附图说明
图1A为本发明使用的CPD合成流程图；图1B和图1C为本发明合成的CPD单体的核磁图谱和质谱图谱；图1D、图1E、图1F分别为本发明合成的CPD的平均分子量、核磁共振氢谱和平均分子量分布曲线。
图2A和图2B为c-di-GMP在CHSE-214细胞中病毒载量变化结果和I-IFN表达情况结果。
图3A和图3B为c-di-GMP+CPD复合物在小鼠L929细胞中的免疫因子测定结果图。
图3C和图3D为c-di-GMP+CPD复合物在CHSE-214细胞中病毒载量变化结果和I-IFN表达情况结果。
图3E和图3F为CPD+c-di-GMP复合物的稳定性结果图。
图4为DNA疫苗联合(cdiG+CPD)佐剂免疫后28天的血清中和抗体结果图。
图5为DNA疫苗联合(cdiG+CPD)佐剂在免疫后28天进行IHNV攻毒测试结果图。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明基于STING激动剂---c-di-GMP和聚二硫化合物(CPD)递送载体发展了一种虹鳟核酸疫苗佐剂，即c-di-GMP+CPD复合物，从而实现虹鳟核酸疫苗的降本增效，推动其实际应用。
IHNV分离株GS21分离自甘肃患病虹鳟，虹鳟DNA疫苗为课题组设计与保存(WU D,et al.Aquaculture.2023,572:739555，CN118903403A)，环二鸟苷酸(c-di-GMP)和聚二硫化合物(CPD)由实验室合成，pRL-TK质粒和pGL3-IFN pro-Luc质粒均为实验室保存，L929细胞及CHSE-214细胞均为实验室保存；转染试剂LipofectamineTM 3000转染试剂(L3000001)购自赛默飞；双萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG029S)购自碧云天；定量PCR试剂盒MonAmpSYBR×green qPCR Mix(MQ10701S)购自莫纳。
实施例1环二鸟苷酸递送载体的开发
聚二硫化合物合成及细胞转染
CPD合成路线如图1A所示，具体合成过程如下：
CPD单体制备
将硫辛酸1(4.12g，20mmol)和CDI(3.24g，20mmol)添加在无水DMF(50mL)中，将反应液在室温下氮气保护搅拌2h活化硫辛酸。将L-精氨酸甲酯二盐酸盐(2.61g，10mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.74mL，10mmol)加到无水DMF(40ml)溶液中反应1h，再加入活化的硫辛酸溶液，并在室温下继续搅拌3.5h。在反应液中加入3倍体积乙醚，混合均匀后离心(2min，3000rpm)，收集油状物，并用DCM/Et2O(1:2，30×60ml)混合液洗涤油状物3次，真空干燥后得到黄色油状CPD单体(4.22g，收率79.6％)。CPD单体的核磁图谱(MS)和质谱图(1H NMR)分别如图1B、图1C所示。
CPD的制备
反应前提前配制好以下溶液：TEOA缓冲液(1M,pH＝7.0,H2O)、引发剂母液(-SH，5mM,TEOA)、新制备的二硫化合物单体M1(1M,TEOA)溶液、终止剂母液(碘乙酰胺,0.5M,H2O)，上述溶液配置完成后使用氮气对其进行脱氧处理，将处理好的溶液按照聚合物单体:引发剂:DMF:TEOA＝1:1:1.5:6.5的体积比加入，总体系为10mL。聚合时，反应在氮气保护下搅拌剧烈。在反应30min后，取20mL碘乙酰胺终止液(0.5M)加入到反应液中终止反应，将终止后的反应液装入分子截留量为2000的透析袋后再置于去离子水中，使未反应完全的小分子透析出去，后面每隔4h换一次透析液，透析二天后，真空冷冻干燥，得到白色CPD粉末。核磁共振氢谱(1H NMR)如图1E所示，凝胶渗透色谱仪测定CPD的平均分子量及其分布曲线(见图1D、图1F)。
c-di-GMP+CPD复合物的制备及转染
用无酶水将c-di-GMP和CPD分别配成为水溶液，其中c-di-GMP为40μg/mL，CPD配制不同浓度，分别为40、80、160、240、320、400μg/mL，按质量比(1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10)进行混合，常温孵育30min，得到不同配比的c-di-GMP+CPD复合物，然后等体积加入到细胞孔板。
免疫因子测定
在转染前24h，用L929细胞铺24孔板。待细胞增长至汇合度60～70％时，转染c-di-GMP+CPD复合物，37℃静置培养。收取转染后6h的细胞样品，利用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，利用莫纳定量PCR试剂盒MonAmp SYBR×green qPCR Mix进行IFN-β、IL6因子测定。
如图3A和图3B所示，在小鼠L929细胞中的测试发现CPD可有效递送c-di-GMP进入细胞，促进小鼠细胞的IFN-β、IL6表达上调，并且其递送效果显著高于商业转染试剂Lipo3000(Lp+cdiG组)。此外，CPD与c-di-GMP的最佳质量配比为4:1。因此，CPD是递送c-di-GMP的适宜载体。
稳定性测定
CPD+c-di-GMP复合物的稳定性影响着其实际应用，将CPD+c-di-GMP复合物分别保存于常温(RT)、4℃、-20℃条件下，检测保存1个月、2个月和4个月后的免疫因子激活效果，小鼠L929细胞测试方法上同。
如图3E和3F所示，通过小鼠L929细胞测试，发现CPD+c-di-GMP复合物可在4℃条件下至少稳定保存120天，长时间保存后仍可上调免疫因子的表达。因此该复合物具备良好的应用潜力。
实施例2环二鸟苷酸的鳟鱼细胞评价
病毒载量变化
在转染前24h，用CHSE-214细胞铺24孔板。待细胞增长至汇合度60～70％时，用无血清培养基替换孔板中的培养基，按转染试剂使用说明配制转染体系，转染c-di-GMP。转染12h后，将培养基替换为含104TCID50 IHNV的培养基，15℃静置培养。收取感染24h后的细胞样品，利用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，利用莫纳定量PCR试剂盒MonAmp SYBR×greenqPCR Mix进行IHNV N基因的绝对荧光定量分析。具体分组见下表1所示。
表1
鱼类I-IFN表达的上调情况
在转染前24h，用CHSE-214细胞铺24孔板。待细胞增长至汇合度60～70％时，用无血清培养基替换孔板中的培养基，按转染试剂使用说明配制转染体系，转染0.5μg pGL3-IFN pro-Luc质粒和0.05μg pRL-TK质粒。转染24h后，以同样方法转染c-di-GMP，26℃静置培养。收取转染24h后的细胞样品，利用双萤光素酶报告基因检测试剂盒检测Fluc表达含量。具体分组见下表2。
表2
如图2A所示，在CHSE-214细胞中，c-di-GMP在商业转染试剂的递送下可以明显抑制IHNV病毒在鳟鱼细胞中的拷贝。如图2B所示，基于双萤光素酶报告实验，c-di-GMP可在CHSE-214细胞中上调虹鳟I型IFN的表达，从而起到抑制病毒的效果。结合两者结果可知，c-di-GMP在鳟鱼细胞中具有免疫刺激效果，具备作为虹鳟疫苗佐剂的潜力。
如图3C和3D所示，在鲑鳟细胞CHSE-214中，CPD+cdiG组可更好的抑制IHNV在细胞中的拷贝，上调更明显的虹鳟I型IFN的表达，因此，CPD+c-di-GMP复合物可应用于鲑鳟鱼类。因此，聚二硫化合物(CPD)可高效递送环二鸟苷酸，并具备较好的稳定性。
实施例3环二鸟苷酸的鱼体评价
免疫
将5±0.1g虹鳟随机分组，每组40尾，暂养水温维持在(16±1)℃的循环水池(65cm×65cm×70cm)中，驯养14天后进行疫苗的注射免疫(注射位置为背鳍基部)，试验前禁食2天。疫苗免疫分组见下表3，同时设空白对照组(50μL/尾磷酸盐溶液)。
表3
组别 疫苗表示形式 疫苗组分
1 对照组 PBS缓冲液
2 DNA 1μg DNA疫苗
3 cdiG+CPD 5μg c-di-GMP+CPD复合物
4 DNA+cdiG+CPD 1μg DNA疫苗+5μg(c-di-GMP+CPD)佐剂
血清中和抗体效价变化
于免疫后28天采集虹鳟(n＝3)尾鳍血液。由于取得的血液量较少，将3条鱼的血液混合为同一样品，4℃放置过夜，以3,000×g离心10min，取上清作为血清样品，冻存于-80℃备用。
取冰箱中保存的血清样品，56℃水浴灭活30min。将血清样品按2倍稀释，从1:20分别稀释至1:40、1:80、1:160和1:320。将上述稀释样品与100TCID50的IHNV在15℃孵育1h。将孵育后的混合样品加到单层铺满的96孔板中，每个梯度做8个复孔。同时，设正常细胞空白对照、病毒对照、阴性血清对照和阳性血清对照孔。放入15℃培养箱中静置培养，7～10天后观察是否出现CPE。将使半数样品免于感染的最高血清稀释度作为该样品的中和抗体效价，中和抗体效价<20认为是阴性样品。
免疫后28天的血清中和抗体结果如图4所示，相较于DNA免疫组，DNA+cdiG+CPD免疫组可产生更强的中和抗体，即，DNA疫苗联合(cdiG+CPD)佐剂可提高鱼体的中和抗体水平。该结果说明c-di-GMP+CPD复合物可增强虹鳟的特异性免疫反应，使低剂量的虹鳟DNA疫苗即可产生较强的免疫保护效果。
病毒载量变化
于免疫后26天开始禁食，在免疫后28天对免疫虹鳟进行攻毒测试，每尾注射100μLIHNV(104TCID50/mL)，注射部位在鱼体腹腔。于攻毒后7天采集虹鳟(n＝3)脾脏组织，利用RNA提取试剂盒提取脾脏总RNA，利用莫纳定量PCR试剂盒MonAmp SYBR×green qPCR Mix进行IHNV N基因的绝对荧光定量分析。
在免疫后28天进行IHNV攻毒测试，图5为攻毒7天后的鱼体病毒载量，相较于DNA免疫组，DNA+cdiG+CPD免疫组的IHNV病毒载量更少，即，DNA疫苗联合(cdiG+CPD)佐剂可明显降低鱼体病毒载量，说明c-di-GMP佐剂增强了DNA疫苗的免疫保护效果。结合上述结果，c-di-GMP+CPD复合物具备作为虹鳟免疫佐剂的潜力，可明显增强虹鳟核酸疫苗的免疫保护效果，降低疫苗使用剂量。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (4)

1.一种虹鳟核酸疫苗佐剂，其特征在于，所述的佐剂包括聚二硫化合物和由聚二硫化合物递送的环二鸟苷酸；
聚二硫化合物合成过程为：
CPD单体制备：
将硫辛酸4.12g，20mmol和CDI 3.24g，20mmol添加在无水DMF 50mL中，将反应液在室温下氮气保护搅拌2h活化硫辛酸；将L-精氨酸甲酯二盐酸盐2.61g，10mmol和N,N-二异丙基乙胺1.74mL，10mmol加到无水DMF 40ml溶液中反应1h，再加入活化的硫辛酸溶液，并在室温下继续搅拌3.5h；在反应液中加入3倍体积乙醚，混合均匀后离心2min，3000rpm，收集油状物，并用DCM/Et2O，1:2，30×60ml混合液洗涤油状物3次，真空干燥后得到黄色油状CPD单体；
CPD的制备：
反应前提前配制好以下溶液：TEOA缓冲液1M,pH＝7.0,溶剂H2O；引发剂母液-SH，5mM,溶剂TEOA；CPD单体溶液，1M,溶剂TEOA；终止剂母液碘乙酰胺,0.5M,溶剂H2O；
溶液配置完成后使用氮气对进行脱氧处理，将处理好的溶液按照聚合物单体:引发剂:DMF:TEOA＝1:1:1.5:6.5的体积比加入，总体系为10mL；聚合时，反应在氮气保护下搅拌剧烈；在反应30min后，取20mL碘乙酰胺终止液0.5M加入到反应液中终止反应，将终止后的反应液装入分子截留量为2000的透析袋后再置于去离子水中，使未反应完全的小分子透析出去，后面每隔4h换一次透析液，透析二天后，真空冷冻干燥，得到白色CPD粉末。
2.根据权利要求1所述的虹鳟核酸疫苗佐剂，其特征在于，所述的聚二硫化合物和环二鸟苷酸的质量比为4:1至10:1。
3.根据权利要求1所述的虹鳟核酸疫苗佐剂，其特征在于，所述的虹鳟核酸疫苗为抗IHNV病毒的虹鳟DNA疫苗。
4.权利要求1至3中任一项所述的虹鳟核酸疫苗佐剂在制备虹鳟IHNV病毒核酸疫苗的应用。
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