CN119909108A - 一种治疗溃疡性结肠炎的纳米粒子复合物及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗溃疡性结肠炎的纳米粒子复合物及制备方法与应用，属于中药靶向制剂技术领域，主要提供了一种纳米粒子复合物，包括葛根提取物、金纳米粒子和壳聚糖；并提供了该纳米粒子复合物的制备方法；本发明提供的纳米粒子复合物能够将葛根的有效成分精准的释放到病灶部位，提高了葛根复杂成分的生物利用度、增强了药物利用的稳定性、实现对病灶的精准靶向治疗，为溃疡性结肠炎(UC)患者开辟了新的治疗前景。

Description

一种治疗溃疡性结肠炎的纳米粒子复合物及制备方法与应用

技术领域

本发明属于中药靶向制剂技术领域，具体涉及一种治疗溃疡性结肠炎的纳米粒子复合物及制备方法与应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是一种慢性、复发性的肠道疾病，无法根治，且存在癌变风险，是中西医共同面临的难题。西药治疗包括抗炎药、免疫调节剂、生物制剂、类固醇等。然而，停药后易复发，且伴有多种副作用，如增加感染和肿瘤风险，治疗面临诸多挑战。

金纳米粒子(AuNps)是承载中药复杂成分的良好工具，提高其生物利用度，增强稳定性和疗效。先前的研究已经表明，负载70％乙醇提取的木槿(Hibiscus syriacus L.，HCE)愈伤组织提取物的金纳米粒子(HCE-AuNps)能够通过自噬依赖性途径，增强对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症的抗炎效果。负载了白头婆(Eupatorium japonicum Thunb.，EJ)黄酮类成分的AuNps具有抗皮炎作用，同时EJ-AuNps降低了EJ对皮肤角质细胞的毒性。然而HCE-AuNps和EJ-AuNPs缺少靶向性以及对抗炎作用的起效成分解析尚不明确，这也是植物绿色合成AuNps所存在的共性问题。

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi或粉葛Pueraria thomsoniiBenth.的干燥根。中药材葛根成分组成复杂，生物利用度低，胃酸也会影响有效成分的稳定性，造成葛根的有效成分难以精准的释放到病灶部位；提高中药复杂成分的生物利用度、增强稳定性、实现对病灶的精准靶向治疗，将为UC患者开辟新的治疗前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种治疗溃疡性结肠炎的纳米粒子复合物及制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种治疗溃疡性结肠炎的纳米粒子复合物，包括葛根提取物、金纳米粒子和壳聚糖。

根据本发明优选的，所述纳米粒子复合物中，葛根提取物为粉葛根提取物。

上述纳米粒子复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将葛根提取物、壳聚糖、HAuCl₄·3H₂O和水混合得到混合物，混合物中葛根提取物的浓度为15mg/mL以上，壳聚糖的质量分数为0.5％以上，HAuCl₄·3H₂O的浓度为0.5mM以上；

(2)将步骤(1)得到的混合物在30℃～70℃条件下反应55min以上，得到合成后的纳米粒子混合物；

(3)将步骤(2)得到的合成后的纳米粒子混合物进行固液分离，收集固体，所得固体即为纳米粒子复合物；或者用水将固体进行洗涤，进行固液分离收集固体，得到纳米粒子复合物。

根据本发明优选的，步骤(1)中，混合物中葛根提取物的浓度为15～25mg/mL，壳聚糖的浓度为0.5～1.0％，HAuCl₄·3H₂O的浓度为1.0～3.0mM。

进一步优选的，步骤(1)中，混合物中葛根提取物的浓度为23mg/mL，壳聚糖的浓度为0.6％，HAuCl₄·3H₂O的浓度为2.0mM。

根据本发明优选的，步骤(1)中，所述壳聚糖是溶解成壳聚糖溶液后加入的。

进一步优选的，壳聚糖溶液的制备方法为将壳聚糖溶解到醋酸溶液中，制得壳聚糖溶液。

进一步优选的，将壳聚糖溶解到1～2％的冰醋酸溶液中，制得壳聚糖溶液，所得溶液中壳聚糖的浓度为5～15％。

更优选的，将壳聚糖溶解到2％的冰醋酸溶液中，制得壳聚糖溶液，所得溶液中壳聚糖的浓度为10％。

根据本发明优选的，步骤(2)中，混合物在50～60℃条件下反应60～70min。

进一步优选的，步骤(2)中，混合物在60℃条件下反应60min。

根据本发明优选的，步骤(3)中，固液分离是通过10,000rpm以上，离心10min以上进行分离；

用水将固体进行洗涤3次以上。

进一步优选的，步骤(3)中，固液分离是通过12,000rpm，离心10min以上进行分离。

根据本发明优选的，步骤(1)或步骤(3)中，所用水为去离子水、蒸馏水或重蒸水。

根据本发明优选的，上述纳米粒子复合物的制备方法，包括如下步骤：

①在去离子水中加入葛根提取物、壳聚糖和HAuCl₄·3H₂O得到混合物，使混合物中葛根提取物(FGR)浓度为23mg/mL、壳聚糖(Chitosan)浓度为0.6％、HAuCl₄·3H₂O浓度为2mM；将混合物在60℃反应60min，得到合成后的纳米粒子混合物；

壳聚糖是利用2％的冰醋酸溶液溶解成10％的壳聚糖溶液后加入；

②将步骤①得到的合成后的纳米粒子混合物通过12,000rpm离心20min，收集固体，即为纳米粒子复合物(CFGR-Nps纳米粒子)；

或者使用去离子水对收集的固体进行洗涤，通过12,000rpm离心20min固液分离，收集固体，进行洗涤3次以上，得到纳米粒子复合物(CFGR-Nps纳米粒子)。

根据本发明优选的，上述葛根提取物的制备方法，包括如下步骤：

将切成块状、片状、颗粒状或粉末状的葛根样品在68～72％乙醇溶液中浸泡23～25h，浸泡后固液分离，收集提取液，所述提取过程重复2～3次，将提取液合并，并在38～42℃浓缩去除溶剂乙醇，最后进行冷冻干燥得到葛根提取物(FGR)。

进一步优选的，所述葛根提取物的制备方法，包括如下步骤：将切成块状、片状、颗粒状或粉末状的葛根样品在70％乙醇溶液中浸泡24h，浸泡后过滤收集滤液，所述提取过程重复3次，将提取液合并，利用40℃的旋转蒸发仪去除溶剂乙醇，最后进行冷冻干燥得到葛根提取物(FGR)。

进一步优选的，所述葛根提取物的制备方法中，将切成块状、片状、颗粒状或粉末状的葛根样品浸泡于5倍体积的70％乙醇溶液中，在37℃的条件下，100rpm提取24h，提取完成后，通过过滤分离固体残渣，收集提取液，重复所述提取步骤3次，并将所有提取液合并，利用40℃的旋转蒸发仪去除溶剂乙醇，最后进行冷冻干燥得到葛根提取物(FGR)。

根据本发明优选的，所述方法中，葛根为粉葛根。

根据本发明优选的，所述方法中，葛根为干燥葛根。

一种治疗溃疡性结肠炎的组合物，包括葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素6”-O-木糖苷、大豆苷元、6-羟基大豆苷元、芒柄花素、染料木苷、葛根素芹菜糖苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、染料木素和6”-O-丙二酰基大豆苷和鸢尾黄素。

上述纳米粒子复合物、上述方法制备的纳米粒子复合物或组合物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

一种治疗溃疡性结肠炎的药物，含有上述纳米粒子复合物、上述方法制备的纳米粒子复合物或组合物。

本发明的有益效果至少包括如下：

1、本发明提供的纳米粒子复合物能够将葛根的有效成分精准的释放到病灶部位，提高了葛根复杂成分的生物利用度、增强了药物利用的稳定性、实现对病灶的精准靶向治疗，为溃疡性结肠炎(UC)患者开辟了新的治疗前景。

2、本发明还提供了一种治疗溃疡性结肠炎的组合物，增加了治疗溃疡性结肠炎(UC)药物的多样性。

附图说明

图1、图2、图3、图4、图5为合成以及条件优化CFGR-Nps结果图；

图1为不同FGR浓度；图2为不同Chitosan浓度；图3为不同HAuCl₄·3H₂O浓度；图4为不同温度；图5为不同时间。

图6为FT-IR分析Chitosan,Chitosan-AuNps(C-Nps),CFGR-Nps,FGR和FGR-Nps的官能团图。

图7为LC-MS/MS鉴定FGR和CFGR-Nps的活性成分图。

图8为MS和MS/MS鉴定FGR和CFGR-Nps的主要黄酮类成分图。

图9为MS和MS/MS鉴定FGR和CFGR-Nps的主要黄酮类成分图

图10为MS和MS/MS鉴定FGR和CFGR-Nps的主要黄酮类成分图

图11为MS和MS/MS鉴定FGR和CFGR-Nps的主要黄酮类成分图

图12为通过不同方法对CFGR-Nps进行鉴定和表征图；

图中：(A)UV-Vis；(B)FE-TEM鉴定纳米粒子大小和形状；(C)FE-SEM鉴定纳米粒子的表面特征；(D)X射线能谱；(E-G)金粒子分布，天然Chitosan有效地包裹了AuNps，形成了一个有机涂层。

图13为CFGR-Nps在模拟胃液和模拟肠液的pH响应释放图；

图中：(A)CFGR-Nps动力学释放在模拟胃液Simulated Gastric Fluid(SGF)和模拟肠液Simulated Intestinal Fluid(SIF)中；(B)LC-LC/MS分析CFGR-Nps在SGF和SIF中的活性成分(positive mode)；(C)LC-LC/MS分析CFGR-Nps在SGF和SIF中的活性成分(negative mode)。

图14为CFGR-Nps具有良好的靶向肠道性能图；

图中：(A)UV-Vis监测CFGR-Nps在pH 1.4的吸收峰0～24h；(B)UV-Vis监测CFGR-Nps在pH 6.8的吸收峰0-24h；(C)UV-Vis监测CFGR-Nps在pH 7.4的吸收峰0～24h；(D)UV-Vis监测FGR-Nps在pH 1.4的吸收峰0～24h；(E)UV-Vis监测FGR-Nps在pH 6.8的吸收峰0～24h；(F)DLS监测CFGR-Nps分别在pH 1.5，6.8，7.4，和4.6的粒径大小在0～12h；(G)DLS监测CFGR-Nps分别在pH 1.5，6.8，7.4，和4.6的Zeta电位；(H)FE-TEM鉴定CFGR-Nps粒子大小以及形状在pH 1.4；(I)FE-TEM鉴定CFGR-Nps粒子大小以及形状在pH 6.8；(J)离体荧光成像胃与肠道组织分别在CFGR-Nps给药0～8h。

图15为CFGR-Nps体内器官代谢图。

图16为CFGR-Nps给药后血清生化指标表达图。

图17为CFGR-Nps小鼠肠组织，心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏组织病理学染色图。

图18为细胞活性检测图；

图中：(A)0～300μg/mL的CFGR-Nps处理后的RAW 264.7细胞活性；(B)0～300μg/mL的CFGR-Nps处理后的HCT 116细胞活性；(C)0～300μg/mL的CFGR-Nps处理后的HEK 293细胞活性。

图19为CFGR-Nps缓解DSS诱导的小鼠UC图；

图中：(A)实验设计；(B)小鼠体重变化；(C)疾病活跃指数(Disease ActivityIndex,DAI)评分；(D)小鼠结肠图片；(E)H&E染色；(F)爱先蓝-糖原染色(AB-PAS)染色。

图20为CFGR-Nps保护与修复结肠上皮屏障图；

图中：(A)IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α和INF-γ的含量在肠道组织；(B)MUC-2免疫荧光染色；(C)Occludin-1/ZO-1免疫荧光共染色。

图21为蛋白组学分析图；

图中：(A)Volcano plot分析Con vs.DSS、DSS vs.FGR、DSS vs.CFGR-Nps-L

和DSS vs.CFGR-Nps-H的差异蛋白上调和下调的数量；(B)Heatmap和GO分析差异蛋白表达调控的信号通路；(C)Heatmap差异蛋白表达。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的技术方案进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

主要材料来源

金纳米粒子(HAuCl4·3H₂O)购自麦克林公司，货号为H821422-1g。

壳聚糖(Chitosan)由Sigma公司提供，货号448877-50g。

壳聚糖溶液：将10g壳聚糖粉末加到100mL 2％的冰错酸溶液中溶解，得到10％的壳聚糖溶液。

粉葛根为常规市售产品。

粉葛根样品采集并提取制得葛根提取物(FGR)，具体如下：

粉葛根样品采集于2023年，地点位于江西省宜春市靖安县。经江西中医药大学教授鉴定确认为真品，将葛根根茎切成块状。将切好的块状葛根干燥后，浸泡于5倍体积(g/mL)的70％乙醇溶液中，以提取其活性成分。在37℃的条件下，在100rpm的摇床充分提取24小时。提取完成后，通过3层滤纸过滤分离固体残渣，收集提取液。重复上述提取步骤3次，并将所有提取液合并，使用40℃旋转蒸发仪将合并后的提取液中的乙醇蒸发，以浓缩提取液，然后采用冷冻干燥技术进行冷冻干燥，得到葛根提取物(FGR)。将得到的葛根提取物(FGR)在4℃条件下保存，以备后续实验使用。

CFGR-Nps的合成及条件优化

发明人研究了五个关键参数：FGR和壳聚糖浓度、HAuCl₄·3H₂O浓度、反应温度和反应时间。

发明人分别将1mL去离子水与一系列不同浓度的HAuCl₄·3H₂O，浓度范围从0.5mM～3mM混合。随后，向混合物中加入不同浓度的FGR(5～25mg)，以及不同浓度的壳聚糖溶液(0.5％～1.0％，W/V，质量单位g，体积单为mL)。该混合物在一系列设定的温度(30℃～70℃)下孵育，孵育时间从20min～70min不等。反应进程通过观察颜色变化和使用紫外-可见光谱仪(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,United States)测量吸光度来监测反应的最优条件。将混合物在12,000rpm的高速离心条件下离心20min获得壳聚糖-粉葛根生物合成的金纳米粒子(CFGR-Nps)，离心后的沉淀物用去离子水进行洗涤，以去除杂质，洗涤后12,000rpm的高速离心条件下离心20min，收集固体，重复4次以确保纯度，得到金纳米粒子(CFGR-Nps)。

各条件参数的相应实验结果见图1、图2、图3、图4、图5，表1。

表1

通过观察吸收光谱中最高的峰值(图1、图2、图3、图4、图5中由实红线表示)，确定了CFGR-Nps生物合成的理想条件。发现最佳参数为：FGR浓度为23mg/mL，壳聚糖浓度为0.6％，金盐(HAuCl₄·3H₂O)浓度为2mM，反应时间为60min，温度为60℃。

CFGR-Nps的合成与表征

FT-IR分析FGR和Chitosan负载在AuNps上的官能团

根据上面优化后的条件，制备粉末Chitosan,Chitosan-AuNps(C-Nps),CFGR-Nps,FGR和FGR-Nps，并进行傅里叶变换红外光谱(FTIR，Spectrum^TMOne FTIR Spectrometer；PerkinElmer,Waltham,Massachusetts,USA)测定。

其中，CFGR-Nps的制备方法，包括如下步骤：

(1)在去离子水中加入葛根提取物(FGR)、壳聚糖溶液和HAuCl₄·3H₂O得到混合物，使混合物中葛根提取物(FGR)浓度为23mg/mL、壳聚糖(Chitosan)浓度为0.6％(W/V)、HAuCl₄·3H₂O浓度为2mM；

(2)将混合物在60℃反应60min，然后在12,000rpm的高速离心条件下离心20min获得CFGR-Nps沉淀物，离心后的沉淀物用去离子水进行洗涤，以去除杂质(去除未反应的残留物和未合成的成分)，洗涤后12,000rpm的高速离心条件下离心20min，收集固体，重复4次以确保纯度，得到CFGR-Nps。

C-Nps的制备方法与CFGR-Nps的制备方法不同之处是不加入葛根提取物(FGR)，具体如下：

在去离子水中加入壳聚糖溶液和HAuCl₄·3H₂O得到混合物，使混合物中壳聚糖(Chitosan)浓度为0.6％(W/V)、HAuCl₄·3H₂O浓度为2mM；其他条件同CFGR-Nps的制备方法，得到C-Nps。

FGR-Nps的制备方法与CFGR-Nps的制备方法不同之处是不加壳聚糖(Chitosan)，具体如下：

在去离子水中加入葛根提取物(FGR)和HAuCl₄·3H₂O得到混合物，使混合物中葛根提取物(FGR)浓度为23mg/mL、HAuCl₄·3H₂O浓度为2mM；其他条件同CFGR-Nps的制备方法，得到FGR-Nps。

上述制备的CFGR-Nps、C-Nps和FGR-Nps在进行物理化学实验鉴定数据检测时，需要进行干燥后才能进行，是通过冷冻干燥方法进行干燥。

实验结果：

根据文献和观察到的光谱，图6中的主要峰值表明了参与表面吸附和氢键相互作用的原子，这些峰值在C-Nps和CFGR-Nps的FTIR光谱中都存在。3292cm^-1处的峰值归因于O-H和NH2的伸缩振动，而2870cm^-1处的吸收带表示C-H的伸缩。1591cm^-1、1417cm^-1和1375cm^-1处的信号分别与C-O伸缩振动、NH2弯曲和C-N伸缩振动相关(图6a)。C-Nps的FTIR光谱(图6b)显示出类似的模式，由于AuNps的引入，存在微小的差异。在向Chitosan引入金盐后，观察到的位置变化和带强度变化表明Au离子与Chitosan的功能团之间存在相互作用。这种相互作用导致在AuNps周围形成了一个包覆层。例如，Chitosan中3292cm^-1的带移至C-Nps中的3232cm^-1，并显示出增加的强度。CFGR-Nps的FTIR光谱显示，在合成过程中添加FGR到Chitosan显著增加了3200-3500cm^-1区域带的强度。这种变化很可能是由于Chitosan和FGR中酚类化合物的O-H伸缩频率所致(图6c)。此外，FGR中831cm^-1、FGR-Nps中836cm^-1和CFGR-Nps中837cm^-1的特征峰，与烯烃中C＝C的弯曲相关，证实了FGR在AuNps的还原和包覆过程中的参与(图6c-e)。1016-1043cm^-1处的吸收带对应于C-O伸缩振动。在C-Nps和FGR-Nps中，这些带分别出现在1016cm^-1和1040cm^-1(图6b,e)，但在CFGR-Nps中移至1036cm^-1(图6c)。FGR介导的AuNps合成前后IR带的变化表明FGR在将Au⁺还原为Au°中发挥了重要作用。

LC-MS/MS测定FGR和CFGR-Nps的活性成分

将2.0mg的FGR和CFGR-Nps粉末溶解在甲醇中，上清液通过0.22μm的膜过滤，然后进行高效液相色谱(HPLC)分析。该分析使用Ultimate 3000系统(Thermo Scientific，美国)进行，采用Kinetex F5色谱柱(2.1mm×150mm，2.6μm)，并保持柱温在45℃。流动相由水中的0.05％甲酸(溶剂A)和乙腈中的0.05％甲酸(溶剂B)组成，以0.3mL/min的流速在25min内输送。HPLC系统与质谱仪(SCIEX Zeno TOF 7600，AB Sciex，美国)联用，使用电喷雾电离(ESI)源进行LC/MS设置中的详细质谱分析。

实验结果：

随后LC-MS/MS表明粉葛根中的主要黄酮类成分被成功的负载到了AuNps上。结果显示，在TIC上6.618min处的一个显著的离子峰，在正离子模式下被识别，对应于葛根素。这一点通过MS/MS得到了确认，其产物离子为m/z 417.118([M+H]+)。同样，在正离子模式下，TIC上6.043、7.118、10.266、11.514和11.733min处的其他5个峰值分别被初步识别为3'-羟基葛根素、葛根素6”-O-木糖苷、大豆苷元、6-羟基大豆苷元和芒柄花素。其相应的m/z值分别为433.1129([M+H]+)、549.1602([M+H]+)、255.0651([M+H]+)、271.0600([M+H]+)和269.0808([M+H]+)。在负离子模式下，TIC上6.419、7.126、7.979、9.649、10.07和11.771min处的6个峰值被识别为染料木苷、葛根素芹菜糖苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、染料木素、6”-O-丙二酰基大豆苷和鸢尾黄素。它们的m/z值分别为431.0983([M-H]-)、547.1457([M-H]-)、313.0717([M-H]-)、269.0455([M-H]-)、517.0987([M-H]-)和299.0561([M-H]-)。发明人发现，这些化合物也在CFGR-Nps样品中被检测到，表明FGR中的大多数活性成分已成功装载到CFGR-Nps上。这些化合物的化学结构在图7和图8、图9、图10、图11中进行了说明。这一发现表明，FGR中的活性成分包括葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素-6”-O-木糖苷、大豆苷元、6-羟基大豆苷元、芒柄花素、染料木苷、葛根素芹菜糖苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、染料木素、6”-O-丙二酰基大豆苷和鸢尾黄素被有效包裹在CFGR-Nps中，可能增强了它们的生物效能。

图7-图11.MS和MS/MS鉴定FGR和CFGR-Nps的主要黄酮类成分。

CFGR-Nps的物理化学特性鉴定

使用UV-Vis分光光度计确认CFGR-Nps在300nm至800nm范围内的最大吸光度，使用TEM分析形状和尺寸，采用元素映射、SAED和EDX分析，使用FE-SEM确定形态、纯度、结构和元素分布，记录粉末XRD图案以表征晶体结构，使用DLS测量颗粒尺寸，测量Zeta电位。

实验结果见图12：

FGR、Chitosan和HAuCl₄·3H₂O没有特定的吸收特征，而CFGR-Nps在536nm处有明显的吸收峰，这表明CFGR-Nps成功合成。通过FE-TEM分析来确定CFGR-Nps的形状、大小和晶体结构。FE-TEM图像显示确定了CFGR-Nps的形状、大小和晶体结构，其粒子大小在13.7至55.2nm之间，形态主要为圆形、球形和多边形。此外，分析显示CFGR-Nps呈现紧凑的球形结构和明显的聚集现象，这表明其具有较高的表面能。FE-SEM图像还证实了壳聚糖覆盖在AuNps表面和分离的水凝胶中。为了进一步确认CFGR-Nps的晶体特性，本研究使用了X射线衍射(XRD)技术。XRD分析证实了CFGR-Nps的晶体结构，并通过元素映射和能量色散X射线光谱(EDX)分析评估了其纯度。EDX分析显示了金元素在纳米粒子中的分布，黄点清晰地指示了CFGR-Nps的高纯度。在EDX谱图中，仅观察到与金元素相对应的峰，表明CFGR-Nps在合成过程中没有检测到杂质。综合这些分析结果，证实了纯的、晶体形态的CFGR-Nps成功合成。

CFGR-Nps负载黄酮类成分鉴定以及在模拟胃、肠液中成分释放

通过透析法检测药物释放曲线，量化药物释放行为。制备0.1mg/mL的CFGR-Nps溶液，将5mL溶液置于透析袋中(截留分子量数值8-14kDa)。进行SGF或SIF透析，在37℃水浴中连续轻轻摇动透析袋，每隔一定时间(0、0.25、0.5、1、2、4和6h)收集释放介质并刷新介质。使用UV-Vis分析释放的FGR量，并使用标准曲线进行分析。将上述游离后的上清液通过LC-MS/MS技术进行分析，鉴定负载的葛根中的活性成分。5mg CFGR-Nps分散在5mL的在模拟胃液(SGF，pH 1.4)和模拟肠液(SIF，pH 6.8)中，所使用的模拟胃液(MSG0250)和模拟肠液(MSI9835)均购自MeGen Biotechnology公司。4h后，10,000rpm离心10min。随后，将上清液转移到甲醇中，并通过0.22μm滤膜进行过滤。过滤后的样品通过LC-MS/MS技术进行分析，以鉴定并确定从CFGR纳米粒子中释放的活性成分。

实验结果见图13，在胃酸pH 1.4的环境下，CFGR-Nps稳定，然而在肠道环境pH为6.8，CFGR-Nps降解，有效成分释放，实现黄酮类多组分靶向UC给药。

CFGR-Nps具有良好的肠道靶向性

每0.5g的FGR-Nps和CFGR-Nps分别分散在5mL pH值为4.6的去离子水(DW，作为空白对照)、pH值为1.4的模拟胃液(SGF)以及pH值分别为6.8和7.4的模拟肠液(SIF)中。UV-Vis监测溶液的吸光度，并在不同的时间间隔进行读数：0.5、1、4和24h。随后，收集不同分散体下的CFGR-Nps，并通过场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)对纳米粒子进行形态学检查，评估CFGR-Nps在不同的模拟液体pH条件下是否有物理变化。为了研究CFGR-Nps在实际胃肠道(GI)环境中的降解性，发明人给Balb/c小鼠经胃内给予200μL的CFGR-Nps(浓度：2mg/mL)在pH值为4.6的去离子水中。然后在给药后的特定时间间隔—0、1、2、4和8h处死小鼠，以收集它们的胃肠道进行分析。随后，使用IVIS Lumina LT Series III成像系统(PerkinElmer，USA)对胃肠道进行离体荧光成像，成像参数与FITC特有的荧光通道一致，确保胃肠道内CFGR-Nps降解评估的一致性和准确性。

实验结果见图14：

CFGR-Nps在pH值为1.4的SGF中，24h内几乎无变化。而在pH值为6.8和7.4时，吸收峰逐渐减小，在12h内几乎消失。然而FGR-Nps在pH6.8时保持稳定，但在pH 1.4时迅速降解。同时DLS检测CFGR-Nps在pH值为1.4的SGF中粒径无变化，而在pH值为6.8和7.4时12h内几乎完全降解。离体荧光成像8h后胃中荧光信号在胃中可见。相比之下，肠道内的荧光信号在2h后开始减弱，4h和8h后结肠中观察到较弱的荧光信号。此外，CFGR-Nps的释放动力学表明在pH为1.4的SGF中，即使在孵育6h后，FGR几乎无释放，这表明CFGR-Nps在强酸性条件下的稳定性。相反，在pH为6.8的SIF中，观察到药物逐渐加速释放。随后LC-MS/MS结果表明，pH为1.4的SGF几乎无吸收峰而在pH为6.8的SIF中检测到FGR中的活性成分。证实CFGR-Nps可抵抗强力的胃酸刺激，精准靶向将有效成分释放在肠道炎症部位。综上所述，CFGR-Nps的优势在于其在胃酸中的高稳定性和在肠道中的靶向释放能力，这使得CFGR-Nps成为一种潜在的有效的药物载体，能够将药物精准地输送到肠道炎症部位，从而提高治疗效果并减少对胃的潜在刺激。

动物实验设计

Balb/c小鼠自由饮用2.5％ DSS(葡聚糖硫酸钠)饮用水5天，诱导急性溃疡性结肠炎(UC)。小鼠随机分组，每组10只：空白组：0.9％生理盐水；2.5％ DSS组；给药组：DSS+低剂量CFGR-Nps(10mg/kg)，DSS+高剂量CFGR-Nps(20mg/kg)，DSS+高剂量FGR(300mg/kg)，DSS+SAS(柳氮磺胺吡啶肠溶片，阳性药)；给药6天，每天一次，每天测量食物摄入量，体重，粪便稠度，粪便和肛门处是否存在出血。解剖取心脏、肺、脾脏、肝脏、肾脏组织，取2-3cm肠道组织固定在10％甲醛中用于组织病理学分析，剩余-80℃条件下保存，用于生化指标检测，Proteomics、PCR和Western blot分析。

评估CFGR-Nps体内安全性

CFGR-Nps体内器官代谢评估

建立2.5％ DSS诱导的UC模型，通过口服灌胃小鼠100μL CFGR-Nps(20mg/kg)6h和48h后，收集心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏，离体NIR荧光成像使用XenogenIVIS光谱体内成像系统进行成像，见图15。

实验结果显示，CFGR-Nps在心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏6h(图15A)和24h(图15B)均无残留。

血清生化指标检测

采集的血液以3,000rpm离心10min以提取血清，然后用于生化分析。测量ALT、AST、TP、Alb、GLO、BUN、TG、CHO和ALP的含量。

实验结果见图16：CFGR-Nps对血清中的生化指标无明显的变化。

组织病理学染色

取小鼠肠组织，心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏经过固定、透明、脱水、浸蜡、包埋，制作石蜡病理切片，切片厚度5μm，通过二甲苯进行常规脱蜡，梯度酒精至水化，苏木素对细胞核进行染色，伊红和阿尔新蓝/高碘酸-希夫(AB/PAS)对细胞质进行染色，脱水、透明，中性树胶封片。通过光学显微镜对组织结构病变情况进行观察。

实验结果见图17：CFGR-Nps对基本的心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏无毒性。

细胞培养以及CCK-8检测

RAW 264.7、HCT 116和HEK 293在37℃和5％ CO₂ DMEM含10％FBS培养基中培养。Caco2在37℃、5％ CO₂ MEM含10％FBS培养基中培养。接种到96孔板中24h。不同浓度CFGR-Nps孵育24h。随后Cell Counting Kit-8(CCK-8，MedChemExpress)方法评估细胞活力。构建TNF-α诱导的Caco2和LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症模型，不同条件下CFGR-Nps给药处理。

实验结果见图18：300μg/mL的CFGR-Nps对RAW 264.7、HCT 116和HEK 293细胞无毒性。

CFGR-Nps缓解DSS诱导的小鼠UC

实验结果见图19：

CFGR-Nps剂量依赖性缓解DSS导致的小鼠体重降低、DAI评分降低、结肠长度变短。病理学H&E和AB/PAS染色表明CFGR-Nps改善DSS诱导的肠道损伤。根据结果，CFGR-Nps与FGR相比在治疗DSS诱导的结肠炎中显示出显著的疗效，其优势在于能够更有效地减轻体重下降、降低疾病活动指数、保护结肠长度、改善肠道病理损伤，并且可能通过靶向药物递送提高治疗效果。这些特性使得CFGR-Nps成为一种有潜力的治疗结肠炎的新疗法。

CFGR-Nps保护与修复结肠上皮屏障

a.肠道组织中因子的测量

采用流式荧光法测定小鼠肠道组织的细胞因子荧光强度。细胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1和INF-γ。使用小鼠六细胞因子测试试剂盒和FCAP array V3.0软件从平均荧光强度获得浓度值。

b.免疫荧光染色：

取小鼠肠组织，经过固定、透明、脱水、浸蜡、包埋，制作石蜡病理切片，切片厚度5μm，通过二甲苯进行常规脱蜡，梯度酒精至水化，苏木素对细胞核进行染色，将切片与一抗在4℃孵育过夜，然后在黑暗中用FITC偶联的二抗染色30min。通过光学显微镜对抗体(MUC-2、Occludin-1和ZO-1)的表达情况进行观察。

实验结果见图20：

CFGR-Nps抑制DSS导致的局部免疫反应，促进结肠上皮屏障的修复。通过升高DSS导致的IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α和INF-γ含量降低。此外，CFGR-Nps改善DSS导致的肠道粘膜的损伤，修复肠道粘膜通过升高DSS导致的MUC-2，和Occludin-1/ZO-1的蛋白表达。根据结果显示，CFGR-Nps与FGR相比在治疗DSS诱导的结肠炎中显示出显著的免疫调节、肠道屏障修复和粘膜保护作用，其优势在于能够有效抑制局部免疫反应、促进结肠上皮屏障修复、改善肠道粘膜损伤，并通过靶向药物递送提高治疗效果。这些特性使得CFGR-Nps成为一种有潜力的治疗结肠炎的新疗法。

蛋白质组学分析

使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的Pierce^TMRIPA裂解缓冲液(Thermo FisherScientific)在4℃下裂解结肠组织1h。将裂解物在4℃下以12,000rpm离心15min，收集上清液(总蛋白)并保存在-20℃下。收集肽段并冷冻干燥，使用Ultimate 3000RSLC Nano系统(Thermo Fisher Scientific)通过高pH分离进行肽分离。随后使用液相色谱联用串联质谱分析肽段，使用PEAKS Studio8.5处理串联质谱图，获得差异表达的蛋白质(DEPs)。从总DEPs中选择显著表达的蛋白质，0.8≤fold change≥1.2,p≤0.05，并进行火山图分析、GO通路富集，Heatmap蛋白可视化等找到CFGR-Nps调控的信号通路以及差异蛋白。

实验结果见图21：

蛋白质组学分析CFGR-AuNps缓解DSS诱导的UC潜在分子机制。火山图结果表明DSSvs.CFGR-Nps-H上调了108个差异蛋白，下调了92个差异蛋白。GO分析表明这些差异蛋白主要调控包括inflammatory response,innate immune response,cell-cell adhesion和mitochondeion相关的通路蛋白包括Dsg2、plA2G2A、Clca1、IFGB2、NDUFB2、NDUFB7、NDUFB3、NDUFA4和DUFA4的表达。

Claims (10)

1.一种治疗溃疡性结肠炎的纳米粒子复合物，其特征在于，包括葛根提取物、金纳米粒子和壳聚糖。

2.如权利要求1所述的纳米粒子复合物，其特征在于，所述纳米粒子复合物中，葛根提取物为粉葛根提取物。

3.权利要求1所述纳米粒子复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将葛根提取物、壳聚糖、HAuCl₄·3H₂O和水混合得到混合物，混合物中葛根提取物的浓度为15mg/mL以上，壳聚糖的质量分数为0.5％以上，HAuCl₄·3H₂O的浓度为0.5mM以上；

(2)将步骤(1)得到的混合物在30℃～70℃条件下反应55min以上，得到合成后的纳米粒子混合物；

(3)将步骤(2)得到的合成后的纳米粒子混合物进行固液分离，收集固体，所得固体即为纳米粒子复合物；或者用水将固体进行洗涤，进行固液分离收集固体，得到纳米粒子复合物。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，混合物中葛根提取物的浓度为15～25mg/mL，壳聚糖的浓度为0.5～1.0％，HAuCl₄·3H₂O的浓度为1.0～3.0mM；

优选的，步骤(1)中，混合物中葛根提取物的浓度为23mg/mL，壳聚糖的浓度为0.6％，HAuCl₄·3H₂O的浓度为2.0mM；

优选的，步骤(1)中，所述壳聚糖是溶解成壳聚糖溶液后加入的；

优选的，壳聚糖溶液的制备方法为将壳聚糖溶解到醋酸溶液中，制得壳聚糖溶液；

优选的，将壳聚糖溶解到1～2％的冰醋酸溶液中，制得壳聚糖溶液，所得溶液中壳聚糖的浓度为5～15％；

优选的，将壳聚糖溶解到2％的冰醋酸溶液中，制得壳聚糖溶液，所得溶液中壳聚糖的浓度为10％。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，混合物在50～60℃条件下反应60～70min；

优选的，步骤(2)中，混合物在60℃条件下反应60min。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，固液分离是通过10,000rpm以上，离心10min以上进行分离；

用水将固体进行洗涤3次以上；

优选的，步骤(3)中，固液分离是通过12,000rpm，离心10min以上进行分离；

优选的，步骤(1)或步骤(3)中，所用水为去离子水、蒸馏水或重蒸水。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

①在去离子水中加入葛根提取物、壳聚糖和HAuCl₄·3H₂O得到混合物，使混合物中葛根提取物浓度为23mg/mL、壳聚糖浓度为0.6％、HAuCl₄·3H₂O浓度为2mM；将混合物在60℃反应60min，得到合成后的纳米粒子混合物；

壳聚糖是利用2％的冰醋酸溶液溶解成10％的壳聚糖溶液后加入；

②将步骤①得到的合成后的纳米粒子混合物通过12,000rpm离心20min，收集固体，即为纳米粒子复合物；

或者使用去离子水对收集的固体进行洗涤，通过12,000rpm离心20min固液分离，收集固体，进行洗涤3次以上，得到纳米粒子复合物。

8.权利要求1-2任一项所述纳米粒子复合物或权利要求3-7任一项所述的制备方法中所述葛根提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将切成块状、片状、颗粒状或粉末状的葛根样品在68～72％乙醇溶液中浸泡23～25h，浸泡后固液分离，收集提取液，所述提取过程重复2～3次，将提取液合并，并在38～42℃浓缩去除溶剂乙醇，最后进行冷冻干燥得到葛根提取物；

优选的，所述葛根提取物的制备方法，包括如下步骤：将切成块状、片状、颗粒状或粉末状的葛根样品在70％乙醇溶液中浸泡24h，浸泡后过滤收集滤液，所述提取过程重复3次，将提取液合并，利用40℃的旋转蒸发仪去除溶剂乙醇，最后进行冷冻干燥得到葛根提取物；

优选的，所述葛根提取物的制备方法中，将切成块状、片状、颗粒状或粉末状的葛根样品浸泡于5倍体积的70％乙醇溶液中，在37℃的条件下，100rpm提取24h，提取完成后，通过过滤分离固体残渣，收集提取液，重复所述提取步骤3次，并将所有提取液合并，利用40℃的旋转蒸发仪去除溶剂乙醇，最后进行冷冻干燥得到葛根提取物；

优选的，所述方法中，葛根为粉葛根；

优选的，所述方法中，葛根为干燥葛根。

9.一种治疗溃疡性结肠炎的组合物，其特征在于，包括葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素6”-O-木糖苷、大豆苷元、6-羟基大豆苷元、芒柄花素、染料木苷、葛根素芹菜糖苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、染料木素和6”-O-丙二酰基大豆苷和鸢尾黄素。

10.权利要求1-2任一项所述的纳米粒子复合物、权利要求3-7任一项所述方法制备的纳米粒子复合物或权利要求9所述的组合物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用；

优选的，一种治疗溃疡性结肠炎的药物，含有权利要求1-2任一项所述的纳米粒子复合物、权利要求3-7任一项所述方法制备的纳米粒子复合物或权利要求9所述的组合物。