CN119876256B - 一种利用基因沉默技术调控植物黄萎病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用基因沉默技术调控植物黄萎病抗性的方法，属于生物基因工程技术领域。本发明提供一种沉默植物中RAB5同源基因的基因沉默载体，并利用所述基因沉默载体基于TRV介导的VIGS技术沉默所述基因。本发明通过沉默RAB5同源基因的方法，发现其与植物抗病性紧密，进而为研究棉花的种质资源的遗传育种提供新的基因。本发明实施例中在获得GhARA6与GhARA7表达量低的棉花植株后，接种大丽轮枝菌，结果显示沉默基因GhARA6/GhARA7的植物对黄萎病展现出更强的抗病性。

Description

一种利用基因沉默技术调控植物黄萎病抗性的方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因沉默技术调控植物黄萎病抗性的方法。

背景技术

ARA6(RABF1)/ARA7(RABF2b)是植物中RAB5的同源基因，两者都属于Rab蛋白，Rab蛋白属于Ras超级家族中的小GTP酶，作为细胞内运输系统的“指挥官”，调控细胞内的囊泡形成、转运、锚定及囊泡与质膜的融合等过程，并且在细胞内吞和分泌途径中发挥分子开关的作用。Rab5敲除以后，不管是早期内吞小体、晚期内吞小体还是溶酶体的数量均呈现显著性减少，并且细胞的内吞作用也会受到抑制。

TRV介导的VIGS沉默(Virus-induced gene silencing，病毒诱导的基因沉默)是一种研究植物基因功能的重要方法，具有简便、快速高效、不需要对植物进行复杂遗传转化和可以对致死基因进行功能研究等特点。然而目前还没有关于沉默ARA6/ARA7的基因表达以及基因沉默后性状变化的相关研究。

发明内容

本发明提供了一种利用基因沉默技术调控植物黄萎病抗性的方法，沉默RAB5的同源基因后，植物表现出更强的抗病性。

本发明提供了一种沉默植物中RAB5同源基因的基因沉默载体，包括以病毒诱导的基因沉默载体为基础载体，连接针对所述RAB5同源基因设计的VIGS沉默片段；

所述VIGS沉默片段包括核苷酸序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的片段。

本发明一个优选方式中，所述基础载体包括TRV载体。

本发明一个优选方式中，扩增SEQ ID No.1所示片段的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物。

本发明一个优选方式中，扩增SEQ ID No.2所示片段的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的上游引物和SEQ ID No.6所示的下游引物。

本发明还提供了上述基因沉默载体在提高植物病害抗性中的应用。

本发明一个优选方式中，所述植物包括棉花。

本发明一个优选方式中，所述病害包括黄萎病。

本发明还提供了一种提高植物对病害抗性的方法，包括利用上述基因沉默载体将植物基因组中的RAB5同源基因进行表达抑制。

本发明一个优选方式中，当所述植物为棉花时，所述RAB5同源基因包括GhARA6和/或GhARA7。

本发明还提供了上述基因沉默载体或上述方法在创制植物种质中的应用。

有益效果：本发明提供一种沉默植物中RAB5同源基因的基因沉默载体，并利用所述基因沉默载体基于TRV介导的VIGS技术沉默所述基因。在本发明实施例中，根据图1所示流程，针对棉花中的目标基因ARA6(RABF1)/ARA7(RABF2b)分别构建VIGS载体，将含有编码所述序列的DNA片段连接到携带TRV2的载体中，用构建的基因沉默载体转化棉花，实现对GhARA6与GhARA7的基因沉默，进而获得了两株分别GhARA6与GhARA7表达量降低的棉花植株。

本发明通过沉默RAB5同源基因的方法，发现其与植物抗病性紧密，进而为研究棉花的种质资源的遗传育种提供新的基因。本发明实施例中在获得GhARA6与GhARA7表达量低的棉花植株后，接种大丽轮枝菌，结果显示沉默基因GhARA6/GhARA7的植物对黄萎病展现出更强的抗病性。

附图说明

图1为本发明实验流程图；

图2为基因GhARA6和GhARA7的cDNA序列扩增结果图；

图3为TRV2载体的酶切结果图；

图4为GhARA6和GhARA7的TRV-VIGS载体图谱；

图5为菌落PCR鉴定结果图；

图6为目的基因的相对表达量结果图，(a)中TRV:GhCLA1为阳性对照，TRV:00为空白载体对照，阳性对照植物在VIGS注射后10天变白，与对照组相比，其他实验组未发现显著的发育表型；(b)为植物中Gh-ARA6基因的相对表达量；(c)为植物中Gh-ARA7基因的相对表达量；

图7为发病棉花中大丽轮枝菌生物量结果图；

图8为陆地棉TM-1接种大丽轮枝菌后的疾病表型。

具体实施方式

本发明提供了一种沉默植物中RAB5同源基因的基因沉默载体，包括以病毒诱导的基因沉默载体为基础载体，连接针对所述RAB5同源基因设计的VIGS沉默片段；

所述VIGS沉默片段包括核苷酸序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的片段。

本发明对所述植物的种类并没有特殊限定，利用本领域的常规植物即可，如一个实施例中以棉花为例进行实验，但是不能仅将其认定为本发明得全部保护范围。

本发明利用TRV介导的VIGS技术沉默基因ARA6和/或ARA7，其中ARA6:>XM_041078078.1，LOC121207708，本发明一个实施例中针对所述ARA6的cDNA序列设计VIGS沉默片段，如SEQ ID No.1所示：

AGTGATGGCCTTGGTTGGTAATAAAGCCGACCTTCAGGAAAAGCGCGAAGTACCAGTCCAAGATGGCATTGACTATGCAGAGAAGAATGGGATGTTCTTTATTGAGACATCTGCCAAGACTGCGGACAATATAAATCAGTTGTTTGAGGAAATTGCCAAGCGGCTGCCACGTCCATCACCTTCATG。

本发明所述基因ARA7：>XM_016897970.2，LOC107961815，一个实施例中针对所述ARA7的cDNA序列设计VIGS沉默片段如SEQ ID No.2所示：

GGAAGGTGGCAACAGAGGAAGCACAAACTTATGCTCAGGAGAATGGTCTTTTCTTCATGGAAACTTCTGCAAAGACCGCATCCAATGTCAATGAACTTTTCTATGAAATAGCTAAAAGATTACCTCGAGTGCAGCCAGCACAAAATCCTGCTGGAATGGTTCTCATGGATAGACCTTCAGAAC。

本发明以所述植物的cDNA为模板，利用设计带有同源臂的引物扩增需要沉默基因的VIGS沉默片段，在一个实施例中利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物对扩增GhARA6的VIGS沉默片段，利用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物对扩增GhARA7的VIGS沉默片段。各引物序列依次如下所示：

M-ARA6-F:aaggttaccgaattctctagaAGTGATGGCCTTGGTTGGTAAT；

M-ARA6-R:tgtcttcgggacatgcccgggCATGAAGGTGATGGACGTGGC；

M-ARA7-F:aaggttaccgaattctctagaGGAAGGTGGCAACAGAGGAAG；

M-ARA7-R:tgtcttcgggacatgcccgggGTTCTGAAGGTCTATCCATGAGAACC。

本发明进行所述扩增时，扩增体系以50μL计，包括：2×PhantaMax Master Mix25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、cDNA模板2μL和余量的RNase-free ddH₂O；其中用于配置扩增体系的试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；扩增程序包括：预变性95℃3min，变性95℃15sec，退火58℃15sec，延伸72℃45s，循环数30cycles；彻底延伸72℃5min。

本发明利用双酶切的方法将扩增得到的VIGS沉默片段插入基础载体中，一个实施例中所用的酶为XbaI和SmaI，如利用同源重组的方法连接到TRV2载体上，构建得到GhARA6与GhARA7的TRV-VIGS载体。

本发明还提供了上述基因沉默载体在提高植物病害抗性中的应用。

本发明一个优选方式中，所述植物包括棉花，所述病害包括黄萎病，一个实施例中，利用GhARA6与GhARA7基因被沉默的棉花植株进行验证，发现GhARA6和GhARA7任一基因被沉默后，都能显著提升对大丽轮枝菌的抗性，从而提高对黄萎病的抗性。

本发明还提供了一种提高植物对病害抗性的方法，包括利用上述基因沉默载体将植物基因组中的RAB5同源基因进行表达抑制。

本发明一个优选方式中，当所述植物为棉花时，所述RAB5同源基因包括GhARA6和/或GhARA7。在进行所述基因的沉默时，一个实施例中，将上述构建的GhARA6与GhARA7的TRV-VIGS载体分别转入农杆GV3101感受态细胞中，而后利用含有GhARA6和/或GhARA7的TRV-VIGS载体的农杆菌侵染棉花，从而获得GhARA6和/或GhARA7被沉默的棉花植株。

本发明还提供了上述基因沉默载体或上述方法在创制植物种质中的应用。

利用本发明所述方法沉默GhARA6和/或GhARA7后，棉花植株展现出更高的疾病抗性，如由大丽轮枝菌引发的棉花黄萎病。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种利用基因沉默技术调控植物黄萎病抗性的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

利用TRV介导的VIGS技术沉默基因ARA6/ARA7：

1.针对基因GhARA6和GhARA7的cDNA序列设计如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的TRV-VIGS的基因片段，并基于所述片段设计带有同源臂的引物M-ARA6-F和M-ARA6-R，以及M-ARA7-F和M-ARA7-R。

2.以陆地棉TM-1的棉花叶片cDNA为模板，以上述引物为上下游引物进行PCR扩增得到带有同源臂的基因片段，PCR扩增试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司。扩增结果如图2所示，表明成功扩增得到GhARA6和GhARA7的cDNA片段。

3.TRV2载体的酶切

20μL反应体系:空载体TRV21μL、10×buffer2μL、0.1％BSA2μL、Xbal 1μL、SmaI 1μL和ddH₂O 12μL，37℃酶切4h。酶切结果如图3所示，可切出一长一短两个片段。

4.将其以同源重组的方法连接到携带TRV2的载体上

20μL反应体系:双酶切载体1μL、目的基因3μL、2×CE Mix 5μL和ddH₂O1μL。利用PCR仪50℃10min，而后4℃保温，分别构建得到图4所示的GhARA6和GhARA7的TRV-VIGS载体。

5.转入农杆GV3101

(1)、从-80℃冰箱取出GV3101感受态细胞，将其在冰上融化5分钟，再加入1μL的载体质粒，冰上静置30分钟。

(2)、将其迅速放入预冷的液氮中进行速冻处理，持续5分钟之后，立即将EP管转移到37℃的水浴中，进行5分钟的热激处理。

(3)、热激处理完成后，加入600μL不含抗生素的液体LB培养基。置于摇床中，设置温度为28℃，转速为200rpm，进行振荡培养2至3小时。

(4)、以5000rpm的转速离心EP管1分钟，吸出500μL的培养基，用移液枪将剩余的200μL菌体吹打均匀，将其涂布在含有卡那霉素(Kan)和利福平(Rif)的固体LB培养基上。

(5)、放置于28℃的培养箱中培养大约2天。挑选单菌落进行菌落PCR鉴定，并通过凝胶电泳进行验证，如图5所示。

6.将分别含有GhARA6与GhARA7的TRV-VIGS载体的农杆菌侵染棉花：

(1).棉苗的种植

陆地棉TM-1棉花种子在自来水中泡8h以上，在人工气候室中培养棉花幼苗，直至出苗后大约8天，此时子叶完全展开，棉花二叶一心。

(2).侵染液的配制

分别将含有GhARA6与GhARA7的TRV-VIGS载体的农杆菌于100ml加有Kan和Rif的LB液体培养液中，放置在28℃摇床上，200rpm摇24h左右，离心收集菌落。

配制100ml的重悬液：1ml MgCI₂、1ml MES、100μLAS，加无菌水至100ml。将含有TRV1和目标基因片段的TRV2重悬液按照1:1的体积比例进行混合，以制备用于棉花子叶注射的溶液。

(3).棉花注射

将配好的侵染液注射到棉花子叶上，每株棉花注射三片叶子，每片叶子注射面积至少为叶片面积的2/3，每个基因注射12株。

(4).验证沉默效率

提取侵染的植株叶片RNA，根据试剂盒提取完成侵染的棉花叶片的RNA，放置在-20℃保存。反转录，将提取的经过注射的棉花RNA反转录为cDNA，放-20℃备用。

以棉花的EIF4α作为内参基因，GhARA6与GhARA7中的非VIGS片段作为qPCR片段，配置25μL体系：2×SuperRealPreMix Plus 12.5μL、正向引物(10μM)0.75μL、反向引物(10μM)0.75μL、cDNA模板1μL和RNase-free ddH₂O 10μL。

qEIF4α-F(SEQ ID No.7):ACATGGACCAGAACACTCGT；

qEIF4α-R(SEQ ID No.8):AACCTTCCACTTCGTCCGAT；

qARA6-F(SEQ ID No.9):GCTTTGCAGGAACACTTCTCTC；

qARA6-R(SEQ ID No.10):TGGGGTCAAACCTGAAATTATTAAA；

qARA7-F(SEQ ID No.11):GGCCACCACTGGAAACAAGAAC；

qARA7-R(SEQ ID No.12)：CGGCCAATGTCTGGGAAAAGA；

采用比较CT法计算目的基因的相对表达量，目的基因的相对表达量＝其中△△Ct＝(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_实验组-(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_对照。实验结果设3个重复，取平均值进行作图分析。

结果如图6所示，以TRV:GhCLA1为阳性对照，TRV:00为空白载体对照，阳性对照植物在VIGS注射后10天变白，与对照组相比，其他实验组未发现显著的发育表型；且相比于对照组，实验组中植物Gh-ARA6基因和Gh-ARA7基因的相对表达量均降低。

筛选基因沉默成功的棉花进行后续大丽轮枝菌的接种实验：

(5).大丽轮枝菌的活化与培养

取-80℃中的大丽轮枝菌在PDA固体培养基上涂板，20℃培养箱活化5天，在超净工作台中切成1cm左右的小块加到提前配好的察氏培养基中，每100mL培养基加5个菌块左右，放置于25℃摇床，200rpm摇7d左右。

(6).接种病原菌侵染液的配制

利用分光光度计测菌液OD₆₀₀在1.0左右后，用自来水稀释5～8倍制成病原菌侵染液。

(7).接种方法

利用灌根法，每株棉花在根部浇50mL的大丽轮枝菌侵染液，并于25天左右观察统计接种大丽轮枝菌的棉花的发病情况

病级描述：0级-棉株健康，无病叶，生长正常；1级-棉株四分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；2级-棉株四分之一以上，二分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；3级-棉株二分之一以上，四分之三以下叶片发病，变黄萎蔫；4级-棉株四分之三以上叶片发病，或棉株枯死。

病情指数＝∑(各级病级株数×各级病级指数)÷(调查总株数×最高级指数)×100％。

(8).统计发病棉花中大丽轮枝菌生物量

利用qRT-PCR的方法统计发病棉花中大丽轮枝菌生物量，并以棉花的EIF4α作为内参基因，大丽轮枝菌特异性引物如下：

VdEF-α-F(SEQ ID No.13)：5′-TGAGTTCGAGGCTGGTATCT-3′；

VdEF-α-R(SEQ ID No.14)：5′-CACTTGGTGGTGTCCATCTT-3′。

25μL体系：2×SuperReal PreMix Plus 12.5μL、正向引物(10μM)0.75μL、反向引物(10μM)0.75μL、cDNA模板1μL和RNase-free ddH₂O 10μL。

计算相对表达量：方法同上。结果如图7所示，TRV:GhARA6和TRV:GhARA7，相比于TRV:00大丽轮枝菌生物量显著降低。

陆地棉TM-1接种大丽轮枝菌后的疾病表型如图8所示，接种大丽轮枝菌30天后，各实验组黄萎病的发生率从严重到健康依次为：TRV:00>TRV:GhARA6,TRV:GhARA7。在未接种大丽轮枝菌的对照实验组中，未发现棉花有黄萎病。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种沉默植物中RAB5同源基因的基因沉默载体，其特征在于，包括以病毒诱导的基因沉默载体为基础载体，连接针对所述RAB5同源基因设计的VIGS沉默片段；

所述VIGS沉默片段为核苷酸序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的片段；

所述基础载体为TRV载体。

2.权利要求1所述基因沉默载体在提高植物病害抗性中的应用，其特征在于，所述植物为棉花，所述病害为黄萎病。

3.一种提高植物对病害抗性的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述基因沉默载体将植物基因组中的GhARA6和/或GhARA7进行表达抑制；

所述植物为棉花，所述病害为黄萎病。