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CN119876176A - 一种基于rna病毒诱导的叶菜类蔬菜沉默体系及其构建方法和应用 - Google Patents

一种基于rna病毒诱导的叶菜类蔬菜沉默体系及其构建方法和应用 Download PDF

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CN119876176A
CN119876176A CN202510038193.8A CN202510038193A CN119876176A CN 119876176 A CN119876176 A CN 119876176A CN 202510038193 A CN202510038193 A CN 202510038193A CN 119876176 A CN119876176 A CN 119876176A
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brpds
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杨亮
龙海城
周玉洁
李菊
常伟
李志�
苗明军
钟建
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Horticulture Research Institute of Sichuan Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Horticulture Research Institute of Sichuan Academy of Agricultural Sciences
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Abstract

本发明提供了一种基于RNA病毒诱导的叶菜类蔬菜沉默体系及其构建方法和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过构建pTRV2‑BrPDS、pTRV2‑BjuPDS‑g和pTRV2‑BrPDS‑c沉默表达载体，将沉默表达载体导入上海青和芥菜叶片，成功地应用VIGS技术沉默了内源PDS基因，导致上海青和芥菜植株产生不同程度的白化表型，为研究上海青和芥菜基因功能提供了技术支持，有助于加快上海青和芥菜功能基因研究的速度。

Description

一种基于RNA病毒诱导的叶菜类蔬菜沉默体系及其构建方法 和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种基于RNA病毒诱导的叶菜类蔬菜沉默体系及其构建方法和应用。
背景技术
病毒诱导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing，VIGS)是一种快速验证植物基因功能的方法。VIGS能够特异性结合并降解转录产生的mRNA，引起目的基因沉默，对沉默个体进行分析即可确定基因的功能。VIGS一般在整个植株水平引起基因沉默，该方法无需进行植物稳定遗传转化，且不改变基因组DNA序列，但可以产生与突变体相似的表型特征，是一种快速有效解析基因功能的方法。
上海青(Brassica rapa subsp.chinensis)又称小白菜，隶属于十字花科芸薹属，富含抗坏血酸，硫代葡萄糖苷、萝卜硫素等营养物质，具有较高的营养价值。芥菜(Brassicajuncea(L.)Czern.)隶属于十字花科芸薹属，富含维生素，且具有利肺豁痰，消肿散结等功效。目前并没有关于以上海青和芥菜为研究对象，通过VIGS系统对其内源PDS基因进行沉默的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于RNA病毒诱导的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系，将沉默体系导入上海青和芥菜叶片，应用VIGS技术沉默了内源PDS基因。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种基于RNA病毒诱导的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系，包括载体pTRV1和含有目的基因片段的重组载体pTRV2，所述目的基因片段包括BrPDS、BjuPDS-g和BjuPDS-c中的任意一种。
优选的，所述目的基因片段BrPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述目的基因片段BjuPDS-g的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述目的基因片段BjuPDS-c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，BrPDS片段的克隆方法包括：提取上海青总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列为引物，扩增获得带有同源臂的BrPDS片段；BjuPDS-g片段的克隆方法包括：提取抱子芥总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的核苷酸序列为引物，扩增获得带有同源臂的BjuPDS-g片段；BjuPDS-c片段的克隆方法包括：提取结球芥总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的核苷酸序列为引物，扩增获得带有同源臂的BjuPDS-c片段。
本发明的另一目的在于提供所述的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系在沉默叶类蔬菜PDS基因中的应用，将含有目的基因片段的重组载体pTRV2转化大肠杆菌DH5α感受态细胞制备重组质粒，将重组质粒和载体pTRV1分别转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，获得含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液，将含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液混合获得侵染液，将侵染液注射到叶菜类蔬菜叶片。
优选的，所述叶类蔬菜为上海青、抱子芥和结球芥。
优选的，所述侵染液含有连接BrPDS片段的重组载体pTRV2时，注射到上海青叶片；所述侵染液含有连接BjuPDS-g片段的重组载体pTRV2时，注射到抱子芥叶片；所述侵染液含有连接BjuPDS-c片段的重组载体pTRV2时，注射到结球芥叶片。
优选的，注射到上海青叶片时，所述侵染液OD600＝0.3～1.0；注射到抱子芥叶片时，所述侵染液OD600＝0.5～0.8；注射到结球芥叶片时，所述侵染液OD600＝0.5～1.0。
优选的，含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液按体积比1:1混合。
优选的，所述叶菜类蔬菜为6片真叶期。
本发明的另一目的在于提供一种检测叶类蔬菜PDS基因的试剂盒，所述试剂盒包括：检测上海青BrPDS基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID No.20和SEQ IDNo.21所示；检测抱子芥BjuPDS-g基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示；检测结球芥BjuPDS-c基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQIDNo.26和SEQ ID No.27所示。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种基于RNA病毒诱导的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系，通过构建pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS-g和pTRV2-BrPDS-c沉默表达载体，将沉默表达载体导入上海青和芥菜叶片，成功地应用VIGS技术沉默了内源PDS基因，导致上海青和芥菜植株产生不同程度的白化表型，为研究上海青和芥菜基因功能提供了技术支持，有助于加快上海青和芥菜功能基因研究的速度。
附图说明
图1为基于TRV的VIGS载体结构，其中，Replicase：依赖于RNA的RNA聚合酶；16KDa：16kDa富半胱氨酸蛋白；MP：移动蛋白；CP：外壳蛋白；LB和RB：T-DNA左右边界；Rz：自剪切核酸酶；MCS：多克隆位点；
图2为不同PDS蛋白氨基酸序列比对；
图3为接种不同浓度农杆菌对植株产生白化表型的影响，其中，A为上海青BrPDS基因沉默株率，B为抱子芥BjuPDS-g基因沉默株率，C为结球芥BjuPDS-c基因沉默株率；
图4为BrPDS沉默植株呈现白化表型，其中，A接种浓度OD600＝0.3；B接种浓度OD600＝0.5；C接种浓度OD600＝0.8；D接种浓度OD600＝1.0；各图中均为左边为对照组，右边为实验组，上排为叶片上表面，下排为叶片下表面；标尺＝1cm；
图5为芥菜内源PDS基因下调导致植株叶片白化现象，A抱子芥接种浓度OD600＝0.3；B抱子芥接种浓度OD600＝0.5；C抱子芥接种浓度OD600＝0.8；D抱子芥接种浓度OD600＝1.0；E结球芥接种浓度OD600＝0.3；F结球芥接种浓度OD600＝0.5；G结球种浓度OD600＝0.8；H结球芥接种浓度OD600＝1.0；各图中均为上边为对照组，下边为实验组，最右侧叶片为注射叶片，最左侧叶片为新生叶片，中间叶片为未注射叶片；标尺＝1cm；
图6为芥菜内源PDS基因下调导致植株花序白化现象，其中，A为不同侵染液浓度处理抱子芥，花序呈现白化表型，B为不同侵染液浓度处理结球芥，花序呈现白化表型；各图中均为左边为对照组，右边为实验组；标尺＝1mm。；
图7为芥菜内源PDS基因下调导致植株花冠白化现象，其中，A为不同农杆菌浓度处理抱子芥，花冠呈现白化表型；B为不同农杆菌浓度处理结球芥，花冠呈现白化表型；各图中均为左边为对照组，右边为实验组；标尺＝1mm；
图8为注射叶片中的TRV1和TRV2 RNA，其中，A为上海青；B为抱子芥；C为结球芥；
图9为内源PDS基因表达水平，其中，A为上海青；B为抱子芥；C为结球芥。
具体实施方式
本发明提供了一种基于RNA病毒诱导的叶菜类蔬菜PDS沉默体系，包括载体pTRV1和含有目的基因片段的重组载体pTRV2，所述目的基因片段包括BrPDS、BjuPDS-g和BjuPDS-c中的任意一种。
本发明中，所述目的基因片段BrPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ACCTGATCGCGTGACTGATGAAGTGTTTATAGCCATGTCAAAGGCACTTAACTTTATAAACCCGAACGAACTGTCAATGCAATGCATTTTGATAGCTTTGAACCGGTTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAGATGGCCTTCTTAGATGGTAATCCTCCGGAGAGGCTATGCATGCCGATTGTTGAACATATTCGATCGCTAGGTGGCGAAGTACGACTCAATTCAAGGATAAGGAAGATTGAACTGGAGGATGATGGTACGGTTAAGAATTTCTTACTCACTGATGGAACCACTATCCAAGGAGACGCT(SEQ ID NO.1)。
所述基因BrPDS的开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示：
ATGGTTGTGTTTGGGAATGTTTCTGCAGCGAATTTGCCTTATCAAAATGGGGTTTTGGAGGCACTTTCATCTGAATTGATGGGACACAGCAGCTTCAGAGTTCCGATCTCTTCACAAGGGCTTAAGACAAGAACAAGGCGAAGGACTGCTGGTCCTTTGCAGGTAGTGTGTGTGGATATACCAAGGCCAGAGCTAGAGAACACTGTCAATTTCTTGGAAGCTGCAAGTTTGTCTGCATCTTTCCGTAGTGCTCCTCGTCCTGCAAAGCCTTTAAAAGTTGTCATTGCTGGTGCTGGATTGGCTGGGCTGTCAACTGCAAAGTACCTGGCCGATGCAGGCCACCAACCTCTCTTGCTCAAAGCAAGAGATGTTCTTGGTGGAAAGATAGCTGCATGGAAGGATGAAGATGGAGATTGGTATGAAACCGGTTTACATATATTTTTCGGTGCTTATCCGAACGTGCAGAACTTATTTGGAGAACTTGGGATTAATGATCGGTTGCAATGGAAGGAACACTCCATGATATTCGCCATGCCAAGTAAACCTGGAGAATTTAGTAGATTTGATTTCCCAGATGTTCTACCAGCACCCTTAAACGGTATTTGGGCAATTTTGAGGAACAACGAGATGCTGACATGGCCAGAGAAAATAAAGTTTGCTATTGGACTGCTTCCAGCAATGGTCGGAGGTCAGGCTTATGTTGAGGCCCAAGATGGTTTATCAGTTGAAGAATGGATGAGAAAGCAGGCAATACCTGATCGCGTGACTGATGAAGTGTTTATAGCCATGTCAAAGGCACTTAACTTTATAAACCCGAACGAACTGTCAATGCAATGCATTTTGATAGCTTTGAACCGGTTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAGATGGCCTTCTTAGATGGTAATCCTCCGGAGAGGCTATGCATGCCGATTGTTGAACATATTCGATCGCTAGGTGGCGAAGTACGACTCAATTCAAGGATAAGGAAGATTGAACTGGAGGATGATGGTACGGTTAAGAATTTCTTACTCACTGATGGAACCACTATCCAAGGAGACGCTTATGTGTTTGCCACTCCAGTCGATATCCTGAAGCTCCTTTTGCCGGATTCATGGAAAGAAATACCATACTTCAAGAGACTGGAGAAGTTAGTTGGTGTTCCAGTCATTAACGTTCATATATGGTTCGATCGGAAACTGAAGAACACATATGATCACTTGCTCTTTAGCAGAAGTAACCTTCTGAGTGTGTATGCAGACATGTCGTTAACTTGTAAGGAATATTACGATCCAAACCGATCAATGCTGGAGCTAGTATTTGCACCTGCAGAGGAATGGATATCACGGACTGACTCTGACATCATCGATGCAACAATGAAAGAGCTAGAGAAAATCTTCCCTGACGAAATAGCAGCTGACCAAAGCAAAGCTAAAATTCTCAAGTACCATGTCGTCAAAACTCCAAGGTCCGTGTACAAGACCATCCCAGACTGTGAACCATGTCGTCCTCTACAGAGATCTCCTATTCAAGGCTTTTACTTAGCTGGAGACTACACTAAACAGAAGTACTTAGCTTCCATGGAAGGCGCCGTTCTCTCTGGCAAATTCTGCTCACAGTCTATTGTGCAGGATTATGAGCTATTGGCTTCCTCTGGACGCCGAAACTTGTCGGAGACAACTGTATCAACATGA(SEQ ID NO.30)。
本发明中，所述目的基因片段BjuPDS-g的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
ACCTGATCGCGTGACTGATGAGGTGTTTATTGCTATGTCAAAGGCGCTAAACTTTATAAACCCGGACGAACTGTCGATGCAATGCATATTGATAGCTTTGAATCGGTTTCTTCAGGAGAAACATGGATCGAAGATGGCGTTCTTAGATGGTAATCCACCGGAGAGGCTTTGTATGCCAATAGTGGAACATATTAGATCACTAGGTGGGGAGGTAAGACTTAACTCAAGGATAAGGAAGATTGAGCTCGAGAATGATGGTACCGTTAAGAATTTCTTACTCACTGATGGCACCACTATCCAAGGAGACGCT(SEQ ID NO.2)。
所述基因BjuPDS-g的开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示：
ATGGTTGTGTTTGGGAATGTTTCTGCAGCGAATTTGCCTTATCAAAATGGGTTTTTCAAGGCAATTTCATCTGGAGGTTGTGATTTAATGGGACACCGTAGCTTCAGAATTTCAACTTCTTTCAAGACAAGAACAAGGAGGAGGAGTGCTGGTGGTCCTTTGCAGGTGGTTTGTGTGGATATACCAAGGCCAGAGCTAGAGAACACTGTCAACTTCTTGGAAGCTGCAAGTTTGTCCGCATCTTTCCGTAGTGCTCCTCGTCCTGCAAAGCCTTTAAAAGTTGTGATCGCTGGTGCTGGATTGGCTGGATTGTCAACAGCAAAGTACCTGGCTGATGCAGGACATAAACCTCTGTTGCTCGAAGCAAGAGATGTTCTTGGTGGAAAGATAGCTGCATGGAAGGATGAAGATGGAGATTGGTATGAAACCGGTCTACATATATTTTTTGGTGCTTATCCGAATGTGCAAAACTTATTTGGAGAACTTGGGATCAATGATCGGTTGCAGTGGAAGGAACACTCCATGATTTTCGCCATGCCAAGTAAACCTGGGGAATTTAGTAGATTTGATTTCCCAGATGTCCTACCAGCACCTTTAAACGGTATATGGGCTATTTTGAGGAACAACGAGATGCTGACATGGCCAGAGAAAATAAAGTTTGCTATTGGACTTCTTCCGGCTATGGTCGGAGGTCAGGCTTATGTTGAGGCTCAAGATGGTTTATCAGTTGAACAATGGATGAGAAAGCAGGGAGTACCTGATCGCGTGACTGATGAGGTGTTTATTGCTATGTCAAAGGCGCTAAACTTTATAAACCCGGACGAACTGTCGATGCAATGCATATTGATAGCTTTGAATCGGTTTCTTCAGGAGAAACATGGATCGAAGATGGCGTTCTTAGATGGTAATCCACCGGAGAGGCTTTGTATGCCAATAGTGGAACATATTAGATCACTAGGTGGGGAGGTAAGACTTAACTCAAGGATAAGGAAGATTGAGCTCGAGAATGATGGTACCGTTAAGAATTTCTTACTCACTGATGGCACCACTATCCAAGGAGACGCTTATGTCTTTGCCACTCCAGTCGATATCCTGAAGCTTCTTTTGCCTGATTCATGGAAAGAGATACCATACTTCAAGAGATTGGAGAAGTTAGTTGGTGTGCCAGTTATCAACGTTCATATATGGTTTGATCGAAAACTAAAGAACACATATGATCATTTACTCTTTAGCAGAAGTAACCTTCTGAGTGTGTATGCTGACATGTCGTTAACTTGTAAAGAATATTACGATCCTAACCGGTCAATGCTGGAGCTAGTATTTGCACCTGCAGAGGAATGGATATCAAGGACCGACTCTGACATCATTGATGCAACCATGAAAGAGCTCGAGAAACTCTTCCCTGACGAAATCTCAGCTGACCAAAGCAAAGCTAAAATTCTCAAGTACCATGTTGTCAAAACTCCAAGGTCTGTGTACAAGACCATCTCAGACTGTGAACCATGTCGTCCACTACAAAGATCTCCTATTAAAGGATTCTACTTAGCTGGGGACTACACAAAACAGAAGTACTTAGCTTCCATGGAAGGCGCCGTTCTCTCTGGCAAATTCTGCTCAGAGTCTATTCTACAGGATTACGAGCTATTGGCTGCTGCGTCTGGACCGCAAAAGTTGTCGGAGACAACTGTATCAACATGA(SEQ ID NO.31)。
本发明中，所述目的基因片段BjuPDS-c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ACCTGATCGCGTGACTGATGAGGTGTTTATAGCCATGTCAAAGGCGCTTAACTTTATAAACCCCGACGAACTCTCAATGCAATGCATTTTGATAGCTTTGAACCGGTTTCTTCAGAGAAACATGGGTTCCAAGATGGGCTTCTTAGATGGTAATCCCCCGGAGAGGCTATGCATGCCGATTGTTGAACATATTCGATCACTATGTGGTGAAGTACGACTCAATTCAAGGATAAGGAAGATTGAGCTGGAGGATGATGGTACGGTTAAGAATTTCTTACTCACTGATGGAACCACTATCCAAGGAGACGCT(SEQ ID NO.3)。
所述基因BjuPDS-c的开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示：
ATGGTTGTGTTTGGGAATGTTTCTGCAGCGAATTTGCCTTATCAAAACGGGTTTTTGGAGGCACTTTCATCTGAGTTGATGGGACACAGCAGCTTCAGAATTCCGATTTCTTCACAAGCGCTTAAGACAAGAACAAGGCCAAGGACTGCTGGTCCTTTGCAGGTAGTGTGTGTGGATATACCAAGGCCAGAGCTAGAGAACACAGTCAATTTCTTGGAAGCTGCAAGTTTGTCTGCATCTTTCCGTAGTGCTCCTCGTCCTGCAAAGCCTTTAAAAGTTGTCATTGCTGGTGCTGGATTGGCTGGACTGTCAACCGCAAAGTACCTGGCTGATGCAGGCCACCAACCTCTGTTGCTCGAAGCAAGAGATGTTCTTGGTGGAAAGATTGCTGCATGGAAGGATGAAGATGGAGATTGGTATGAAACCGGTTTACATATATTTTTCGGTGCTTATCCGAATGTGCAGAACTTATTTGGAGAACTTGGGATCAATGACCGGTTACAATGGAAGGAACACTCAATGATTTTCGCCATGCCAAGTAAACCTGGAGAATTTAGTAGATTTGATTTCCCAGACGTTCTACCAGCACCCTTAAACGGTATTTGGGCAATTTTGCGGAACAACGAGATGCTGACATGGCCAGAGAAAATAAAGTTCGCTATTGGACTTCTTCCAGCTATGGTGGGAGGTCAGGCTTATGTTGAGGCCCAAGATGGTTTGTCAGTTGAAGAATGGATGAGAAAGCAGGGAGTACCTGATCGCGTGACTGATGAGGTGTTTATAGCCATGTCAAAGGCGCTTAACTTTATAAACCCCGACGAACTCTCAATGCAATGCATTTTGATAGCTTTGAACCGGTTTCTTCAGAGAAACATGGGTTCCAAGATGGGCTTCTTAGATGGTAATCCCCCGGAGAGGCTATGCATGCCGATTGTTGAACATATTCGATCACTATGTGGTGAAGTACGACTCAATTCAAGGATAAGGAAGATTGAGCTGGAGGATGATGGTACGGTTAAGAATTTCTTACTCACTGATGGAACCACTATCCAAGGAGACGCTTATGTGTTTGCCACTCCAGTCGATATCCTGAAGCTCCTTTTACCGGATTCATGGAAAGAAATACCATACTTCAAGAGGTTGGAGAAGTTAGTTGGTGCTCCAGTCATTAACGTTCATATATGGTTCGATCGGAAACTGAAGAACACATATGATCACTTACTCTTTAGCAGAAGTAACCTTCTGAGCGTGTATGCAGACATGTCGTTAACTTGTAAGGAATATTACGATCCAAACCGATCAATGCTAGAGCTAGTATTTGCACCTGCTGAGGAATGGATATCACGGACCGACTCTGACATCATTGATGCAACAATGAAAGAGCTCGAGAAACTCTTCCCTGACGAGATCGCAGCTGACCAAAGCAAAGCTAAAATTCTCAAGTACCATGTCGTCAAAACTCCAAGGTCTGTTTACAAGACCATCCCAGACTGTGAACCATGTCGTCCTCTACAGAGATCTCCTATTCAAGGCTTTTACTTAGCTGGAGACTACACTAAACAGAAGTACTTAGCTTCCATGGAAGGCGCCGTTCTCTCTGGCAAATTCTGCTCTCAGTCTATTGTGCAGGATTATGAGATATTGGCTGCGTCTGGAGGTCGAAACTTGTCGGAGACAACTGTATCAACATGA(SEQ ID NO.32)。
TRV为双链正义RNA病毒，由RNA1和RNA2两条RNA分子组成，均源自TRV的基因组RNA和亚基因组RNA。RNA1分子编码134KDa和194KDa复制酶与29KDa移动蛋白和16KDa富半胱氨酸蛋白，它的复制和移动不依赖于RNA2。RNA2分子编码外壳蛋白和两个非结构蛋白(图1)。基于TRV病毒构建的Ti质粒的VIGS载体中，T-DNA中RNA1和RNA2的cDNA，由花椰菜花叶病毒(CauliflowerMosaic Virus,CaMV)35S启动子驱动转录，及胭脂碱合酶(nopalinesynthase,NOS)基因的终止子，终止转录。多克隆位点(multiple cloning site,MCS)位于TRVRNA2的cDNA中间，可以用于克隆需要沉默的靶标基因的DNA片段。
本发明中，BrPDS片段的克隆方法包括：提取上海青总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为引物扩增获得BrPDS编码序列(SEQ ID NO.30)，基于BrPDS编码序列为模板，设计SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列为引物，以cDNA第一链为模板扩增获得带有同源臂的BrPDS片段；BjuPDS-g片段的克隆方法包括：提取抱子芥总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列为引物扩增获得BjuPDS-g编码序列(SEQID NO.31)，基于BjuPDS-g编码序列为模板，设计SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的核苷酸序列为引物，以cDNA第一链为模板扩增获得带有同源臂的BjuPDS-g片段；BjuPDS-c片段的克隆方法包括：提取抱子芥总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ IDNo.8和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列为引物扩增获得BjuPDS-c编码序列(SEQ IDNO.32)，基于BjuPDS-c编码序列为模板，设计SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的核苷酸序列为引物，以cDNA第一链为模板扩增获得带有同源臂的BjuPDS-c片段。
本发明中，pTRV2-BrPDS重组质粒的构建包括：将带有源臂的BrPDS片段通过Gibson Assembly技术分别连接至线性pTRV2载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至LB筛选培养基，暗培养。进行菌落PCR，获得阳性克隆，送测序，获得构建成功的pTRV2-BrPDS重组载体；pTRV2-BjuPDS-g重组质粒的构建包括：将带有源臂的BjuPDS-g片段通过Gibson Assembly技术分别连接至线性pTRV2载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至LB筛选培养基，暗培养。进行菌落PCR，获得阳性克隆，送测序，获得构建成功的pTRV2-BjuPDS-g重组载体；pTRV2-BjuPDS-c重组质粒的构建包括：将带有源臂的BjuPDS-c片段通过Gibson Assembly技术分别连接至线性pTRV2载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至LB筛选培养基，暗培养。进行菌落PCR，获得阳性克隆，送测序，获得构建成功的pTRV2-BjuPDS-c重组载体。
本发明的另一目的在于提供所述的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系在沉默叶类蔬菜PDS基因中的应用，将pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS-g和pTRV2-BrPDS-c重组质粒和载体pTRV1分别转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，获得含载体pTRV1的菌液和含pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS-g和pTRV2-BrPDS-c重组质粒的菌液，将含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液按体积比1:1混合获得侵染液，将侵染液注射到叶菜类蔬菜叶片。
本发明中所述应用中，将重组质粒pTRV2和载体pTRV1分别转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，优选将阳性GV3101菌株划线与含有抗生素的LB固体培养基中，所述抗生素由0.05mg/mLKan(卡那霉素)、0.05mg/mL Gent(庆大霉素)和0.05mg/mLRif(利福平)组成；挑选单克隆菌株，接种于LB液体选择培养基，培养至OD600＝0.8；取OD600＝0.8的菌液按1:150的体积比接种于LB液体选择培养基，培养至OD600＝2.0，菌液离心后收集菌体；菌体洗涤后用渗透液重悬菌体为OD600＝2.0，培养4h后，使用渗透液分别稀释含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液，然后将稀释后的含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液按体积比1:1混合获得侵染液。本发明中，所述渗透液的组分为MES、乙酰丁香酮和氯化钠，所述渗透液中，MES的工作浓度为10mM，乙酰丁香酮的工作浓度为20μM，氯化钠的工作浓度为10mM。
本发明中，将含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液稀释为相同的OD600值，然后再等体积混合获得侵染液，所述侵染液的OD600值与上述菌液稀释后的OD600值相同，如将含载体pTRV1的菌液稀释为OD600值为0.3，将含重组载体pTRV2的菌液稀释为OD600值为0.3，再将稀释后的含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液按体积比1:1混合获得侵染液，所述侵染液的OD600值为0.3。
本发明中，所述叶类蔬菜为上海青、抱子芥和结球芥；所述侵染液于叶菜类蔬菜为6片真叶期时注射到叶片；所述侵染液含有连接BrPDS片段的重组载体pTRV2时，注射到上海青叶片，优选所述侵染液OD600＝0.3～1.0；所述侵染液含有连接BjuPDS-g片段的重组载体pTRV2时，注射到抱子芥叶片，优选所述侵染液OD600＝0.5～0.8；所述侵染液含有连接BjuPDS-c片段的重组载体pTRV2时，注射到结球芥叶片，优选所述侵染液OD600＝0.5～1.0。
上海青和芥菜遗传转化体系构建困难，难以获得转基因植株，导致通过常规的转基因技术研究上海青和芥菜基因功能的进展缓慢，本发明通过构建pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS-g和pTRV2-BrPDS-c沉默表达载体，将沉默表达载体导入上海青和芥菜叶片，为研究上海青和芥菜基因功能提供了技术支持。
本发明还提供了一种检测叶类蔬菜PDS基因的试剂盒，所述试剂盒包括：检测上海青BrPDS基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示；检测抱子芥BjuPDS-g基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID No.24和SEQIDNo.25所示；检测抱子芥BjuPDS-c基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ IDNo.26和SEQ ID No.27所示。
将沉默表达载体导入上海青和芥菜叶片后，利用本发明试剂盒中的引物组通过定量qRT-PCR分析，可确定侵染植株中内源性PDS基因是否沉默。
本发明具体实施例中，载体为pTRV1和pTRV2(购自美国拟南芥生物资源保藏中心：Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)；菌株为大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101(购自成都安普迪生物科技有限公司)；多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(RNAprep PurePlantKit，购自TIANGEN公司)。PrimeScripttm II1st StrandcDNA Synthesis Kit(购自Takara公司)，Nco I和Sac I(购自Fermentas公司)；表1为本发明所用引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。
表1引物信息
注：小写部分的序列指代同源臂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.目的基因片段编码序列的扩增
利用RNAprep Pure Plant Kit提取上海青(Brassica rapa subsp.chinensis)总RNA，测定总RNA浓度，根据PrimeScripttm II 1st Strand cDNA Synthesis Kit方法，反转录生成cDNA第一链，以其作为模板，BrPDS-F和BrPDS-R为上下游引物，进行PCR反应，扩增BrPDS编码序列，反应程序为：94℃10min；94℃15sec，55℃15sec，72℃15sec，35个循环；72℃10min。
利用RNAprep Pure Plant Kit提取芥菜栽培种抱子芥(Brassicajunceavar.gemmifera Lee&Lin)总RNA，测定总RNA浓度，根据PrimeScripttm II 1st StrandcDNA Synthesis Kit方法，反转录生成cDNA第一链，以其作为模板，BjuPDS-g-F和BjuPDS-g-R为上下游引物，进行PCR反应，扩增BjuPDS-g编码序列，反应程序为：94℃10min；94℃15sec，55℃15sec，72℃15sec，35个循环；72℃10min。
利用RNAprep Pure PlantKit提取芥菜栽培种结球芥(Brassicajunceavar.capitata Hort)总RNA，测定总RNA浓度，根据PrimeScripttm II 1st Strand cDNASynthesis Kit方法，反转录生成cDNA第一链，以其作为模板，BjuPDS-c-F和BjuPDS-c-R为上下游引物，进行PCR反应，扩增BjuPDS-c编码序列，反应程序为：94℃10min；94℃15sec，55℃15sec，72℃15sec，35个循环；72℃10min。
2.含目的基因片段的重组pTRV2载体的构建
1)以上海青cDNA作为模板，BrPDS-F1和BrPDS-R1为引物，扩增带有同源臂的BrPDS片段，电泳后回收目的条带；反应程序为：94℃10min；94℃15sec，56℃10sec，72℃15sec，40个循环；72℃10min。
以抱子芥cDNA作为模板，BjuPDS-g-F1和BjuPDS-g-R1为引物，扩增带有同源臂的BjuPDS-g片段，电泳后回收目的条带；反应程序为：94℃10min；94℃15sec，56℃10sec，72℃15sec，40个循环；72℃10min。
以结球芥cDNA作为模板，BjuPDS-c-F1和BjuPDS-c-R1为引物，扩增带有同源臂的BjuPDS-c片段，电泳后回收目的条带；反应程序为：94℃10min；94℃15sec，56℃10sec，72℃15sec，40个循环；72℃10min。
2)用EcoRⅠ和BamHⅠ对pTRV2载体进行双酶切，纯化酶切产物。
3)将BrPDS、BjuPDS-g和BjuPDS-c片段通过GibsonAssembly技术分别连接至pTRV2载体。
4)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至LB固体选择培养基，倒置培养。挑取单克隆菌株，接种至含有0.05mg/mLKan的LB液体培养基，进行扩大培养。
5)通过菌液PCR进行检测，对阳性克隆进行测序。
6)对序列进行分析，用正确的重组质粒转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，经菌液PCR鉴定后在阳性克隆中加入甘油，保存于-80℃。
3.病毒诱导的基因沉默
3.1将保存于-80℃的包含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS-g和pTRV2-BjuPDS-c质粒载体的GV3101菌株分别划线于含有抗生素(0.05mg/mL Kan、0.05mg/mLGent和0.05mg/mLRif)的LB固体选择培养基上，在30℃进行暗培养24h。
3.2挑取单克隆菌株，分别接种至LB液体选择培养基，在200r/m、30℃条件下培养至OD600＝0.8。
3.3分别吸取上述菌液2mL，添加至300mLLB液体选择培养基中，200r/m、30℃培养至OD600＝2.0。
3.4将上述菌液于5000r/m离心10min，弃上清，收集菌体。用无菌水对菌体进行洗涤。
3.5用渗透液(10mM MES，20μM乙酰丁香酮和10mM氯化钠)重悬上述菌体，至OD600＝2.0，28℃培养4h后，用渗透液将含有载体pTRV1的菌液稀释为OD600值分别为0.3、0.5、0.8和1.0的稀释后的菌液，用渗透液将含有重组载体pTRV2的菌液稀释为OD600值分别为0.3、0.5、0.8和1.0的稀释后的菌液。
3.6将OD600值相同的稀释后的pTRV1菌液和稀释后的pTRV2菌液按体积比1:1混合，作为对照组的侵染液。按体积比1:1的比例分别混合OD600值相同的稀释后的pTRV1菌液和稀释后的pTRV2-BrPDS菌液，OD600值相同的稀释后的pTRV1菌液和稀释后的pTRV2-BjuPDS-g菌液，OD600值相同的稀释后的pTRV1菌液和稀释后的pTRV2-BjuPDS-c菌液，作为实验组的侵染液。
将对照组侵染液和含有pTRV2-BrPDS的侵染液用无菌注射器将侵染液分别从叶片下表面注射至6片真叶时期的上海青幼苗叶片，每颗植株注射3个叶片，在充足的光照条件下生长，温度25±2℃。
将对照组侵染液和含有pTRV2-BjuPDS-g的侵染液，用无菌注射器将侵染液分别从叶片下表面注射至6片真叶时期的抱子芥幼苗叶片，每颗植株注射3个叶片，在充足的光照条件下生长，温度25±2℃。
将对照组侵染液和含有pTRV2-BjuPDS-c的侵染液用无菌注射器将侵染液分别从叶片下表面注射至6片真叶时期的结球芥幼苗叶片，每颗植株注射3个叶片，在充足的光照条件下生长，温度25±2℃。
4待实验组植株有表型变化时，提取处理组植株的未注射叶片为材料总RNA，根据PrimeScripttm II 1st Strand cDNA Synthesis Kit方法，以随机引物为反转录引物，反转录生成cDNA第一链；以表1中的引物分别检测TRV1 RNA、TRV2 RNA是否成功转化至处理植株，同时检测处理植株内源PDS基因是否被有效沉默。
5、结果
5.1克隆PDS基因
以上海青，芥菜(抱子芥和结球芥)为研究材料，提取mRNA，反转录生成cDNA，扩增内源PDS基因。基于上海青内源BrPDS基因(BraA04g008530.3.1C)序列设计特异性引物，获得BrPDS基因开放阅读框序列(Open Reading Frame，ORF)长为1692bp，可编码563aa蛋白。同样，分别以抱子芥和结球芥cDNA为模板，克隆得到抱子芥BjuPDS-g基因ORF为1698bp可编码565aa蛋白，以及ORF为1692bp可编码563aa蛋白的结球芥BjuPDS-c基因。氨基酸序列比对分析发现，上海青，抱子芥和结球芥PDS蛋白，与拟南芥AtPDS蛋白氨基酸序列一致性分别为93.95％，92.06％和92.95％(图2)。分别以BrPDS、BjuPDS-g和BjuPDS-c基因为模板，设计特异性引物，构建pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS-g和pTRV2-BjuPDS-c载体。
5.2不同农杆菌浓度对VIGS沉默效率的影响
注射侵染液16天后，实验组植株开始出现白化表型，通过统计具有白化现象的植株数计算VIGS的沉默株率。如图3所示，不同的农杆菌浓度对上海青，抱子芥和结球芥的VIGS沉默株率有显著影响。农杆菌菌液OD600＝1.0时，上海青PDS基因的沉默比例最高，为66.7％，农杆菌菌液OD600＝0.5，抱子芥PDS基因的沉默比例最高，为42.2％，而农杆菌菌液OD600＝0.8时，结球芥PDS基因的沉默比例最高，为51.1％。所有对照组植株均没有产生白化表型。
5.3BrPDS沉默导致上海青叶片呈白化表型
基于VIGS沉默系统，靶向沉默上海青内源BrPDS基因，植株呈现白化表型(图4)。在这些具有白化表型的上海青植株中，白化程度从轻微到强烈不等。与对照组相比，侵染液浓度OD600＝0.3处理组，叶片下表皮出现了白化表型，上表皮并没有呈现明显的白化表型(图4中的A)，侵染液浓度OD600＝0.5和OD600＝0.8处理组，叶片上表皮轻微白化，叶片下表皮则会完全白化(图4中的B-C)。而当侵染液浓度OD600＝1.0时，叶片上表皮和下表皮均呈现强烈的白化表型(图4D)，经含pTRV2-BrPDS的侵染液处理的上海青植株，其叶柄也完全白化。
5.4芥菜内源PDS沉默导致其植株呈白化表型
含有pTRV2-BjuPDS-g的侵染液和含有pTRV2-BjuPDS-c的侵染液，分别注射抱子芥和结球芥叶片，不同浓度的侵染液处理植株，呈现不同程度的白化表型。当侵染液浓度OD600＝0.3时，抱子芥注射叶片白化程度较低，未注射叶片、新生叶片和茎并没有发生白化现象；当侵染液浓度OD600＝0.5和OD600＝0.8时，抱子芥注射叶片、未注射叶片、新生叶片和茎均呈现明显的白化表型；而当侵染液浓度OD600＝1.0时，注射叶片呈萎蔫状态，未注射叶片、新生叶片表现为较弱的白化表型(图5中的A-D)。
用不同浓度的侵染液处理结球芥时，注射叶片具有不同程度的白化表型，当OD600＝0.8时，白化表型最明显，而未注射叶片和新生叶片并没有明显的白化表型(图5中的E-H)。
随着抱子芥和结球芥继续生长，与对照相比，处理植株的花序、花萼和花瓣都具有白化表型(图6-7)。
5.5白化植株内源PDS基因表达量分析
为了证实所观察到的白化表型是由TRV重组病毒侵染后内源性BrPDS基因发生沉默而引起的，首先，对所有处理材料进行了半定量RT-PCR分析。结果显示，在实验组和对照组的注射叶片中都能够检测到TRV1和TRV2 RNA(图8中的A-C)。其次，通过定量qRT-PCR对所有材料内源PDS基因表达水平进行了分析，与对照组相比，BrPDS、BjuPDS-g和BrPDS-c基因的表达水平在实验组中注射叶片和未注射的叶片中均明显降低(图9中的A-C)。
以上结果表明，通过TRV介导的VIGS技术可以下调上海青和芥菜内源PDS基因转录本的数量，使上海青和芥菜组织产生白化表型。同时表明，由TRV介导的VIGS技术可以用来快速验证上海青和芥菜基因的功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于RNA病毒诱导的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系，其特征在于，包括载体pTRV1和含有目的基因片段的重组载体pTRV2，所述目的基因片段包括BrPDS、BjuPDS-g和BjuPDS-c中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系，其特征在于，所述目的基因片段BrPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述目的基因片段BjuPDS-g的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述目的基因片段BjuPDS-c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系，其特征在于，BrPDS片段的克隆方法包括：提取上海青总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ ID No.10和SEQID No.11所示的核苷酸序列为引物，扩增获得带有同源臂的BrPDS片段；
BjuPDS-g片段的克隆方法包括：提取抱子芥总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的核苷酸序列为引物，扩增获得带有同源臂的BjuPDS-g片段；
BjuPDS-c片段的克隆方法包括：提取结球芥总RNA，反转录得到cDNA第一链，以此链为模板，以SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的核苷酸序列为引物，扩增获得带有同源臂的BjuPDS-c片段。
4.权利要求1～3任意一项所述的叶菜类蔬菜VIGS沉默体系在沉默叶类蔬菜PDS基因中的应用，其特征在于，将含有目的基因片段的重组载体pTRV2转化大肠杆菌DH5α感受态细胞制备重组质粒，将重组质粒和载体pTRV1分别转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，获得含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液，将含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液混合获得侵染液，将侵染液注射到叶菜类蔬菜叶片。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述叶类蔬菜为上海青、抱子芥和结球芥。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述侵染液含有连接BrPDS片段的重组载体pTRV2时，注射到上海青叶片；所述侵染液含有连接BjuPDS-g片段的重组载体pTRV2时，注射到抱子芥叶片；所述侵染液含有连接BjuPDS-c片段的重组载体pTRV2时，注射到结球芥叶片。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，注射到上海青叶片时，所述侵染液OD600＝0.3～1.0；注射到抱子芥叶片时，所述侵染液OD600＝0.5～0.8；注射到结球芥叶片时，所述侵染液OD600＝0.5～1.0。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，含载体pTRV1的菌液和含重组载体pTRV2的菌液按体积比1:1混合。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述叶菜类蔬菜为6片真叶期。
10.一种检测叶类蔬菜PDS基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
检测上海青BrPDS基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID No.20和SEQIDNo.21所示；
检测抱子芥BjuPDS-g基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID No.24和SEQID No.25所示；
检测结球芥BjuPDS-c基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID No.26和SEQID No.27所示。
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