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CN119876088A - 一种脂肪酶突变体及其在制备(s)-3-环己烯-1-甲酸中的应用 - Google Patents

一种脂肪酶突变体及其在制备(s)-3-环己烯-1-甲酸中的应用 Download PDF

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CN119876088A
CN119876088A CN202510311700.0A CN202510311700A CN119876088A CN 119876088 A CN119876088 A CN 119876088A CN 202510311700 A CN202510311700 A CN 202510311700A CN 119876088 A CN119876088 A CN 119876088A
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CN
China
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cyclohexene
carboxylic acid
mutant
lipase
calb
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CN202510311700.0A
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柳志强
蔡雪
崔杰
郑裕国
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East China Institute Of Synthetic Biology Industry Technology
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
East China Institute Of Synthetic Biology Industry Technology
Zhejiang University of Technology ZJUT
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Abstract

本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其在制备(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸中的应用。本发明的脂肪酶CALB突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列281位采取单点突变获得的。该突变体相比于野生型在催化外消旋3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯生产(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸反应时的立体选择性大大提高。相比较于传统化学法制备(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸，本发明提供的脂肪酶CALB突变体立体选择性高，反应条件温和，对环境友好，且对设备要求降低，大大减少了生产成本，在工业化应用中显示出广泛的应用前景。

Description

一种脂肪酶突变体及其在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的 应用
本发明是申请日为2025年1月8日的中国专利申请202510027385.9的分案申请，原申请的发明名称为“一种脂肪酶突变体及其应用”。
技术领域
本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
背景技术
脂肪酶具有良好的水解、转酯、酯化、酯交换等反应的催化能力，在食品、化工、医药、生物能源等行业中应用广泛。微生物中来源的脂肪酶已然成为工业应用中脂肪酶的主要来源。南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)是来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)，CALB由于具有出色的酯合成、水解、转酯等催化活性，被广泛应用于食品、医药、化工等领域。
(S)-3-环己烯-1-甲酸作为手性化合物是一种重要的化学试剂或医药中间体，被广泛应用于医药、化工等多个领域。(S)-3-环己烯-1-甲酸可以用于生成(S)-3,4-二氨基环己烷羧酸，这是凝血因子Xa(fXa)抑制剂依度沙班(edoxaban，商品名：Savaysa)的关键手性砌块。该药物用于治疗癌症相关的静脉血栓栓塞症，与同类型凝血因子Xa抑制剂药物如利伐沙班和阿哌沙班相比，具有肾脏负担小、出血风险小、安全可靠等突出优点，市场前景广阔。而(S)-3-环己烯-1-甲酸作为该药物的关键中间体，其高效制备技术成为研究热点。
目前手性3-环己烯-1-甲酸的合成方法主要有以下三种：狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应、化学法外消旋酸拆分法和酶法不对称水解拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯。其中Diels-Alder反应是目前合成手性3-环己烯-1-甲酸的主要方法，然而其反应中丁二烯为气体且产物不易于分离，反应步骤多，最终收率较低，该方法仍需进一步提升。化学法外消旋酸拆分法的分离需通过至少六次在丙酮中的重结晶过程，这一化学拆分方法不仅耗费大量丙酮，而且拆分后的收率仅介于20-30％，经济性能较低。由此可见，采用化学法合成手性3-环己烯-1-甲酸具有操作步骤多、收率低和大量丙酮的消耗等问题。采用生物酶催化拆分手性化合物具有反应条件温和、立体选择性高、污染低及操作简捷等优点，这使其在推动可持续发展的进程中，成为替代或补充传统化学合成途径的一种重要途径。
在2004年，Cihangir T等人研究了三种酶：猪肝酯酶(PLE)、马肝酯酶(HLE)和猪胰脂肪酶(PPL)，具有对于外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的水解功能。结果显示，PLE和HLE的水解产物均为(S)-3-环己烯-1-甲酸，且ee值分别超过99％和达到97％；而PPL的水解产物为(R)-3-环己烯-1-甲酸，其ee值为91％。然而，这三种酶均来自动物，作为商品酶在实际应用中面临多重挑战，包括：高昂的成本、同工酶的干扰、批次间存在显著的差异性以及潜在的病毒污染风险。
2019年，窦哲等人采用3-环己烯-1-羧酸甲酯作为底物，开展对野生菌株进行筛选的工作，并成功发现一株名为Acinetobacter sp.JNU9335的菌株，该菌株能够选择性地催化水解底物，剩下的(S)-3-环己烯-1-羧酸甲酯，通过碱性条件下的进一步水解，得到了目标产物(S)-3-环己烯-1-甲酸。在50mL反应中加入3.50g外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯，反应12h，最终得到收率为40％的目标产物，e.e.值高达99％。2020年窦哲等人成功获取了环己烯甲酸酯水解酶AcEst1及其突变体，利用活力增强的突变体F78V/A202K/G326A的粗酶粉，能够催化58.7g外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯，剩余(S)-3-环己烯-1-羧酸甲酯，通过碱水解处理，获得了22.3g(S)-3-环己烯-1-甲酸，收率达到38％，且产物的气相色谱(GC)纯度为99％，光学纯度高达99.5％e.e.。之后在2021年，窦哲等人又公开了一种新型羧酯酶CarEst3及其突变体，该酶具有出色的催化能力，能够处理高达500g/L外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯，最终得到的(S)-3-环己烯-1-甲酸总收率为37％，光学纯度为99％e.e.。
与传统化学合成法相比，利用生物酶催化制备(S)-3-环己烯-1-甲酸的方法具有反应条件温和、对映体选择性高、环境友好和操作简单等优点，但目前关于(S)-3-环己烯-1-甲酸制备方法仅限于实验室规模，同时存在酶选择性较低致使产品收率低等缺陷，不适用于工业化生产，并且缺乏关于脂肪酶CALB催化合成(S)-3-环己烯-1-甲酸的报道。因此，需要筛选具有高催化效率的对映选择性互补的脂肪酶CALB的突变体，用于满足工业化生产(S)-3-环己烯-1-甲酸的需求。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的利用生物酶催化制备(S)-3-环己烯-1-甲酸工艺存在酶选择性较低致使产品收率低、催化效率低、难以适用于工业化生产的缺陷，提供了一种脂肪酶突变体、突变体编码基因、含有该突变体编码基因的重组载体、含有该突变体编码基因的重组基因工程菌，并将脂肪酶突变体应用于制备(S)-3-环己烯-1-甲酸的工业化生产工艺中。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种脂肪酶CALB突变体，由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第40位、(2)第134位、(3)第154位、(4)第189位、(5)第278位、(6)第281位。
作为优选，所述脂肪酶CALB突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或两个：(2)第134位、(6)第281位。
作为优选，所述突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第40位苏氨酸突变为赖氨酸，(2)第134位天冬氨酸突变为丝氨酸，(3)第154位缬氨酸突变为异亮氨酸，(4)第189位异亮氨酸突变为精氨酸，(5)第278位赖氨酸突变为天冬氨酸，(6)第281位丙氨酸突变为谷氨酰胺。
一种核酸分子，所述核酸分子含有如上所述的脂肪酶CALB突变体的编码序列。
一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的编码序列。
一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌含有如上所述的重组载体。
作为优选，所述重组基因工程菌以大肠杆菌为表达宿主。
本发明提供一种重组脂肪酶CALB突变体的编码基因，含编码基因的重组载体以及重组载体构建的重组基因工程菌，表达载体为pET28b(+)，重组基因工程菌宿主为E.coliBL21(DE3)。
本发明的重组脂肪酶CALB突变体是通过对野生型脂肪酶CALB进行多个特定氨基酸位点的突变，目的是增强其对外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的对映体拆分能力。首先，将野生型南极假丝酵母脂肪酶B的编码基因(其序列如SEQ ID NO.2所示)与表达载体pET28b(+)质粒连接，构建重组表达质粒。然后将构建成功的重组表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中。将含有脂肪酶CALB编码基因的重组表达质粒做为模板，通过定点突变技术进行基因改造，然后将构建成功的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，得到含有重组脂肪酶CALB突变体的编码基因的重组基因工程菌。将获得的重组基因工程菌进行发酵培养，诱导表达，发酵液通过离心得到含有重组脂肪酶CALB突变体的湿菌体细胞。将湿菌体重悬于磷酸盐缓冲溶液中，在冰浴条件下，进行超声破碎，低温离心收集上清，最终得到脂肪酶CALB突变体粗酶液。将突变体脂肪酶CALB与野生型脂肪酶CALB的立体选择性进行比较，筛选具有拆分性能优异的突变体。
如上所述的脂肪酶CALB突变体在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
作为优选，所述的应用为：将磷酸盐缓冲溶液、3-环己烯-1-羧酸甲酯、含脂肪酶CALB突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后提取的粗酶液混合均匀，进行催化反应，得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。
相比较于传统化学法制备(S)-3-环己烯-1-甲酸，本发明提供的脂肪酶CALB突变体立体选择性高，反应条件温和，对环境友好，且对设备要求较低，大大减少了生产成本，在工业化生产中显示出广泛的应用前景。本发明提供的脂肪酶CALB具有较高的催化活性，使得反应条件温和，底物转化率高，对映体选择性较高，生产成本降低且对环境友好。本发明通过设计氨基酸的多个不同位点的突变，能够提高脂肪酶CALB对外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的催化活性和立体选择性。本发明具有反应条件温和、底物浓度高、立体选择性高、催化剂处理步骤简单、对坏境友好的优点，例如10℃条件下，40g/L的脂肪酶CALB突变体能够在6h内催化70g/L的外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯，转化率为52％，e.e.p值为72％。
作为优选，催化反应的反应温度为0～40℃，反应时间为2～12h。
作为进一步优选，催化反应的反应温度为10℃，反应时间为6h。
作为优选，磷酸盐缓冲溶液中含有的磷酸盐的浓度为50～200mM。
作为进一步优选，磷酸盐缓冲溶液中含有的磷酸盐的浓度为200mM。
作为优选，磷酸盐缓冲溶液包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
作为优选，磷酸盐缓冲溶液的pH值为6～9。
作为进一步优选，磷酸盐缓冲溶液的pH值为7。
作为优选，3-环己烯-1-羧酸甲酯的浓度为20～140g/L。
作为进一步优选，3-环己烯-1-羧酸甲酯的浓度为70g/L。
作为优选，催化反应中添加的含脂肪酶CALB突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体的浓度为10～100g/L。
作为进一步优选，催化反应中添加的含脂肪酶CALB突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体的浓度为40g/L。
作为优选，通过有机试剂萃取酶催化反应液中的(S)-3-环己烯-1-甲酸的方法，包括以下步骤：
酶催化反应结束后，加入等体积的3M HCl终止反应，再加入两倍体积的有机试剂乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并萃取后的有机相，加入无水硫酸钠干燥除去多余水分，过滤，旋转蒸发后得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。
作为优选，所述湿菌体的制备方法包括以下步骤：
将含有重组脂肪酶CALB突变体编码基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，在37℃、180rpm条件下培养10～12h，再以体积浓度2％接种量接种至含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在37℃、180rpm条件下培养至菌体OD600为0.6～0.8，加入终浓度为1mM IPTG，在28℃、180rpm条件下诱导培养12h后，4℃、8000rpm、离心10min，弃上清，收集沉淀，得到含有重组脂肪酶CALB突变体编码基因的重组基因工程菌的湿菌体。
作为优选，粗酶液的制备方法包括以下步骤：
将含有重组脂肪酶CALB突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体按照每0.4g湿菌体加入9.6mL的200mM、pH为7.0的磷酸钠盐缓冲溶液重悬湿菌体；细胞重悬液在冰浴和60W功率条件下进行超声破碎，持续2s，间歇4s，连续破碎10min，获得细胞破碎液；将超声破碎后获得的细胞破碎液在8000rpm、4℃条件下离心10min，所得到的上清即为粗酶液。
因此，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过设计氨基酸的多个不同位点的突变，能够提高脂肪酶CALB对外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的催化活性和立体选择性；
(2)本发明具有反应条件温和、底物浓度高、立体选择性高、催化剂处理步骤简单、对坏境友好的优点，且对设备要求降低，大大减少了生产成本，在工业化应用中显示出广泛的应用前景；
(3)相比较于传统化学法制备(S)-3-环己烯-1-甲酸，本发明提供的脂肪酶CALB突变体立体选择性高，转化率高，10℃条件下，40g/L的脂肪酶CALB突变体能够在6h内催化70g/L的外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯，转化率最高可达52％，e.e.p值最高可达72％。
附图说明
图1为脂肪酶CALB的SDS-PAGE图。
图2为生物酶法拆分外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯示意图。
图3为重组脂肪酶CALB突变体CALB-D134S/A281Q催化反应6h后的产物S/R-3-环己烯-1-甲酸的高效气相色谱(GC)检测示意图。
图4为野生型脂肪酶CALB及重组脂肪酶CALB突变体的转化率示意图。
图5为野生型脂肪酶CALB及重组脂肪酶CALB突变体的e.e.p值示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1：脂肪酶CALB基因工程菌E.coli BL21(DE3)/CALB的构建将基因库中来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B(CALB)基因序列(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，通过全基因合成并转入载体pET28b(+)质粒中，获得pET28b(+)-CALB重组质粒，将该重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，获得野生型脂肪酶CALB基因工程菌E.coli BL21(DE3)/CALB，相应的脂肪酶记为野生型脂肪酶CALB。
实施例2：定点突变构建重组酯酶突变体基因工程菌E.coli BL21(DE3)/CALB-muts根据突变位点进行引物合成，以含有编码南极假丝酵母脂肪酶B基因的pET28b(+)-CALB重组质粒为模板，通过PCR延伸扩增进行定点突变(定点突变引物见表1)。
表1：引物的核酸序列
引物名称 序列(5’-3’)
T40K-R ATTTTACTGGTTCCAGGAAAGGGTACTACTGGA
T40K-L TCCTGGAACCAGTAAAATAGGTTTACTAACGGA
D134S-R CTTATGGCCTTTGCTCCTTCTTACAAAGGTACCG
D134S-L AGGAGCAAAGGCCATAAGTCTGTCGACCTTTGA
V154I-R GCAGTGTCCGCTCCTTCCAGGTGGCAACAAACC
V154I-L GGAAGGAGCGGACACTGCCAAGGCGTCAAGTGG
I189R-R TACTCAGCTACAGACGAAAGGGTTCAGCCTCAA
I189R-L TTCGTCTGTAGCTGAGTATAGGTTAGTAGTGGG
L278N-R GTCGCTGCCGCAGCCCTGAATGCTCCAGCAGCT
L278N-L CAGGGCTGCGGCAGCGACCTTTTGTTCAGGGGT
A281Q-R GCAGCCCTGCTGGCTCCACCAGCTGCCGCTATC
A281Q-L TGGAGCCAGCAGGGCTGCGGCAGCGACCTTTTG
。
PCR反应程序如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃3min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR反应结束后的产物添加DpnI置于37℃处理3h，处理结束后在80℃条件下灭活10min，再化学转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含终浓度50mg/L氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，37℃、培养12h。随机挑取单菌落进行测序分析，获得含重组脂肪酶CALB突变体基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/CALB-muts，即分别为E.coliBL21(DE3)/CALB-T40K、E.coli BL21(DE3)/CALB-D134S、E.coli BL21(DE3)/CALB-V154I、E.coli BL21(DE3)/CALB-I189R、E.coli BL21(DE3)/CALB-L278N、E.coli BL21(DE3)/CALB-A281Q、E.coli BL21(DE3)/CALB-D134S/A281Q。相应的脂肪酶CALB突变体分别记为突变体CALB-T40K、CALB-D134S、CALB-V154I、CALB-I189R、CALB-L278N、CALB-A281Q、CALB-D134S/A281Q。
实施例3：重组脂肪酶CALB突变体基因工程菌的湿菌体的制备将实施例2中获得的含有重组脂肪酶CALB突变体基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/CALB-muts接种至含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素抗性的10mL LB试管培养基中，37℃、180rpm、培养10-12h，再以2％(v/v)接种量接种至含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素抗性的100mL LB摇瓶培养基中，37℃、180rpm、培养至菌体OD600达到0.6～0.8，加入终浓度为1mM IPTG，28℃、培养12h后，4℃、8000rpm、离心10min，弃上清，收集沉淀，即获得含有表达重组脂肪酶CALB突变体基因的重组大肠杆菌的湿菌体。该湿菌体可直接作为生物催化剂或者用于制备粗酶液。采用相同方法制备含有表达重组脂肪酶CALB基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/CALB湿菌体。
实施例4：重组酯酶及其突变体的粗酶液制备
重组脂肪酶CALB粗酶液的制备：将按实施例3中方法收集获得的湿菌体按照每0.4g湿菌体加9.6mL200mM、pH为7.0的磷酸钠盐缓冲溶液重悬，在冰浴条件下进行超声破碎(60W功率、持续2s、间歇4s、连续破碎10min)，之后获得细胞破碎液。将超声破碎后获得的细胞破碎液于8000rpm、4℃、离心10min，所得到的上清即为所需的重组脂肪酶CALB粗酶液。其中E.coli BL21(DE3)/CALB的细胞破碎上清液和沉淀的SDS-PAGE图(即脂肪酶CALB的SDS-PAGE图)如图1所示。其中，图1中左起泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为原始菌株脂肪酶CALB的粗酶样品，泳道3为原始菌株脂肪酶CALB的破碎沉淀样品。从图1中可以发现重组脂肪酶CALB以可溶的形式存在。
实施例5：脂肪酶CALB立体选择性测定
分别将实施例3中得到的野生型脂肪酶CALB及重组脂肪酶CALB突变体CALB-T40K、CALB-D134S、CALB-V154I、CALB-I189R、CALB-L278N、CALB-A281Q、CALB-D134S/A281Q的湿菌体用于催化外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯。
酶催化体系及催化条件如下：加入40g/L湿菌体，加入70g/L外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯，用200mM、pH为7.0的磷酸钠盐缓冲液组成10mL反应体系，在10℃和700rpm条件下反应6h，反应结束后取100μL反应液加入等体积100μL 3M HCl终止反应，用乙酸乙酯萃取三次，总共加800μL乙酸乙酯，12000rpm、离心1min，分离水相和有机相，收集有机相并在其中加入一定量的无水硫酸钠干燥除水，12000rpm、离心1min后取200μL上清。生物酶法拆分外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯示意图如图2所示。
其中上清中包含：(S)-3-环己烯-1-羧酸甲酯、(R)-3-环己烯-1-羧酸甲酯、(S)-3-环己烯-1-甲酸、(R)-3-环己烯-1-甲酸，采用高效气相色谱(GC)检测底物((S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯、(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯)和产物((S)-3-环己烯-1-甲酸和(R)-3-环己烯-1-甲酸)的含量，并计算转化率和e.e.p值。其中，重组脂肪酶CALB突变体CALB-D134S/A281Q催化反应6h后的产物S/R-3-环己烯-1-甲酸的高效气相色谱(GC)检测示意图如图3所示。野生型脂肪酶CALB及重组脂肪酶CALB突变体的转化率示意图如图4所示。野生型脂肪酶CALB及重组脂肪酶CALB突变体的e.e.p值示意图如图5所示。
e.e.p值的计算公式如下：
e.e.p/％＝(Sp-Rp)/(Sp+Rp)，Sp代表(S)-3-环己烯-1-甲酸的含量，Rp代表(R)-3-环己烯-1-甲酸的含量。
GC检测方法如下：Trace1610气相色谱仪(赛默飞Trace1610)；手性气相柱：B-DM(0.25mm×30m×0.12mm)，进样口温度：250℃；FID检测器温度：250℃；空气流量350mL/min，尾吹气流量40mL/min；恒压：137.9kPa；恒流1mL/min。柱箱升温程序：初始温度50℃，保持2min，6℃/min升温至120℃，保持2min，2℃/min升温至144℃，保持2min。
从图2～5中分析可知：与野生型脂肪酶CALB相比，发生单位点突变(T40K、D134S、V154I、I189R、L278N、A281Q)的脂肪酶CALB的选择性显著提高，发生组合位点突变(D134S/A281Q)的脂肪酶CALB的选择性和转化率均优于野生型，转化率最高可达52％，e.e.p值最高可达72％，由此表明，本发明通过设计氨基酸的多个不同位点的突变，能够显著提高脂肪酶CALB的活性和选择性。
综上所述，本发明创造性地发现通过设计氨基酸的多个不同位点的突变，能够提高脂肪酶CALB催化外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的活力和立体选择性，更利于生产(S)-3-环己烯-1-甲酸的活力，降低生产成本且对环境友好，利于通过微生物发酵进行规模化生产，更适于商业化和工业化应用。
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种脂肪酶CALB突变体，其特征在于，所述突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为以下一个：(1)第281位丙氨酸突变为谷氨酰胺。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的脂肪酶CALB突变体。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的脂肪酶CALB突变体的编码序列。
4.一种重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌含有权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的一种重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌以大肠杆菌为表达宿主。
6.如权利要求1所述的脂肪酶CALB突变体在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为：将磷酸盐缓冲溶液、3-环己烯-1-羧酸甲酯、含脂肪酶CALB突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后提取的粗酶液混合均匀，进行催化反应，得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，催化反应的反应温度为0～40℃，反应时间为2～12h。
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