CN119876056B - 一种抗除草剂的hppd突变蛋白 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种抗除草剂的HPPD突变蛋白。本申请通过基因编辑技术，获得了至少三个优良的突变体，其表达不同的HPPD突变蛋白，能赋予植物除草剂抗性或耐受性。

Description

一种抗除草剂的HPPD突变蛋白

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗除草剂的HPPD突变蛋白。

背景技术

对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxypheny l pyruvate D ioxygenase，HPPD)是生物体内酪氨酸代谢过程中重要的酶，HPPD的抑制则会导致植物细胞内的光合作用解偶联、辅助捕光色素缺乏、叶绿素被破坏，结果造成植物光合作用组织产生白化症状，生长受到抑制，直至死亡。

通过抑制HPPD而起作用的除草剂包括多种类型，比如异噁唑类、二酮腈类、三酮类、二苯酮类以及吡唑特类等。这类除草剂具有广谱的除草活性，但在其不加选择杀死杂草的同时也给作物带来一定的伤害，因此获得耐受除草剂的作物尤为重要。

目前的一种策略是对HPPD进行突变以获得对HPPD抑制剂耐受性更高的靶酶，同时不影响植物的正常生长。尽管对HPPD的编码基因进行单点或多点突变可能筛选到某种合适的HPPD突变，但这样的筛选工作量极大且随机性强，很难预期每种突变的效果。发明人结合CRI SPR技术，在水稻中幸运地筛选到了在除草剂下能正常生长的三种新的HPPD突变体，以期改进植物对HPPD抑制剂的耐受性。

发明内容

本申请提供了一种突变的HPPD蛋白，其特征在于，所述HPPD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示、或如SEQ ID NO.3所示、或如SEQ ID NO.4所示。

本申请还提供与上述HPPD蛋白相关的生物材料，其为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码上述HPPD蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的植物细胞系；

A6)含有A2)所述表达盒的植物细胞系；

A7)含有A3)所述重组载体的植物细胞系；

A8)含有A4)所述重组载体的植物细胞系。

在一些实施方式中，上述植物细胞系不发育为整个植株或完整植株。本申请还提供上述的HPPD蛋白或生物材料在植物抗除草剂中的用途。

本申请还提供一种获得具有除草剂抗性的植物细胞、植物组织、植物部分或植物的方法，包括：

1)使植物细胞、植物组织、植物部分或植物表达上述的突变的HPPD蛋白；或

2)使植物细胞、植物组织、植物部分或植物包含上述的生物材料；或

3)对植物细胞、植物组织、植物部分或植物的内源HPPD基因进行突变或编辑，以实现在其中表达上述的突变的HPPD蛋白。

在一些实施方式中，上述获得具有除草剂抗性的植物细胞、植物组织、植物部分或植物的方法还进一步包括杂交、回交或无性繁殖的步骤。

本申请还提供一种鉴定抗除草剂的植物的方法，包括以下步骤：

1)测定所述植物是否表达上述的HPPD蛋白；或

2)测定所述植物是否包含上述的生物材料。

本申请还提供一种控制作物周围杂草的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物表达上述的突变的HPPD蛋白或者包含上述的生物材料。

本申请还提供一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括：1)使植物细胞、植物组织、植物部分或植物表达上述的突变的HPPD蛋白；或

2)使植物细胞、植物组织、植物部分或植物包含上述的生物材料；或

3)对植物细胞、植物组织、植物部分或植物的内源HPPD基因进行突变或编辑，以实现在其中表达上述的突变的HPPD蛋白。

在一些实施方式中，包括在植物或作物的根、茎、叶、花、果实或种子中表达上述蛋白质。

在另一优选例中，植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓等。

在一个实施方式中，除草剂例如为HPPD抑制剂类除草剂(或称之为HPPD抑制性除草剂)包括三酮类、二酮腈类、异噁唑类、吡唑类、二苯酮类、喹唑啉二酮类或其组合。三酮类除草剂优选双环磺草酮、硝磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、特呋三酮或氟吡草酮中的一种或任意几种；异噁唑类除草剂优选异噁唑草酮、异噁氯草酮、异恶草酮中的一种或任意几种；吡唑类除草剂优选苄草唑、吡草酮、吡唑特、磺酰草吡唑或苯唑草酮中的一种或任意几种；喹唑啉二酮除草剂优选喹草酮、甲基喹草酮等。

附图说明

图1：喷施除草剂15天后，突变体C6-14,C7-20,C3-10,C6-21与野生型的生长状况对比。

图2：喷施除草剂45天后，突变体C6-14,C7-20,C3-10,C6-21与野生型的生长状况对比。

图3：喷施除草剂15天后，突变体P6-17 429,P6-17 381,P6-11,P6-54与野生型的生长状况对比。

图4：喷施除草剂45天后，突变体P6-17 429,P6-17 381,P6-11,P6-54与野生型的生长状况对比。

图5：喷施除草剂15天后，突变体A2-36,A2-40与野生型的生长状况对比。

图6：喷施除草剂45天后，突变体A2-36,A2-40与野生型的生长状况对比。

具体实施方式

为了具体阐述本申请具有普适性的设计思路，下面以具体的实验参数为例进行展示，但不应当反而成为限制本申请保护范围的理由。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1构建编辑载体

利用CRISPR技术构建了三种编辑载体。第一种，构建pHK-dCas9-CBE编辑载体，期望将靶点序列中的C碱基替换为T碱基，从而实现编码氨基酸的改变。pHK-dCas9-CBE质粒总长17648bp，用BsaI酶切该质粒，切除22bp的片段，回收17626bp长的线性质粒。采用T4DNA连接酶将黏性末端和靶点引物进行连接，酶切连接产物转化感受态细胞(如DH5ɑ),挑取单克隆进行测序验证，将测序阳性克隆提取质粒，转化农杆菌EV105，准备进行水稻愈伤组织的转化。

第二种，构建pH-A3A-PBE编辑载体，能实现比CBE更加高效的C-T单碱基编辑。第三种，构建pHK-dCas9-ABE编辑载体，将DNA中的腺嘌呤(A)转化为鸟嘌呤(G)。第二种和第三种编辑载体的构建方式参照第一种的方式。

实施例2水稻愈伤组织转化

2.1水稻愈伤组织准备选取种皮干净，无霉斑，籽粒饱满的南粳46的水稻种子，在不损伤胚的情况下进行脱壳，将脱壳后的水稻种子用75％无水乙醇侵染1min，30％NaClO消毒20min，期间不断摇晃，确保消毒充分，消毒结束后，用无菌水冲洗5-6次，冲洗干净并用无菌滤纸吸干。将消毒好的种子移到诱导培养基中，每板培养基放25-30粒水稻种子，25～27℃培养两周左右。

2.2农杆菌侵染与共培养

将携带目的基因靶位点的农杆菌菌株活化培养在含有Kan和Rif抗生素的Yep固体培养基上，28℃培养箱倒置培养48h，用涂布器将所有的菌落刮板到AAM+AS(20mg)培养基中，28℃培养1-2h，调整农杆菌悬浮液的OD600在0.4-0.6范围之内。将悬浮好的农杆菌侵染液倒入50ml灭菌的离心管中，倒入预培养的愈伤组织，浸泡2min，期间不断摇晃。空皿上预先垫上两层无菌滤纸，把侵染好的愈伤组织放在上面，吹30min左右。在空皿上预先垫上3层无菌滤纸，滤纸提前均匀加入2mIAAM+AS(20mg)培养液，将晾干的愈伤组织接种到含有3层无菌滤纸的皿中，25℃暗培养48-72h。

2.3抗性愈伤的筛选、分化和生根

将共培养后的愈伤组织转移到含有抗生素的筛选培养基上，25～27℃培养30天左右。将筛选后存活的愈伤组织接种到分化培养基上,25～27℃培养一周左右，将开始变绿并开始长出小苗的愈伤组织重新转移到新的分化培养基中，25～27℃培养两周左右。生根培养待水稻幼苗长到5cm左右，拔掉所有的原根，将幼苗移栽到生根培养基上中，光照下培养，待小苗长到与盖子高度一致时，加入无菌水炼苗4-6天。观察幼苗在生根培养基中的生长状态，之后将编辑苗移栽到大田中进行种植培养，并检测编辑苗。

实施例3除草剂抗性检测

产生编辑的T0植株，培养收种获得T1代植株种子。将T1代种子萌发培养到三叶一心时期，在使用气压式喷雾器植株进行除草剂(异噁唑草酮，农药登记号：PD20183297，浓度为2.5mg/L，1/8X)叶面喷洒处理,使其均匀分布在叶片的表面,并以野生型水稻植株作为对照于28℃培养室中继续培养，分别在15天和45天观察植株生长情况，选取具有代表性的独立株系进行拍照，由于无法在一张图中全部并列显示，因此，结果分别显示于图1-6及表1。

表1

可见，对HPPD进行单点或多点突变后，各突变体的效果差别较大。其中，以C6-14、C3-10效果最好，P6-17 429效果次好。

显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。

Claims (7)

1.一种突变的HPPD蛋白，其特征在于，所述HPPD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

2.与权利要求1所述HPPD蛋白相关的生物材料，其特征为下述A1）至A4）中的任一种：

A1）编码权利要求1所述HPPD蛋白的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体。

3.权利要求1所述的HPPD蛋白或权利要求2所述的生物材料在植物抗除草剂中的用途；所述除草剂为HPPD抑制性除草剂。

4.一种获得具有除草剂抗性的植物细胞、植物组织、植物部分或植物的方法，其特征在于，包括：

1）使植物细胞、植物组织、植物部分或植物表达权利要求1所述的突变的HPPD蛋白；或

2）使植物细胞、植物组织、植物部分或植物包含权利要求2所述的生物材料；

所述除草剂为HPPD抑制性除草剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其还进一步包括杂交、回交或无性繁殖的步骤。

6.一种控制作物周围杂草的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物表达权利要求1所述的突变的HPPD蛋白或者包含权利要求2所述的生物材料；所述除草剂为HPPD抑制性除草剂。

7.一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括：1）使植物细胞、植物组织、植物部分或植物表达权利要求1所述的突变的HPPD蛋白；或

2）使植物细胞、植物组织、植物部分或植物包含权利要求2所述的生物材料；

所述除草剂为HPPD抑制性除草剂。