CN119875997A - Igf-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了IGF‑1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用。本发明通过IGF‑1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中发挥作用，可以明确PI3K‑AKT信号通路是PGCs增殖所必需的，为其他信号通路小分子研究提供理论基础。

Description

IGF-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及IGF-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用。

背景技术

在遗传育种领域，原始生殖细胞（PGCs）因其独特的发育潜力和遗传特性，成为基因编辑和遗传改良的重要工具细胞。PGCs起源于外胚层，在胚胎发育早期迁移至生殖嵴，并随着性腺的发育分化为雌性或雄性配子。这一特性使得PGCs成为从源头上改变基因型、制备基因编辑动物的关键细胞类型。

然而，PGCs的体外培养与增殖一直是一个技术难题。传统的培养方法往往面临细胞增殖效率低、存活率不高等问题，这严重限制了PGCs在遗传育种中的应用。

胰岛素可以促进PGCs的增殖，研究表明胰岛素可以通过PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、FOXO信号通路、mTOR信号通路和RAS信号通路等信号通路调节各种生物过程，包括代谢、生长、分化和凋亡。在PGCs培养中，胰岛素通过哪条信号通路未知。因此，探索新的培养体系和方法，以提高PGCs的体外增殖效率，明确信号通路，具有重要的科学意义和应用价值。

发明内容

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供IGF-1（胰岛素样生长因子-1）替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用，能有效解决上述培养方法体外增殖PGCs效率低，作用信号通路不明确等不足之处。

技术方案：第一方面，本发明提供IGF-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用。

优选的，体外培养鸡原始生殖细胞应用的IGF-1的浓度C为0＜C≤100 ng/mL。

优选的，体外培养鸡原始生殖细胞应用的IGF-1的浓度C为25 ng/mL≤C≤100 ng/mL。

优选的，体外培养鸡原始生殖细胞应用的IGF-1的浓度C为100 ng/mL。

第二方面，本发明提供IGF-1在制备促进鸡原始生殖细胞增殖的药物中的应用。

有益效果：本发明通过IGF-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中发挥作用，可以明确PI3K-AKT信号通路是PGCs增殖所必需的，为其他信号通路小分子研究提供理论基础。

附图说明

图1是本发明中胰岛素对PGCs增殖和生物学特性的影响结果图，其中A为胰岛素与无胰岛素对PGCs形态学的影响，B为胰岛素和无胰岛素培养72h后细胞计数统计结果，C-E为EdU和CCK8增殖实验检测，F为qRT -PCR检测胰岛素和无胰岛素对PGCs细胞黏附和多能性的影响，G-H为western blot检测胰岛素和无胰岛素对PGCs细胞黏附蛋白的影响；

图2是本发明中胰岛素和无胰岛素转录组KEGG分析，其中A为KEGG分析中上调的信号通路，B为KEGG分析中下调的信号通路；

图3是本发明中不同信号通路激活剂对PGCs增殖的影响；

图4是本发明中不同浓度的IGF-1对PGCs增殖的影响结果图，其中A为不同浓度的IGF-1对PGCs形态学的影响，B为不同浓度IGF-1培养PGCs 24-72h细胞计数结果统计图，C-E为EdU检测无胰岛素、IGF-1 100 ng/mL和胰岛素对PGCs增殖的影响；

图5是本发明中IGF-1和胰岛素对PGCs抗氧化和凋亡的影响结果图，其中A-B为胰岛素和IGF-1对ROS的影响以及统计图，C-E为胰岛素和无胰岛素对总谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的影响，F-G为胰岛素和无胰岛素对PGCs凋亡的影响；

图6是本发明中IGF-1与胰岛素对PGCs迁移能力以及建系的影响结果图，其中A为7.5 d和12.5 d荧光PGCs迁移观察图，B为迁移效率统计图，C为建系效率统计图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：

实施例1：验证胰岛素对PGCs增殖和生物学特性的影响

原代细胞经过70天的培养，建系成功后进行冷冻，使用时进行复苏。实验分为2个组，对照组为原培养体系（即胰岛素组），实验组为去除胰岛素的B27^TM（即无胰岛素组），于37℃细胞培养箱培养72 h，观察细胞形态，如图1中A-B所示：无胰岛素组细胞形态扁平破碎，呈现不规则状；胰岛素组PGCs能够正常增殖。

接下来进行增殖检测，首先是CCK-8增殖实验，将PGCs在24孔板中进行铺板传代培养72 h，每孔吸取100 μL，加入到96孔板中每组设定3个平行孔，并向每孔加入10 μL CCK-8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。孔板放于37 ℃、5% CO₂的培养箱中；将培养板在培养箱内培养2-4小时；调整酶标仪波长为450 nm，将96孔板置于读板处，操作仪器，读吸光度值。如图1中C和E所示：表明胰岛素促进PGCs增殖。

随后进行了 EdU检测PGCs增殖，将PGCs在24孔板中进行铺板传代，无胰岛素作为实验组；用PGCs完全培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液，制备适量50 μM EdU培养基；每孔加入100 μL 50 μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟；1400rpm离心6 min，弃上清，留20 μL将PGCs吹打混匀后滴至载玻片上；滴加20 μL细胞固定液（含4 %多聚甲醛的PBS）室温孵育30分钟，弃固定液；滴加20 μL 2 mg/mL甘氨酸，孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；滴加20 μL PBS，清洗5分钟后，弃PBS；滴加20 μL渗透剂（0.5 %TritonX-100的PBS）孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟；滴加20 μL的1× Apollo染色反应液，避光、室温孵育30分钟后，弃染色反应液；滴加20 μL渗透剂清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂；PBS清洗1次，5分钟；滴加20 μL Hoechst 33342染色液，避光、室温孵育30分钟后，弃染色液；滴加20μL渗透剂孵育10分钟，PBS清洗1次，5分钟；中性树胶封固，荧光显微镜下用不同通道观察，结果如图1中C和D所示：表明胰岛素促进PGCs增殖。

后续进行：①总RNA提取：将胰岛素和无胰岛素培养的PGCs收集至离心管中，1400rpm离心6 min，弃上清；加入1 mL TRIZOL试剂，吹打混匀，4 ℃静置5 min；将样品于室温静置5 min，使蛋白质充分解离；加入0.2 mL氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15 s并于室温静置2-3 min；于4 ℃、12000×g离心15 min，离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA；取500 μL上清，加入0.5 mL异丙醇，轻轻混匀，于室温静置10 min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA；于4 ℃、12000×g离心10 min后，弃上清；向沉淀中加入1 mL 75%乙醇，轻轻混匀；4 ℃、7500×g离心5 min后，弃上清；将RNA样品晾干，加入适量无酶水溶解（可于55-60 ℃促溶10 min）；测定RNA浓度，紫外分光光度计检测并计算OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，1.9~2.0为效果良好。

②cDNA合成：将模板RNA在冰上解冻；5×FastKing-RT SuperMix和RNase-FreeddH₂O在室温解冻，解冻后立即置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，瞬时离心以收集残留在管壁的液体；配制反转录反应体系：4 μL 5×FastKing-RT SuperMix，Total RNA50 ng-2 μg（依据RNA浓度），RNase-Free ddH₂O补足到20 μL；反转录反应：去除基因组及反转录反应：42 ℃，15 min；酶灭活过程：95 ℃，3 min；依据所用RNA含量添加RNase-FreeddH₂O稀释cDNA浓度。

③采用qRT-PCR技术检测不同浓度卵转铁蛋白处理后PGCs中各基因的mRNA表达水平：10 μL qRT-PCR反应体系由5 μL 2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix、0.4 μL上游引物（10 μM）、0.4 μL下游引物（10 μM）、2 μL cDNA、RNase-Free ddH₂O补足至10 μL组成。反应过程：95 ℃ 3分钟；95 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒，共40个循环。PGCs培养设3个生物重复，每个样品设3个技术重复。采用2^-ΔΔCT方法对表达水平进行量化分析，结果如图1中F所示：细胞黏附基因ZO-1,Occludin，Claudin1,β-catenin，JAM下调，多能性基因LIN28,NANOG,POUV,SOX2下调，以上结果表明：胰岛素缺乏可以降低细胞黏附和多能性。

接下来进行了Western Blot：

1）PGCs总蛋白的提取：将PGCs在24孔板中进行铺板传代，并在有、无胰岛素培养72h，1400 rpm离心6 min，弃上清，加入1 mL RIPA裂解液，于冰上低温裂解40分钟，随后在4℃离心机中以12000×g离心10 min，吸取上清于1.5 mL离心管中，于-80 ℃保存；

2）BCA法测定蛋白浓度：BCA工作液的配制：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液可于室温放置24 h。蛋白浓度微孔检测（20-2000 μg/mL）：准备96孔板，先于7个孔中每孔加入25 μL各浓度稀释的BSA标准品，再根据样品数量于对应孔中加入25 μL待测样品；每孔加入200 μL BCA工作液，混匀，每孔共225 μL混合液；盖上孔板，放置于37 ℃培养箱孵育30 min，反应激活后冷却至室温；3-5分钟内于酶标仪562 nm处检测吸光值；

3）WB试剂准备：配制电泳液：一包SDS粉末加入1000 mL超纯水，搅匀10分钟；配制转膜液：一包Transfer粉末假如900 mL超纯水，搅匀10分钟后加入100 mL甲醇；配制1×TBST缓冲液：配制500 mL 1×TBST缓冲液，将25 mL 20×TBST缓冲液与475 mL超纯水混匀在一起；

4）SDS-PAGE凝胶电泳，用移液枪吸取电泳液，轻轻吹打胶板上样孔，待疏通后开始上样。从左到右依次加入Marker以及待测蛋白样品，尽量缩短上样时间，避免样品扩散；接通电泳槽，设置80V恒定电压运行40分钟左右，将电压调换至110V恒压电泳，直至跑到分离胶底部结束；

5）转膜，PVDF膜放入甲醇中完全浸透活化，转入转膜液中10min，滤纸和黑色海绵也放置于转膜液中浸泡。切胶：在目的蛋白大小相对应的位置切下凝胶，记住正反面，将胶放入转膜液中。从下到上按黑色海绵，3层滤纸，PVDF膜，凝胶，3层滤纸，黑色海绵的顺序安装好，用滚轮压出气泡，放入转膜装置中注意黑色对应黑色转膜壁，电流方向从负极流向正极，电流为230mA，转膜时间根据蛋白大小而定；

6）封闭；转膜结束后，裁剪合适大小的目的蛋白，加入现配现用的封闭液（50ml封闭液：2.5g脱脂奶粉+50ml 1×TBST，充分混合，振荡10分钟）于摇床上孵育两小时，封闭结束后，用1×TBST洗涤3次，每次10分钟；

7）孵育一抗，洗涤结束后，按比例（1：1000）加入1×TBST稀释一抗，将pvdf膜浸透，摇床孵育10分钟后放置4℃过夜，第二天回收一抗（可重复使用3次），用1×TBST洗涤3次，每次10分钟；

8）孵育二抗，洗涤结束后，按比例（1：5000）加入1×TBST稀释二抗，将pvdf膜浸透，摇床孵育2小时后，回收二抗（可重复使用3次），用1×TBST洗涤3次，每次10分钟；

9）ECL显色、发光，按A液：B液=1：1配制ECL显色液，现配现用，在每个PVDF膜上均匀滴加约100μl显色液，放置凝胶成像系统中显影观察结果，并用 Image J 软件计算灰度值。结果显示，去除胰岛素后，PGCs细胞黏附性降低，多能性降低；结果如图1中G-H所示：细胞黏附蛋白ZO-1、Occludin和JAM下调。

结论：胰岛素缺乏可以导致PGCs细胞粘附性下调。

实施例2：通过转录组测序探究胰岛素促进PGCs增殖的分子机制

为了系统地分析胰岛素在调节鸡PGCs形成过程中的分子机制，将收样送测序公司进行了转录组测序，使用KEGG分析，结果如图2所示：缺乏胰岛素后PI3K-Akt 信号通路、ECM受体相互作用通路、RAS信号通路和mTOR信号通路下调。在缺乏胰岛素的情况下，采用这四种信号通路的激活剂（即IGF-1、Pyrintegrin、ML-099和MHY1485）替代胰岛素的作用，使用DMSO溶解激活剂，结果如图3所示：IGF-1可以显著促进PGCs增殖，其他的信号通路激活剂单独添加或两两组合都达不到IGF-1替代的作用，且IGF-1与其他组信号通路激活剂联合添加并未提高PGCs增殖效率。

实施例3：IGF-1促进PGCs增殖的最适宜浓度

为了明确IGF-1最适宜的浓度，采用去除胰岛素的B27^TM作为对照，随后每组分别添加0、25、50、100、200和300 ng/mL的胰岛素，于37℃细胞培养箱培养至72 h，并每天观察细胞生长形态，检测细胞增殖与细胞活性。结果如图4所示：去除胰岛素后，PGCs几乎不增殖，随着IGF-1浓度添加，PGCs状态变好并开始增殖，使用CCK-8和EdU检测结果表明当IGF-1的浓度达到100 ng/mL时，其增殖速度不再随着浓度的升高而升高，即100 ng/mL为其最适宜浓度。

实施例4：IGF-1和胰岛素对PGCs抗氧化和凋亡的影响

为了探究IGF-1对PGCs的细胞抗氧化水平的影响，进行了以下实验：

GSH和GSSG检测：1400 rpm离心6 min收集细胞，使用96孔板，依次加入样品或标准品，混匀。加入15 μL总谷胱甘肽检测工作液后，混匀，25 ℃或室温孵育5分钟；加入50 μL0.5 mg/mL NADPH溶液，混匀；立即用酶标仪测定405 nm吸光度值。

ROS检测：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37 ℃细胞培养箱内避光孵育，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM，离心收集细胞，加入适当稀释好的探针，使其细胞密度为1.0×10⁶~2.0×10⁷。37 ℃细胞培养箱内孵育20-60min，每隔3-5 min颠倒混匀一下，用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，流式细胞仪检测。

采用流式细胞术检测细胞凋亡：将PGCs在24孔板中进行铺板传代，并添加梯度浓度的卵转铁蛋白培养72 h，采用流式细胞术对PGCs进行检测，方法步骤如下：300×g、4 ℃离心收集细胞；用预冷的 PBS 洗涤细胞2次，每次均需 300×g，4 ℃离心5 min。收集 1～5×10⁵细胞；吸弃PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞；加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，轻轻混匀；避光、室温反应10-15 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪检测。（图5）。

结果如图5所示：PGCs中总GSH含量无明显差异（P＞0.05）；与对照无胰岛素组相比，IGF-1和胰岛素组还原型GSH上调；氧化型GSSG下调；ROS下调。结果表明：IGF-1和胰岛素对PGCs抗氧化和凋亡的影响一致，IGF-1可以替代胰岛素的作用。

实施例5：IGF-1和胰岛素对PGCs迁移和建系的影响

为了明确IGF-1与胰岛素对PGCs迁移能力以及建系的影响，进行了迁移观察，采用IGF-1和胰岛素培养荧光PGCs，培养72 h进行鸡胚注射，具体过程如下：

（1）受精种蛋的收集和孵化

（1-1）对获得的新鲜种蛋进行消毒，使用新洁尔灭溶液（1：1000的1.0%新洁尔灭溶液）对蛋壳进行擦拭，擦拭后放入孵化箱内进行孵化，入孵时记录入孵时间并进行标记；

（1-2）在入孵48-60小时（HH stage 16-18）时收集种蛋，此时可以先取出一枚种蛋由大头（钝端）开口后观察鸡胚是否到达孵化的相应时期，需要重点观察胚胎有无发育出可见的血管并形成心脏和其他身体部位，到达时期的种蛋即可取出进行注射。

（2）种蛋开窗

（2-1）用75 %酒精棉球轻轻擦拭蛋壳表面，特别是鸡蛋的开口端；

（2-2）使用镊子在蛋壳表面创建一个小窗口（直径<1cm）以暴露胚胎并去除外壳膜，将鸡蛋放在解剖显微镜下的支架上，准备进行注射。

（3）鸡胚血管注射

（3-1）在体视显微镜下找到胚胎位置，使用眼科镊轻轻挑开胚胎膜，露出胚胎及其血管；

（3-2）将荧光PGCs使用微量移液器通过枪头填入玻璃针（注释：填入过程应缓慢吸取和填入，避免气泡冲入玻璃针），将注射针连接至手持注射器，调节好剂量后在体视显微镜下缓慢沿胚胎背主动脉血管方向扎入注射针，缓慢地将外源溶液（含荧光细胞）填充到玻璃针中，并避免注射针中出现气泡；

（3-3）使用气动式注射器法将荧光细胞推入，需要注意电压或气压应足够低，以减少对胚胎血管的破坏。同时通常注射体积为1~5 μL，过多则容易造成胚胎死亡，一旦外源性溶液被注入胚胎血管中，胚胎血管的颜色将迅速变成溶液的颜色并在随后逐渐恢复为红色，表明外源性溶液已成功输送到胚胎中；

（3-4）注射完成后，轻轻拔出注射针，轻轻滴加20 μL青链霉素至注射部位，然后使用医用胶带封口。将封口后的种蛋继续放入孵化箱进行孵化，孵化至7.5天、12.5天和18.5天进行迁移效率观察。

结果如图6所示：在7.5d和12.5d时，IGF-1和胰岛素对迁移能力的影响相同，接下来进行了建系能力的检测，建系结果表明两者均能建系且无差异，以上结果表明IGF-1可以替代胰岛素的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.IGF-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用。

2.根据权利要求1所述的IGF-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用，其特征在于：体外培养鸡原始生殖细胞应用的IGF-1的浓度C为0＜C≤100 ng/mL。

3.根据权利要求1所述的IGF-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用，其特征在于：体外培养鸡原始生殖细胞应用的IGF-1的浓度C为25 ng/mL≤C≤100 ng/mL。

4.根据权利要求1所述的IGF-1替代胰岛素在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用，其特征在于：体外培养鸡原始生殖细胞应用的IGF-1的浓度C为100 ng/mL。

5.IGF-1在制备促进鸡原始生殖细胞增殖的药物中的应用。