CN119875858A

CN119875858A - 一株酿酒酵母菌及其应用、发酵方法

Info

Publication number: CN119875858A
Application number: CN202410937381.XA
Authority: CN
Inventors: 刘明; 董彦君; 王文欢; 刘泰然
Original assignee: Beijing Zhongnong Hongke Biotechnology Co ltd; Shandong Hongke Fulai Biotechnology Co ltd; Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing Zhongnong Hongke Biotechnology Co ltd; Shandong Hongke Fulai Biotechnology Co ltd; Beijing University of Agriculture
Priority date: 2024-07-12
Filing date: 2024-07-12
Publication date: 2025-04-25

Abstract

本发明涉及一株酿酒酵母菌及其应用、发酵方法，本发明提供了酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）HKB‑145051，于2022年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25020。该酿酒酵母菌可同时发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶这三种纤维降解酶。本发明还提供了相应的发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶这三种纤维降解酶的方法，通过厌氧发酵，利用玉米芯粉或麦麸，配合以无机盐，可诱导该酵母菌株高效发酵生产上述三种纤维降解酶。

Description

一株酿酒酵母菌及其应用、发酵方法

技术领域

本发明涉及真菌技术领域，具体涉及一株酿酒酵母菌及其应用、发酵方法。

背景技术

我国拥有丰富的纤维资源，随着工业技术发展，纤维的功能逐渐受到重视，并被誉为第七大营养素。纤维在人类和动物生产中均有不同的营养价值需求，在动物饲料中添加一定水平膳食纤维对动物的生长、繁殖性能和肠道健康等具有重要作用，能够减少畜禽粪便中氮残留对环境的污染，实现废弃饲料资源的循环利用，节约饲料成本，进一步提高养殖的效益。在欧美发达国家的动物生产抗生素减量替代的进程中，膳食纤维曾作为一个重要产品广泛使用。目前，我国的饲用纤维产品多为麸皮、稻壳等，这类粗纤维原料产品的直接使用存在膳食纤维利用率低、霉菌毒素超标等生物安全问题。

在实际生产中，饲料加工会选择使用防霉剂、纤维降解酶等产品，减少天然纤维饲料原料的霉变，降低饲料原料中长链纤维素、木质素和高聚合木聚糖物质的含量，提高可溶性性纤维和短链不可溶性纤维物质的含量，进而提高天然纤维产品功效。但是化学合成纤维降解酶价格昂贵；更有前景的是微生物发酵法，以果蔬、谷物副产物为原料，通过微生物分泌纤维降解酶酵解原料中抗性淀粉，以及发酵过程中微生物利用、分解蛋白质、脂肪等营养物质并代谢产生有机酸、小肽等活性物质，获得天然富有多重活性的膳食纤维产品。并且通过发酵法提纯获得的膳食纤维具有品质高、色泽高和气味清香等优点，具有较高的适口性。

发酵菌株的选用是微生物发酵的基础和重点。目前对于高纤维饲料原料的发酵多选用混合菌发酵或真菌中的米曲霉和黑曲霉等作为发酵菌，但是曲霉发酵产物的气味及适口性不高，混菌发酵的发酵参数受物料影响较大，对于预处理工艺要求较高。

酵母菌被人类利用的历史十分悠久，早在史前时期，人类祖先就从成熟的落果自然发酵现象学会了酿酒，而且食用发酵面包已有6 000年之久。目前酵母已广泛应用于食品、药用、饲用、化妆品、生物工程、工业等领域。在实际生产中，可以根据对酵母细胞数量、细胞组成成分的需求，或者对酵母代谢产物的需求，按照不同的目的来确定酵母发酵的生产工艺。同时，酵母菌也是人类用来进行生物制造的应用最广的底盘菌种。目前，我国，在饲料原料和添加剂中合法使用的酵母仅有三种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、产朊假丝酵母（Candida utilis）和红发夫酵母（Phaffia rhodozyma）。

所以，选育一株纤维酶发酵生产量较高的酿酒酵母菌，应用于饲料原料加工和产品开发，将有助于我国饲料原料资源的“开源节流。”

发明内容

本发明的目的在于提供一株酿酒酵母菌及其应用、发酵方法，该酿酒酵母菌通过特定的厌氧发酵技术，可同时发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶这三种纤维降解酶。

为此，第一方面，本发明提供一株酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）HKB-145051，所述酿酒酵母菌于2022年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 25020。

该酿酒酵母菌HKB-145051是从自然界中分离、筛选，经自然驯化后获得，未经基因工程技术改造。

本发明的第二方面，提供所述酿酒酵母菌的发酵方法，其包括将所述酿酒酵母菌接种于液体培养基中进行有氧发酵，制备得到有氧发酵液。

通过该发酵方法，可以大量制备所述酿酒酵母菌。

进一步，所述液体培养基包括：10%-15%甘蔗糖蜜，20-30 g/L蛋白胨，0.1%-0.15%KH₂PO₄、0.1%-0.15% MgSO₄·7H₂O和0.05%-0.15% CaCl₂。

在一些实施方式中，所述液体培养基包括：10%甘蔗糖蜜，20 g/L蛋白胨，0.1%KH₂PO₄、0.1% MgSO₄·7H₂O和0.05% CaCl₂。

进一步，所述液体培养基的条件包括：初始发酵温度25-28℃，初始发酵pH值6.5-7.0，转速180-200rpm，发酵时间32-36h。

进一步，所述有氧发酵之前还包括种子液制备步骤；所述种子液制备步骤包括：将所述酿酒酵母菌接种于种子液培养基，进行种子培养，得到所述酿酒酵母菌的种子液。

在一些实施方式中，所述种子液培养基与所述液体培养基相同。

进一步，当包括种子液制备步骤时，将所述种子液接种到液体培养基中的接种量为10%-12%。

进一步，在所述种子液制备步骤之前，还包括以下步骤：菌种活化；所述菌种活化包括：将所述酿酒酵母菌接种于斜面培养基，进行菌种活化培养。

进一步，所述斜面培养基为固体麦芽汁培养基，包括麦芽膏粉、氯霉素、琼脂；各成分含量优选为麦芽膏粉130 g/L、氯霉素0.1 g/L，琼脂20 g/L。

进一步，所述菌种活化培养的温度为28℃-32℃，培养时间为24-48 h。

本发明的第三方面，提供所述酿酒酵母菌在发酵生产纤维降解酶方面的应用。

本发明的第四方面，提供利用所述酿酒酵母菌同时生产三种纤维降解酶的发酵方法，包括将所述酿酒酵母菌接种至液体发酵培养基，进行厌氧发酵；所述纤维降解酶包括纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶。

进一步，所述厌氧发酵培养基包括：10%-15%甘蔗糖蜜，20-30 g/L蛋白胨，20-25g/L 玉米芯，0.1%-0.15% MgSO₄·7H₂O，0.05%-0.15% KH₂PO₄，0.05%-0.15% NaCl；还可包含0.08-0.1 g/L氯霉素。

在一些实施方式中，所述厌氧发酵培养基包括：10%甘蔗糖蜜，20 g/L蛋白胨，20g/L玉米芯，0.1% MgSO₄·7H₂O，0.1% KH₂PO₄，0.05% NaCl；还可包含0.08 g/L氯霉素。

进一步，所述厌氧发酵的条件包括：初始温度25-30℃，例如25℃、28℃、30℃等；初始pH值6.0-7.0，例如pH为6.0、6.5、7.0等；发酵时间为60-72h，例如60h、64h、68h、72h等。

进一步，所述厌氧发酵之前还包括有氧发酵，所述有氧发酵按照本发明第二方面所述的发酵方法进行。

进一步，当所述厌氧发酵之前还包括所述有氧发酵时，将所述有氧发酵液接种到所述厌氧培养基中的接种量为10%-15%，例如可以为约10%、12%、15%等。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1）本发明提供一株具有高纤维素酶表达活性的酿酒酵母菌株HKB-145051；

2）本发明提供的酿酒酵母菌株HKB-145051，可同时生产纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶这三种纤维降解酶；

3）本发明提供的酿酒酵母菌株HKB-145051，通过特定厌氧发酵技术，利用玉米芯粉或麦麸，配合以无机盐，可诱导酵母菌株高效发酵同时生产上述三种纤维降解酶。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1：培养基中不同糖蜜浓度对酿酒酵母HKB-145051生长的影响；

图2：培养基中不同氮源对酿酒酵母HKB-145051生长的影响；

图3：培养基中不同氮源浓度对酿酒酵母HKB-145051生长的影响；

图4：培养基中不同无机盐及浓度对酿酒酵母HKB-145051生长的影响；

图5：采取不同接种量时，对酿酒酵母HKB-145051发酵效果的影响；

图6：采取不同发酵温度时，对酿酒酵母HKB-145051发酵效果的影响；

图7：采取不同发酵时间时，对酿酒酵母HKB-145051发酵效果的影响；

图8：采取不同pH值，对酿酒酵母HKB-145051发酵效果的影响；

图9：采取不同转速，对酿酒酵母HKB-145051发酵效果的影响；

图10：采取有氧发酵和厌氧发酵，对酿酒酵母HKB-145051发酵产纤维素的影响；

图11：厌氧发酵中，采用不同原料对酿酒酵母HKB-145051发酵产纤维素的影响；

图12：厌氧发酵中，采用不同浓度的玉米芯和麦麸对酿酒酵母HKB-145051发酵产纤维素的影响；

图13：厌氧发酵中，采用不同的无机盐及添加浓度对酿酒酵母HKB-145051发酵产纤维素的影响；

图14：厌氧发酵中，采用不同的接种量对酿酒酵母HKB-145051发酵产纤维素的影响；

图15：厌氧发酵中，采用不同的初始温度对酿酒酵母HKB-145051发酵产纤维素的影响；

图16：厌氧发酵中，采用不同的初始pH值对酿酒酵母HKB-145051发酵产纤维素的影响；

图17：厌氧发酵中，采用不同的发酵时间对酿酒酵母HKB-145051发酵产纤维素的影响；

图18：本发明的技术路线示意图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明技术方案的技术路线如图18所示。参考图18，本发明首先从自然界中筛选可同时产生纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶的酿酒酵母菌种，经菌株选育后，得到酿酒酵母菌HKB-145051；然后经发酵工艺研究（包括液体有氧发酵、液体厌氧发酵），主要通过激发纤维素降解酶生产的底物研究，探索得到了最佳发酵条件，形成了酿酒酵母菌及纤维素降解酶高效发酵工艺。

实施例1 酿酒酵母菌HKB-145051的分离

（1）培养基：麦芽汁培养基。取500 g麦芽，将其粉碎后放入烧杯中，加入2000 mL蒸馏水，搅拌下45℃水浴30 min，温度调高至70℃，保持1 h；8层纱布过滤，并用蒸馏水洗涤烧杯和滤槽，使滤液达到2000 mL，煮沸后再过滤，冷却，10℃保存备用。

（2）酿酒酵母菌的分离：以奶牛粪便、肉牛粪便、山羊粪便、以及各牛羊牧场土壤等为原料，分别采集400 mL（液体样品）或400 g（捣碎的固体样品）原料样品，置于无菌锥形瓶中，盖8层纱布于28℃自然发酵3 d。无菌条件下，将发酵培养液样品摇匀，用无菌移液器吸取适量发酵液于经过灭菌的麦芽汁培养液中，28℃培养。待有酒味时采用梯度稀释法稀释至浓度为10^-5，吸取0.1 mL稀释后的培养液均匀涂布于麦芽汁培养基（麦芽汁培养液+2%琼脂）上，28℃倒置48 h，待长出菌落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步分离、纯化，直至获得纯菌株。经鉴定后确认后转入麦芽汁固体斜面培养基，4℃保存备用。

（3）具有纤维降解特性酵母菌分离

纤维素培养基：NaNO₃2.0 g/L，KH₂PO₄1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，KClKCl 0.5g/L，蛋白胨2.0 g/L，羧甲基纤维素0.5 g/L；

木聚糖培养基：NaNO₃2.0 g/L，KH₂PO₄1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，KClKCl 0.5g/L，蛋白胨2.0 g/L，木聚糖0.5 g/L；

木质素培养基：KH₂PO₄1.0 g/L，酵母膏0.01 g/L，C₄H₁₂N₂O₆酒石酸铵1.0 g/L，CuSO₄0.001 g/L，MgSO₄·7H₂O0.5 g/L，Fe₂(SO₄)₃0.001 g/L，MnSO₄0.001 g/L，CaCl₂0.01 g/L，琼脂1.6% w/v，0.25%w/v木质素。

上述三种培养基高压灭菌后，点种前述分离的酵母菌；再分别补充10mL20%(w/v)葡萄糖溶液和 0.1g/L氯霉素，调节pH值6.0，发酵温度25℃，培养2.5天。

（4）酿酒酵母菌产生纤维降解酶定性分析

对在前述三个培养基上有明显菌落生长的菌群进行分离如下处理；

（1）在纤维素和木聚糖培养基上的：酵母菌落倒入使用15mL 0.1%刚果红染色液约15mL，浸泡15 min后倾去染色液，然后用1mol/L NaCl溶液染色。从接种点菌群向外有晕带部分呈现黄色表明酵母菌代谢产物对底物（CMC或木聚糖）降解，呈现红色表明不降解；

（2）对木质素培养基上的：酵母菌落菌株，使用新配制的1%(w/v)的FeCl₃和K₃(Fe(CN)₆)水溶液浸泡，菌落周围呈现蓝绿色说明木质素被菌群代谢物降解为酚类。筛选结果见表1所示。

表1 具有纤维降解特性的酵母菌筛选

备注：+ 表示可降解，- 表示不可降解。

（5）对酵母菌145051进行鉴定保藏。

经鉴定酵母菌145051为酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），命名为HKB-145051，于2022年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo. 25020。

实施例2 酿酒酵母HKB-145051发酵培养基的选择

取酿酒酵母HKB-145051，经菌种活化、种子液培养后，分别采用以下培养基进行有氧发酵培养，温度条件均为28℃。

（1）不同糖蜜浓度对酿酒酵母HKB-145051生长的影响

分别选择5%、8%、10%、13%、15%甘蔗糖蜜作为培养基，菌液接种量为2%，培养24 h后，取8 mL菌液用无菌水洗涤两次，取菌体烘干至恒重后称量干重。每组三个平行并计算平均值，统计结果如图1所示。根据图1结果可知，当甘蔗糖蜜浓度为10%以上时，培养基中的糖蜜浓度变化对酿酒酵母HKB-145051的生长无显著影响，所以在10%以上增加糖蜜用量对菌株发酵无意义。

（2）不同氮源对酿酒酵母HKB-145051生长的影响

在10%甘蔗糖蜜的基础上添加氮源，具体地，分别选牛肉浸粉、酵母膏、蛋白胨、氯化铵、氨水、尿素作为氮源，并且使最终氮元素含量为2.2 g/L。菌液接种量为2%，培养24 h后，取8 mL菌液用无菌水洗涤两次，取菌体烘干至恒重后称量干重。每组三个平行并计算平均值，统计结果如图2所示。根据图2结果可知，当采用酵母膏与蛋白胨时，酿酒酵母HKB-145051的生长情况最佳。

（3）氮源浓度的选择

在10%甘蔗糖蜜的基础上添加氮源，具体地，根据生产便利和通用性，选择蛋白胨为氮源，其浓度分别选取10、15、20、25、30 g/L。菌液接种量为2%，培养24 h后，取8 mL菌液用无菌水洗涤两次，取菌体烘干至恒重后称量干重。每组三个平行并计算平均值，统计结果如图3所示。根据图3结果可知，当培养基中的蛋白胨浓度为20 g/L时，酿酒酵母HKB-145051的生长效果最佳。

（4）不同无机盐及浓度对酿酒酵母HKB-145051生长的影响

在10%甘蔗糖蜜，20 g/L蛋白胨的基础上添加无机盐，具体地，分别选取KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O 、KCl、CaCl₂，且分别设置不同的添加浓度0.00%、0.05%、0.10%、0.15%。菌液接种量为2%，培养24 h后，取8 mL菌液用无菌水洗涤两次，取菌体烘干至恒重后称量干重。

每组三个平行并计算平均值，统计结果如图4所示。根据图4结果可知，KCl和K₂HPO₄·3H₂O对酵母生长影响不大，所以不再加入，0.1%与0.15%的KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O与对生长的影响基本一致，所以浓度选用0.1%。0.05%CaCl₂与0.1%和0.15%对生长的影响基本一致，所以选用0.05%。

综上，经优化得到的培养基组成为：10%甘蔗糖蜜，20g/L蛋白胨，0.1% KH₂PO₄、0.1%MgSO₄·7H₂O和0.05%CaCl₂。

实施例3 酿酒酵母HKB-145051发酵参数的选择

取酿酒酵母HKB-145051，经菌种活化、种子液培养后，采用实施例2优化得到的培养基进行有氧发酵培养，具体培养条件如下：

（1）接种量的选择

采用不同的菌液接种量：2%、5%、8%、10%、12%、15%、18%。发酵24h后称取最终的酵母菌干重。每组三个平行并计算平均值，统计结果如图5所示。根据图5可知，当采取10~12%的接种量时，即可达到较高的发酵效果。

（2）发酵温度的选择

采用10%的接种量，分别采用以下温度进行发酵培养：25℃、28℃、30℃、32℃、35℃，培养24h，称取酵母干重。每组三个平行并计算平均值，统计结果如图6所示。根据图6可知，初始发酵温度25-28℃会获得较好的发酵效果。

（3）发酵时间的选择

采用10%的接种量，发酵温度为28℃，进行发酵培养，从12h至48h每隔4h取样，并且称取酵母菌干重。每组三个平行并计算平均值，统计结果如图7所示。根据图7可知，当发酵时间为32~36h时，可取得优良的发酵效果。

（4）发酵pH值的选择

采用10%的接种量，发酵温度为28℃，分别采取以下初始pH值进行发酵培养：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。发酵32h后称取最终的酵母菌干重。每组三个平行并计算平均值，统计结果如图8所示。根据图8可知，pH值6.5-7.0条件下，发酵效果较好。

（5）转速的选择

采用10%的接种量，发酵温度为28℃，初始pH为7.0，分别采取以下摇床转速进行发酵培养：150、180、200、220、240、260rpm，发酵32h后称取最终的酵母菌干重。每组三个平行并计算平均值，统计结果如图9所示。根据图9可知，180-200 rpm条件下获得的发酵效果较好。

综上，通过系列试验研究，采用以下条件对酿酒酵母HKB-145051进行发酵培养可取得较好的发酵效果：接种量10-12%，初始发酵温度25-28℃，初始发酵pH值6.5-7.0，转速180-200rpm，发酵时间32-36h。

实施例4 酿酒酵母HKB-145051的液体有氧发酵

（1）斜面菌种活化：将冷冻保藏的酿酒酵母菌HKB-145051接种到含有130 g/L麦芽膏粉、0.1 g/L氯霉素、20 g/L琼脂的斜面培养基上，静置恒温30℃，培养48 h，得到活化后的酵母菌种。

（2）种子液的制备：接种一环活化后的酵母菌种于10%甘蔗糖蜜，20 g/L蛋白胨，0.1% KH₂PO₄、0.1% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂、0.08 g/L氯霉素，pH值为6.5的液体培养基中，在28℃恒温摇床培养，转速200 r/min，培养24 h，制备得到种子液。

（3）有氧发酵：按10%的接种量，将种子液接种至含有10%甘蔗糖蜜，20 g/L蛋白胨，0.1% KH₂PO₄、0.1% MgSO₄·7H₂O和0.05% CaCl₂、0.08 g/L氯霉素，pH值为7.0的液体培养基中，在28℃恒温摇床培养，转速200 r/min，培养32 h，制备得到有氧发酵液。将该有氧发酵液接种至实施例5中的培养基进行后续发酵。

实施例5 酿酒酵母HKB-145051高效生产纤维降解酶的发酵方法研究

（1）诱导酿酒酵母HKB-145051高效生产纤维降解酶发酵方式的选择

同等液体培养基条件（10%甘蔗糖蜜，20 g/L蛋白胨，0.1% KH₂PO₄、0.1% MgSO₄·7H₂O和0.05% CaCl₂、0.08 g/L氯霉素）下，接种10%，分别进行有氧和厌氧发酵，初始温度25℃，初始pH值6.5，发酵24h。

以5 mL/g发酵菌泥加入50 mM柠檬酸缓冲液(pH 4.8)提取粗酶，以200 rpm搅拌30min。过滤分离后收集滤液，1500 rpm离心20 min后，选用上清液。用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶和木聚糖酶活性，用Lip过氧化法测定木质素酶活性。

通过对纤维酶、木聚糖酶和木质素酶活性的比较（每组三个平行并计算平均值，具体结果见图10所示），选择厌氧发酵为主要的发酵方法。

（2）酿酒酵母HKB-145051高效生产纤维降解酶的厌氧发酵底物选择

厌氧发酵在糖分耗尽情况下比较理想，并且一些纤维素原料可提高纤维酶的表达，分别选择豆粕、玉米、玉米芯、麦麸、甜菜渣作为原料，粉碎后进行厌氧发酵，24h后对发酵产物的纤维降解酶活性比较。每组三个平行并计算平均值，结果如图11所示，发现玉米芯和麦麸两种原料可以很好的在厌氧条件下诱发酿酒酵母HKB-145051纤维降解酶的产生。

（3）酿酒酵母HKB-145051高效生产纤维降解酶厌氧发酵培养基组成

含有10%甘蔗糖蜜、20 g/L蛋白胨和0.08 g/L氯霉素的基础培养基中，高温灭菌后冷却到40℃的玉米芯、麦麸分别添加10、15、20、25 g/L，菌液接种量10%，初始发酵温度25℃，自然pH值条件下，发酵24h后检测纤维酶活性。每组三个平行并计算平均值，结果如图12所示，发现采用20 g/L玉米芯可诱发酿酒酵母HKB-145051纤维降解酶的产生。

在应用20 g/L玉米芯的基础上，分别选取KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O 、NaCl、CaCl₂作为无机盐，分别设置不同的无机盐添加浓度0.00%、0.05%、0.10%、0.15%。菌液接种量10%，初始发酵温度25℃，自然pH值条件下，发酵24h后检测三种纤维降解酶活性。每组三个平行并计算平均值，结果如图13所示，可知采用20 g/L的玉米芯时，配合含有0.1%MgSO₄·7H₂O，0.1%KH2PO4，0.05%CaCl₂有机盐溶液，作为酿酒酵母HKB-145051氧发酵培养基，可获得较高纤维降解酶。

（4）酿酒酵母HKB-145051高效生产纤维降解酶厌氧发酵条件选择

采用前述液体发酵培养基（10%甘蔗糖蜜，20 g/L蛋白胨，0.08 g/L氯霉素，20 g/L玉米芯，0.1% MgSO₄·7H₂O，0.1% KH₂PO₄，0.05% NaCl），选择接种量分别为5%、8%、10%、12%、15%，初始发酵温度25℃，自然pH值条件下，发酵24h后检测三种纤维降解酶活性。每组三个平行并计算平均值，结果如图14所示。

在此基础上，进一步优化初始温度：采用10%的接种量，自然pH值条件下，分别采用以下初始温度进行发酵：25℃、28℃、30℃、32℃、35℃，发酵24h后检测三种纤维降解酶活性。每组三个平行并计算平均值，结果如图15所示。

在此基础上，进一步优化pH值：采用10%的接种量，初始温度28℃，分别采用以下初始pH值进行发酵：5.5、6.0、6.5、7.0，发酵24h后检测三种纤维降解酶活性。每组三个平行并计算平均值，结果如图16所示。

在此基础上，进一步优化发酵时间：采用10%的接种量，初始温度28℃，初始pH值6.0，发酵24h后，每4h取样并检测三种纤维降解酶活性。每组三个平行并计算平均值，结果如图17所示。

根据上述研究，采用接种量10%，初始温度28℃，初始pH值6.0，发酵60-72h，在此厌氧发酵条件下，酿酒酵母HKB-145051发酵生产三种纤维降解酶的效率较高。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1. 一株酿酒酵母菌，其特征在于，为酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）HKB-145051，于2022年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 25020。

2.权利要求1所述的酿酒酵母菌的发酵方法，其特征在于，包括将所述酿酒酵母菌接种于液体培养基中进行有氧发酵，制备得到有氧发酵液。

3. 如权利要求2所述的酿酒酵母菌的发酵方法，其特征在于，所述液体培养基包括：10%-15%甘蔗糖蜜，20-30 g/L蛋白胨，0.1%-0.15% KH₂PO₄、0.1%-0.15% MgSO₄·7H₂O和0.05%-0.15% CaCl₂。

4.如权利要求2或3所述的酿酒酵母菌的发酵方法，其特征在于，所述液体培养基的条件包括：初始发酵温度25-28℃，初始发酵pH值6.5-7.0，转速180-200rpm，发酵时间32-36h。

5.如权利要求2所述的酿酒酵母菌的发酵方法，其特征在于，所述有氧发酵之前还包括种子液制备步骤；所述种子液制备步骤包括：将所述酿酒酵母菌接种于种子液培养基，进行种子培养，得到所述酿酒酵母菌的种子液。

6.权利要求1所述的酿酒酵母菌在发酵生产纤维降解酶方面的应用。

7.一种利用酿酒酵母菌同时生产三种纤维降解酶的发酵方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的酿酒酵母菌接种至厌氧发酵培养基，进行厌氧发酵；所述纤维降解酶包括纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶。

8. 如权利要求7所述的利用酿酒酵母菌同时生产三种纤维降解酶的发酵方法，其特征在于，所述厌氧发酵培养基包括：10%-15%甘蔗糖蜜，20-30 g/L蛋白胨，20-25g/L 玉米芯，0.1%-0.15% MgSO₄·7H₂O，0.05%-0.15% KH₂PO₄，0.05%-0.15% NaCl。

9.如权利要求7或8所述的利用酿酒酵母菌同时生产三种纤维降解酶的发酵方法，其特征在于，所述厌氧发酵的条件包括：初始温度25-30℃，初始pH值6.0-7.0，发酵时间60-72h。

10.如权利要求7所述的利用酿酒酵母菌同时生产三种纤维降解酶的发酵方法，其特征在于，所述厌氧发酵之前还包括有氧发酵，所述有氧发酵按照权利要求2-5中任一项所述的酿酒酵母菌的发酵方法进行；

并且，当所述厌氧发酵之前还包括所述有氧发酵时，将所述有氧发酵液接种到所述厌氧培养基中的接种量为10%-15%。