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CN119874933A - 一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系及其制备方法 - Google Patents

一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系及其制备方法 Download PDF

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CN119874933A
CN119874933A CN202411665725.2A CN202411665725A CN119874933A CN 119874933 A CN119874933 A CN 119874933A CN 202411665725 A CN202411665725 A CN 202411665725A CN 119874933 A CN119874933 A CN 119874933A
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刘泽
李胜华
陆芳
袁蕊
赵明治
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Jinyubaoling Bio Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，更具体而言，涉及一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系及其制备方法。所述纳米抗体序列VHH为表达序列SEQ ID NO.1，以pET39b为载体构建表达纳米抗体，并在纳米抗体C端分别连接His标签。可以实现纳米抗体的可溶高表达，最终获得的纳米抗体具有结构均一、无残留标签序列、表达量高的特点，基于581纳米抗体，最终可实现5.6mg/g菌体的表达量。本发明表达体系为纳米抗体的早期筛选体系建立和未来的纳米抗体产业化提供了平台技术。

Description

一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，更具体而言，涉及一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系及其制备方法。
背景技术
自1975年第一支单克隆抗体诞生以来，越来越多的抗体(如嵌合抗体，人源化抗体，以及全人源抗体)被应用于各种疾病的诊断和治疗，显示出不断扩大的应用前景。骆驼和鲨鱼体内天然存在一种缺乏轻链的独特抗体，称为可变重链域，又称纳米抗体(nanobody，VHH)。与传统抗体复杂的加工过程相比，VHH具有体积更小(12-15kDa)、结构更简单的特点，在实验室环境下具有更好的研发应用价值。例如，VHH可以作为免疫识别抗体、分子探针或分子成像工具。
目前用于纳米抗体的体外表达生产有多种方式：如大肠杆菌、毕赤酵母、真菌、哺乳动物细胞、植物细胞等。酵母表达体系通过分泌表达的方式进行，但是酵母有很严重的蛋白酶介导的降解和翻译后修饰问题，对下游工艺不利。哺乳动物细胞如HEK293，CHO等是纳米抗体的合适表达体系之一，但是其表达体系操作复杂成本高，不适合早期工艺开发。大肠杆菌，主要通过胞外周质分泌表达的方式进行可溶表达，有文献报道可以通过优化信号肽的方式提高表达量，但是大肠杆菌外周质空间较小，表达量有限。大肠杆菌基因操作简单，成本便宜。但是大肠杆菌缺乏必要的翻译后折叠和二硫键形成机制，多数外源蛋白会以包含体形式表达。尽管表达产物可以通过变复性等下游工艺获得有活性的蛋白，但是变复性工艺对早期筛选仍不适用。
尽管纳米抗体结构简单，利用大肠杆菌表达体系，通过引入信号肽，将表达产物定位到胞外周质可溶分泌表达，是目前的常用战略，但是由于伴侣蛋白的不足和内膜发生的低效率易位，胞外周质空间较小等问题，其产量的上限远远低于预期。建立工艺简单、纯度高、表达量高的纳米抗体表达体系是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个方面的目的在于，提供一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系，所述纳米抗体序列VHH为表达序列SEQ ID NO.1，以pET39b为载体构建表达纳米抗体，并在纳米抗体C端分别连接His标签。
优选的，所述纳米抗体融合是表达序列SEQ ID NO.1上添加蛋白标签和/或酶切位点。
优选的，所述酶切位点为DDDDK。
优选的，所述酶切位点包括EK酶、TEV蛋白酶。
本发明的另一个方面的目的在于，提供一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系的制备方法，所述制备方法具体步骤为：
S1.在菌体培养和诱导表达结束后，收集大肠杆菌的菌体，可溶表达的蛋白经破碎收集上清后直接纯化；
S2.将收集的上清溶液进行亲和层析纯化，脱盐制剂与酶切、酶切产物的亲和纯化，最终获得均一性和纯度好的纳米抗体。
优选的，所述S1中菌体培养为将重组表达载体，按照1:1000接种于2YT+G的培养基(含Kana+)中，37℃、220转/分钟培养；所述诱导表达为在菌体培养过程中，当检测到OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。
优选的，所述S1中收集大肠杆菌的菌体为在菌体培养和诱导表达结束后取500μL于4℃、12000转/分钟离心1分钟，弃上清，破碎菌体并通过SDS PAGE检测蛋白表达量。
优选的，所述S2中亲和层析纯化为将收集的上清样品溶液稀释过滤上样后，先使用平衡缓冲液冲洗，再使用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到纯化的带亲和标签的纳米抗体融合蛋白。
优选的，所述平衡缓冲液pH值为8.5，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris-HCl，300mM NaCl；所述洗脱缓冲液pH值为8.5，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，500mM咪唑。
优选的，所述S2中脱盐制剂与酶切为将亲和纯化样品脱盐至酶切缓冲液中，紫外分光光度计A280nm检测样品浓度，并用EK酶进行酶切，EK酶:蛋白＝1:50～1:500(mg:mg)的酶切比例，分别在20℃、37℃酶切14-18小时以获得酶切后的重组纳米抗体；所述酶切缓冲液pH值为8.0，由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris-HCl，50mMNaCl，2mM CaCl2。
本发明所具有的有益效果如下：
本发明基于大肠杆菌的纳米抗体表达体系，可以实现纳米抗体的可溶高表达，最终获得的纳米抗体具有结构均一、无残留标签序列、表达量高的特点。基于581纳米抗体，最终可实现5.6mg/g菌体的表达量。本发明表达体系为纳米抗体的早期筛选体系建立和未来的纳米抗体产业化提供了平台技术。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例一连接His标签的重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳图谱；
图2为本发明实施例一连接His+SUMO重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳图谱；
图3为本发明实施例二sumo-581亲和纯化的SDS-PAGE电泳图谱；
图4为本发明实施例二sumo-581亲和纯化洗脱样酶切的SDS-PAGE电泳图谱；
图5为本发明实施例二DsbA-EK-581亲和纯化的SDS-PAGE电泳图谱；
图6为本发明实施例二DsbA-EK-581亲和纯化洗脱样酶切的SDS-PAGE电泳图谱；
图7为本发明实施例三DsbA-EK-581-Flag亲和纯化的SDS-PAGE电泳图谱；
图8为本发明实施例三DsbA-EK-581-Flag亲和纯化洗脱样酶切的SDS-PAGE电泳图谱；
图9为本发明实施例三DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化的SDS-PAGE电泳图谱；
图10为本发明实施例三DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化色谱图；
图11为本发明实施例三DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化样品质谱图；
图12为本发明实施例三DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化样品ELISA活性测定。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
IPTG为麦克林公司产品，产品目录号为367-93-1；
下述实施例中的pET28b载体为Novagen公司产品，产品目录号为69865-3。
下述实施例中的pET39b载体为Novagen公司产品，产品目录号为70090-3。
下述实施例中的相关培养基及溶液如下：
LB培养基：Yeast extract 5g、Tryptone 10g、NaCl 10g、pH7.0，定容至1L，121℃、20min灭菌。
2YT+G培养基：Yeast extract 30g、Tryptone 10g、NaCl 5g、Glycerol 10g、pH7.0，定容至1L，121℃、20min灭菌。
2YT+G培养基(含Kana+)：Yeast extract 30g、Tryptone 10g、NaCl 5g、Glycerol10g、pH7.0，定容至1L，121℃、20min灭菌，灭菌降温后加终浓度为50ug/mL卡那霉素。
平衡缓冲液pH值为8.5，由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mMTris-HCl，300mM NaCl。
洗脱缓冲液pH值为8.5，由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mMTris-HCl，300mM NaCl，500mM咪唑。
酶切缓冲液pH值为8.0，由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM CaCl2。
实施例一.纳米抗体连接His标签与His+SUMO标签
本发明通过免疫羊驼利用噬菌体展示技术从构建的纳米抗体文库中筛选获得的纳米抗体序列VHH为表达序列，以pET28b为载体构建表达纳米抗体，并在纳米抗体N端分别连接His标签，获得了如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示的序列。同时，重组蛋白在大肠杆菌中表达。
将连接His标签重组纳米抗体在大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株培养于5mL LB培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。培养结束后，取500μL于4℃、12000转/分钟离心1分钟，弃上清，破碎菌体并通过SDS PAGE检测蛋白表达量。
纳米抗体连接His+SUMO标签，以pET SUMO为载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。连接His+SUMO标签获得了如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7所示的序列。同时，重组蛋白在大肠杆菌中表达。
将连接His+SUMO重组纳米抗体表达菌株培养于5mL LB培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。培养结束后，取500μL于4℃、12000转/分钟离心1分钟，弃上清，破碎菌体并通过SDS PAGE检测蛋白表达量。
结果表明，通过SDS-PAGE检测如图1和图2所示。
图1为连接His标签的重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳图谱。泳道1-BI为诱导前AnHSA的全菌蛋白，泳道1-Sup为诱导后AnHSA超声破碎离心的上清，泳道1-IBs为诱导后AnHSA超声破碎离心的沉淀，泳道Marker为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道2-BI为诱导前156的全菌蛋白，泳道2-Sup为诱导后156超声破碎离心的上清，泳道2-IBs为诱导后156超声破碎离心的沉淀，泳道3-BI为诱导前581的全菌蛋白，泳道3-Sup为诱导后581超声破碎离心的上清，泳道为3-IBs为诱导后581超声破碎离心的沉淀。
图2为连接His+SUMO重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳图谱。泳道Marker为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道1-BI为诱导前sumo-581的全菌蛋白，泳道1-Sup为诱导后sumo-581超声破碎离心的上清，泳道1-IBs为诱导后sumo-581超声破碎离心的沉淀，泳道2-BI为诱导前sumo-156的全菌蛋白，泳道2-Sup为诱导后sumo-156超声破碎离心的上清，泳道2-IBs为诱导后sumo-156超声破碎离心的沉淀，泳道3-BI为诱导前sumo-AnHSA的全菌蛋白，泳道3-Sup为诱导后sumo-AnHSA超声破碎离心的上清，泳道3-IBs为诱导后sumo-AnHSA超声破碎离心的沉淀。
连接His标签的重组纳米抗体与His+SUMO重组纳米抗体相比，产生的目的蛋白His标签重组纳米抗体表达量明显少于Sumo融合表达方式如下表1，且存在部分目的蛋白是包涵体表达的情况。
表1.581纳米抗体表达量汇总比较表
实施例二.纳米抗体连接DsbA+His标签
本发明通过免疫羊驼利用噬菌体展示技术从构建的纳米抗体文库中筛选获得的纳米抗体序列VHH为表达序列，以pET39b为载体构建表达纳米抗体，并在纳米抗体N端连接DsbA标签，并在标签与纳米抗体中间加上一个EK酶切位点，C端连接His标签，获得了如SEQID NO.8所示的序列。同时，重组蛋白在大肠杆菌中表达。
将DsbA+His重组纳米抗体表达菌株培养于5mL LB培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。培养结束后，取500μL于4℃、12000转/分钟离心1分钟，弃上清，破碎菌体并通过SDS PAGE检测蛋白表达量。
将DsbA+His重组纳米抗体表达菌株培养于2L 2YT+G培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。菌体培养和诱导表达结束后，收集大肠杆菌的菌体，可溶表达的蛋白经破碎收集上清后直接纯化。将收集的上清溶液进行亲和层析(例如使用GE HisTrap FF层析柱)，脱盐酶切(例如使用Sephadex G-25Fine层析柱)、酶切穿透(例如使用GE HisTrapFF层析柱)的纯化的步骤。
1)在亲和层析纯化中，将收集的上清样品溶液稀释过滤上样后，先使用平衡缓冲液洗涤，再使用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到纯化的带亲和标签的重组蛋白。
2)将亲和纯化样品脱盐至酶切缓冲液，紫外分光光度计A280nm检测样品浓度，并用EK酶进行酶切，EK酶:蛋白＝1:500～1:2000(mg:mg)的酶切比例，分别在4℃、20℃、30℃酶切14-18小时以获得酶切后的重组纳米抗体，选择最优的方式进行酶切。
纳米抗体连接多顺反子DsbA+His标签获得了如SEQ ID NO.9所示的序列。以pET39b为载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。将连接多顺反子DsbA+His标签重组纳米抗体表达菌株培养于5mL LB培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。培养结束后，取500μL于4℃、12000转/分钟离心1分钟，弃上清，破碎菌体并通过SDS PAGE检测蛋白表达量。
将连接多顺反子DsbA+His标签重组纳米抗体表达菌株培养于2L 2YT+G培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。菌体培养和诱导表达结束后，收集大肠杆菌的菌体，可溶表达的蛋白经破碎收集上清后直接纯化。将收集的上清溶液进行亲和层析(例如使用GE HisTrap FF层析柱)，脱盐酶切(例如使用Sephadex G-25Fine层析柱)、酶切穿透(例如使用GE HisTrap FF层析柱)的纯化的步骤。
1)在亲和层析纯化中，将收集的上清样品溶液稀释过滤上样后，先使用平衡缓冲液洗涤，再使用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到纯化的带亲和标签的重组蛋白。
2)将亲和纯化样品脱盐至酶切缓冲液，紫外分光光度计A280nm检测样品浓度，并用EK酶进行酶切，尝试使用不同的酶切条件，不同温度、酶量、缓冲体系及变性条件，该构建通过EK酶切，在EK酶:蛋白＝1:500(mg:mg)的酶切比例，20℃条件下，成功将标签与纳米抗体切开。
结果表明，通过SDS-PAGE检测结果如图3-6所示。
图3为sumo-581亲和纯化的SDS-PAGE电泳图谱。泳道581-2为sumo-581上清清洗原液，泳道FT为sumo-581亲和纯化流穿样，泳道M为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道EL1为sumo-581亲和纯化0-10％B液洗脱样，泳道EL2为sumo-581亲和纯化11％-35％B液洗脱样，泳道EL3为sumo-581亲和纯化36％-70％B液洗脱样，泳道EL4为sumo-581亲和纯化71％-100％B液洗脱样。
图4为sumo-581亲和纯化洗脱样酶切的SDS-PAGE电泳图谱。泳道4℃、1：500为Sumo酶500倍稀释在4℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样，泳道4℃、1：1000为Sumo酶1000倍稀释在4℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样，泳道4℃、1：2000为Sumo酶2000倍稀释在4℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样，泳道M为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道20℃、1：500为Sumo酶500倍稀释在20℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样，泳道20℃、1：1000为Sumo酶1000倍稀释在20℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样，泳道20℃、1：2000为Sumo酶2000倍稀释在20℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样，泳道30℃、1：500为Sumo酶500倍稀释在30℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样，泳道30℃、1：1000为Sumo酶1000倍稀释在30℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样，泳道30℃、1：2000为Sumo酶1:2000倍稀释在30℃条件酶切sumo-581纯化洗脱样。
图5为DsbA-EK-581亲和纯化的SDS-PAGE电泳图谱。泳道581-4为DsbA-EK-581上清清洗原液，泳道FT为DsbA-EK-581亲和纯化流穿样，泳道M为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道EL1为DsbA-EK-581亲和纯化0-20％B液洗脱样，泳道EL2为DsbA-EK-581亲和纯化21％-45％B液洗脱样，泳道EL3为DsbA-EK-581亲和纯化46％-65％B液洗脱样，泳道EL4为DsbA-EK-581亲和纯化66％-85％B液洗脱样，泳道EL5为DsbA-EK-581亲和纯化86％-100％B液洗脱样。
图6为DsbA-EK-581亲和纯化洗脱样酶切的SDS-PAGE电泳图谱。泳道4℃、1：500为EK酶500倍稀释在4℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样，泳道4℃、1：1000为EK酶1000倍稀释在4℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样，泳道4℃、1：2000为EK酶2000倍稀释在4℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样，泳道M为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道20℃、1：500为EK酶500倍稀释在20℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样，泳道20℃、1：1000为EK酶1000倍稀释在20℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样，泳道20℃、1：2000为EK酶2000倍稀释在20℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样，泳道30℃、1：500为EK酶500倍稀释在30℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样，泳道30℃、1：1000为EK酶1000倍稀释在30℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样，泳道30℃、1：2000为EK酶2000倍稀释在30℃条件酶切DsbA-EK-581纯化洗脱样。
连接DsbA+His标签的重组纳米抗体与多顺反子DsbA+His重组纳米抗体相比，多顺反子DsbA+His重组纳米抗体在EK酶:蛋白＝1:500(mg:mg)的酶切比例，20℃条件下，成功将标签与纳米抗体切开，而DsbA+His标签的重组纳米抗体在多种酶切条件下均未酶切开。
实施例三.纳米抗体连接DsbA+His+Flag标签
本发明通过免疫羊驼利用噬菌体展示技术从构建的纳米抗体文库中筛选获得的纳米抗体序列VHH为表达序列，以pET39b为载体构建表达纳米抗体，并在纳米抗体N端插入DsbA及EK酶切位点，C端分别连接His、Flag标签，获得了如SEQ ID NO.1所示的序列。同时，重组蛋白在大肠杆菌中表达。
将DsbA+His+Flag重组纳米抗体表达菌株培养于5mL LB培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。培养结束后，取500μL于4℃、12000转/分钟离心1分钟，弃上清，破碎菌体并通过SDS PAGE检测蛋白表达量。
将DsbA+His+Flag重组纳米抗体表达菌株培养于2L 2YT+G培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。菌体培养和诱导表达结束后，收集大肠杆菌的菌体，可溶表达的蛋白经破碎收集上清后直接纯化。
将收集的上清溶液进行亲和层析(例如使用GE HisTrap FF层析柱)，脱盐酶切(例如使用Sephadex G-25Fine层析柱)、酶切穿透(例如使用GE HisTrap FF层析柱)的纯化的步骤。
1)在亲和层析纯化中，将收集的上清样品溶液稀释过滤上样后，先使用平衡缓冲液洗涤，再使用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到纯化的带亲和标签的重组蛋白。
2)将亲和纯化样品脱盐至酶切缓冲液，紫外分光光度计A280nm检测样品浓度，并用EK酶进行酶切，EK酶:蛋白＝1:50～1:500(mg:mg)的酶切比例，分别在20℃、30℃酶切14-18小时以获得酶切后的重组纳米抗体，选择最优的方式进行酶切(例如EK酶:蛋白＝1:250、20℃)。
3)将酶切后的样品过滤上样后，先使用平衡缓冲液洗涤，收集洗脱样品即为酶切后的重组纳米抗体，通过SDS PAGE检测结果。
4)将酶切纯化后的样品通过BCA测定抗体浓度，质谱法分析纳米抗体分子量，通过高分辨质谱、超高效液相色谱及去卷积软件分析纳米抗体分子量为17206.5Da，与预期一致。
5)包被适当浓度靶标抗原于酶标板上，1％BSA封闭非特异孔后，加入梯度系列稀释后的纳米抗体，使用兔抗Flag过氧化物酶标记的二抗，间接ELISA分析纳米抗体结合活性。
结果表明，通过SDS-PAGE检测如图7-10所示。
图7为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化的SDS-PAGE电泳图谱。泳道M为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道581-5为DsbA-EK-581-Flag上清清洗原液，泳道FT为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化流穿样，泳道EL1为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化0-20％B液洗脱样，泳道EL2为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化21％-50％B液洗脱样，泳道EL3为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化51％-75％B液洗脱样，泳道EL4为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化76％-100％B液洗脱样。
图8为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化洗脱样酶切的SDS-PAGE电泳图谱。泳道M(左)为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道酶切前(左)为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化洗脱样，泳道20℃、1：50为EK酶50倍稀释在20℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道20℃、1：150为EK酶150倍稀释在20℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道20℃、1：250为EK酶250倍稀释在20℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道20℃、1：350为EK酶350倍稀释在20℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道20℃、1：500为EK酶500倍稀释在20℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道M(右)为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道酶切前(右)为DsbA-EK-581-Flag亲和纯化洗脱样，泳道37℃、1：50为EK酶50倍稀释在37℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道37℃、1：150为EK酶150倍稀释在37℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道37℃、1：250为EK酶250倍稀释在37℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道37℃、1：350为EK酶350倍稀释在37℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样，泳道37℃、1：500为EK酶500倍稀释在37℃条件酶切DsbA-EK-581-Flag纯化洗脱样。
图9为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化的SDS-PAGE电泳图谱。泳道M为分子量10-180kD的蛋白质分子量标准，泳道酶切前为DsbA-EK-581-Flag酶切前纯化洗脱样，泳道酶切为DsbA-EK-581-Flag纯化后EK酶切样，泳道FT1为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化流穿样1，泳道FT2为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化流穿样2，泳道EL1为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化0-21％B液洗脱样，泳道EL2为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化22％-47％B液洗脱样，泳道EL3为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化48％-70％B液洗脱样，泳道EL4为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化71％-100％B液洗脱样。
图10为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化色谱图。左纵坐标为吸光值(A280nm)，右纵坐标为洗脱缓冲液B的占比百分数(％)，横坐标为亲和纯化样品体积(mL)。
连接DsbA+His+Flag标签的重组纳米抗体在EK酶:蛋白＝1:250(mg:mg)的酶切比例，20℃条件下，成功将标签与纳米抗体切开。通过质谱分析，结果如图11所示。
图11为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化样品质谱图。左纵坐标为质谱Intensity值，横坐标为分子质量(Da)。
重组表达的纳米抗体分子量为17206.5Da，且纳米抗体ELISA分析，特异性的结合能力为234ng/mL，结果如图12所示。
图12为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化样品ELISA活性测定。左纵坐标为吸光值(OD450nm)，横坐标为DsbA-EK-581-Flag酶切后亲和纯化样品浓度(ng/mL)。
以上所述仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系，其特征在于：所述纳米抗体序列VHH为表达序列SEQ ID NO.1，以pET39b为载体构建表达纳米抗体，并在纳米抗体C端分别连接His标签。
2.根据权利要求1所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系，其特征在于：所述纳米抗体融合是表达序列SEQ ID NO.1上添加蛋白标签和/或酶切位点。
3.根据权利要求2所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系，其特征在于：所述酶切位点为DDDDK。
4.根据权利要求2所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系，其特征在于：所述酶切位点包括EK酶、TEV蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体步骤为：
S1.在菌体培养和诱导表达结束后，收集大肠杆菌的菌体，可溶表达的蛋白经破碎收集上清后直接纯化；
S2.将收集的上清溶液进行亲和层析纯化，脱盐制剂与酶切、酶切产物的亲和纯化，最终获得均一性和纯度好的纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系的制备方法，其特征在于：所述S1中菌体培养为将重组表达载体，按照1:1000接种于2YT+G的培养基中，37℃、220转/分钟培养；所述诱导表达为在菌体培养过程中，当检测到OD600nm值达到0.6～0.8时加入终浓度为1mM/mL的IPTG诱导重组纳米抗体表达，诱导条件为：20℃，16小时。
7.根据权利要求5所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系的制备方法，其特征在于：所述S1中收集大肠杆菌的菌体为在菌体培养和诱导表达结束后取500μL于4℃、12000转/分钟离心1分钟，弃上清，破碎菌体并通过SDS PAGE检测蛋白表达量。
8.根据权利要求5所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系的制备方法，其特征在于：所述S2中亲和层析纯化为将收集的上清样品溶液稀释过滤上样后，先使用平衡缓冲液冲洗，再使用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到纯化的带亲和标签的纳米抗体融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系的制备方法，其特征在于：所述平衡缓冲液pH值为8.5，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris-HCl，300mM NaCl；所述洗脱缓冲液pH值为8.5，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，500mM咪唑。
10.根据权利要求5所述的一种基于大肠杆菌的纳米抗体融合表达体系的制备方法，其特征在于：所述S2中脱盐制剂与酶切为将亲和纯化样品脱盐至酶切缓冲液中，紫外分光光度计A280nm检测样品浓度，并用EK酶进行酶切，EK酶:蛋白＝1:50～1:500(mg:mg)的酶切比例，分别在20℃、37℃酶切14-18小时以获得酶切后的重组纳米抗体；所述酶切缓冲液pH值为8.0，由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris-HCl，50mM NaCl，2mM CaCl2。
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