CN119874827B - 一种具有免疫调节作用的九肽及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有免疫调节作用的九肽及其制备和应用，属于生物医药技术领域。所述九肽QT9的氨基酸序列为Gln‑Pro‑Gln‑Pro‑Pro‑Phe‑Ser‑His‑Thr。该肽段可以通过人工合成或小麦蛋白的定向酶解获得。功能验证该九肽具有促进免疫细胞增殖、提高免疫因子水平、提高免疫器官指数以及改善肠道粘膜免疫功能的作用。而且九肽QPQPPFSHT为天然肽段，生物安全性高，因此，可以将其应用于制备预防和改善免疫低下不良现象的保健食品或药物。本发明为提升免疫功能提供新的解决方案，符合公众对免疫保健的需求，具有良好的市场前景和应用潜力。

Description

一种具有免疫调节作用的九肽及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种具有免疫调节作用的九肽及其制备和应用。

背景技术

免疫系统（immune system）是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统。由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调，共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。

免疫低下是一种常见的亚健康状态，免疫功能低下者难以抵抗细菌、病毒、真菌等侵袭，易造成各种严重的感染，如上呼吸道感染、尿路感染、败血症、脑膜炎、水痘、麻疹、肺结核等，严重时甚至可能引发癌症。相较于免疫功能正常者，免疫功能低下者更易得病或在相同的环境中病情更易加重。

根据发病原因不同，可将免疫功能低下分为原发性和继发性两类，原发性是先天发育不全所致，大多数与遗传有关，多发生于儿童；继发性则由病毒、细菌、真菌等感染或药物、肿瘤、疲劳、失眠、营养不良、压力过大等原因引起，可见于各种年龄的人群。因此，提升免疫功能已成为公众关注的焦点。

生物活性肽（bioactive peptides）是指一类具有生物功能的小分子肽，通常由20个以下的氨基酸残基组成。它们在食品、医药和化妆品领域具有广泛应用，功能多样，包括抗菌、抗肿瘤、降血压、降血脂及免疫调节等。生物活性肽的功能特性与其氨基酸组成及排列顺序密切相关，这使得通过合理设计和合成生物活性肽成为提升免疫力的有效策略。例如：胸腺五肽是胸腺生成素Ⅱ第32~36位氨基酸残基片段，具有诱导T淋巴细胞分化、成熟并活化的功能，增强自然杀伤细胞（NK）的活性和巨噬细胞的吞噬功能，临床上主要用作免疫调节剂。

另有研究显示，蛋白水解生产的一些小分子肽具有免疫活性作用。它们不仅能增强机体的免疫力，而且能刺激机体淋巴细胞的增殖和增强巨噬细胞的吞噬能力。例如Wu等从小麦胚芽球蛋白中提取到新型肽，纯化得到序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala（ECFSTA），对其进行免疫评估，发现其可以激活巨噬细胞，可作为免疫调节剂（Characterization andImmunomodulatory Activity of a Novel Peptide, ECFSTA, from Wheat GermGlobulin.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017,65:5561-5569.）。

小麦肽是以小麦蛋白（谷朊粉）为原料，经生物酶解、精制、喷雾干燥等工艺而制成，例如专利文献CN 112226478 A。研究表明小麦肽具有增强免疫的作用，因此，通过对小麦肽进行肽谱解析，筛选出与免疫提升相关的高效肽段，将为新型免疫调节剂的开发提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有免疫调节作用的天然小分子生物活性肽，将其应用于开发安全且高效的免疫调节产品。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明利用LC-MS/MS肽谱分析技术对小麦肽中的肽段序列进行解析，再采用分子对接技术探究肽段与M1-毒蕈碱型乙酰胆碱受体（CHRM1）的相互作用，从中筛选出一个候选肽段，经质谱鉴定，其氨基酸序列为Gln-Pro-Gln-Pro-Pro-Phe-Ser-His-Thr（QPQPPFSHT），分子量为1037.49 Da，将其命名为QT9。进一步通过人工合成九肽QT9，功能验证发现九肽QT9在免疫低下动物模型中表现出显著提升免疫作用的效果。

因此，本发明提供了一种具有免疫调节作用的九肽QT9，所述九肽QT9的氨基酸序列为Gln-Pro-Gln-Pro-Pro-Phe-Ser-His-Thr。

本发明还提供了制备所述九肽QT9的方法，所述九肽QT9可以通过固相合成法制备得到，具体方法包括：采用Fmoc固相合成策略，以Fmoc保护的氨基酸为原料，选用Wang树脂作为固相载体，依次引入苏氨酸、组氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺残基，使肽链从C端向N端延伸，固相合成九肽QT9。

所述九肽QT9也可以通过酶解小麦谷朊蛋白获得，具体的，按照水和小麦蛋白（谷朊粉）质量比为10：1的比例混合，调节料液pH至8.0 ± 0.2后添加占谷朊粉总重量1.0%的碱性蛋白酶酶解30 min，酶解过程持续维持料液pH≥7.5，结束后添加占谷朊粉总重量的1.5%的中性蛋白酶酶解60 min。酶解结束后用占谷朊粉总重量的0.5%的风味蛋白酶作用30min，然后置于100 ℃条件下灭酶30 min。随后浓缩、干燥获得小麦肽粉末，其中含有所述九肽QT9。

本发明提供了所述的九肽QT9在制备免疫调节产品中的应用，所述免疫调节包括提高免疫细胞的增殖、提高免疫因子水平、提高免疫器官指数、提高肠道短链脂肪酸含量中的至少一种。本发明研究显示，在免疫低下动物模型中给予九肽QT9处理，可以显著提高免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞的数量；显著提高免疫因子如免疫球蛋白IgA、干扰素-γ的含量；显著提高免疫器官指数如胸腺指数、脾脏指数；显著提高肠道短链脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸的含量，表明九肽QT9具有免疫调节活性，促进免疫细胞恢复，因此可以将其应用于开发调节免疫功能的相关产品。

进一步的，所述免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞中的至少一种；所述免疫因子包括免疫球蛋白IgA、干扰素-γ中的至少一种；所述免疫器官指数包括胸腺指数、脾脏指数；所述肠道短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸中的至少一种。

进一步的，所述产品为预防或治疗免疫低下的药物。具体的，所述药物可以用于治疗免疫低下疾病，所述疾病可以是指伴随免疫功能低下状态，需要给予免疫增强剂或给予免疫增强剂更有利缓解症状的疾病，例如免疫缺陷性疾病、反复性或难治性感染性疾病，这类疾病由于机体免疫功能低下，导致反复发作、治疗用药周期较长。所述药物也可以用于治疗因使用糖皮质激素、环磷酰胺等免疫抑制剂引起的免疫功能低下。

进一步的，所述免疫低下的表现包括：免疫细胞数量、免疫因子水平、肠道短链脂肪酸含量中至少一种的指标下降。

作为本发明的一种具体实施方式，所述免疫低下为因使用免疫抑制剂引起的免疫功能低下。具体的，所述免疫抑制剂可以为但不限于环磷酰胺。

作为本发明的一种具体实施方式，所述免疫低下为因使用氯霉素引起的免疫功能低下。氯霉素的毒副作用包括免疫细胞数量减少导致免疫低下。

进一步的，所述产品为增强免疫力的保健食品。具体的，所述保健食品用于改善免疫功能低下这一亚健康状态。

进一步的，所述产品为缓解哺乳动物免疫低下的药品或增强哺乳动物免疫力的保健食品。所述哺乳动物可以为但不限于人类。

本发明提供了一种用于预防或治疗免疫低下的药物组合物，所述药物组合物包括有效剂量的九肽QT9和药学上可接受的载体，所述九肽QT9的氨基酸序列为Gln-Pro-Gln-Pro-Pro-Phe-Ser-His-Thr。

本发明以九肽QT9为主要活性成分，添加药剂学上可接受的载体制成，可按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。本发明提供的药物组合物中九肽QT9可以作为唯一的发挥免疫调节作用的活性成分，也可以与其他具有调节免疫作用的活性成分比如海参肽、大豆肽复配。

进一步的，所述药学上可接受的载体包括：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。所述药学上可接受的载体为能够递送本发明有效剂量活性物质，不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或受试者无毒副作用的任何制剂或载体介质。

进一步的，所述药物组合物的制剂形式可以为但不限于口服液、胶囊、微胶囊粉、片剂、颗粒或者乳液。

所述药物组合物的具体给药量根据疾病种类、疾病程度、年龄及给药目的进行调节。在免疫低下斑马鱼模型中，九肽QT9的有效作用浓度为5 μg/mL；在免疫低下小鼠模型中，含九肽QT9的小麦肽的有效作用浓度为0.25~0.5g/kg小鼠体重。在上述作用条件下均未表现毒副作用。

本发明还提供了一种用于增强免疫力的保健食品，包括作为活性成分的九肽QT9和食品学上可接受的辅料，所述九肽QT9的氨基酸序列为Gln-Pro-Gln-Pro-Pro-Phe-Ser-His-Thr。所述食品学上可接受的辅料为能够递送本发明有效剂量活性物质，不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或受试者无毒副作用的任何制剂或载体介质。

本发明具备的有益效果：

本发明提供了一种具有免疫调节作用的九肽QPQPPFSHT，该肽段可以通过人工合成或小麦蛋白的定向酶解获得。动物模型功能验证，该肽段具有促进免疫细胞增殖的作用，主要体现在促进巨噬细胞和中性粒细胞的增殖、提高免疫因子IgA、IFN-γ水平、提高免疫器官指数以及改善肠道粘膜免疫功能的作用。而且小麦蛋白酶解制备得到的九肽QPQPPFSHT为天然肽段，生物安全性高，因此，可以将其应用于制备预防和改善免疫低下不良现象的保健食品或药物。本发明为提升免疫功能提供新的解决方案，符合公众对免疫保健的需求，具有良好的市场前景和应用潜力。

附图说明

图1为九肽QT9的二级质谱图，图中# 1:1表示编号，Q/P/Q/P/P/F/S/H/T表示九肽序列；纵坐标Intensity(%)表示相对丰富；y1表示通过肽段C端断裂产生的第一个碎片离子；b2/b4[2+]表示通过肽段N端断裂产生的第2个碎片离子和通过肽段N端断裂产生的第4个碎片离子带有2个电荷，b3表示通过肽段N端断裂产生的第3个碎片离子，b4表示通过肽段N端断裂产生的第4个碎片离子，b5表示通过肽段N端断裂产生的第5个碎片离子，y5表示通过肽段C端断裂产生的第五个碎片离子；y6表示通过肽段C端断裂产生的第六个碎片离子，b6表示通过肽段N端断裂产生的第6个碎片离子，y7表示通过肽段C端断裂产生的第七个碎片离子，y8-H₂O表示通过肽段C端断裂产生的第八个脱水后的碎片离子。

图2为九肽QT9与CHRM1结合作用示意图。

图3为在斑马鱼模型中给予九肽QT9处理后在体视显微镜下观察头部巨噬细胞的照片。

图4为图3中头部巨噬细胞个数统计图，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，*表示p＜0.05，****表示p＜0.0001；#号表示与造模组比较的显著性差异，#表示p＜0.05。

图5为在斑马鱼模型中给予九肽QT9处理后在体视显微镜下观察泄殖腔至尾部末端中性粒细胞荧光的照片。

图6为图5中的中性粒细胞荧光强度统计图，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，****表示p＜0.0001；#号表示与造模组比较的显著性差异，###表示p＜0.001。

图7为九肽QT9对斑马鱼模型INF-γ的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，***表示p＜0.001；#号表示与造模组比较的显著性差异，##表示p＜0.01。

图8为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对摄食量的影响。

图9为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对体重的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，*表示p＜0.05，***表示p＜0.001。

图10为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对脾脏指数的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，****表示p＜0.0001；#号表示与造模组比较的显著性差异，#表示p＜0.05。

图11为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对胸腺指数的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，**表示p＜0.01，****表示p＜0.0001；#号表示与造模组比较的显著性差异，##表示p＜0.01。

图12为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对血清免疫球蛋白IgA的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，****表示p＜0.0001；#号表示与造模组比较的显著性差异，##表示p＜0.01，####表示p＜0.0001。

图13为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对血清细胞因子IFN-γ的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，**表示p＜0.01，****表示p＜0.0001；#号表示与造模组比较的显著性差异，####表示p＜0.0001。

图14为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对粪便中乙酸含量的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；#号表示与造模组比较的显著性差异，####表示p＜0.0001。

图15为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对粪便中丙酸含量的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；#号表示与造模组比较的显著性差异，####表示p＜0.0001。

图16为在小鼠模型中给予含QT9的小麦肽处理后对粪便中丁酸含量的影响，其中*号表示与正常组比较的显著性差异，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001；#号表示与造模组比较的显著性差异，####表示p＜0.0001。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

小麦蛋白（谷朊粉）购自滨州中裕食品有限公司；碱性蛋白酶（来源于地衣芽孢杆菌）购自安琪酶制剂（宜昌）有限公司；中性蛋白酶（来源于枯草芽孢杆菌）购自南宁庞博生物工程有限公司；风味蛋白酶购自安琪酶制剂（宜昌）有限公司。

实施例1：活性肽段的筛选

1、制备小麦肽（谷氨酰胺肽）

按照水和小麦蛋白（谷朊粉）质量比为10：1的比例投入反应釜中，投料结束后，调节料液pH至8.0 ± 0.2后添加碱性蛋白酶（占谷朊粉总重量的1.0%）酶解30 min，酶解过程持续维持料液pH≥7.5，结束后添加中性蛋白酶（占谷朊粉总重量的1.5%）酶解60 min。酶解结束后用风味蛋白酶（占谷朊粉总重量的0.5%）作用30 min，然后置于100 ℃条件下灭酶30min。随后将料液糖度浓缩至25°Bx后进行喷雾干燥获得小麦肽（谷氨酰胺肽）粉末。

2、筛选活性肽段

对小麦肽进行LC-MS/MS肽谱分析，获得小麦肽的肽段按照筛选条件进行整理，随后进一步利用分子对接，根据得分的高低确定最终的理论有效肽段。具体分析过程如下：

（a）小麦肽序列鉴定

将小麦肽样品溶解于NH₄HCO₃溶液中，加入二硫苏糖醇溶液，置于56 ℃水浴中还原1 h。随后加入碘乙酰胺溶液避光反应40 min。脱盐后挥干溶剂，然后用10 μL流动相A（0.1%甲酸）溶解样品至液相进样瓶。随后进行LC-MS/MS分析。

色谱条件：分析柱（Acclaim PepMap RPLC C18，150×150 mm，3 μm）；流动相A（0.1%甲酸）；流动相B（0.1%甲酸和80%乙腈）；流速（600 nL/min）。梯度洗脱程序：0-2 min，4% B -8%B；2-45 min，8%B-40%B；45-55 min，40%B-60% B；55-56 min，60%B-95%B；56-66min，95%B。

质谱条件：全扫描MS使用Orbitrap进行一级扫描，扫描范围（100~1500 m/z），分辨率（70000），离子最大引入时间（100 ms），自动增益控制（3×10⁶）；使用高能碰撞解离对符合串级（MS/MS）碎裂条件的强度前20名母离子进行碎裂并用Orbitrap扫描，分辨率（17500），离子最大引入时间（50 ms），自动增益控制（1×10⁵）。质谱得到的原始数据采用PEAKS Studio的De novo（从头测序）软件进行多肽序列解析。

（b）具有潜在调节免疫功能活性肽的筛选

乙酰胆碱受体在免疫系统中扮演着重要角色。研究表明，乙酰胆碱通过与免疫细胞上的尼古丁型受体结合，能够抑制炎症反应并增强免疫细胞的功能。本实施例将小麦肽的肽段与乙酰胆碱受体进行分子对接，筛选出具有潜在调节免疫功能的肽段。

按照平均本地置信度（ALC）大于95%，峰面积大于2×10⁶，PeptideRanker得分大于0.8条件进行筛选获得符合条件的肽段。随后将肽段与M1-毒蕈碱型乙酰胆碱受体（CHRM1）进行分子对接。

首先从PDB蛋白质数据库中下载CHRM1的晶体结构（5CXV），通过Discovery Studio软件对受体靶标去除水分子、添加氢原子后，定义其活性中心。所选小麦肽的肽段的结构由Discovery Studio构建，其能量通过CHARMm力场最小化，将这些肽定义为配体。将构建好的肽与CHRM1进行CDOCKER对接，模拟出结合能量最低和结合程度最高的结合方式、位点和发生作用的氨基酸残基，并按照结合能和氢键数目进行筛选。最后确定了1条九肽（QPQPPFSHT），如表1所示。

表1. 小麦肽中具有潜在调节免疫活性的肽段

肽段序列

ALC得分(%)

长度

质荷比(m/z)

电荷数(z)

相对丰度

分子量(Da)

PeptideRanker得分

对接能 (kcal/mol)

QPQPPFSHT

95.8

9

519.752

2

3.92E+06

1037.49

0.71

-88.16

其中九肽QT9的二级质谱图1所示，肽类的裂解碎片离子包括：N端碎片离子（有a、b、c型）和C端碎片离子（有x、y、z型）。a、y、z型离子侧链断裂分别形成d、v、w型离子，此外还有两端断裂形成的内部离子等，以b、y系列离子最为常见，根据肽的b或y系列碎片离子可解析推断出肽的一级结构，519.752 m/z为九肽的[M+H]+离子信号，电荷数（z）为2，分子量为1037.49 Da。进一步通过源内碰撞诱导解离技术对九肽进行二级质谱分析（如图1所示），确定所述九肽的一级结构为Gln-Pro-Gln-Pro-Pro-Phe-Ser-His-Thr。

九肽QT9与CHRM1的分子对接2D和3D图如图2所示。对化学键进行分析发现，九肽QT9通过范德华力、氢键（包括常规氢键和碳-氢键）和疏水相互作用（烷基）与CHRM1相结合的，对接能为-88.16kcal/moL。九肽QT9与氨基酸残基ALA1073、VAL1102、GLU1021、THR1020、ARG1136、ARG1007、GLU1010、TYR1023、GLY1029、ARG1144、HIS1030和ASP1069形成12个范德华力，与GLY1106、MET1105、THR1141、TRP1137、GLN1140、ILE1008、ASP1009、GLY1011、GLN1104、PHE1103、ASP1019、TYR1017和THR1025形成16个氢键，与LEU1031形成1个疏水相互作用。

由分子对接结果可知，九肽QT9可以与CHRM1结合，进而激活CHRM1，进而发挥免疫调节功效。

委托深圳博润思达生物科技有限公司合成肽段QPQPPFSHT，纯度≥98%，用于后续功能验证。

实施例2：九肽（QPQPPFSHT）对巨噬细胞的增殖作用

本发明使用斑马鱼模型对肽段的免疫功能进行表征。斑马鱼（zebrafish）与人类基因组相似度约为87%，同源性高，所以斑马鱼的免疫系统与人类相似，其免疫应答反应能可靠地模拟和预测人类的生理学特征。斑马鱼的免疫系统完备，具有先天性免疫系统和适应性免疫系统。斑马鱼先天性免疫系统中的主要细胞为巨噬细胞与中性粒细胞，与哺乳动物相似，且发育早，胚胎在受精30 h后即出现巨噬细胞和中性粒细胞。T淋巴细胞和B淋巴细胞在4 dpf后开始发育，适应性免疫系统在受精后四至六周才完全成熟。也就是说，斑马鱼在胚胎阶段的免疫功能以先天性免疫系统为主。斑马鱼在胚胎阶段即有免疫分子参与免疫应答，如TLRs、TNF和ILs。以MyD88为受体蛋白的TLRs能与病原的模式识别受体结合，从而活化MAPK和NF-κB等信号通路。因此，一些具有免疫调节活性的物质可以通过这些免疫分子影响斑马鱼胚胎的先天性免疫系统，巨噬细胞数量、中性粒细胞数量和某些细胞因子如IFN-γ含量等指标能衡量这些物质对于斑马鱼的免疫调节活性。

巨噬细胞（macrophages）是先天性免疫系统的重要组成部分，源自骨髓中的祖细胞和组织常驻巨噬细胞。巨噬细胞能通过吞噬功能杀灭病菌和清除健康异常细胞，并分泌不同功能的细胞因子。当病原入侵或细胞受损时，巨噬细胞会根据机体生理状况极化为不同表型：促炎型巨噬细胞（M1型）和抗炎型巨噬细胞（M2型），M1型能分泌IL-6，IL-1β和TNF-α等促炎因子，以及NO、活性氧等具有提高杀菌能力的物质；M2型能分泌抗炎细胞因子，并参与血管生成和成纤维化等过程和修复组织。因此对巨噬细胞数量的表征是免疫提升作用的重要指标。

本实施例通过野生AB系斑马鱼使用氯霉素造模，使巨噬细胞数量降低，造成免疫低下模型，使用QPQPPFSHT九肽进行干预，表征九肽对重要免疫细胞巨噬细胞数量的影响。

野生AB系斑马鱼胚胎24 hpf时加入苯硫脲母液10 μL/mL（PTU），48 hpf进行脱膜，将脱膜后的胚胎置于六孔板中，每组平行2孔，每孔10条，分组如下：

（1）正常对照组：0.5 %DMSO+系统水+PTU；

（2）造模组：125 μg/mL氯霉素（用DMSO溶解）+系统水+PTU，DMSO体积分数为0.5%；

（3）九肽QT9干预组：5 μg/mL QPQPPFSHT九肽（QT9）+125 μg/mL氯霉素（用DMSO溶解）+系统水+PTU，DMSO体积分数为0.5%。

加药作用24 h后，每孔加入2.5 μg/mL中性红染料和PTU，避光染色6 h。用系统水避光洗脱，麻醉后用6%甲基纤维素固定胚胎，在体视显微镜下拍照并统计头部巨噬细胞个数，以造模组为对照，用SPSS 22.0与GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，采用One-wayANOVA中的Tukey检验进行多组之间的差异比较。

结果如图3和图4所示，使用氯霉素（125 μg/mL）造模后成功造成免疫低下模型，巨噬细胞个数显著低于正常对照组（p＜0.0001）。当5 μg/mL QPQPPFSHT九肽干预后能显著促进巨噬细胞的增殖（p＜0.05），说明QPQPPFSHT九肽对重要免疫细胞巨噬细胞具有促进作用。

实施例3：九肽（QPQPPFSHT）对中性粒细胞的增殖作用

在血液循环的白细胞中，源自骨髓干细胞的中性粒细胞（neutrophils）占比最高。当病菌入侵机体时，中性粒细胞最早到达感染处，通过分泌多种细胞毒性颗粒和蛋白酶实现病原的杀灭和吞噬，此外还发挥招募单核细胞和修复受损组织等作用。斑马鱼胚胎中的中性粒细胞起源于胚胎肝脏或是卵黄囊中的髓系母细胞，该细胞在造血区前端分化成中性粒细胞，进入血液循环，进而到达全身各个部位。因此，中性粒细胞也是重要的一种免疫细胞。免疫学实验中，通常以中性粒细胞荧光转基因斑马鱼幼鱼为模型，在荧光显微镜下直接观察排泄孔至尾部末端中性粒细胞的荧光强度或个数。

本实施例以Tg（Lyz:DsRed）中性粒细胞荧光转基因斑马鱼幼鱼为模型，使用氯霉素造模，使中性粒细胞数量降低，造成免疫低下模型，使用QPQPPFSHT九肽进行干预，表征九肽对重要免疫细胞中性粒细胞数量的影响。

Tg（Lyz:DsRed）斑马鱼胚胎24 hpf时加入苯硫脲母液10 μL/mL（PTU），48 hpf进行脱膜，在体视荧光显微镜下筛选出表达荧光基因的胚胎，将脱膜后的具有荧光基因的胚胎置于六孔板中，每组平行2孔，每孔10条，分组如下：

（1）正常对照组：0.5 %DMSO+系统水+PTU；

（2）造模组：125 μg/mL氯霉素（用DMSO溶解）+系统水+PTU，DMSO体积分数为0.5%；

（3）九肽QT9干预组：5 μg/mL QPQPPFSHT九肽（QT9）+125 μg/mL氯霉素（用DMSO溶解）+系统水+PTU，DMSO体积分数为0.5%。

共同作用24 h后，清洗胚胎，麻醉，在体视荧光显微镜下拍照，统计泄殖腔至尾部末端的荧光强度，使用SPSS 22.0软件对造模组与其他组进行显著性检验。

结果如图5和图6所示，使用氯霉素（125 μg/mL）造模后成功造成免疫低下模型，中性粒细胞个数显著低于正常对照组（p＜0.0001）。当5 μg/mL QPQPPFSHT九肽干预后能显著性促进中性粒细胞的增殖（p＜0.001），且与正常对照组无显著差异（p＞0.05），说明从重要免疫细胞中性粒细胞角度，QPQPPFSHT九肽也具有免疫提升作用。

实施例4：九肽（QPQPPFSHT）对免疫因子IFN-γ的上调作用

干扰素（INF）是一类具有多种生物活性的糖蛋白。干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型主要是干扰素-β和干扰素-α，Ⅱ型仅包括干扰素-γ（IFN-γ）一种。IFN-γ可以由T细胞、NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞分泌，在哺乳动物体内是主要的巨噬细胞活化因子。不同于干扰素-β和干扰素-α，IFN-γ是免疫调节干扰素，免疫调节作用比抗病毒干扰素强数十倍。因此，IFN-γ是表征免疫作用的重要免疫因子。

本实施例通过野生AB系斑马鱼使用氯霉素造模，使IFN-γ水平降低，造成免疫低下模型，使用QPQPPFSHT九肽进行干预，表征九肽对重要免疫因子IFN-γ水平的影响。

野生AB系斑马鱼胚胎24 hpf时加入苯硫脲母液10 μL/mL（PTU），48 hpf进行脱膜，将脱膜后的胚胎置于六孔板中，每组平行2孔，每孔10条，分组如下：

（1）正常对照组：0.5 %DMSO+系统水+PTU；

（2）造模组：150 μg/mL氯霉素（用DMSO溶解）+系统水+PTU，DMSO体积分数为0.5%；

（3）九肽QT9干预组：5 μg/mL QPQPPFSHT九肽（QT9）+150 μg/mL氯霉素（用DMSO溶解）+系统水+PTU，DMSO体积分数为0.5%。

在28.5℃培养箱中培养24 h后，将每组的120个胚胎放入1.5 mL离心管中，分别用每孔液体总体积1倍量的PBS缓冲液清洗胚胎，将残余PBS缓冲液吸净后，按照每10 mg样本加入50 μL液体的比例加入PBS缓冲液，用高速组织研磨仪研磨均浆90 s后离心（4 ℃，5000r/min，5 min），取上清液，使用IFN-γ ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）按照试剂盒说明书对上清液中所含的IFN-γ含量进行测定，使用SPSS 22.0与GraphPad Prism8.0软件进行数据分析，采用One-way ANOVA中的Tukey检验进行多组之间的差异比较。

结果如图7所示，使用氯霉素（150 μg/mL）造模后成功造成免疫低下模型，IFN-γ水平显著低于正常对照组（p＜0.001）。当5 μg/mL QPQPPFSHT九肽干预后能显著性上调IFN-γ水平（p＜0.01），说明从重要免疫因子IFN-γ水平角度，QPQPPFSHT九肽也具有免疫提升作用。

实施例5：小麦肽在免疫低下小鼠模型中的免疫提升效果

本实施例使用环磷酰胺造模的免疫低下小鼠模型探究小麦肽（实施例1制备，其中含肽段QPQPPFSHT）的免疫提升作用。环磷酰胺作为一种常用的抗癌化疗药物，会导致全身重要免疫器官（如脾脏、胸腺，肠道黏膜）的免疫系统功能紊乱。这种免疫抑制状态不仅影响了小鼠的免疫细胞增殖和活性，还使其易感于各种感染和疾病。因此，建立此模型为评估小麦肽在免疫调节方面的效果提供了重要基础。在研究过程中，免疫低下小鼠将接受不同剂量的小麦肽处理，以观察其对免疫细胞增殖的影响。通过检测小鼠体内的免疫因子水平、免疫器官的变化以及相关免疫细胞的功能，旨在确定小麦肽是否能够有效逆转环磷酰胺引起的免疫抑制，并促进免疫细胞的恢复。

1、实验方法

（1）小鼠与饲养

45只SPF级别雄性ICR小鼠（年龄：6-11周龄，体重：35±2 g），购买于浙江中医药大学，来源为上海斯莱克公司，动物实验伦理批号：IACUC-20230206-07。小鼠养殖环境如下：22±2 ℃，50±10%相对湿度，12小时的光/暗循环。

（2）分组与给药方法

实验设置正常对照组，小麦肽处理组3组（剂量分别为高剂量0.5 g/kg小鼠体重，记作小麦肽高剂量；中剂量0.25 g/kg，记作小麦肽中剂量；低剂量0.1 g/kg，记作小麦肽低剂量）和环磷酰胺造模对照组1组（造模组），共5组。高中低小麦肽处理组灌胃相应剂量的小麦肽，而正常组和造模组灌胃等量生理盐水。每天灌胃1次，连续30 d。但是，第28天开始造模组和处理组用50 mg/kg环磷酰胺处理造模（第28-30天），正常对照组等量生理盐水处理。记录环磷酰胺造模前后的体重与摄食量。

（3）免疫器官指数测定

收集的胸腺和脾脏在预冷磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01 mol/L，pH=7.4）中清洗，然后用滤纸吸干。脾脏和胸腺指数按以下公式计算：

脾脏指数（%）=脾脏重量/体重×100%；

胸腺指数（%）=胸腺重量/体重×100%。

（4）Elisa测定血清免疫相关细胞因子和免疫球蛋白A（IgA）

使用基因美商业Elisa分析试剂盒对血清细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和免疫球蛋白A（IgA）的含量进行测定，测定方法按照试剂盒说明书进行。

（5）粪便短链脂肪酸含量测定

样品制备：精准称取约50 mg的小鼠粪便，加入250 μL的无菌超纯水，涡旋振荡5min，然后加入10 μL 5 mol/L盐酸溶液调节悬浊液pH为2-3，涡旋振荡1 min后置于室温下静置5 min，然后在4 °C、12000 rpm条件下离心30 min，取200 μL上清液置于装有0.5 μL稀释20倍后的2-乙基丁酸（内标），涡旋振荡1 min，并于4 °C、12000 rpm条件下离心5 min，取150 μL上清用于气相色谱分析。

气相色谱条件：Agilent DB-FFAP125-3237（30 m×0.52 mm×0.50 mm）气相柱；气相柱程序升温条件为起始温度100 °C维持0.5 min，然后以8 °C/min程序升温到180 °C并维持1 min，最后以20 °C/min程序升温至240 °C并维持15 min；进样口温度和氢离子火焰检测器温度分别为200 °C和240 °C；氢气、空气和氮气流速分别设为30 mL/min、300 mL/min和20 mL/min；进样量为1 μL。

2、结果分析

2.1 生长性能

由图8可以看出，环磷酰胺的给药对小鼠的摄食量没有显著性差异。

由图9可知，在环磷酰胺给药后，与正常对照组相比，造模组的体重显著下调（p＜0.001），表明环磷酰胺免疫抑制处理模型得到了初步建立。而小麦肽高剂量和中剂量组与正常对照组相比则无显著性差异（p＞0.05），说明含肽段QPQPPFSHT的小麦肽处理能改善环磷酰胺造成的小鼠体重减轻。

2.2 免疫器官指数

环磷酰胺造模会显著降低机体免疫细胞的产生，这表现在产生免疫细胞的初级和次级免疫器官的萎缩。如图10和图11所示，环磷酰胺造模显著降低了小鼠胸腺和脾脏指数（p＜0.0001），表明免疫器官产生免疫细胞能力下降，而高剂量小麦肽显著增加了脾脏指数和胸腺指数（p＜0.05，p＜0.01），中剂量小麦肽显著增加了胸腺指数（p＜0.01），表明小麦肽能显著恢复免疫抑制小鼠的免疫细胞增殖能力。

2.3 免疫因子

血清中的免疫球蛋白和细胞因子往往起着激活免疫细胞以及清除体液循环中抗原的作用。例如IFN-γ可以直接清除血液中的抗原，IgA则可以抗感染促进机体的黏膜免疫。小麦肽对血清免疫球蛋白IgA和细胞因子IFN-γ的影响如图12和图13所示。由环磷酰胺诱导的免疫抑制，造模组与正常对照组相比，血清免疫球蛋白IgA和细胞因子IFN-γ显著下调（p＜0.0001），表明小鼠的免疫能力受到抑制。补充小麦肽可显著逆转血清中这些免疫相关蛋白的降低：与造模组相比，高中低剂量小麦肽的IgA均显著上调（p＜0.0001，p＜0.01，p＜0.01）；高中剂量小麦肽的IFN-γ显著上调（p＜0.0001）。说明小麦肽能显著提升免疫作用。

2.4 短链脂肪酸

短链脂肪酸调控着肠道内多种营养物质的吸收及激素产生，具有参与机体能量代谢与肠道屏障修复合成等作用，其含量以及组成变化与肠道黏膜免疫息息相关。小麦肽对小鼠粪便短链脂肪酸含量影响如图14-图16所示。环磷酰胺造模处理下的粪便乙酸、丙酸和丁酸较正常组相比显著性降低（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.001）。而较正常组、造模组而言，高中剂量小麦肽显著提升了小鼠粪便中的乙酸、丙酸和丁酸含量（p＜0.0001），说明小麦肽的免疫提升作用同时对肠道粘膜也有有益作用。

综上，本发明通过肽段的质谱鉴定和分子对接从小麦肽中筛得九肽QPQPPFSHT，该九肽分子在免疫低下的斑马鱼模型与小鼠模型中均表现出高效的免疫调节作用，主要体现在促进免疫细胞的增殖，提高免疫因子的含量，而且在提升免疫的同时对肠道粘膜也有有益作用。本发明为提升免疫功能提供新的解决方案，九肽QPQPPFSHT可应用到制备预防和改善免疫低下不良现象的保健食品或药物中，具体的，九肽QPQPPFSHT可以单独应用于提升免疫的保健品或药品，也可以与其他具有提升免疫的活性成分进行复配，所述具有提升免疫作用的活性组分可以包括植物提取物和其他的蛋白肽（海参肽、大豆肽等）。所述保健品或药物的制剂形式可以成微胶囊，以改善多肽的胃肠道消化稳定性、生物利用度和延缓保质期，使其更好的应用于食品工业和保健领域。

Claims (5)

1.一种具有免疫调节作用的九肽QT9，其特征在于，所述九肽QT9的氨基酸序列为Gln-Pro-Gln-Pro-Pro-Phe-Ser-His-Thr。

2.如权利要求1所述的九肽QT9的制备方法，其特征在于，所述九肽QT9通过固相合成法制备得到；或者通过酶解小麦谷朊蛋白获得，所述酶解条件为：按照水和小麦谷朊粉质量比为10：1的比例混合，调节料液pH至8.0 ± 0.2后添加占谷朊粉总重量1.0%的碱性蛋白酶酶解30 min，酶解过程持续维持料液pH≥7.5，结束后添加占谷朊粉总重量的1.5%的中性蛋白酶酶解60 min，酶解结束后用占谷朊粉总重量的0.5%的风味蛋白酶作用30 min。

3.如权利要求1所述的九肽QT9在制备免疫调节产品中的应用，其特征在于，所述产品为增强免疫力的保健食品。

4.一种用于预防或治疗免疫低下的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括有效剂量的九肽QT9和药学上可接受的载体，所述九肽QT9的氨基酸序列为Gln-Pro-Gln-Pro-Pro-Phe-Ser-His-Thr。

5.一种用于增强免疫力的保健食品，其特征在于，包括作为活性成分的九肽QT9和食品学上可接受的辅料，所述九肽QT9的氨基酸序列为Gln-Pro-Gln-Pro-Pro-Phe-Ser-His-Thr。