CN119866346A

CN119866346A - 一种抗vegfa抗体或其抗原结合片段及其应用

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Publication number: CN119866346A
Application number: CN202380057815.0A
Authority: CN
Inventors: 黄金亮; 刘慧琴
Original assignee: Xunji Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Xunji Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2022-09-14
Filing date: 2023-09-13
Publication date: 2025-04-22
Also published as: AU2023340044A1; WO2024055996A1; EP4582447A4; EP4582447A1; JP2025534252A

Abstract

一种抗VEGFA抗体或其抗原结合片段及其应用，该抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，热稳定性高、水溶性高、分子量小，表达和纯化工艺简单，与VEGFA具有高亲和力，且具有有效阻断VEGFA信号通路，有效阻断VEGFA导致的血管内皮细胞增殖以及血管新生等病理过程，能潜在应用于与VEGFA相关的疾病的治疗中。

Description

一种抗VEGFA抗体或其抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗VEGFA抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术

血管内皮生长因子A(VEGFA)是与血管新生密切相关的一种细胞因子。VEGFA通过结合其受体VEGFR1和VEGFR2，激活两个受体的下游信号通路，促进血管内皮细胞增殖和血管新生。

病理性血管新生发生在多种实体瘤、炎症反应和眼底血管病等疾病中。肿瘤细胞增殖后期依赖于新生血管提供足够的营养物质，支持肿瘤生长和转移。因此，抑制血管新生是治疗癌症的重要手段，首个抗VEGFA单抗Bevacizumab于2004年被批准用于治疗转移性结直肠癌。VEGFA的过量表达还与眼底血管增殖密切相关，如湿性年龄相关黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病视网膜病变(DR)等。因此，抗VEGFA药物已成为治疗眼底血管增生的首选。

目前，在湿性AMD的治疗中，已上市的抗VEGFA蛋白药物主要有4种，包括雷珠单抗(Ranibizumab)、阿柏西普(Aflibercept)、康柏西普(Conbercept)和Brolucizumab。此外，贝伐珠单抗(Bevacizumab)也被超标签(off-label)用于治疗湿性AMD。这些抗VEGFA蛋白药物的类型包括传统单抗、抗体片段Fab和scFv、受体-Fc融合蛋白，暂没有单域抗体(variable domain of heavy-chain antibody，VHH)，或纳米抗体(nanobody，Nb)的药物上市。

单域抗体或纳米抗体是骆驼类动物体内天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody)的可变区结构域，是具有完整抗原结合功能的稳定的最小抗体单元。单域抗体的分子量约为13kDa，热稳定性高且水溶性好，作为一类新型抗体形式，纳米抗体的开发受到越来越多重视。

因此，本发明提供了一种新的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，用于阻断VEGF与VEGFR1和VEGR2结合，进而抑制VEGF下游信号通路，抑制VEGF所刺激的细胞增殖。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。

CDR-H1的氨基酸序列包含SYTMG(SEQ ID NO：1)或与SYTMG(SEQ ID NO：1)具有至少80％同一性的氨基酸序列；

CDR-H2的氨基酸序列包含AISKGGYKYX₁X₂VSLEA(SEQ ID NO：2)或与AISKGGYKYX₁X₂VSLEA(SEQ ID NO：2)具有至少80％同一性的氨基酸序列；

CDR-H3的氨基酸序列包含TRAYGSSRLX₃LAX₄TYEY(SEQ ID NO：3)或与TRAYGSSRLX₃LAX₄TYEY(SEQ ID NO：3)具有至少80％同一性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的X可以为任意天然氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)。

在本发明的一个具体实施方式中，SEQ ID NO：2中的X₁X₂代表DS、DA、NT、DT、NA或NS；SEQ ID NO：3中的X₃代表R或K，X₄代表D、N、E或K。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列包含下列任一组(具体见表1)：

A)SEQ ID NO：1、4、9；

B)SEQ ID NO：1、5、9；

C)SEQ ID NO：1、6、10；

D)SEQ ID NO：1、4、11；

E)SEQ ID NO：1、7、12；

F)SEQ ID NO：1、6、11；

G)SEQ ID NO：1、4、10；

H)SEQ ID NO：1、5、12；

I)SEQ ID NO：1、4、12；

J)SEQ ID NO：1、8、12；

K)SEQ ID NO：1、33、34。

表1候选抗体的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列

优选的，所述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列以从N端到C端的顺序排列，本申请中抗体CDR区氨基酸的划分采用Kabat编号系统。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，以及，CH2和/或CH3区。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的结构为纳米抗体、嵌合抗体、Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、分离的CDR区、F(ab')2片段、单结构域抗体、单链抗体分子或线性抗体。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段可以为双靶点特异性抗体或三个以上靶点特异性抗体(三个以上例如3、4、5、6、7、8、9、10个以上等等)。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段可以为线性抗体。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段可以为单域抗体或纳米抗体。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段可以为人源化抗体或全人源抗体。

优选的，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段包括人源化序列，所述的人源化序列的改造位点位于非CDR区，进一步优选的，所述的人源化改造位点位于抗体的框架区和/或恒定区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段为纳米抗体，与全长IgG抗体、Fab、scFv相比，在相同质量下，纳米抗体具有更高的摩尔浓度，可结合更多的抗原分子。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段可以结合人或猴VEGFA蛋白，其中，所述的人VEGFA蛋白与猴VEGFA蛋白序列相同。

优选的，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO：13-32、35-61、64-67中的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13-32、35-61、64-67中的任一氨基酸序列具有至少80％同一性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13-32、35-61、64-67中的任一氨基酸序列所示。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段可以抑制或竞争其他抗体(优选为与本发明所述的抗VEGFA抗体结合相同或重叠的表位)与人或猴VEGFA蛋白的结合。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段可以采用现有技术任何常规方法进行构建。例如人工合成或者真核表达或原核表达。

本发明的第二方面，提供了一种抗VEGFA抗体或其抗原结合片段。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段为纳米抗体。

所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：13-32、35-61、64-67中的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13-32、35-61、64-67中的任一氨基酸序列具有至少80％同一性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13-32、35-61、64-67中的任一所示。

本发明的第三方面，提供了一种抗VEGFA抗体或其抗原结合片段筛选的方法，所述的方法包括用人或猴VEGFA蛋白免疫羊驼。

本发明的第四方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段。

优选的，所述的融合蛋白还包含除上述抗VEGFA抗体或其抗原结合片段外的其他抗VEGFA抗体或其他靶点的抗体或其抗原结合片段或其他功能组分。

优选的，所述的功能组分包括但不限于血清白蛋白、细胞因子、转铁蛋白、支架蛋白、寡肽、寡肽聚合物、多肽、多肽聚合物、多糖、脂肪链、亲和素、生物素、链霉亲和素、毒素、药物、核酸、放射性核素及其标记物、PEG化成分或Fc片段中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的其他靶点选自IgG、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFR、FGF、FGFR、PlGF、PDGF、ANG2、Endoglin(CD105)、TGF、Integrin、Integrin受体、白细胞介素(如IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23等)、白细胞介素受体(如IL1R1、IL2Rα、IL3R、IL4Rα、IL6R、IL10R、IL12R、IL15Rα、IL17R、IL23R等)、PCSK9、TNF-α、TNFR、RANKL、补体蛋白C3、补体蛋白C5、G蛋白偶联受体(GPCR)、GLP1R、CD3、CD19、CD20、CD22、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD47、CD80、CD86、CD96、CD99、CD111、CD112、CD123、CD133、CD138、CD155、CD171、Claudin 18.2、OX40、ICOS、CTLA4、4-1BB、TCR、B7-1、B7-2、BTLA、TIM-3、LAG3、Galectin-9、PD-L1、PD-L2、PD-1、TIGIT、EGFR、Her2、PSCA、CEA、FAP、EGFRVIII、BCMA、PSMA、CA125、EphA2、C-met、L1CAM、CS1、ROR1、EC、NY-ESO-1、MUC1、MUC16、mesothelin、LewisY、GPC3、GD2、EPG、DLL 3或5T4。

所述的抗体或其抗原结合片段的结构为纳米抗体、嵌合抗体、Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、分离的CDR区、F(ab')2片段、单结构域抗体、单链抗体分子或线性抗体。

优选的，所述的融合蛋白至少包含一个抗VEGFA抗体或其抗原结合片段。

优选的，所述的融合蛋白至少包含一个其他抗VEGFA抗体或其抗原结合片段。

优选的，所述的融合蛋白至少包含一个其他靶点的抗体或其抗原结合片段或其他功能组分。

其中，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段之间、抗VEGFA抗体或其抗原结合片段与其他抗VEGFA抗体或其抗原结合片段之间、抗VEGFA抗体或其抗原结合片段与其他靶点的抗体或其抗原结合片段或其他功能组分、其他抗VEGFA抗体与其他靶点的抗体或其抗原结合片段或其他功能组分之间、其他靶点的抗体或其抗原结合片段或其他功能组分之间、其他抗VEGFA抗体或其抗原结合片段之间直接连接或间接连接。

所述的间接连接可以为通过接头、功能结构域和/或用于偶联的连接子连接。其中，接头选自连接肽、寡肽、寡肽聚合物、多肽、多肽聚合物、PEG、核酸、多糖、脂肪链、生物素、链霉亲和素或亲和素。

所述的功能结构域为Fc片段、血清白蛋白、细胞因子、转铁蛋白、支架蛋白、VEGFA或其他靶点的抗体或其抗原结合片段中的一种或两种以上的组合。

所述的用于偶联的连接子包括毒素、药物、核酸、PEG、放射性核素及其标记物中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的直接或者间接连接包括直接或者间接连接在所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、其他抗VEGFA抗体和/或其他靶点的抗体的N端、C端和/或内部残基上。

所述的融合蛋白中包含的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、其他的抗VEGFA抗体或其他靶点的抗体的连接顺序可以为一个抗体的N端、C端和/或内部残基与另一个抗体的N端、C端和/或内部残基相连。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的融合蛋白中包含的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、其他的抗VEGFA抗体或其他靶点的抗体的连接顺序可以为一个抗体的N端与另一个抗体的N端或C端相连。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的融合蛋白中包含的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、其他的抗VEGFA抗体或其他靶点的抗体的连接顺序可以为一个抗体的C端与另一个抗体的N端或C端相连。

在一个具体实施方式中，所述的融合蛋白包含抗VEGFA抗体和Fc片段。

优选的，所述的融合蛋白包含SEQ ID NO：64-67中的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：64-67中的任一氨基酸序列具有至少80％同一性。

优选的，所述的融合蛋白中还包含标签。

优选的，所述的标签连接在融合蛋白的C端。

本发明的第五方面，提供了一种嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体的胞外结构域包含上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段。

优选的，所述的嵌合抗原受体还包含现有技术中常规的任何跨膜区和/或胞内信号传导区。

本发明的第六方面，提供了一种核酸，所述的核酸编码上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、编码上述的融合蛋白或上述的嵌合抗原受体。

本发明的第七方面，提供了一种载体，所述的载体包含上述的核酸。

所述的载体能够在体内或体外或离体条件下表达。优选的，所述的载体为原核表达载体、病毒表达载体或真核表达载体。例如大肠杆菌系列载体、噬菌体等等。

本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含上述的核酸或上述的载体。

所述的宿主细胞可以为真核细胞或原核细胞。

真核细胞包括动植物细胞，例如T细胞、酵母细胞、HEK293细胞或CHO细胞等等。

原核细胞例如大肠杆菌等。

本发明的第九方面，提供了一种宿主细胞的制备方法，所述的制备方法包括将上述核酸或载体导入宿主细胞，然后诱导其表达。

本发明的第十方面，提供了一种抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述的制备方法包括将编码抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的核酸或载体导入宿主细胞，然后诱导其表达。

本发明的第十一方面，提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞表达上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段或上述的嵌合抗原受体。

优选的，所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞。

优选的，免疫细胞为CAR-免疫细胞。

本发明的第十二方面，提供了一种免疫细胞的构建方法，所述的构建方法包括将编码本发明所述嵌合抗原受体的核酸序列转染至免疫细胞中表达获得。

本发明的第十三方面，提供了一种治疗和/或诊断疾病的产品，所述的治疗和/或诊断疾病的产品包含下列任一种：

A)上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段；

B)上述的融合蛋白；

C)上述的嵌合抗原受体；

D)上述的免疫细胞

E)上述的核酸；

F)上述的载体；或，

G)上述的宿主细胞。

所述的治疗和/或诊断疾病的产品靶向表达VEGFA的细胞，所述的细胞可以为心肌细胞、近端肾小管细胞、肝细胞、血管内皮细胞、颗粒细胞、特化的上皮细胞、间充质细胞、巨噬细胞、血小板、树突状细胞、活化的T细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜中的Muller细胞、星形胶质细胞、成骨细胞、支气管与肺泡上皮细胞、周细胞、血管平滑肌细胞、肌成纤维细胞、角质形成细胞、肾系膜细胞或肿瘤细胞等。

优选的，所述的产品可以是试剂盒或药物或芯片或抗体药物偶联物等。所述的疾病为与VEGFA信号通路相关的疾病。进一步优选可以为肿瘤、血管异常增生、眼科涉及血管新生的疾病(例如眼底血管病)等等。

本发明的第十四方面，提供了一种抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)，其包含与药物共价结合的本发明所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段。

本发明的第十五方面，提供了一种VEGFA的检测方法，所述的检测方法包括将待检样品与上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段接触，然后检测VEGFA与抗VEGFA抗体或其抗原结合片段形成的复合物的含量。

所述的检测方法为检测VEGFA的存在或含量。其中，所述的存在表示有无，所述的含量可以为表达量或蛋白浓度等。

本发明的第十六方面，提供了一种诊断疾病的方法，所述的方法包括取样，将样品与所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白、上述的核酸、上述的载体、上述的宿主细胞、上述的免疫细胞或上述的治疗和/或诊断疾病的产品接触，检测检测VEGFA与抗VEGFA抗体或其抗原结合片段形成的复合物含量。

所述的疾病为与VEGFA信号通路相关的疾病。进一步优选可以为肿瘤、血管异常增生、眼科涉及血管新生的疾病(例如眼底血管病)等等。

本发明的第十七方面，提供了一种治疗和/或预防疾病的方法，所述的方法包括向个体施加上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白、上述的核酸、上述的载体、上述的宿主细胞、上述的免疫细胞或上述的治疗和/或诊断疾病的产品。

本发明的第十八方面，提供了一种阻断VEGFA介导的血管内皮细胞增殖或抑制血管新生的方法，所述的方法包括将血管内皮细胞与上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白、上述的核酸、上述的载体、上述的宿主细胞、上述的免疫细胞或上述的治疗和/或诊断疾病的产品接触。

优选的，所述的方法包括用血管内皮细胞的无血清培养基稀释上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白、上述的核酸、上述的载体、上述的宿主细胞、上述的免疫细胞或上述的治疗和/或诊断疾病的产品，然后与抗原(例如VEGFA165)孵育。

优选的，孵育后包含弃去培养板中血管内皮细胞完全培养基的步骤。

优选的，将抗原以及上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白、上述的核酸、上述的载体、上述的宿主细胞、上述的免疫细胞或上述的治疗和/或诊断疾病的产品加入到血管内皮细胞培养板中，在培养板上培养。

优选的，培养后进行检测。

优选的，所述的孵育时间为0.5-5h，优选1-3h，例如0.5、1、2、3、4、5h。

优选的，所述的孵育温度为室温-45℃，优选30-40℃，例如25、30、35、36、37、38、39、40、45℃等。

优选的，所述的培养温度为室温-45℃，优选30-40℃，例如25、30、35、36、37、38、39、40、45℃等。优选的，所述的培养在5％CO₂的培养箱中进行。

优选的，所述的培养时间为1-5天，优选2-4天，例如1、1.5、2、2.5、3、2.5、4、4.5、5天等。

优选的，所述的检测为检测活的血管内皮细胞数。

本发明的第十九方面，提供了一种治疗和/或预防疾病的方法，所述的方法包括使用上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白、上述的核酸、上述的载体、上述的宿主细胞、上述的免疫细胞或上述的治疗和/或诊断疾病的产品，与靶细胞接触。

优选的，所述的靶细胞选自表达VEGFA的细胞，例如心肌细胞、近端肾小管细胞、肝细胞、血管内皮细胞、颗粒细胞、特化的上皮细胞、间充质细胞、巨噬细胞、血小板、树突状细胞、活化的T细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜中的Muller细胞、星形胶质细胞、成骨细胞、支气管与肺泡上皮细胞、周细胞、血管平滑肌细胞、肌成纤维细胞、角质形成细胞、肾系膜细胞或肿瘤细胞等等。

本发明的第二十方面，提供了一种上述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白、上述的核酸、上述的载体、上述的宿主细胞或上述的免疫细胞在制备治疗和/或预防与VEGFA相关的疾病的产品中的应用，或者，在制备阻断VEGFA介导的血管内皮细胞细胞增殖或抑制血管新生的产品中的应用，或者，在制备抗体药物偶联物或抗体诊断试剂盒或示踪剂中的应用。

所述的疾病可以为肿瘤、血管异常增生、眼科涉及血管新生的疾病(例如眼底血管病)等等。

所述的产品可以为试剂盒或药物或芯片或抗体药物偶联物等。

本发明提供了一种新的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，其热稳定性高、水溶性高、分子量小，表达和纯化工艺简单，与VEGFA具有高亲和力，且具有有效阻断VEGFA信号通路，有效阻断VEGFA导致的血管内皮细胞增殖以及血管新生等病理过程，能潜在应用于与VEGFA相关的疾病的治疗中。也可能带来更大的临床价值，如有更好的组织穿透性、更低的生产成本、更便捷的给药方式等。

本发明所述的“药物”可以用于治疗人或非人动物，例如非人哺乳动物。所述的药物可以包含现有技术常见的药学上可接受的载体、辅料或盐。所述的药物可以采用任何合适的给药途径，例如胃肠道给药(例如口服)或非胃肠道给药(例如，静脉内、肌内、皮下、皮内、器官内、鼻内、眼内、滴注、脑内、鞘内、透皮、直肠内等)途径。所述的药物可以为任何合适的剂型，例如经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型，优选包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、微乳剂、混悬剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、舌下片剂、栓剂、气雾剂、泡腾片、滴丸剂、凝胶剂等等。所述的药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。所述的药物可以含有重量比为0.01-99.5％(具体如，0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％)的所述抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、所述的核酸、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的免疫细胞等等。所述的药物可以制备为蛋白浓度为1-300mg/mL(例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300mg/mL)的试剂。所述的药物的单次给药剂量可以为0.1-1000mg，例如0.1、0.2、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、3、5、10、20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg。

本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。

本发明所述的“…方法”可以为疾病的诊断和治疗目的，也可以为非疾病的诊断和治疗目的。

本发明所述的“抗原结合片段”是保留抗体的特定结合活性的抗体的一部分，即抗体的任何部分能够与抗体的靶分子上的表位特异结合。它包括例如Fab，Fab'，F(ab')2、Fv、Fd和这些片段的变体。例如，抗体的重链和/或轻链，抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或来自抗体的重链或轻链的单个或2个以上CDR。其中，Fab，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。F(ab')2，即包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段。Fd，由VH和CH1结构域组成的Fd片段。Fv，由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段。Fab'，是在CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段。Fab'-SH是对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离硫醇基团的Fab'。其中，VH代表重链可变区，VL代表轻链可变区，CL代表轻链。

本发明所述的“CH2”或“CH3”为重链恒定区的CH2或CH3。完整的重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。具体的，CH2结构域指从约EU位置231延伸至EU位置340(按照Kabat的EU编号系统)的抗体重链多肽部分。CH2结构域的独特性在于，它不与另一结构域紧密配对。CH3结构域指约从EU位置341延伸至EU位置446的抗体重链多肽部分。

本发明所述的“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由铰链区的两个或多个二硫键形成二聚体并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。

本发明所述的“线性抗体”包括一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)。

本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。

本发明所述的“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。

本发明所述的“人源化抗体”指抗体的框架区和/或恒定区部分(例如CH区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。在本发明的一个具体实施方式中，抗体的CDR区未经过改造。

本发明所述的“个体”可以为人或非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。

本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述的“预防”表示为了阻止或延迟疾病或病症或症状在机体内的发生而实施的方式。

本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。

本发明所述的肿瘤可以是任何不良的细胞增殖(或本身表现为不良细胞增殖的任何疾病)、赘生物，或不良细胞增殖、赘生物或肿瘤的倾向性或风险增加。其可以是良性或恶性的，也可以是原发性或继发性(转移性)。赘生物可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织的实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或排除大脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。进一步优选的，所述的肿瘤选自前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤(例如神经胶质瘤)、肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、横纹肌癌、舌鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盘绒毛癌、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤)、白血病、直肠腺癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤(例如神经纤维肉瘤)、室管膜瘤、神经鞘瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、慢性粒细胞白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、表皮样癌、结肠癌、胸腺癌、血液癌、头颈癌或口咽癌。

本发明所述的“眼底血管病”指的是发生在视网膜动脉或静脉的疾病，或与脉络膜血管新生相关疾病的总称。包括但不限于年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞、病理性近视、新生血管性青光眼等等。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：不同批次纯化的候选抗体考染胶图。

图2：不同候选抗体结合VEGFA的信号随抗体浓度变化结果图。

图3：不同候选抗体的竞争ELISA结果图。

图4：不同候选抗体对HUVEC细胞增殖的抑制率。

图5：ELISA检测抗体V1结合人VEGFA121的活性。

图6：ELISA检测抗体V1结合小鼠VEGFA164活性。

图7：ELISA检测抗体V1结合大鼠VEGFA164活性。

图8：人源化抗体纯化后的考染胶图。

图9：人源化抗体结合VEGFA的ELISA测试。

图10：人源化抗体竞争VEGFR2的ELISA测试。

图11：V30和V43的人源化抗体竞争VEGFR2的ELISA测试。

图12：V1-SA1与VEGFA165的结合解离曲线(SPR)。

图13：不同人源化抗体的熔解温度(Tm)。

图14：人源化抗体V1-SA1和阳性对照抗体BI-VEGF ab纯化后的SDS-PAGE胶图。

图15：单价纳米抗体-Fc融合蛋白纯化后的考染胶图。

图16：单价纳米抗体-Fc融合蛋白结合VEGFA的ELISA测试。

图17：V1-SA1-Fc-m1与VEGFA165的结合解离曲线(SPR)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：羊驼免疫和抗体初筛

1、羊驼免疫

将人VEGFA165(无标签，购自：义翘神州，货号：HPLC-10008-HNAH，以下简称VEGFA)乳化后免疫羊驼。选用2只羊驼，每只动物每次免疫1mg VEGFA蛋白，每2周免疫一次，从第二次免疫开始，取血清检测效价。其中1#羊驼免疫4次抗原，2#羊驼免疫3次抗原，经血清效价检测，均达到文库构建标准。

2、免疫后血清阻断VEGFA和VEGFR2结合的竞争活性检测

将VEGF受体胞外区VEGFR2-ECD进行生物素标记(命名为VEGFR2-biotin)，将VEGFA用CBS缓冲液稀释到0.5μg/mL，包被酶标板，4℃过夜。经3％脱脂奶粉封闭后洗板，将羊驼血清以及阴性血清(抗原免疫之前的羊驼血清)分别稀释5倍、15倍、45倍、135倍、405倍、1215倍、3645倍，稀释到终浓度为0.5μg/mL的VEGFR2-biotin溶液中，之后分别取100μL加入到封闭好的孔中，室温放置1h，PBST(含0.1％Tween20的PBS，pH7.4)洗板3次，加入streptavidin-HRP，室温放置1h，PBST洗板3次，加入TMB显色15分钟，加入终止液，用酶标仪读取450nm波长处的吸光度。两只羊驼的血清竞争活性检测结果见表2-3。

表2 1#羊驼血清竞争活性检测结果

表3 2#羊驼血清竞争活性检测结果

结果说明，1#和2#羊驼均检测到阻断VEGFA和VEGFR2结合的抗体，可以用于文库构建。

3、抗体文库构建

使用采血针抽取40mL羊驼外周血，按照红细胞裂解液说明书裂解红细胞后，收集白细胞加入trizol冻存。建库前使用trizol从分离好的羊驼PBMC中提取total RNA和cDNA的反转录，采用纳米抗体特异性引物扩增可变区VH片段。用SfiI酶对上述所得片段以及pcomb3X载体进行酶切，酶切后按适当比例混合用T4连接酶连接。连接后，用于电转化XL1-Blue感受态细胞。根据菌落生长情况，计算2只羊驼的转化库容量分别为6.52×10⁸和4.12×10⁸。从转化子菌落中随机挑取克隆送测序验证，测序结果显示为正确的纳米抗体序列。

4、抗体文库筛选

采用噬菌体展示方法，筛选能结合VEGFA的噬菌体。

对于1#羊驼文库，经4轮富集筛选后，挑取1板96孔的单克隆(筛选方法记为VEGF-4^th富集)，检测噬菌体与VEGFA的结合活性。同时，对第四轮的噬菌体采用竞争洗脱：利用10μg/mL VEGFR2胞外区结构域VEGFR2-ECD-His(内部制备)竞争洗脱结合VEGF的噬菌体，预期获得可以与VEGFR2竞争结合VEGFA的抗体，对获得的噬菌体挑取5块96孔板，检测噬菌体与VEGFA的结合活性(筛选方法记为VEGF-5^th VEGFR2竞争)。此外，对VEGFR2竞争筛选获得的噬菌体再进行对照品单抗Bevacizumab(Avastin)的竞争洗脱筛选，即用10μg/mL Bevacizumab抗体竞争洗脱结合VEGFA的噬菌体，对获得的噬菌体挑取1块96孔板，检测噬菌体与VEGFA的结合活性(筛选方法记为VEGF-6^th Bevacizumab竞争)，检测噬菌体是采用HRP标记的识别噬菌体外壳蛋白的抗体，标记为anti-M13(HRP)。上述单克隆中有结合VEGFA活性的阳性克隆的检测结果见表4。

表4 1#羊驼文库筛选后结合VEGFA活性的阳性克隆的检测结果

此外，采用生物素标记的VEGFA去筛选结合更多表位的噬菌体，方法为：先包被Avidin，再孵育生物素化的VEGFA，将1#羊驼文库与2#羊驼文库合并后，通过文库与生物素化的VEGFA的孵育、洗脱，获得结合VEGFA的噬菌体，重复该过程。经过多轮富集后，筛选1块96孔板单克隆菌落。对上清中的噬菌体进行ELISA检测VEGFA结合活性，有结合活性的阳性克隆结果见表5。

表5文库合并后，筛选结合VEGFA活性的阳性克隆的检测结果

5、初筛抗体序列

上述有结合VEGFA活性的噬菌体，经质粒测序和密码子翻译后，获得候选纳米抗体(CDR区+框架区)的氨基酸序列，合并序列相同的抗体，CDR序列各不相同的候选抗体见表6。

表6候选抗体的氨基酸序列

6、候选抗体的表达和纯化

挑选上表中的部分候选抗体，利用哺乳动物细胞表达，纯化后进行ELISA测试，重复验证抗体的结合VEGFA活性。

将各纳米抗体的编码基因通过PCR方法从原始的噬菌体质粒中扩增，构建到pVRC8400表达载体上，其中抗体N端加入分泌肽：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS(SEQ ID NO：68)，抗体C端依次添加柔性连接子GGGGS(SEQ ID NO：69)和标签6×His。与此同时，合成阳性对照抗体BI-VEGF ab的编码基因序列(该抗体是抗VEGFA的纳米抗体，抗体氨基酸序列来自专利US 9527925B2中的SEQ ID NO:57)，对照抗体BI-VEGF ab的C端添加标签6×His。各抗体的表达质粒测序正确后进行无内毒素大量提取。采用转染试剂聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，简称PEI，linear，MW＝25kDa，购自：Polysciences，货号：23966-1)，对293F悬浮细胞进行瞬转，转染后第4天或第5天收集细胞上清，开展Ni珠亲和纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE分析，分子量符合预期(～15kDa)。阳性对照抗体BI-VEGF ab和部分候选抗体纯化后的考染胶图如图1所示。

实施例2：抗体活性测试

1、候选抗体结合VEGFA的活性测试

用ELISA包被缓冲液稀释抗原VEGFA(终浓度为0.3μg/mL)，加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜。经5％脱脂奶粉封闭后，加入阳性对照抗体BI-VEGF ab(该抗体是抗VEGFA的纳米抗体，抗体氨基酸序列来自专利US 9527925B2中的SEQ ID NO:57，其表达质粒的构建方法以及蛋白纯化方法与实施例1中“6、候选抗体的表达和纯化”步骤相同)，以及待测候选抗体的梯度稀释液(0.001，0.01，0.1，1，3，10，100nM)，37℃孵育1小时，洗板后加入His-Tag单克隆抗体稀释液(购自：Proteintech，货号：66005-1-Ig)，37℃孵育1小时，洗板后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体稀释液(HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，购自：Proteintech，货号：SA00001-1)，室温孵育45分钟。洗板后，每孔加入100μL TMB(购自：天根生化，货号：PA107-01)，37℃显色15分钟后，加入终止液50μL。用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD450)。

部分抗体结合VEGFA的信号随抗体浓度变化如图2所示。

ELISA测试中VEGFA结合数据经拟合，得到抗体结合VEGFA的EC50，见表7，可知表中10个候选抗体均具有较高的VEGFA结合活性。

表7候选抗体的VEGFA结合活性检测

上述抗体CDR区氨基酸序列氨基酸残基有部分不同，抗体活性在可接受的范围内波动。

此外，利用表面等离子共振(SPR)技术测试纳米抗体与VEGFA的亲和力。采用Biacore 8K仪器(Cytiva)，以抗原VEGFA165(无标签，购自：义翘神州，货号：HPLC-10008-HNAH)为配体，通过氨基偶联试剂(EDC和NHS)偶联到CM5芯片上，偶联量约为400RU。实验过程中流动相缓冲液为HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％v/v Tween 20)。分析物为各个候选抗体和阳性对照抗体BI-VEGF ab，其稀释液浓度是：80nM、40nM、20nM、10nM、5nM、2.5nM。动力学分析时，抗原与抗体的结合时间为240秒，解离时间为1500秒，流速是30μL/min。采用多循环模式，芯片经100mM盐酸再生。候选抗体与VEGFA165的结合和解离曲线采用“1：1 binding”模型拟合获得结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)，见表8所示。

表8候选抗体结合VEGFA165的结合速率(ka)，解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)

从表8中可知，候选抗体与VEGFA165具有高亲和力，KD数值与阳性对照相差为3倍以内，因此认为候选抗体亲和力与阳性对照蛋白相当。

2、竞争VEGFR2活性测试

为进一步验证候选抗体阻断VEGFA结合受体VEGFR2的活性，开展竞争ELISA。

用ELISA包被缓冲液稀释抗原VEGFA(终浓度为0.53μg/mL)，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜。经5％脱脂奶粉封闭，将终浓度为1nM的VEGFR2胞外区结构域VEGFR2-ECD-Fc(购自：义翘神州，货号：10012-H02H)与待测抗体的梯度稀释液(0.01，0.1，1，3，10，100nM)浓度梯度，混合均匀，加入96孔板中，37℃孵育1小时，洗板后加入HRP标记的山羊抗人IgG抗体稀释液(HRP-conjugated Goat Anti-Human IgG，购自：Abbkine，货号：A21050)，室温孵育45分钟。洗板后，每孔加入100μL TMB(购自：天根生化，货号：PA107-01)，37℃显色15分钟后，加入终止液50μL。用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD450)。竞争ELISA结果见图3。

抗体竞争VEGFR2的活性(IC50值和最大抑制率)比较见表9，可看出表中12个候选抗体能与VEGFR2竞争结合VEGFA，最大抑制率计算公式是：

表9候选抗体竞争VEGFR2的活性(IC50值和最大抑制率)

3、候选抗体抑制HUVEC细胞增殖的活性

验证候选抗体V1、V13、V15和V30阻断VEGFA刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖。

将原代HUVEC细胞(来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC))消化并稀释成5×10^4cell/mL，接种于96孔板，100μL/well，培养基为完全培养基(F-12K+0.1mg/mL heparin+ECGS+10％FBS)，贴壁培养5h后进行加药处理。

用DMEM/F12(HAM)1:1培养基(无血清，添加青霉素和链霉素，含谷氨酰胺，购自Biological Industries，货号：01-172-1ACS)配置VEGFA和候选抗体稀释液的混合物，其中VEGFA在各稀释液中的终浓度均为35ng/mL，候选抗体V1浓度梯度为1000000pM、33333.33pM、111111.11pM、37037.04pM、12345.68pM、4115.23pM、1371.74pM、457.25pM、152.42pM、50.81pM、16.94pM、5.65pM。V13、V15、V30浓度梯度为1000000pM、33333.33pM、111111.11pM、37037.04pM、12345.68pM、4115.23pM、1371.74pM、457.25pM、152.42pM、5.65pM。

阴性对照抗体(Negative control)为结合不相关抗原的纳米抗体，它的浓度梯度为(3倍递减)：1000000pM、33333.33pM、111111.11pM、37037.04pM、12345.68pM、4115.23pM、1371.74pM、457.25pM、152.42pM。

同时设置不含VEGFA(细胞增殖最少)，和不加任何抗体仅含VEGFA(细胞增殖最多)的对照。VEGFA与各抗体稀释液的混合物于37℃共孵育1h，将96孔细胞板中的原培养基吸走后，将VEGFA与各抗体稀释液的混合物加入到细胞板中。每个浓度设置2个细胞孔。37℃细胞培养箱培养72小时。向96孔板中加入CCK-8溶液(购自：索莱宝，货号：CA1210)，将培养板在培养箱内孵育3h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD450)。

根据对照孔(不含VEGFA以及仅含VEGFA且不加任何抗体)的读值差异，计算候选抗体在不同浓度下对细胞增殖的抑制率，抑制率的计算公式是：

各抗体对HUVEC细胞增殖的抑制率曲线，以及最大抑制率、IC50，如图4和表10所示。

表10各抗体对HUVEC细胞增殖的最大抑制率及IC50值

因此，四个候选抗体均能在细胞水平抑制VEGFA信号通路，即抑制VEGFA刺激的HUVEC细胞增殖。在最高的抗体浓度(1μM)下，候选抗体V1能高效抑制HUVEC增殖(最大抑制率接近100％)。而从IC50来看，候选抗体V30活性相对更强。

通过结合VEGFA的ELISA和竞争VEGFR2的ELISA测试，以及细胞水平抑制HUVEC增殖的活性检测，表明候选抗体能高效结合VEGFA，并阻断VEGFA结合VEGFR2，从而抑制VEGFA-VEGFR信号通路，抑制血管内皮细胞增殖。

4、候选抗体结合人VEGFA121和鼠源VEGFA164的活性检测

采用ELISA实验，方法同本实施例“1、候选抗体结合VEGFA的活性测试”，即包被0.3μg/mL的人源VEGFA121(购自：义翘神州，货号：10008-HNAH)或小鼠VEGFA164(购自：义翘神州，货号：50159-MNAB)，或大鼠VEGFA164(购自：义翘神州，货号：80006-RNAB)，检测His标签的候选抗体V1结合人源VEGFA121、小鼠VEGFA164和大鼠VEGFA164的活性。

采用ELISA检测抗体V1结合人VEGFA121的活性，如图5和表11所示。

表11抗体V1结合人VEGFA121的活性

抗体V1结合小鼠VEGFA164活性如图6所示。

抗体V1结合大鼠VEGFA164活性如图7所示。

综上，候选抗体V1结合人VEGFA121活性较高。

5、候选抗体Tm值检测

选取8个候选抗体(V1、V15、V29、V30、V31、V36、V40、V43)，替换抗体所处缓冲液为：10mM His,pH＝6.5,40mM NaCl,5％sucrose,0.01％Tween-20，用UNCLE仪器(unchainedlabs)测定抗体的熔解温度(Tm)，结果见表12。结果表明这些候选抗体都具有一定的热稳定性。

表12候选抗体的熔解温度Tm

实施例3：抗VEGFA纳米抗体的人源化改造

以候选抗体V1作为起始抗体，进行人源化改造。先通过抗体数据库IGBLAST和IMGT，比对候选抗体V1序列与人的抗体序列同源性，再将同源性高的人抗体框架区与候选抗体的CDR区进行组合，构建完整的人源化抗体。人源化抗体的表达质粒构建方法以及蛋白纯化方法与实施例1中“6、候选抗体的表达和纯化”步骤相同。

纯化后的抗体用ELISA方法测试结合VEGFA的活性。V1经初次人源化改造后，抗体结合VEGFA活性大幅下降，将框架区的少数几个氨基酸恢复突变，获得9个优化后的V1人源化抗体，它们的氨基酸序列见表13所示。

表13人源化候选抗体的氨基酸序列

对这些恢复突变的人源化抗体开展瞬转表达和纯化，第一步的纯化的实验方法与实施例1中“6、候选抗体的表达和纯化”步骤相同。其中，阳性对照BI-VEGF ab和人源化抗体V1-DP和V1-SA1经过Ni珠亲和纯化后，开展阳离子交换层析纯化(S柱)，部分蛋白纯化后的SDS-PAGE考染胶如图8(A)所示，目标蛋白分子量符合预期(～15kDa)。

将候选抗体V13、V15、V30、V40、V43的CDR区移植到V1人源化恢复突变后的框架区，开展这些候选抗体的人源化改造，并进行表达和纯化。部分纯化后的人源化抗体如图8(B)(C)(D)所示，目标蛋白分子量符合预期(～15kDa)。

实施例4：人源化抗VEGFA纳米抗体的活性检测

用ELISA方法对获得的人源化抗体进行VEGFA结合活性测试，实验方法与实施例2中“1、候选抗体结合VEGFA的活性测试”相同。部分人源化抗体结合VEGFA的ELISA测试结果如图9所示。

ELISA测试中VEGFA结合数据经拟合，得到人源化抗体结合VEGFA的EC50，见表14。数据显示候选抗体经过人源化改造后，结合VEGFA的活性与人源化之前(V40)近似。

表14人源化抗体结合VEGFA的EC50值

为进一步验证人源化抗体阻断VEGFA结合受体VEGFR2的活性，开展竞争ELISA。实验方法与实施例2中“2、竞争VEGFR2活性测试”近似，不同之处是：对于V1、V13、V15和V43的人源化抗体，VEGFR2胞外区结构域VEGFR2-ECD-Fc(购自：义翘神州，货号：10012-H02H)的终浓度为2nM。V1人源化抗体的浓度梯度为：0.01，0.1，1，10，30，100，1000nM。V13、V15和V43人源化抗体的浓度梯度为：0.03，0.3，3，10，30，300nM。

结果显示发现V1和V15的人源化抗体与VEGFR2竞争结合VEGFA的活性，分别恢复到人源化改造之前(即V1和V15)，其余人源化抗体表现出近似的竞争VEGFR2活性。部分人源化抗体的竞争ELISA结果如图10，IC50和最大抑制率如表15所示。最大抑制率计算公式是：

表15人源化抗体的竞争ELISA结果和最大抑制率

此外，对V30的人源化抗体和V43的其余人源化抗体，开展阻断VEGFR2的ELISA测试。实验方法与实施例2中“2、竞争VEGFR2活性测试”近似，不同之处是VEGFR2胞外区结构域VEGFR2-ECD-Fc(购自：义翘神州，货号：10012-H02H)终浓度为1nM。人源化抗体的浓度梯度为：0.03，0.3，3，10，30，300nM。

V30和V43的人源化抗体竞争VEGFR2的ELISA测试结果如图11所示。

抗体竞争VEGFR2的活性(IC50值和最大抑制率)见表16，可看出人源化抗体能与VEGFR2竞争结合VEGFA，活性与人源化之前(V30)近似。最大抑制率计算公式是：

表16抗体竞争VEGFR2的活性(IC50值和最大抑制率)

利用表面等离子共振(SPR)技术，偶联抗原VEGFA165，测试纳米抗体在人源化改造前后与VEGFA的亲和力。实验方法和数据拟合方法与实施例2中“1、候选抗体结合VEGFA的活性测试”相同。获得的KD如表17所示。

表17人源化抗体与VEGFA的结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)

此外，利用表面等离子共振(SPR)技术，以偶联抗体的方式，测试人源化后的抗体V1-SA1与VEGFA的亲和力。采用Biacore 8K仪器(Cytiva)，以抗体V1-SA1为配体，通过氨基偶联试剂(EDC和NHS)偶联到CM5芯片上：偶联条件为10mM醋酸钠(pH4.0)，V1-SA1蛋白浓度是20μg/mL。配体V1-SA1的偶联量为371.8RU。实验过程中流动相缓冲液为HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％v/v Tween 20)。分析物为抗原VEGFA165(无标签，购自：金斯瑞，货号：Z03073)，其稀释液浓度是：100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM。动力学分析时，抗原与抗体的结合时间为180秒，解离时间为200秒，流速是30μL/min。采用多循环模式，芯片经10mM甘氨酸盐酸盐(pH＝1.5)再生。抗原抗体的结合曲线采用“Two state reaction”模型拟合获得结合速率、解离速率和KD。

V1-SA1与VEGFA165的结合解离曲线见图12，拟合的KD见表18所示。

表18人源化后的抗体V1-SA1与VEGFA的结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)

从表17和表18中，可知抗体V1在人源化改造后维持了与VEGFA165的高亲和力。

实施例5：人源化抗VEGFA纳米抗体的稳定性研究

1、比较V1人源化抗体的Tm值

热稳定性高的抗体更有利于抗体的生产和长期储存，因此比较了不同人源化抗体的熔解温度(Tm)。

针对V1的9种人源化抗体，替换缓冲液为PBS(pH＝7.4)，用UNCLE仪器(unchainedlabs)测定Tm，Tm的排序见图13，人源化抗体的Tm值在可接受范围内波动，其中V1-DP和V1-SA1的Tm值较高，说明这两个抗体的热稳定性很可能优于其他人源化抗体。

2、人源化抗体V1-SA1的胶体稳定性研究

将人源化抗体V1-SA1和阳性对照抗体BI-VEGF ab的编码基因构建到表达载体pCDNA3.1(+)上，其中抗体N端加入分泌肽：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS(SEQ ID NO：68)，抗体C端依次添加柔性连接子GGS和标签6×His。对这两个抗体开展瞬转表达和Ni珠亲和纯化，实验方法与实施例1中“6、候选抗体的表达和纯化”步骤相同。纯化后经SDS-PAGE分离，凝胶染色结果见图14，从图中可看出两个蛋白的分子量符合预期(～15kDa)，蛋白表达量和SDS-PAGE的考染纯度见表19，可见V1-SA表达量远高于BI-VEGF ab。

表19人源化抗体V1-SA1和阳性对照抗体BI-VEGF ab的瞬转表达量和蛋白在SDS-PAGE凝胶上的纯度

将V1-SA1和BI-VEGF ab蛋白都换液到1xPBS(pH＝7.4)中，蛋白浓度调整为10mg/mL，对蛋白进行HPLC-SEC分析(色谱柱为Zenix-C SEC-300，Sepax)。蛋白单体、聚集体和片段占比见表20，可见V1-SA的聚集体占比远少于BI-VEGF ab，表明V1-SA1的更不容易发生聚集。

表20抗体V1-SA1和BI-VEGF ab在SEC-HPLC分析中各成分占比

对换液到PBS的抗体V1-SA1和BI-VEGF ab(蛋白浓度为10mg/mL)，无菌过滤后放置37℃一段时间(0天和2天)，观察蛋白溶液性状，对比二者胶体稳定性，结果如表21所示。

表21抗体V1-SA1和BI-VEGF ab放置37℃0天和2天的性状、平均粒径和PDI对比

根据动态光散射原理，利用纳米粒度及电位分析仪(NS-90Z，欧美克)，对上述放置37℃一段时间(0天和2天)的抗体V1-SA1和BI-VEGF ab溶液(用PBS稀释4倍后)，分别进行蛋白粒径测量，蛋白平均粒径(Z-Average)和多分散系数(Polydispersity index，PDI)结果如表21所示。对于0时刻样品，V1-SA1的平均水化动力学直径和PDI均小于BI-VEGF ab，考虑到二者分子量近似，说明BI-VEGF ab在该缓冲溶液中有一定比例的高分子量蛋白聚集体，而同等条件下，V1-SA1比BI-VEGF ab的粒径分布更均一，且高分子量蛋白聚集体的占比明显更低。

从表21中可以看出，对于37℃放置2天的样品，V1-SA1依然保持澄清，而BI-VEGF ab蛋白溶液出现沉淀，表明V1-SA1的胶体稳定性好于BI-VEGF ab。此时，V1-SA1的平均水化动力学直径远小于BI-VEGF ab，且相比0时刻变化较小；而BI-VEGF ab的平均水化动力学直径远大于V1-SA1，且相比0时刻的BI-VEGF ab溶液明显增加，说明BI-VEGF ab在高温条件下，进一步形成高分子量蛋白聚集体。

实施例6：单价纳米抗体-Fc融合蛋白的制备和活性研究

1、单价纳米抗体-Fc融合蛋白的制备

本实施例开展了单价纳米抗体和IgG1 Fc(SEQ ID NO：62)或PPCP-Fc(SEQ ID NO：75，即将SEQ ID NO：62中的DKTHTC去除后的剩余氨基酸序列)或IgG1 Fc突变体Fc-m1(SEQ ID NO：63)的融合表达。

其中，IgG1 Fc氨基酸序列为：

PPCP-Fc氨基酸序列为：

IgG1 Fc的突变体Fc-m1，其氨基酸序列为：

构建的纳米抗体-Fc融合蛋白氨基酸序列见表22。

表22纳米抗体-Fc融合蛋白氨基酸序列

为了便于对比线性串联的二价纳米抗体2V15-9GS(SEQ ID NO：74)(在2V15-9GS基础上含有6个组氨酸的标签)，与融合蛋白V15-PPCP-Fc、V15-9GS-PPCP-Fc和V15-Fc在结合VEGFA方面的活性，在融合蛋白Fc段的C末端添加连接子(SGGS(SEQ ID NO：70))和6个组氨酸的标签(HHHHHH(SEQ ID NO：71))。单价纳米抗体-Fc融合蛋白的质粒构建过程中，用PCR方法分别扩增纳米抗体和含连接子和组氨酸标签的Fc，其中Fc片段的PCR模板来自于基因合成的Fc基因。采用两片段同源重组的方法，将纳米抗体和Fc整合到载体pCDNA3.1(+)上，所用酶切位点是：NheI和XbaI。融合蛋白的分泌肽为：METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：72)，其后融合目的蛋白序列。这些融合蛋白质粒测序成功后，进行质粒无内毒素提取，采用转染试剂聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，简称PEI，linear，MW＝25kDa，购自：Polysciences，货号：23966-1)，对293F悬浮细胞进行瞬转，转染后第4天或第5天收集细胞上清，开展Ni珠纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE分析，还原条件下蛋白单体分子量约为39kDa，分子量符合预期。部分单价纳米抗体-Fc融合蛋白纯化后的考染胶图如图15所示。

2V15-9GS(SEQ ID NO：74)

对于人源化后的抗体V1-SA1与Fc的融合蛋白(V1-SA1-Fc-m1)，V1-SA1与Fc-m1之间的连接子氨基酸序列为：EPKSA(SEQ ID NO：73)。采用上述方法构建表达质粒，但Fc的C末端不含额外氨基酸，即融合蛋白V1-SA1-Fc-m1含Fc标签，不含组氨酸标签。V1-SA1-Fc-m1的表达质粒瞬转293F细胞后，采用Protein A珠亲和纯化，蛋白洗脱时使用0.1M柠檬酸(pH3.0)洗脱目标蛋白，并快速中和，获得目标蛋白。

2、单价纳米抗体-Fc融合蛋白的活性检测

对纯化的单价纳米抗体-Fc融合蛋白开展VEGFA结合活性测试，ELISA实验方法同实施例2中的“1、候选抗体结合VEGFA的活性测试”。ELISA结果如图16所示，EC50如表23所示。

表23单价纳米抗体-Fc融合蛋白的VEGFA结合活性测试

由表中数据可知，测试的单价纳米抗体-Fc融合蛋白与线性串联的二价纳米抗体均有很强的结合VEGFA活性。

利用表面等离子共振(SPR)技术测试单价纳米抗体-Fc融合蛋白(V1-SA1-Fc-m1)与VEGFA的亲和力。采用Biacore 8K仪器(Cytiva)，以V1-SA1-Fc-m1为配体，捕获在Protein A芯片上，固定时，用流动相缓冲液HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％v/v Tween 20)稀释V1-SA1-Fc-m1到蛋白浓度为2μg/mL，其偶联量约为590RU。实验过程中，分析物为抗原VEGFA165(无标签，购自：金斯瑞，货号：Z03073)，其稀释液浓度是：25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM、0.390625nM。动力学分析时，融合蛋白与抗原VEGFA165的结合时间为180秒，解离时间为900秒，流速是30μL/min。在每个“结合-解离”循环结束之后，芯片经再生处理，再生条件是10mM甘氨酸盐酸盐(pH 1.5)。融合蛋白与抗原VEGFA165的结合解离曲线如图17所示。采用“1:1 binding”模型拟合获得结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)，见表24所示。

表24单价纳米抗体-Fc融合蛋白与VEGFA165的结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)

从SPR数据可以看出，单价纳米抗体-Fc融合蛋白V1-SA1-Fc-m1与VEGFA165具有很高的亲和力(KD＝0.148nM)。而在上述实施例2的“6、人源化抗体的活性检测”的表18和图12中，可知，单价纳米抗体V1-SA1与VEGFA165的KD为4.38nM。所以，单价纳米抗体与Fc融合后，与VEGFA165的亲和力，相比于未融合Fc提升了将近30倍，表明抗VEGFA抗体-Fc融合蛋白具有更强的靶点亲和力，和潜在更优的阻断VEGFA信号通路的药效。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

一种抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；其中，

CDR-H1的氨基酸序列包含SYTMG(SEQ ID NO：1)或与SYTMG(SEQ ID NO：1)具有至少80％同一性的氨基酸序列；

CDR-H2的氨基酸序列包含AISKGGYKYX₁X₂VSLEA(SEQ ID NO：2)或与AISKGGYKYX₁X₂VSLEA(SEQ ID NO：2)具有至少80％同一性的氨基酸序列；

CDR-H3的氨基酸序列包含TRAYGSSRLX₃LAX₄TYEY(SEQ ID NO：3)或与TRAYGSSRLX₃LAX₄TYEY(SEQ ID NO：3)具有至少80％同一性的氨基酸序列。
根据权利要求1所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，SEQ ID NO：2中的X₁X₂代表DS、DA、NT、DT、NA或NS；SEQ ID NO：3中的X₃代表R或K，X₄代表D、N、E或K。
根据权利要求1或2所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列包含下列任一组：

A)SEQ ID NO：1、4、9；

B)SEQ ID NO：1、5、9；

C)SEQ ID NO：1、6、10；

D)SEQ ID NO：1、4、11；

E)SEQ ID NO：1、7、12；

F)SEQ ID NO：1、6、11；

G)SEQ ID NO：1、4、10；

H)SEQ ID NO：1、5、12；

I)SEQ ID NO：1、4、12；

J)SEQ ID NO：1、8、12；

K)SEQ ID NO：1、33、34。
根据权利要求1-3任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段包括人源化序列，所述的人源化序列的改造位点位于非CDR区，优选的，所述的人源化序列的改造位点位于抗体的框架区和/或恒定区。
根据权利要求1-4任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段为纳米抗体、嵌合抗体、Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、分离的CDR区、F(ab')2片段、单结构域抗体、单链抗体分子或线性抗体。
根据权利要求1-5任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO：13-32、35-61、64-67中的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13-32、35-61、64-67中的任一氨基酸序列具有至少80％同一性。
根据权利要求1-6任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段结合人或猴VEGFA蛋白。
一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包含权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段。
根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白还包括除权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段外的其他抗VEGFA抗体或其抗原结合片段或其他靶点的抗体或其抗原结合片段或其他功能组分，

优选的，所述的其他功能组分包括但不限于血清白蛋白、细胞因子、转铁蛋白、支架蛋白、寡肽、寡肽聚合物、多肽、多肽聚合物、多糖、脂肪链、亲和素、生物素、链霉亲和素、毒素、药物、核酸、放射性核素及其标记物、PEG化成分或Fc片段中的一种或两种以上的组合；

优选的，所述的其他靶点选自IgG、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFR、FGF、FGFR、PlGF、PDGF、ANG2、Endoglin(CD105)、TGF、Integrin、Integrin受体、白细胞介素(如IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23等)、白细胞介素受体(如IL1R1、IL2Rα、IL3R、IL4Rα、IL6R、IL10R、IL12R、IL15Rα、IL17R、IL23R等)、PCSK9、TNF-α、TNFR、RANKL、补体蛋白C3、补体蛋白C5、G蛋白偶联受体(GPCR)、GLP1R、CD3、CD19、CD20、CD22、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD47、CD80、CD86、CD96、CD99、CD111、CD112、CD123、CD133、CD138、CD155、CD171、Claudin 18.2、OX40、ICOS、CTLA4、 4-1BB、TCR、B7-1、B7-2、BTLA、TIM-3、LAG3、Galectin-9、PD-L1、PD-L2、PD-1、TIGIT、EGFR、Her2、PSCA、CEA、FAP、EGFRVIII、BCMA、PSMA、CA125、EphA2、C-met、L1CAM、CS1、ROR1、EC、NY-ESO-1、MUC1、MUC16、mesothelin、LewisY、GPC3、GD2、EPG、DLL3或5T4。
一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的胞外结构域包含权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段。
一种免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段或权利要求10所述的嵌合抗原受体。
一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段或编码权利要求8-9任一所述的融合蛋白。
一种载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求12所述的核酸。
一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的载体。
一种权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将编码抗VEGFA抗体或其抗原结合片段的核酸或载体导入宿主细胞，然后诱导其表达。
一种权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段筛选的方法，其特征在于，所述的方法包括用人或猴VEGFA蛋白免疫羊驼。
一种治疗和/或诊断疾病的产品，其特征在于，所述的治疗和/或诊断疾病的产品包含下列任一种：

A)权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段；

B)权利要求8-9任一所述的融合蛋白；

C)权利要求10所述的嵌合抗原受体；

D)权利要求11所述的免疫细胞；

E)权利要求12所述的核酸；

F)权利要求13所述的载体；或，

G)权利要求14所述的宿主细胞。
一种权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、权利要求8-9任一所述的融合蛋白、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫细胞、权利要求12所述的核酸、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞在制备治疗和/或预防与VEGFA相关的疾病的产品中的应用，或者，在制备阻断VEGFA介导的血管内皮细胞增殖或抑制血管新生的产品中的应用，或者，在制备抗体药物偶联物或抗体诊断试剂盒或示踪剂中的应用。
一种VEGFA的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括将待检样品与权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段接触，然后检测VEGFA与抗VEGFA抗体或其抗原结合片段形成的复合物含量。
一种治疗和/或预防疾病的方法，其特征在于，所述的方法包括向个体施加权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、权利要求8-9任一所述的融合蛋白、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫细胞、权利要求12所述的核酸、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞或权利要求17所述的治疗和/或诊断疾病的产品。
一种治疗和/或预防疾病的方法，其特征在于，所述的方法包括使权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、权利要求8-9任一所述的融合蛋白、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫细胞、权利要求12所述的核酸、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞或权利要求17所述的治疗和/或诊断疾病的产品，与靶细胞接触。
根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的靶细胞选自表达VEGFA的细胞，例如心肌细胞、近端肾小管细胞、肝细胞、血管内皮细胞、颗粒细胞、特化的上皮细胞、间充质细胞、巨噬细胞、血小板、树突状细胞、活化的T细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜中的Muller细胞、星形胶质细胞、成骨细胞、支气管与肺泡上皮细胞、周细胞、血管平滑肌细胞、肌成纤维细胞、角质形成细胞、肾系膜细胞或肿瘤细胞等等。
根据权利要求20-22任一所述的方法，其特征在于，所述的疾病为与VEGFA信号通路相关的疾病；优选的，所述的疾病选自肿瘤、血管异常增生或眼科涉及血管新生的疾病(例如眼底血管病)。
一种阻断VEGFA介导的血管内皮细胞增殖或抑制血管新生的方法，其特征在于，所述的方法包括将血管内皮细胞与权利要求1-7任一所述的抗VEGFA抗体或其抗原结合片段、权利要求8-9任一所述的融合蛋白、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫细胞、权利要求12所述的核酸、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞或权利要求17所述的治疗和/或诊断疾病的产品接触。