CN119855908A - 植物调控元件及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了可用于调节植物中的基因表达的重组DNA多核苷酸和构建体以及它们的核苷酸序列。本发明还提供了包含所述重组DNA多核苷酸的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子，所述重组DNA多核苷酸可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。还提供了使用所述重组DNA多核苷酸和构建体以及所述包含所述重组DNA多核苷酸和构建体的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子的方法。

Description

植物调控元件及其用途

相关申请的引用

本申请要求2022年9月14日提交的美国临时申请号63/375,684的权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。

序列表的并入

包含在名为“MONS538WO_ST26.xml”的文件中的67,794字节(如在Microsoft中测量的)的序列表创建于2023年8月28日，并且通过电子递交同时提交(使用美国专利局专利中心)并且通过引用整体并入。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程领域。更具体地，本发明涉及可用于调节植物中的基因表达的DNA多核苷酸。

背景技术

调控元件是通过调节可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的转录来调控基因活性的遗传元件。此类元件可包括启动子、前导序列、内含子和3'非翻译区，并且可用于植物分子生物学和植物遗传工程领域。

发明内容

本节提供本公开的总体概述，并且不是其全部范围或其所有特征的全面公开。

本文提供了用于植物中的基因调控元件。若干个实施方案涉及包含调控元件的重组DNA多核苷酸。还提供了包含调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。在一个实施方案中，调控元件可操作地连接至可转录DNA多核苷酸。在某些实施方案中，可转录DNA多核苷酸对于调控DNA序列可以是异源的。因此，在特定的实施方案中，本文提供的调控元件DNA序列可以被定义为可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。若干个实施方案涉及使用调控元件以及制备和使用包含调控元件的重组DNA多核苷酸、以及包含与可转录DNA多核苷酸可操作地连接的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子的方法。

在一些实施方案中，提供了一种重组DNA多核苷酸，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少约85％序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及(c)SEQ ID NO:1-23中的任一个的片段，其中所述片段包含基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。在具体的实施方案中，重组DNA多核苷酸包含与SEQ ID NO:1-23中任一个的DNA序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的DNA序列。

在另一个方面，本文提供了包含重组DNA多核苷酸的转基因植物细胞，所述重组DNA多核苷酸包含选自由以下组成的组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少约85％序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及(c)SEQID NO:1-23中的任一个的片段，其中所述片段包含基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。在某些实施方案中，转基因植物细胞可以是单子叶植物细胞。在其他实施方案中，转基因植物细胞可以是双子叶植物细胞。

在另一个方面，本文进一步提供了一种包含重组DNA多核苷酸的转基因植物或其部分，所述重组DNA多核苷酸包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及c)SEQ ID NO:1-23中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。在具体实施方案中，转基因植物可以是包含重组DNA多核苷酸的任何世代的后代植物。还提供了包含重组DNA多核苷酸的转基因种子，所述转基因种子在生长时产生这种转基因植物。

若干个实施方案涉及一种生产商业产品的方法，其包括获得含有如本文所述的重组DNA多核苷酸(诸如包含选自SEQ ID NO:1-23的DNA序列的那些)的转基因植物或其部分，以及由其生产商业产品。在一个实施方案中，商业产品可以是种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和/或粗粉。

若干个实施方案涉及一种生产包含重组DNA多核苷酸的转基因植物的方法，所述重组DNA多核苷酸包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及c)SEQ IDNO:1-23中的任一个的片段，其中所述片段包含基因调控活性，所述方法包括用重组DNA多核苷酸转化植物细胞以产生转化的植物细胞并且由转化的植物细胞再生转基因植物。

序列简述

SEQ ID NO:1是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.08G282100:2的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:2是3'UTR，T-Gm.08G282100:2的DNA序列。

SEQ ID NO:3是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.02G215700:2的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:4是3'UTR，T-Gm.02G215700:2的DNA序列。

SEQ ID NO:5是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.11G155000:2的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:6是3'UTR，T-Gm.11G155000:2的DNA序列。

SEQ ID NO:7是可操作地连接至启动子的天然前导序列P-Gm.PSII:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:8是3'UTR，T-Gm.PSII:1的DNA序列。

SEQ ID NO:9是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.01G238800:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:10是3'UTR，T-Gm.01G238800:1的DNA序列。

SEQ ID NO:11是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.19G007700:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:12是3'UTR，T-Gm.19G007700:1的DNA序列。

SEQ ID NO:13是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.05G007100:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:14是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.16G089000:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:15是3'UTR，T-Gm.16G089000:1的DNA序列。

SEQ ID NO:16是可操作地连接至启动子的天然前导序列P-Gm.16G089000_trunc:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:17是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.15G057600:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:18是3'UTR，T-Gm.15G057600:1的DNA序列。

SEQ ID NO:19是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.07G156100:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:20是3'UTR，T-Gm.07G156100:1的DNA序列。

SEQ ID NO:21是可操作地连接至启动子的天然前导序列P-Gm.07G156100_trunc:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:22是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.17G020600:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:23是可操作地连接至启动子的天然前导序列，P-Gm.02G101100:1的启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:24是合成3'UTR，T-Zm.GST59.nno:1的DNA序列。

SEQ ID NO:25是用于β-葡糖醛酸苷酶(GUS)的植物表达的合成编码序列，其具有衍生自马铃薯光诱导，组织特异性St-LS1基因(GenBank登录号：X04753)的可加工内含子。

具体实施方式

现在将更全面地描述示例性实施方案。本文包括的描述和具体实例仅旨在用于说明的目的，并且不旨在限制本公开的范围。除非另有说明，否则术语应根据相关技术领域普通技术人员的常规用法来理解。

本文提供了在植物中具有基因调控活性的调控元件。这些调控元件的核苷酸序列提供为SEQ ID NO:1-23。这些调控元件能够影响植物组织中的可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的表达，因此调控转基因植物中的可操作地连接的转基因的基因表达。还提供了修饰、生产和使用含有所提供的调控元件的重组DNA多核苷酸的方法。还提供了包括转基因植物细胞、植物、植物部分和种子的组合物以及用于制备和使用所述组合物的方法，所述转基因植物细胞、植物、植物部分和种子含有包含如本文所述的一个或多个调控元件的重组DNA多核苷酸。

DNA多核苷酸

如本文所用，术语“DNA”或“DNA多核苷酸”是指从5'(上游)端至3'(下游)端读取的基因组或合成来源的双链DNA多核苷酸，即，脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或DNA多核苷酸。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA多核苷酸的核苷酸序列。本文使用的命名法对应于美国联邦规则汇编§1.822的标题37，并且在WIPO标准ST.26(2021)，附件I，表1和3的表中阐明。

如本文所用，“重组DNA多核苷酸”是包含在没有人为干预的情况下不会天然一起存在的DNA多核苷酸组合的DNA多核苷酸。例如，重组DNA多核苷酸可以是由相对于彼此异源的至少两个DNA多核苷酸组成的DNA多核苷酸、或包含与自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA多核苷酸、或包含合成DNA序列的DNA多核苷酸、或已通过遗传转化或基因编辑掺入宿主细胞的DNA中的DNA多核苷酸。

如本文所用，“合成核苷酸序列”或“人工核苷酸序列”是已知在自然界中不存在或不天然存在的核苷酸序列。优选地，合成核苷酸序列与天然序列共享很少或没有延伸同源性。在本上下文中，延伸同源性通常是指延伸超过连续序列的约25个核苷酸的100％序列同一性。合成核苷酸序列的一个实例是3′UTR，T-Zm.GST59.nno:1(SEQ ID NO:24)。

在本申请中提及“分离的DNA多核苷酸”或等效术语或短语旨在意指所述DNA多核苷酸是单独存在或与其他组合物组合存在，但不在其天然环境中的DNA多核苷酸。例如，只要在生物体的基因组的DNA中天然存在的核酸元件(诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等)位于生物体的基因组内并且在其天然存在的基因组内的位置处，所述元件就不被认为是“分离的”。然而，只要这些元件中的每一个以及这些元件的子部分不在生物体的基因组内并且不在其天然存在的基因组内的位置处，所述元件在本公开的范围内就是“分离的”。类似地，只要编码杀昆虫蛋白或该蛋白的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列不在编码所述蛋白的序列天然存在的细菌的DNA中，所述核苷酸序列就是分离的核苷酸序列。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，例如插入植物或细菌细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，无论其存在于用于转化细胞的质粒或类似结构中、存在于植物或细菌的基因组中或以可检测的量存在于衍生自植物或细菌的组织、后代、生物样品或商业产品中。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最佳比对的多肽序列相同的程度。通过比对两个序列(例如，参考序列和另一个序列)产生最佳序列比对，以使序列比对中具有适当内部核苷酸插入、缺失或缺口的核苷酸匹配数最大化。在一些实施方案中，提供为SEQ ID NO:1-23的DNA序列用作参考序列。

如本文所用，术语“百分比序列同一性”或“百分比同一性”或“％同一性”是同一性分数乘以100。与参考序列最佳比对的序列的“同一性分数”是最佳比对中的核苷酸匹配数，除以参考序列中的核苷酸总数，例如，整个参考序列全长中的核苷酸总数。因此，若干个实施方案涉及包含序列的DNA多核苷酸，所述序列在与本文提供为SEQ ID NO:1-23的参考序列最佳比对时，与参考序列具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、或至少约100％同一性。本文公开的序列可具有衍生其的参考序列，例如SEQ ID NOs:1-23中的任一个的活性。

调控元件

调控元件，诸如启动子、前导序列(也称为5'UTR)、增强子、内含子和转录终止区(或3'UTR)，在活细胞中基因的整体表达中发挥着不可或缺的作用。如本文所用，术语“调控元件”(或“表达元件”)是指具有基因调控活性的DNA多核苷酸。如本文所用，术语“基因调控活性”是指影响可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的表达的能力，例如通过影响可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的转录和/或翻译。在植物中发挥作用的调控元件，诸如启动子、前导序列、增强子、内含子和3'UTR，可用于通过遗传工程来修饰植物表型。

如本文所用，“调控表达元件组”或“EXP”序列可指代一组可操作地连接的调控元件，诸如增强子、启动子、前导序列和内含子。例如，调控表达元件组可包含例如与前导序列5'可操作地连接、与内含子序列5'可操作地连接的启动子。

调控元件可通过其基因表达模式来表征，例如，正性和/或负性效应诸如组成性表达或时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达，及其任何组合，以及通过定量或定性指示来表征。如本文所用，“基因表达模式”是可操作地连接的DNA多核苷酸转录成转录的RNA的任何模式。转录的RNA可被翻译以产生蛋白质或可提供反义或其他调控RNA，诸如双链RNA(dsRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)等。

如本文所用，术语“蛋白质表达”是转录的RNA翻译成蛋白质的任何模式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态性质，以及通过定量或定性指示来表征。

启动子可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的表达的调控元件。如本文所用，术语“启动子”总体上是指涉及识别和结合RNA聚合酶(例如，RNA聚合酶II)和其他蛋白质(诸如反式作用转录因子)以启动转录的DNA多核苷酸。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5'非翻译区域(5'UTR)分离。在一些实施方案中，启动子可操作地连接至前导序列的5'。启动子可以是合成产生或操纵的DNA多核苷酸。启动子也可以是嵌合的。嵌合启动子通过两个或更多个异源DNA多核苷酸的融合来产生。在一些实施方案中，启动子作为SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23或其片段或变体存在。在一些实施方案中，如本文所述的要求保护的DNA多核苷酸及其任何片段或变体被进一步定义为包含启动子活性，即能够在宿主细胞中(诸如在转基因植物细胞中)充当启动子。在其他具体的实施方案中，片段可被定义为表现出延伸其的起始启动子分子所具有的启动子活性，或片段可包含“最小启动子”，其提供基础水平的转录并且包含用于识别和结合RNA聚合酶II复合物以启动转录的TATA盒或等效DNA序列。

在一个实施方案中，提供了本文公开的启动子序列的片段。启动子片段可包含如上所述的启动子活性，并且可单独使用或与其他启动子和启动子片段组合使用，诸如在构建嵌合启动子时，或者与其他表达元件和表达元件片段组合使用。在一些实施方案中，提供了启动子的片段，其包含具有如本文公开的启动子活性的DNA多核苷酸的至少约50个、至少约75个、至少约95个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约175个、至少约200个、至少约225个、至少约250个、至少约275个、至少约300个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约900个、或至少约1000个连续核苷酸或更长。在一些实施方案中，提供了启动子的片段，其包含DNA序列的至少约50个、至少约75个、至少约95个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约175个、至少约200个、至少约225个、至少约250个、至少约275个、至少约300个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个、至少约1050个、至少约1100个、或至少约1150个连续核苷酸，所述DNA序列包含TATA盒并且与具有如本文公开的启动子活性的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23中的任一个具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、或至少约100％同一性。本文公开的片段可具有衍生其的参考序列的活性，例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23中的任一个的活性。

用于由起始启动子多核苷酸产生此类片段的方法是本领域众所周知的。

衍生自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23的启动子元件(诸如内部或5'缺失)的组合物例如可使用本领域已知的方法产生以改善或改变表达，包括通过去除对表达具有正面或负面影响的元件；复制对表达具有正面或负面影响的元件；和/或复制或去除对表达具有组织或细胞特异性影响的元件。衍生自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23的启动子元件的组合物可用于例如制备增强子元件，所述启动子元件包含3'缺失，其中TATA盒元件或其等效序列和下游序列被去除。可进一步删除以去除对表达具有正面或负面；组织特异性；细胞特异性；或时间特异性(诸如但不限于昼夜节律)影响的任何元件。如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23提供任何启动子元件以及由其衍生的片段或增强子可用于制备嵌合转录调控元件组合物。

可分析如本文所述的启动子或启动子片段是否存在已知的启动子元件，例如DNA序列特性，诸如TATA盒和其他已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可以使用此类已知的启动子元件的鉴定来设计与原始启动子具有类似表达模式的启动子的变体。

如本文所用，术语“前导序列”是指从基因的非翻译5'区(5'UTR)分离的DNA多核苷酸并且总体上定义为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。替代地，前导序列可以是合成产生或操纵的DNA元件。前导序列可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的表达的5'调控元件。前导多核苷酸可与异源启动子或与其原生启动子一起使用。若干个实施方案涉及存在于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23中的前导序列或其片段或变体。在具体的实施方案中，此类DNA序列可被定义为能够充当宿主细胞(包括例如转基因植物细胞)中的前导序列。在一个实施方案中，此类序列被解码为包含前导序列活性。在一些实施方案中，提供了前导序列的片段，其包含DNA序列的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、或至少约95个连续核苷酸，所述DNA序列与具有如本文公开的前导序列活性的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23中包含的前导序列具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、或至少约100％同一性。如本文所公开的前导序列可具有衍生其的参考序列的活性，例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23中的任一个的活性。

包含在SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23中的前导序列(也称为5'UTR)可包含调控元件，或可采用可以对可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的转录或翻译具有影响的二级结构。包含在SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23内的前导序列或其片段或变体可用于制备影响可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的转录或翻译的嵌合调控元件。

如本文所用，术语“内含子”是指可从基因分离或鉴定的DNA多核苷酸并且可总体上定义为在翻译之前的信使RNA(mRNA)处理期间剪接的区域。替代地，内含子可以是合成产生或操纵的DNA元件。内含子可含有实现可操作地连接的基因的转录的增强子元件。内含子可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的表达的调控元件。构建体可包含内含子，并且内含子相对于可转录DNA多核苷酸可以是异源的或可以不是异源的。内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子。

在植物中，相对于缺乏内含子的构建体，在基因构建体中包含一些内含子导致mRNA和蛋白质积累增加。这种效应被称为基因表达的“内含子介导的增强”(IME)。已知刺激植物中的表达的内含子已在玉米基因(例如，tubA1、Adh1、Sh1和Ubi1)、水稻基因(例如，tpi)和双子叶植物基因(例如，rbcS)中得到鉴定，所述双子叶植物基因如来自矮牵牛花(petunia)(例如，rbcS)、马铃薯(例如，st-ls1)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)(例如，ubq3和pat1)的那些。研究表明，内含子剪接位点内的缺失或突变会降低基因表达，表明IME可能需要剪接。然而，双子叶植物中的IME已通过拟南芥pat1基因剪接位点内的点突变得到证实。在一种植物中多次使用同一内含子已经显示表现出缺点。在那些情况下，有必要收集基本控制元件来构建适当的重组DNA元件。

如本文所用，术语“3'转录终止多核苷酸”、“3'非翻译区”或“3'UTR”是指在mRNA的3'部分的非翻译区的转录期间所使用的DNA多核苷酸。mRNA的3'非翻译区(也称为polyA尾部)可通过特异性切割和3'聚腺苷酸化生成。3'UTR可以可操作地连接至可转录DNA多核苷酸并且位于其下游，并且可包括聚腺苷酸化信号和能够影响转录、mRNA加工或基因表达的其他调控信号。polyA尾部被认为在mRNA稳定性和翻译起始中发挥作用。3'转录终止多核苷酸的实例为胭脂碱合酶3'区、小麦hsp17 3'区、豌豆rubisco小亚基3'区、棉花E6 3'区和薏苡仁(coixin)3'UTR。

3'UTR通常有益于特异性DNA多核苷酸的重组表达。弱3'UTR有可能生成通读，这可能会影响位于相邻表达盒中的DNA多核苷酸的表达。转录终止的适当控制可防止通读位于下游的DNA序列(例如，其他表达盒)，并且可进一步允许RNA聚合酶的有效再循环以改善基因表达。转录的有效终止(从DNA中释放RNA聚合酶II)是重新启动转录的先决条件，从而直接影响总体转录水平。转录终止后，成熟的mRNA从合成位点释放，并且模板被转运至细胞质。真核mRNA在体内以poly(A)形式积累，使得很难通过常规方法检测转录终止位点。然而，很难通过生物信息学方法预测功能性的和高效的3'UTR，因为没有保守的DNA序列允许轻松预测有效的3'UTR。

从实际角度来看，表达盒中使用的3'UTR具有以下特性通常是有益的。第一，3'UTR应当能够高效且有效地终止可转录DNA多核苷酸(例如，转基因)的转录，并且防止转录物通读任何相邻的DNA序列，所述相邻的DNA序列可包含另一个表达盒，如在植物转化期间多个表达盒存在于一个转运DNA(T-DNA)上或存在于已经被插入T-DNA的相邻染色体DNA上的情况下。第二，3'UTR不应导致用于驱动可转录DNA多核苷酸表达的启动子、前导序列、增强子和内含子所赋予的转录活性降低。最后，在植物生物技术中，3'UTR通常用于引发从转化的植物中提取的逆转录RNA的扩增反应，并且用于：(1)评估表达盒整合到植物染色体中之后的转录活性或表达；(2)评估植物DNA内的插入的拷贝数；以及(3)评估育种后的所得种子的接合性。3′UTR还用于从转化植物中提取的DNA的扩增反应，以表征插入盒的完整性。与调控元件(例如，作为SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23存在的调控元件)结合使用的3′UTR作为SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、15、18、20和24存在。

如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用调控元件，也被称为顺式元件，其赋予总体表达模式的方面，但是通常不足以单独驱动可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的转录。不同于启动子，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等效DNA序列。启动子或启动子片段可天然地包含一个或多个影响可操作地连接的DNA序列的转录的增强子元件。增强子元件还可融合至启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的总体调节的方面。

据信许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白质且/或影响DNA拓扑结构，产生选择性地允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或者促进转录起始位点处的双螺旋的选择性打开的局部构象。增强子元件可起到与调控转录的转录因子结合的作用。一些增强子元件结合多于一个转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与多于一个增强子结构域相互作用。增强子元件可以通过多种技术来鉴定，包括删除分析，即从启动子的5'端或内部删除一个或多个核苷酸；使用DNase I足迹法的DNA结合蛋白分析、甲基化干扰、电移位切测定、通过连接介导的聚合酶链反应(PCR)进行的体内基因组足迹法和其他常规测定，或通过使用已知的顺式元件基序或增强子元件作为靶序列或靶基序，使用常规DNA序列比较方法(诸如BLAST)进行DNA序列类似性分析。增强子结构域的精细结构可通过一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或通过本领域已知的其他常规方法来进一步研究。增强子元件可通过化学合成或通过从包含此类元件的调控元件分离来获得，并且它们可与含有有用的限制性酶位点的附加侧翼核苷酸一起合成以促进后续操作。因此，本文考虑了根据本文公开的方法用于调节可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的表达的增强子元件的设计、构建和使用。增强子可衍生自作为SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23存在的启动子。

如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一DNA多核苷酸融合至第二DNA多核苷酸而产生的单个DNA多核苷酸，其中第一DNA多核苷酸和第二DNA多核苷酸通常都不会以该构型(即，彼此融合)存在。因此，嵌合DNA多核苷酸是自然界中原本正常不存在的新的DNA多核苷酸。如本文所用，术语“嵌合启动子”是指通过DNA多核苷酸的这种操作产生的启动子。嵌合启动子可组合两个或更多个DNA片段，例如启动子与增强子元件的融合。因此，本文考虑了根据本文公开的方法用于调节可操作地连接的可转录DNA多核苷酸的表达的嵌合启动子的设计、构建和使用。

嵌合调控元件可被设计成包含可通过本领域已知的各种方法可操作地连接的各种组成元件，所述方法诸如限制酶消化和连接、不依赖于连接的克隆、扩增期间PCR产物的模块化组装、或调控元件的直接化学合成、以及本领域已知的其他方法。所得的各种嵌合调控元件可包含相同的组成元件或其变体，但在包含一个或多个允许组成部分可操作地连接的连接DNA序列的一个或多个DNA序列方面有所不同。在一些实施方案中，提供为SEQ IDNO:1-23的DNA序列可提供调控元件参考序列，其中包含参考序列的组成元件可通过本领域已知的方法连接并且可包含一个或多个核苷酸的取代、缺失、和/或插入或在细菌和植物细胞转化中自然存在的突变。

如本文所用，术语“变体”是指组成与第一DNA多核苷酸类似但不相同的第二DNA多核苷酸(诸如调控元件)，并且其中第二DNA多核苷酸仍然保持第一DNA多核苷酸的一般功能性，例如，相同或类似的表达模式，例如通过或多或少等效的转录活性。变体可以是第一DNA多核苷酸的缩短或截短型式或第一DNA多核苷酸的序列的改变型式，诸如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代或插入的DNA多核苷酸。“变体”还可涵盖具有核苷酸序列的调控元件，所述核苷酸序列包含参考序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，其中衍生的调控元件具有与对应的亲本调控多核苷酸相比或多或少或同等的转录或翻译活性。调控元件“变体”还将涵盖由细菌和植物细胞转化中天然存在的突变产生的变体。在一些实施方案中，提供为SEQ ID NO:1-23的多核苷酸序列可用于产生变体，所述变体与原始调控元件的DNA序列组成类似但不相同，同时仍保持原始调控元件的一般功能性，例如相同或类似的表达模式。鉴于本公开，此类变体的产生完全在本领域的普通技能范围内并且在本文考虑的范围内。

本文所述的修饰、复制或缺失对特定转基因的期望表达方面的功效可以在稳定和瞬时的植物测定(诸如本文的工作实施例中描述的那些)中凭经验进行测试，以便验证结果，所述结果可根据在起始DNA多核苷酸中进行的改变和改变的目标而变化。

构建体

如本文所用，术语“构建体”意指任何重组DNA多核苷酸，诸如质粒、粘粒、病毒、噬菌体、或线性或环状DNA或RNA多核苷酸，其衍生自任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包含DNA多核苷酸，其中至少一个DNA多核苷酸已经以功能性操作方式连接(即，可操作地连接)至另一个DNA多核苷酸。如本文所用，术语“载体”意指可用于转化目的(即，将异源DNA或RNA引入宿主细胞中)的任何构建体。构建体通常包含一个或多个表达盒。如本文所用，“表达盒”是指至少包含可操作地连接至一个或多个调控元件(通常至少启动子和3'UTR)的可转录DNA多核苷酸的重组DNA多核苷酸。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一DNA多核苷酸与第二DNA多核苷酸连接，其中第一和第二DNA多核苷酸如此排列，使得第一DNA多核苷酸影响第二DNA多核苷酸的功能。两个DNA多核苷酸可以是或可以不是单个连续DNA多核苷酸的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，如果启动子调节细胞中的感兴趣的可转录DNA多核苷酸的转录，则启动子与所述可转录DNA多核苷酸可操作地连接。例如，当前导序列能够影响DNA序列的转录或翻译时，其可操作地连接至DNA序列。

在一些实施方案中，如本文所述与可转录DNA多核苷酸可操作地连接的一种或多种调控元件提供在双肿瘤诱导(Ti)质粒边界构建体中，所述构建体具有包含T-DNA的从根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区，所述一种或多种调控元件与由根瘤农杆菌细胞提供的转运分子一起，允许T-DNA整合到植物细胞基因组中(参见，例如，美国专利6,603,061)。构建体还可含有在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA区段，例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)复制起点，诸如ori322，广泛宿主范围复制起点，诸如oriV或oriRi，以及选择性标志物的编码区，诸如编码赋予对大观霉素(spectinomycin)或链霉素(streptomycin)或庆大霉素(Gm，Gent)选择性标志物基因的抗性的Tn7氨基糖苷类腺苷酸转移酶(aadA)的Spec/Strp。对于植物转化，宿主细菌菌株通常是根癌农杆菌(A.tumefaciens)ABI、C58或LBA4404，然而植物转化领域技术人员已知的其他菌株也可以发挥作用。

以使得可转录DNA多核苷酸转录成翻译并表达为蛋白质的功能性mRNA多核苷酸的方式用于将构建体组装并引入细胞中的方法是本领域已知的。用于制备和使用构建体和宿主细胞的组合物和方法是本领域技术人员众所周知的。可用于在植物中表达核酸的典型载体是本领域众所周知的，并且包括衍生自根癌农杆菌的Ti质粒的载体和pCaMVCN转运控制载体。

构建体中可以包含各种调控元件，包括本文提供的那些中的任一种。任何此类调控元件可以与其他调控元件组合提供。可设计或修改此类组合以产生期望的调控特征。在一个实施方案中，构建体可包含至少一个与可转录DNA多核苷酸可操作地连接的调控元件，所述可转录DNA多核苷酸与3'UTR可操作地连接。

在一些实施方案中，构建体可包括本文提供的或本领域已知的任何启动子或前导序列。例如，启动子(例如，SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23或其片段或变体)可以可操作地连接至异源非翻译5'前导序列，诸如衍生自热休克蛋白基因的前导序列。或者，前导序列(例如，包含或存在于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23或其片段或变体中的前导序列)可以可操作地连接至异源启动子，诸如花椰菜花叶病毒35S转录物启动子。

表达盒还可以包括转运肽编码序列，其编码可用于可操作地连接的蛋白质的亚细胞靶向的肽，特别是亚细胞靶向至叶绿体、白色体或其他质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡；或细胞外位置。许多叶绿体定位蛋白作为前体由核基因表达，并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与以下相关的那些：核酮糖-1,5,-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、光捕获复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F和烯醇式丙酮酸莽草酸磷酸合酶(EPSPS)。叶绿体转运肽描述于例如美国专利号7,193,133中。已经证明，非叶绿体蛋白可通过与编码非叶绿体蛋白的转基因可操作地连接的异源CTP的表达而靶向叶绿体。

可转录DNA多核苷酸

如本文所用，术语“可转录DNA多核苷酸”是指能够转录成RNA的任何DNA多核苷酸，包括但不限于具有蛋白质编码序列(例如，mRNA)的那些多核苷酸、编码指导RNA(gRNA)的那些多核苷酸、和产生具有可用于基因抑制的序列的RNA(例如，siRNA、miRNA和dsRNA)的那些多核苷酸。DNA多核苷酸的类型可包括但不限于来自相同植物的DNA多核苷酸、来自另一种植物的DNA多核苷酸、来自不同生物体的DNA多核苷酸、或合成DNA多核苷酸(诸如含有基因的反义信息的DNA多核苷酸)或编码人工、合成或以其他方式修饰型式的转基因的DNA多核苷酸。用于掺入到如本文所述的构建体中的可转录DNA多核苷酸的实例包括，例如，来自与掺入DNA多核苷酸的物种不同的物种的DNA多核苷酸或基因，或衍生自或存在于相同物种中，但通过遗传工程方法而不是经典育种技术掺入到受体细胞中的基因。

如本文所用，术语“异源可转录DNA多核苷酸”是指相对于与其可操作地连接的一个或多个调控元件是异源的可转录DNA多核苷酸。

“转基因”是指至少相对于其在宿主细胞基因组中的位置对于宿主细胞异源的可转录DNA多核苷酸和/或在当前或任何以前世代的细胞中人工掺入宿主细胞基因组中的可转录DNA多核苷酸。

调控元件，诸如启动子(例如，SEQ ID NOs:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、21、22和23或其片段或变体)，可以可操作地连接至相对于调控元件异源的可转录DNA多核苷酸。如本文所用，术语“异源”是指两个或更多个DNA多核苷酸(或核苷酸序列或DNA序列)的组合，这种组合通常不存在于自然界中。例如，两个DNA多核苷酸(或核苷酸序列或DNA序列)可衍生自不同物种且/或两个DNA多核苷酸(或核苷酸序列或DNA序列)可衍生自不同基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，如果这种组合通常不存在于自然界中，即，可转录DNA多核苷酸并非天然地与调控序列可操作地连接，则调控元件相对于可操作地连接的可转录DNA多核苷酸是异源的。

可转录DNA多核苷酸总体上可以是期望转录物的表达的任何DNA多核苷酸。转录物的这种表达可导致所得mRNA的翻译，从而导致蛋白质表达。或者，例如，可转录DNA多核苷酸可被设计为最终导致特定基因或蛋白质的表达减少。在一个实施方案中，这可通过使用沿反义方向取向的可转录DNA多核苷酸来实现。本领域普通技术人员熟悉使用这种反义技术。任何基因都可以此方式负性调控，并且在一个实施方案中，可转录DNA多核苷酸可被设计成通过dsRNA、siRNA或miRNA的表达来抑制特定基因。

因此，一个实施方案提供了一种包含调控元件(诸如提供为SEQ ID NO:1-23的那些)的重组DNA多核苷酸，所述调控元件可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸，使得当构建体整合到植物细胞或转基因植物细胞的基因组中时，以期望的水平或以期望的模式调节可转录DNA多核苷酸的转录。在一个实施方案中，可转录DNA多核苷酸包含基因的蛋白质编码区，并且在另一个实施方案中，可转录DNA多核苷酸包含基因的反义区。

具有农艺价值的基因

可转录DNA多核苷酸可包含具有农艺价值的基因。如本文所用，术语“具有农艺价值的基因”是指当在特定植物组织、细胞或细胞类型中表达时赋予期望特性的可转录DNA多核苷酸。具有农艺价值的基因的产物可以在植物内发挥作用，以便对植物形态、生理学、生长、发育、产量、谷物组成、营养状况、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性产生影响，或者可充当以植物为食的害虫的饮食中的杀虫剂。在一个实施方案中，将调控元件(诸如提供为SEQ ID NO:1-23的那些)掺入到构建体中，使得调控元件可操作地连接至作为具有农艺价值的基因的可转录DNA多核苷酸。在含有这种构建体的转基因植物中，具有农艺价值的基因的表达可赋予有益的农艺性状。有益的农艺性状可包括例如但不限于除草剂耐受性、昆虫防治、改良的产量、疾病抗性、病原体抗性、改良的植物生长和发育、改良的淀粉含量、改良的油含量、改良的脂肪酸含量、改良的蛋白质含量、改良的水果成熟度、增强的动物和人类营养、生物聚合物生产、环境压力抗性、药用肽、改进的加工质量、改进的风味、杂交种子生产效用、改进的纤维生产、加强的碳封存和/期望的生物燃料生产。

本领域已知的具有农艺价值的基因的实例包括以下的基因：除草剂抗性(美国专利号6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；和5,463,175)、增加的产量(美国专利号USRE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098；和5,716,837)、昆虫防治(美国专利号6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658；5,880,275；5,763,245；和5,763,241)、真菌疾病抗性(美国专利号6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；和6,506,962)、病毒抗性(美国专利号6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；和5,304,730)、线虫抗性(美国专利号6,228,992)、细菌疾病抗性(美国专利号5,516,671)、植物生长和发育(美国专利号6,723,897和6,518,488)、淀粉生产(美国专利号6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)、改良的油生产(美国专利号6,444,876；6,426,447；和6,380,462)、高油生产(美国专利号6,495,739；5,608,149；6,483,008；和6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美国专利号6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；和6,459,018)、高蛋白生产(美国专利号6,380,466)、水果成熟(美国专利号5,512,466)、增强的动物和人类营养(美国专利号6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605；和6,171,640)、生物聚合物(美国专利号USRE37,543；6,228,623；和5,958,745和6,946,588)、环境压力抗性(美国专利号6,072,103)、药用肽和可分泌肽(美国专利号6,812,379；6,774,283；6,140,075；和6,080,560)、改进的加工性状(美国专利号6,476,295)、改进的消化性(美国专利号6,531,648)、低棉子糖(美国专利号6,166,292)、工业酶生产(美国专利号5,543,576)、改进的风味(美国专利号6,011,199)、固氮作用(美国专利号5,229,114)、杂交种子生产(美国专利号5,689,041)、纤维生产(美国专利号6,576,818；6,271,443；5,981,834；和5,869,720)和生物燃料生产(美国专利号5,998,700)。

或者，具有农艺价值的基因可以通过编码引起内源基因的基因表达的靶向调节的RNA来影响上述植物特性或表型，例如通过反义RNA(参见，例如美国专利5,107,065)；抑制性RNA(“RNAi”)，包括通过miRNA、siRNA、反式作用siRNA和定相sRNA介导的机制来调节基因表达，例如，如已公开的申请U.S.2006/0200878和U.S.2008/0066206以及美国专利申请11/974,469中所述)；或共抑制介导的机制。RNA还可以是经工程化以裂解期望的内源mRNA产物的催化RNA(例如，核酶或核糖开关；参见例如U.S.2006/0200878)。以使得转录成能够引起基因抑制的分子的方式用于构建构建体并将其引入细胞中的方法是本领域已知的。

选择性标志物

编码选择性标志物的可转录DNA多核苷酸也可与调控元件(诸如提供为SEQ IDNO:1-23的那些)一起使用。如本文所用，术语“选择性标志物”是指其在转基因植物、组织或细胞中的表达或表达的缺乏可以一些方式进行筛选或评分的任何可转录DNA多核苷酸。可选择标志物(也称为报告基因)及其相关选择和筛选技术是本领域已知的，并且包括但不限于，编码β-葡糖醛酸苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白质、和赋予除草剂耐受性的蛋白质的可转录DNA多核苷酸。报告转基因的实例提供为SEQ ID NO:25。

使用报告基因测定(或报告转基因测定)以确定调控元件的基因调控活性(或表达谱)是本领域众所周知的(例如，Clarke等人.,Molecular Biology的第4单元,第21章,第3版,Academic Press,Elsevier Inc.,2019)。如本文所用，术语“报告基因测定”是指首先使用报告基因(诸如编码β-葡糖醛酸苷酶(GUS)蛋白的转基因)作为可操作地连接至特定调控元件的异源可转录DNA多核苷酸以确定后者(例如启动子或3'UTR)的基因调控活性(或表达谱)的方法。在随后的报告基因测定中，可使用定性和定量GUS分析以评价转化的植物中的所选植物器官和/或组织中调控元件的基因调控活性(或表达谱)。应当理解，通过使用报告基因测定(例如GUS测定)确定的调控元件(例如启动子或3'UTR)的基因调控活性(或表达谱)与GUS之外的其他可操作地连接的可转录DNA分子相同或基本相同或基本类似。在一个实施方案中，其他可操作地连接的可转录DNA分子可以是具有农艺价值的基因，包括但不限于本文所述的那些。

基因组编辑

若干个实施方案涉及包含表达盒的重组DNA构建体，所述表达盒包含与SEQ IDNO:1-23或其片段具有至少约85％序列同一性、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性或更高序列同一性的序列，所述SEQ ID NO:1-23或其片段可操作地连接至编码用于进行基因组修饰的位点特异性基因组修饰酶和/或任何相关蛋白的异源DNA序列。这些一个或多个位点特异性基因组修饰酶表达盒可与用于模板编辑的供体模板存在于同一分子或载体中(顺式)，或存在于单独的分子或载体中(反式)。若干种编辑方法是本领域已知的，其涉及修饰基因组DNA的不同序列特异性基因组修饰酶(或蛋白质和/或指导RNA的复合物)。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶通过在期望的基因组位点或基因座处诱导双链断裂(DSB)或切口对基因组进行修饰。在一些实施方案中，在修复由基因组修饰酶引入的DSB或切口的过程期间，供体模板DNA可以在DSB或切口的位点处被整合到基因组中。在一些实施方案中，在修复由基因组修饰酶引入的DSB或切口的过程期间，可以将插入或缺失突变(插入缺失)引入到基因组中。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶包含胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶包含腺嘌呤脱氨酶。在本公开中，位点特异性基因组修饰酶包括核酸内切酶、重组酶、转座酶、脱氨酶、解旋酶、逆转录酶及其任何组合。

若干个实施方案涉及如本文所述的基因调控元件，其可操作地连接至编码基因组编辑系统的一种或多种组分的异源可转录DNA分子。基因组编辑系统可用于将一个或多个插入、缺失、取代、碱基修饰、易位或倒位引入到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至编码序列特异性DNA结合结构域(诸如CRISPR-Cas效应蛋白、锌指蛋白或转录激活因子(TAL)蛋白)的异源可转录DNA多核苷酸。在一些实施方案中，序列特异性DNA结合结构域可以是融合蛋白。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至编码CRISPR-Cas效应蛋白的异源可转录DNA多核苷酸。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白选自I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、III型CRISPR-Cas系统、IV型CRISPR-Cas系统、V型CRISPR-Cas系统或VI型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至编码指导RNA的异源可转录DNA多核苷酸。如本文所用，“指导RNA”或“gRNA”是指识别靶DNA序列并且将CRISPR效应蛋白引导或“指导”至靶DNA序列的RNA。指导RNA包含与靶DNA互补的区域(称为crRNA)和结合CRISPR效应蛋白的区域(称为tracrRNA)。指导RNA可以是单个RNA分子(sgRNA)或两个单独的RNA分子(2片gRNA(2-piece gRNA))。在一些实施方案中，gRNA可进一步包含逆转录酶的RNA模板(pegRNA)。

若干个实施方案涉及如本文所述的基因调控元件，其可操作地连接至编码CRISPR-Cas基因组编辑系统的一种或多种组分的异源可转录DNA多核苷酸，所述CRISPR-Cas基因组编辑系统包含CRISPR-Cas效应蛋白。CRISPR-Cas效应蛋白的实例包括但不限于Cas9、C2c1、C2c3、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas12i、Cas12g、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3”、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)、Csf5、Cas14a、Cas14b和Cas14c效应蛋白。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至在其核酸酶活性位点(例如，RuvC、HNH和/或NUC结构域)中包含突变的CRISPR-Cas效应蛋白。在其核酸酶活性位点中具有突变并因此不再包含核酸酶活性的CRISPR-Cas效应蛋白通常被称为“死的”，例如dCas。在一些实施方案中，与不具有突变的相同CRISPR-Cas效应蛋白相比，在其核酸酶活性位点中具有突变的CRISPR-Cas效应蛋白结构域或多肽可以具有受损的活性或降低的活性。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至在其核酸酶活性位点中具有突变的CRISPR-Cas效应蛋白，以生成可操作地连接至逆转录酶的切口酶活性。

细胞转化

还提供了产生转化细胞和植物的方法，所述转化细胞和植物包含与可转录DNA多核苷酸可操作地连接的一种或多种调控元件，诸如提供为SEQ ID NO:1-23的那些。

术语“转化”是指将DNA多核苷酸引入受体宿主中。如本文所用，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或后代。特别感兴趣的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、秧苗、胚胎和花粉。

如本文所用，术语“转化”是指已经向其中引入外来DNA多核苷酸(诸如如本文所述的构建体)的细胞、组织、器官或生物体。引入的DNA多核苷酸可被整合到受体细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得引入的DNA多核苷酸被随后的后代继承。“转基因”或“转化的”细胞或生物体也包括细胞或生物体的后代以及由杂交中使用这种转基因植物作为亲代并且表现由外部DNA分子的存在引起的改变表现型的育种计划中产生的后代。引入的DNA多核苷酸还可瞬时引入到受体细胞中，使得引入的DNA多核苷酸不被随后的后代继承。术语“转基因”是指含有一个或多个异源DNA多核苷酸的细菌、真菌或植物。

存在许多本领域技术人员众所周知的用于将DNA多核苷酸引入到植物细胞中的方法。所述方法通常包括选择合适的宿主细胞、用载体转化宿主细胞、以及获得经转化的宿主细胞的步骤。通过将植物构建体引入到植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括任何众所周知的和已证明的方法。合适方法包括但不限于细菌感染(例如，农杆菌)、二元BAC载体、直接递送DNA(例如，通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA吸收、电穿孔、使用碳化硅纤维的搅拌和DNA涂布粒子的加速)、基因编辑(例如，CRISPR-Cas系统)等。

宿主细胞可以是任何细胞或生物体，诸如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞和转化的细胞可包括来自作物植物的细胞。在进一步具体的实施方案中，宿主细胞和转化的细胞可包括来自大豆植物的细胞。

随后可由如本文所述的转基因植物细胞再生转基因植物。使用常规育种技术或自花授粉，可由这种转基因植物产生种子。这种种子和由这种种子生长的所得后代植物将含有如本文所述的重组DNA多核苷酸(诸如包含选自SEQ ID NO:1-23的序列的重组DNA分子)，并因此将是转基因的。

转基因植物可以自花授粉以提供纯合转基因植物(对于如本文所述的重组DNA分子是纯合的)的种子，或者与非转基因植物或不同的转基因植物杂交以提供杂合转基因植物(对于如本文所述的重组DNA分子是杂合的)的种子。此类纯合和杂合转基因植物在本文中均称为“后代植物”。后代植物是起源于原始转基因植物并且含有如本文所述的重组DNA多核苷酸的转基因植物。可收获使用转基因植物产生的种子并将其用于培育转基因植物的世代，即包含如本文所述的重组DNA分子并表达具有农艺价值的基因的后代植物。通常用于不同作物的育种方法的描述可见于若干本参考书之一，参见，例如，Allard,Principles ofPlant Breeding,John Wiley&Sons,NY,U.of CA,Davis,CA,50-98(1960)；Simmonds,Principles of Crop Improvement,Longman,Inc.,NY,369-399(1979)；Sneep和Hendriksen,Plant breeding Perspectives,Wageningen(编辑),Center forAgricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr,Soybeans:Improvement,Production and Uses,第2版,Monograph,16:249(1987)；Fehr,Principles of VarietyDevelopment,Theory and Technique,(第1卷)和Crop Species Soybean(第2卷),IowaState Univ.,Macmillan Pub.Co.,NY,360-376(1987)。

可分析经转化的植物中是否存在一个或多个感兴趣的基因以及由调控元件(诸如提供为SEQ ID NO:1-23的那些)赋予的表达水平和/或谱。本领域技术人员知道可用于分析转化的植物的多种方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹或Northern印迹、基于PCR的方法、生化分析、表型筛选方法、现场评估和免疫诊断测定。可转录DNA多核苷酸的表达可使用(Applied Biosystems,Foster City,CA)试剂和如制造商所述的方法进行测量，并且使用测试矩阵确定PCR循环时间。或者，可使用(Third Wave Technologies,Madison,WI)试剂和如制造商所述的方法来评价转基因表达。

还提供了如本文所述的植物的部分。植物部分包括但不限于叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。植物部分可以是存活的、非存活的、可再生的和/或不可再生的。还提供了转化的植物细胞，其包含如本文所述的DNA多核苷酸，诸如提供为SEQ ID NO:1-23的那些。转化的或转基因植物细胞包括可再生和/或不可再生的植物细胞。

由含有如本文所述的重组DNA多核苷酸(诸如提供为SEQ ID NO:1-23的那些)的转基因植物或其部分产生的商业产品。在一些实施方案中，商业产品含有可检测量的DNA，所述DNA包含选自由SEQ ID NO:1-23或其片段或变体组成的组的DNA序列。如本文所用，“商业产品”是指包含衍生自转基因植物、种子、植物细胞或植物部分的材料的任何组合物或产物，所述转基因植物、种子、植物细胞或植物部分含有如本文所述的重组DNA多核苷酸，诸如提供为SEQ ID NO:1-23的那些。商业产品包括但不限于加工的种子、谷物、植物部分和粗粉。考虑了包含可检测量的DNA的商业产品，所述DNA对应于如本文所述的重组DNA分子，诸如提供为SEQ ID NO:1-23的那些。样品中这种DNA的一种或多种的检测可用于确定商业产品的含量或来源。可使用检测DNA多核苷酸的任何标准方法，包括本文公开的检测方法。

所提供的定义和方法定义了本公开并指导本领域普通技术人员实践本公开。除非另有说明，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。分子生物学中常用术语和方法的定义也可见于Clark等人,Molecular Biology,第3版,Academic Press,Elsevier Inc.,2019；Alberts等人,Molecular Biology of The Cell,第5版,GarlandScience Publishing,Inc.:New York,2007；Rieger等人,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,第5版,Springer-Verlag:New York,1991；King等人,ADictionary of Genetics,第6版,Oxford University Press:New York,15 2247；以及Lewin,Genes IX,Oxford University Press:New York,2007。

实施方案

为了进一步说明，下面阐述本公开的附加示例性非限制性实施方案。

实施方案1涉及一种重组DNA多核苷酸，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及c)SEQ ID NO:1-23中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。

实施方案2涉及如实施方案1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述序列与SEQ IDNO:1-23中的任一个的DNA序列具有至少90％序列同一性。

实施方案3涉及如实施方案1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述序列与SEQ IDNO:1-23中的任一个的DNA序列具有至少95％序列同一性。

实施方案4涉及如实施方案1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述DNA序列包含基因调控活性。

实施方案5涉及如实施方案1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述异源可转录DNA多核苷酸包含具有农艺价值的基因。

实施方案6涉及如实施方案5所述的重组DNA多核苷酸，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物除草剂耐受性。

实施方案7涉及如实施方案5所述的重组DNA多核苷酸，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物害虫抗性。

实施方案8涉及如实施方案1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述异源可转录DNA多核苷酸编码dsRNA、miRNA或siRNA。

实施方案9涉及一种转基因植物细胞，其包含重组DNA多核苷酸，所述重组DNA多核苷酸选自由以下组成的组的序列：a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；和c)SEQ ID NO:1-23中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。

实施方案10涉及如实施方案9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。

实施方案11涉及如实施方案9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。

实施方案12涉及转基因植物或其部分，其包含如实施方案1所述的重组DNA多核苷酸。

实施方案13涉及如实施方案12所述的转基因植物的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含所述重组DNA多核苷酸。

实施方案14涉及一种转基因种子，其中所述种子包含如实施方案1所述的重组DNA多核苷酸。

实施方案15涉及一种生产商业产品的方法，其包括获得如实施方案12所述的转基因植物或其部分以及由其生产所述商业产品。

实施方案16涉及如实施方案15所述的方法，其中所述商业产品是种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。

实施方案17涉及一种表达可转录DNA多核苷酸的方法，所述方法包括获得如实施方案12所述的转基因植物以及培养植物，其中所述可转录DNA被表达。

实施方案18是一种重组DNA多核苷酸，所述重组DNA多核苷酸包含选自由以下组成的组的DNA序列：

a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；

b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及

c)SEQ ID NO:1-23中任一个的片段，其中所述片段包含基因调控活性；

其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。

实施方案19是如实施方案18所述的重组DNA多核苷酸，其中所述DNA序列与SEQ IDNO:1-23中的任一个的DNA序列具有至少90％序列同一性。

实施方案20是如实施方案18或19中任一项所述的重组DNA多核苷酸，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:1-23中的任一个的DNA序列具有至少95％序列同一性。

实施方案21是如实施方案18至20中任一项所述的重组DNA多核苷酸，其中所述DNA序列包含基因调控活性。

实施方案22是如实施方案18至21中任一项所述的重组DNA多核苷酸，其中所述异源可转录DNA多核苷酸包含具有农艺价值的基因。

实施方案23是如实施方案22所述的重组DNA多核苷酸，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物除草剂耐受性。

实施方案24是如实施方案22所述的重组DNA多核苷酸，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物害虫抗性。

实施方案25是如实施方案18至21中任一项所述的重组DNA多核苷酸，其中所述异源可转录DNA多核苷酸编码dsRNA、miRNA或siRNA。

实施方案26是一种包含重组DNA多核苷酸的转基因植物细胞，所述重组DNA多核苷酸包含选自由以下组成的组的DNA序列：

a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；

b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及

c)SEQ ID NO:1-23中任一个的片段，其中所述片段包含基因调控活性；

其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。

实施方案27是如实施方案26所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。

实施方案28是如实施方案26所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。

实施方案29是一种转基因植物或其部分，其包含如实施方案18至25中任一项所述的重组DNA多核苷酸。

实施方案30是如实施方案29所述的转基因植物的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含如实施方案18至25中任一项所述的重组DNA多核苷酸。

实施方案31是一种转基因种子，其中所述种子包含如实施方案18至25中任一项所述的重组DNA多核苷酸。

实施方案32是一种生产商业产品的方法，其包括获得如实施方案29所述的转基因植物或其部分或如实施方案30所述的后代植物或其部分以及由其生产所述商业产品。

实施方案33是如实施方案32所述的方法，其中所述商业产品选自由以下组成的组：种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。

实施方案34是一种表达可转录DNA多核苷酸的方法，其包括获得如实施方案29所述的转基因植物或如实施方案30所述的后代植物或其部分以及培养所述植物，其中所述可转录DNA多核苷酸被表达。

实施方案35是一种分离的重组DNA分子，其特征在于包含SEQ ID NO:1-23中任一个的DNA序列，其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子。

实施方案36是如实施方案35所述的分离的重组DNA分子，其特征在于所述异源可转录DNA多核苷酸分子包含具有农艺价值的基因。

实施方案37是如实施方案36所述的分离的重组DNA分子，其特征在于所述具有农艺价值的基因赋予植物除草剂耐受性。

实施方案38是如实施方案36所述的分离的重组DNA分子，其特征在于所述具有农艺价值的基因赋予植物害虫抗性。

实施方案39是一种生产转基因植物的方法，除通过所述方法获得的植物外，其特征在于包括：

a.用如实施方案35所述的分离的重组DNA分子转化植物细胞，以产生转化的植物细胞；以及

b.从所述转化的植物细胞再生转基因植物。

实施方案40是一种构建体，其特征在于包含如实施方案35所述的分离的重组DNA分子。

本文所述的实施方案可通过参考以下实施例来更容易理解，所述实施例通过说明提供，并且不旨在进行限制，除非指定。本领域技术人员应当理解，在以下实施例中公开的技术代表本发明者发现的在实践本发明中发挥较好作用的技术。但是，鉴于本公开，本领域技术人员了解到可以在公开的具体实施方案中进行许多变化，并且仍然获得同样或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围，因此，附图中提出或示出的所有事项应理解为例示性的，而不具有限制意义。

实施例

实施例1

调控元件的鉴定和克隆

本实施例描述了衍生自大豆(Glycine max)(大豆(Soybean))的调控表达元件的鉴定、合成和克隆。

SEQ ID NO:1-23的表达元件是基于大豆品种A3555的转录组中观察到的表达模式所选的。挖掘了专有的大豆A3555基因表达图集，以鉴定驱动三叶组织和地上组织中的基因表达的表达元件，而在根和花粉中几乎不表达或不表达。鉴定具有合适表达谱的那些基因并且使用Williams 82基因组组装鉴定那些基因的对应表达元件序列。启动子是使用距启动蛋氨酸起始密码子上游大约2千碱基(kb)的序列所选的并且包含天然启动子和前导序列(5′UTR)两者。转录终止/聚腺苷酸化序列(3′UTR)被鉴定为在内源基因终止密码子后的大约500个碱基对(bp)。在P-Gm.16G089000:1(SEQ ID NO:14)和P-Gm.07G156100:1(SEQ IDNO:19)的上游区鉴定了短的潜在开放阅读框，导致了5'截短的P-Gm.16G089000_trunc:1(SEQ ID NO:16)和5'截短的P-Gm.07G156100_trunc:1(SEQ ID NO:21)的设计。

从大豆中鉴定出的表达元件呈现在表1中。

表1.调控表达元件组、启动子、前导序列和内含子。

使用本领域已知的方法合成已鉴定的表达元件并克隆到二元植物转化载体构建体中的用于驱动β-葡糖醛酸苷酶(GUS)表达的表达盒内，以评估稳定转化的大豆植物中的表达元件的活性，如实施例2中所述。

实施例2

稳定转化的大豆植物中的驱动GUS表达的大豆表达元件分析

用植物二元表达载体构建体转化大豆植物，所述植物二元表达载体构建体含有作为SEQ ID NO:1-8存在的驱动β-葡糖醛酸苷酶(GUS)转基因的表达的表达元件。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估调控元件对表达的影响。

用包含下表2中示出的表达元件的GUS表达构建体转化大豆植物。

表2.用于稳定转化大豆植物的植物GUS表达构建体。

所得植物表达载体含有：来自根癌农杆菌的左边界(B-AGRtu.leftborder)、第一转基因选择盒，其用于选择赋予抗生素壮观霉素抗性的转化植物细胞；第二表达盒，其用于评估存在于表2中的表达元件的活性，所述第二个表达盒包含启动子(启动子和前导序列)，所述启动子将5'可操作地连接至GUS编码序列，所述GUS编码序列包含可加工内含子(SEQID NO:25)，所述可加工内含子将5'可操作地连接至3'UTR；以及来自根癌农杆菌的右边界(B-AGRtu.right border)。

如本领域众所周知的，使用上述二元转化载体构建体通过农杆菌介导的转化来转化大豆植物细胞。诱导所得的转化植物细胞以形成完整的大豆植物。

使用定性和定量GUS分析来评价转化的植物中的所选植物器官和组织中的表达元件活性。为了通过组织化学染色来定性分析GUS表达，将整块或切片组织与含有1mg/mL X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)的GUS染色溶液在37℃下孵育5小时并用35％EtOH和50％乙酸脱色。通过在解剖显微镜或复合显微镜下目视检查所选的植物器官或组织的蓝色染色来定性确定GUS的表达。

为了通过酶测定来定量分析GUS表达，从转化的玉米植物的所选组织中提取总蛋白。将一至两微克的总蛋白与1mM浓度的荧光底物4-甲基伞形酰基-β-D-葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)在50微升的总反应体积中孵育。在37℃下孵育1小时后，通过添加350微升的200mM碳酸氢钠溶液来停止反应。反应产物4-甲基伞形酮(4-MU)在高pH下发出最大的荧光，其中羟基被电离。添加碱性碳酸钠溶液同时停止测定，并且调节pH以量化荧光产物4-MU。通过使用FLUOstar Omega微板读板器(BMG LABTECH)测量荧光来估计形成的4-MU的量(在355nm处激发，在460nm处发射)。以4-MU/小时/mg总蛋白的纳摩尔数提供GUS活性值。

对以下组织进行取样用于R0世代中的GUS表达：V5阶段库叶、源叶和根；R1阶段花朵、叶柄、源叶、花粉和根；R3阶段荚和未成熟种子；R5源叶；以及R8种子子叶和胚。大豆营养和繁殖阶段是本领域技术人员众所周知的，并且描述这些阶段的许多出版物可见于万维网和其他地方，诸如北达科他州立大学(North Dakota State University)出版物A-1174，1999年6月，其于2004年8月审查并重印。表3-6示出了用每个构建体(构建体-1至构建体-4)转化的每个采样组织的范围和平均GUS表达。

表3.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.08G282100:2(SEQ ID NO:1)和T-Gm.08G282100:2(SEQ ID NO:2)驱动的平均和范围GUS表达。

表4.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.02G215700:2(SEQ ID NO:3)和T-Gm.02G215700:2(SEQ ID NO:4)驱动的平均和范围GUS表达。

表5.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.11G155000:2(SEQ ID NO:5)和T-Gm.11G155000:2(SEQ ID NO:6)驱动的平均和范围GUS表达。

表6.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.PSII:1(SEQ ID NO:7)和T-Gm.PSII:1(SEQID NO:8)驱动的平均和范围GUS表达。

从表3至表6可看出，衍生自每种大豆基因的表达元件具有独特的表达模式。对所选组织进行定性表达分析证明了每种表达元件组合都有不同的表达模式。例如，对于R1源叶，在使用构建体-1(P-Gm.08G282100:2/T-Gm.08G282100:2)转化的大豆植物中，GUS表达主要在叶肉中观察到。使用构建体-2(P-Gm.02G215700:2/T-Gm.02G215700:2)转化的大豆植物主要在维管束中显示R1源叶表达，而使用构建体-4(P-Gm.PSII:1/T-Gm.PSII:1)转化的大豆植物则在韧皮部、气孔、叶肉和维管束中显示表达。

每种表达元件组合都能够驱动稳定转化大豆植物中的基因表达。

实施例3

稳定转化的大豆植物中的驱动GUS表达的大豆表达元件分析

用植物二元表达载体构建体转化大豆植物，所述植物二元表达载体构建体含有作为SEQ ID NO:9-24存在的驱动β-葡糖醛酸苷酶(GUS)转基因的表达的表达元件。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估调控元件对表达的影响。

用包含下表7中示出的表达元件的GUS表达构建体转化大豆植物。

表7.用于稳定转化大豆植物的植物GUS表达构建体。

所得植物表达载体含有：来自根癌农杆菌的左边界(B-AGRtu.leftborder)、第一转基因选择盒，其用于选择赋予抗生素壮观霉素抗性的转化植物细胞；第二表达盒，其用于评估存在于表7中的表达元件的活性，所述第二个表达盒包含启动子(启动子和前导序列)，所述启动子将5'可操作地连接至GUS编码序列，所述GUS编码序列包含可加工内含子(SEQID NO:25)，所述可加工内含子将5'可操作地连接至3'UTR；以及来自根癌农杆菌的右边界(B-AGRtu.right border)。

如本领域众所周知的，使用上述二元转化载体构建体通过农杆菌介导的转化来转化大豆植物细胞。诱导所得的转化植物细胞以形成完整的大豆植物。

定性和定量表达测定如先前实施例2所述。对以下组织进行取样用于R0世代中的GUS表达：V5阶段库叶、源叶和根；R1阶段花朵、叶柄、源叶、花粉和根；R3阶段荚和未成熟种子；和R5源叶；以及R8种子子叶和种子胚。表8-17示出了用每种构建体转化的每种采样组织的范围和平均GUS表达。

表8.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.01G238800:1和T-Gm.01G238800:1驱动的平均和范围GUS表达。

表9.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.19G007700:1和T-Gm.19G007700:1驱动的平均和范围GUS表达。

表10.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.05G007100:1和T-Zm.GST59.nno:1驱动的平均和范围GUS表达。

表11.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.16G089000:1和T-Gm.16G089000:1驱动的平均和范围GUS表达。

表12.在稳定大豆转化植物中，由由P-Gm.16G089000_trunc:1和T-Gm.16G089000:1驱动的平均和范围GUS表达。

表13.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.15G057600:1和T-Gm.15G057600:1驱动的平均和范围GUS表达。

表14.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.07G156100:1和T-Gm.07G156100:1驱动的平均和范围GUS表达。

表15.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.07G156100_trunc:1和T-Gm.07G156100:1驱动的平均和范围GUS表达。

表16.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.17G020600:1和T-Zm.GST59.nno:1驱动的平均和范围GUS表达。

表17.在稳定大豆转化植物中，由P-Gm.02G101100:1和T-Zm.GST59.nno:1驱动的平均和范围GUS表达。

从表8至表17可看出，衍生自每种大豆基因的表达元件具有独特的表达模式。与V5和R1根相比，构建体-6至构建体-9中的表达元件在V5和R1源叶中显示更高水平的平均GUS表达。例如，与处于相同生长阶段的根相比，构建体-6的表达元件驱动V5和R1源叶中的平均GUS表达高出十倍。构建体-7的表达元件能够在V5源叶、R1叶柄和源叶中驱动非常高的平均GUS表达，而V5和R1根中的平均GUS表达比源叶低大约二十倍。

已经示出和描述本发明的原理，本领域技术人员显而易知本发明可在安排和细节上改进而不背离此类原则。我们要求保护在权利要求的精神和范围内的所有修改。本文中的所有公布都以引用的方式并入本文，该引用的程度就如同已明确且个别地指示将各个别公布或专利申请通过引用并入本文一般。

Claims (17)

1.一种重组DNA多核苷酸，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：

a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；

b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及

c)SEQ ID NO:1-23中任一个的片段，其中所述片段包含基因调控活性；

其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。

2.如权利要求1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:1-23中任一个的DNA序列具有至少90％序列同一性。

3.如权利要求2所述的重组DNA多核苷酸，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:1-23中任一个的DNA序列具有至少95％序列同一性。

4.如权利要求1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述DNA序列包含基因调控活性。

5.如权利要求1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述异源可转录DNA多核苷酸包含具有农艺价值的基因。

6.如权利要求5所述的重组DNA多核苷酸，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物除草剂耐受性。

7.如权利要求5所述的重组DNA多核苷酸，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物害虫抗性。

8.如权利要求1所述的重组DNA多核苷酸，其中所述异源可转录DNA多核苷酸编码dsRNA、miRNA或siRNA。

9.一种包含重组DNA多核苷酸的转基因植物细胞，所述重组DNA多核苷酸包含选自由以下组成的组的DNA序列：

a)与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；

b)包含SEQ ID NO:1-23中的任一个的序列；以及

c)SEQ ID NO:1-23中任一个的片段，其中所述片段包含基因调控活性；

其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA多核苷酸。

10.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。

11.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。

12.一种转基因植物或其部分，其包含如权利要求1所述的重组DNA多核苷酸。

13.一种如权利要求12所述的转基因植物的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含如权利要求1所述的重组DNA多核苷酸。

14.一种转基因种子，其中所述种子包含如权利要求1所述的重组DNA多核苷酸。

15.一种生产商业产品的方法，其包括获得如权利要求12所述的转基因植物或其部分以及由其生产所述商业产品。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述商业产品选自由以下组成的组：种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。

17.一种表达可转录DNA多核苷酸的方法，其包括获得如权利要求12所述的转基因植物以及培养所述植物，其中所述可转录DNA多核苷酸被表达。