CN119837816B - 一种钝口螈皮肤提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种钝口螈皮肤提取物及其制备方法与应用，涉及生物医学技术领域。该钝口螈皮肤提取物富含多种活性成分，包括胶原蛋白家族成员、纤维胶蛋白、C1Q补体蛋白、纤连蛋白等，上述成分之间相互补充、相互促进，使得该提取物在皮肤抗衰老、皮肤损伤修复等方面具有显著的效果，进而在药物研发、化妆品和功能性食品中具有广泛的应用前景。而钝口螈皮肤蛋白提取方法，通过对样本进行快速冻融处理，并结合机械破碎、超声辅助分离和多重过滤步骤，避免了对产物活性的影响，可得到多种复合蛋白；调整缓冲液的pH值，进一步优化提取物性质，更适用于人类皮肤，且无菌可直接作为产品原料，实现规模化生产，推动钝口螈皮肤提取物的产业化应用。

Description

一种钝口螈皮肤提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种钝口螈皮肤提取物及其制备方法与应用。

背景技术

随着生物技术与天然资源开发技术的不断进步，天然活性成分的提取与利用成为医药、化妆品及功能性食品等多个领域的研究热点。其中，源自生物体的活性提取物因安全性高、生物活性强以及多功能性而备受关注。两栖动物作为天然活性成分的重要来源，其皮肤分泌物和组织中富含多种具有显著生物活性的物质，如小分子肽（例如抗氧化肽、伤口愈合促进肽、免疫调节肽、抗菌肽、抗病毒肽、抗肿瘤肽等）、抗氧化因子和多糖类化合物，这些物质在抗感染、抗炎症、促进组织再生等方面显示出巨大潜力。

在两栖动物中，蝾螈、钝口螈等有尾目物种以卓越的再生能力和丰富的皮肤分泌物特性而受到广泛关注。研究表明，有尾目物种的皮肤中包含多种具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节功能的活性成分，这使其在医药与生物制品开发方面具有极大的应用前景。有尾目物种皮肤中分泌的抗菌肽不仅具有广谱抗菌性能，还可对多种耐药菌株产生显著的抑制作用，为解决抗生素滥用问题提供了潜在解决方案。此外，有尾目物种皮肤中的再生因子在促进细胞分裂、组织修复方面具有重要价值，是组织工程和再生医学研究的理想候选材料。然而，与青蛙和蟾蜍等其他两栖动物相比，蝾螈、钝口螈等有尾目物种皮肤活性成分的研究起步较晚，对其应用的探索更是处于起步阶段，其皮肤提取物的应用范围也受到极大的限制。

因此，解决目前的蝾螈、钝口螈等有尾目物种皮肤提取物的研究较少、应用范围受限、应用领域严重不足的问题，探索高效、稳定且具有可持续发展的活性成分提取技术，提供更广泛的应用领域，填补两栖有尾目物种皮肤提取物实际应用的空白，对于推动该领域的发展具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种钝口螈皮肤提取物及其制备方法与应用，旨在解决目前的两栖有尾目物种皮肤提取物的研究较少、应用范围受限、应用领域严重不足的问题。

本发明第一方面的实施例，提供了一种钝口螈皮肤提取物，所述钝口螈皮肤提取物的活性成分包括胶原蛋白（COL）家族中的一种或多种、纤维胶蛋白（FCN）家族中的一种或多种、C1Q补体蛋白家族中的一种或多种、纤连蛋白（FN1）、细胞色素b5还原酶3（CYB5R3）、烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）、或线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）。

根据本发明第一方面实施例的钝口螈皮肤提取物，至少具有如下有益效果：本发明提供的钝口螈皮肤提取物富含多种活性成分，其中，胶原蛋白（Collagen, COL）家族和纤维胶蛋白（Ficolin, FCN）家族可以改善皮肤含水量并降低皮肤经皮水分散失，改善皮肤皱纹和弹性，还可改善皮肤胶原纤维结构补体系统的免疫蛋白；C1Q补体蛋白（ComplementComponent 1q）在神经元功能和衰老中起关键作用；纤连蛋白（Fibronectin, FN1或FN）具有生长因子的作用，可促进细胞增殖，诱导表皮细胞形成肉芽组织，并促进表皮下基底膜再建和正常角化过程，作为皮肤细胞外基质重要的组成成分，可将胶原蛋白紧紧铆定在皮肤细胞上，强化肌肤弹力纤维网，撑紧松弛下垂肌肤，促进皮肤细胞生长、分化、迁移，指导肌肤有序再生，促进屏障蛋白表达，修复皮肤屏障，加强皮肤防御力；细胞色素b5还原酶3（cytochrome b5 reductase 3, CYB5R3）过表达激活呼吸代谢并可以发挥延长寿命的作用；而细胞色素b5还原酶3、烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT）、线粒体乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2, ALDH2）在代谢上具有促进作用，在细胞衰老和免疫细胞功能调节等方面发挥重要的作用。上述丰富的生物活性成分之间相互补充、相互促进，使得该钝口螈皮肤提取物在药物研发、化妆品和功能性食品中具有广泛的应用前景。

在本发明的一些实施方式中，所述胶原蛋白家族包括COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL4A1、COL5A1、COL5A2、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL6A6、COL11A1、COL12A1、COL17A1、COL18A1、COL28A1、或COLGALT1。胶原蛋白（Collagen）家族是哺乳动物中含量最多的蛋白质，本发明的钝口螈皮肤提取物中含有丰富的胶原蛋白，并涵盖了其家族的多个成员。

在本发明的一些实施方式中，所述纤维胶蛋白家族包括FCN1（Ficolin-1）、FCN2（Ficolin-2）、或FCN3（Ficolin-3）。

在本发明的一些实施方式中，所述C1Q补体蛋白家族包括C1QC（Complement C1qSubcomponent C）、C1QB（Complement C1q Subcomponent B）、C1QA（Complement C1qSubcomponent A）、或C1QTNF3（Clq and TNF related 3）。

在本发明的一些实施方式中，所述钝口螈包括墨西哥钝口螈，但不限于此，也可以包括两栖纲有尾目的其他种属。

墨西哥钝口螈（学名：Ambystoma mexicanum）是钝口螈科、钝口螈属两栖类动物，又名六角蝾螈、六角恐龙、美西螈。野生的墨西哥钝口螈体色为深棕色，带有黑色斑点。头部较宽，眼睛较小，四肢和四足娇小。体长通常为20~30 厘米，体重60~110克。皮肤光滑无鳞，不具鼓室和鼓膜。拥有明显的外鳃和鳍状尾巴，呈羽毛状。背鳍从头背向后延伸至尾端，腹鳍从两个后肢中间延伸至尾巴末端，利于在水中游泳。墨西哥钝口螈因拥有极强的再生能力，成为了研究热点。

目前，针对两栖有尾目物种皮肤的研究尚属早期阶段，其活性成分的提取方法多借鉴于其他两栖动物（如青蛙和蟾蜍）。现有技术中，针对动物皮肤活性提取物的提取和分离，通常采用以下几种方法和技术路线：（1）溶剂提取法：这是最传统且广泛应用的一种方法，利用水、乙醇或其他有机溶剂作为提取介质，通过将皮肤组织浸泡于溶剂中，利用分子溶解性将活性成分释放。该方法的优势在于操作简便、成本较低，但其对热敏性物质或结构易受破坏的成分不够友好。（2）酶解提取法：通过加入特定酶类（如蛋白酶、纤维素酶）对皮肤组织进行选择性降解，从而释放皮肤中的蛋白、多肽或其他大分子活性物质。酶解提取具有专一性强、提取率高的特点，但对于大规模操作，存在难以实现稳定性的问题，且易造成目标蛋白结构的部分改变。（3）超声波辅助提取：超声波通过声波空化作用对组织细胞进行破裂，使得细胞内的活性成分能够迅速释放到提取介质中。这种方法操作时间短、提取效率高，尤其适合初步分离步骤。但在实际应用中，超声波的强度和处理时间需要严格控制，否则可能引起活性物质的降解。（4）机械破碎与离心法：机械破碎技术通过均质器或组织研磨器对皮肤样本进行物理性破碎，以暴露并释放细胞内容物，随后结合高速离心技术分离沉淀物与上清液。这种方法操作灵活，适合小规模提取，但在过程中可能混入大量杂质，需进一步净化。（5）膜分离和色谱技术：对于粗提取物的进一步纯化，膜分离技术和色谱技术（如高效液相色谱HPLC）被广泛应用。膜分离通过选择性过滤去除大分子杂质，而色谱技术则能够分离并纯化特定分子结构的目标成分。然而，这些方法通常成本较高，且难以大规模实现。（6）冷冻干燥与稳定化处理：为了更好地保存活性成分，部分现有技术在提取后会对产品进行冷冻干燥，通过低温去除水分，从而提高提取物的稳定性。配合稳定剂（如抗氧化剂）的使用，可以进一步延长提取物的保存时间，特别是热敏性物质的活性。

上述多种方法为两栖动物皮肤活性提取物的研究提供了基础支持。然而，针对有尾目物种皮肤的特殊性，现有技术多为通用提取流程，尚未形成专门针对有尾目皮肤特定成分的优化方案。不仅如此，采用溶剂提取、酶解和物理分离等方法，在提取效率、成分稳定性以及目标活性物质的保护方面仍存在诸多不足，导致提取效率低下且活性成分得率有限，且提取过程也存在着蛋白易降解、杂质混入及不适合规模化生产等问题，极大限制了蝾螈、钝口螈等皮肤活性提取物的实际应用范围。为此，开发一套针对有尾目物种皮肤特性的高效提取和分离方案，提升活性成分的分离与纯化效率，保护目标活性物质的稳定性，优化提取工艺及操作适应性，实现规模化、工业化生产，显得尤为重要。

基于此，为了解决蝾螈、钝口螈等两栖有尾目物种皮肤提取过程中的蛋白降解、酶解提取导致的蛋白结构变化、提取过程中杂质含量过高以及提取物性质不适合人类应用等问题，本发明第二方面的实施例，提供了上述的钝口螈皮肤提取物的制备方法，包括步骤：

S100、对钝口螈皮肤取样；

S200、对获得的皮肤样本进行液氮速冻和冻融；

S300、将冻融后的样本进行机械破碎；

S400、将机械破碎后的样本粗提物进行离心过滤；

S500、将离心过滤后的样本提取物进行超声破碎；

S600、将超声破碎后的二次提取物进行除菌过滤，获得钝口螈皮肤提取物。

根据本发明第二方面实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：本发明针对两栖有尾目物种的皮肤特性，开发了一种高效、稳定且具有可持续发展的优化提取方案，整合从样本处理到提取分离的全流程技术，确保了提取物的高效分离和活性保持。本发明提供的提取有尾目物种皮肤组织蛋白的方法，包括皮肤取样、样本冻融、机械破碎、离心过滤、超声破碎、除菌过滤等步骤，可针对蝾螈、钝口螈等物种提取大量蛋白：首先，在皮肤样本处理时采用液氮速冻处理，实现样本快速冻结以抑制微生物的生长和酶的活性，从而有效避免蛋白降解；通过机械破碎法替代酶解提取法，以保持蛋白结构的完整性，同时显著提高蛋白的含量，适用于规模化操作需求；使用超声破碎法进一步去除杂质，并进行除菌过滤以彻底去除杂质，从而提高提取物的纯度；同时，在提取过程中将提取物的pH值从弱碱性调整至弱酸性，提升对人类皮肤的兼容性与适配性。最终，本发明提出的优化的提取和分离方法，针对有尾目物种皮肤的组织特性，通过对样本进行快速冻融处理，并结合机械破碎、超声辅助分离和多重过滤步骤，在全程低温条件下逐步提取蝾螈、钝口螈等有尾目皮肤中的活性成分，避免了酶类、有机溶剂或高温等对目标产物活性的负面影响，可得到多种复合蛋白；同时，调整缓冲液的pH值，进一步优化提取物的性质，使其更适用于人类皮肤的使用需求，且无菌可直接作为产品原料；上述提取技术绿色环保、可持续，能够实现规模化、工业化生产，可以显著推动蝾螈、钝口螈等有尾目皮肤提取物的产业化应用，对于推动该领域的发展具有重要意义，不仅能够填补当前技术领域的空白，还能为多领域的技术创新提供科学支撑。

在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还可应用于提取其他两栖有尾目物种的皮肤活性成分。

具体的，所述制备方法还可应用于制备蝾螈皮肤提取物，包括步骤：

S10、对蝾螈皮肤取样；

S20、对获得的皮肤样本进行液氮速冻和冻融；

S30、将冻融后的样本进行机械破碎；

S40、将机械破碎后的样本粗提物进行离心过滤；

S50、将离心过滤后的样本提取物进行超声破碎；

S60、将超声破碎后的二次提取物进行除菌过滤，获得蝾螈皮肤提取物。

在本发明的一些实施方式中，对钝口螈皮肤取样后，将获得的皮肤样本保存在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中。

在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液的pH值为5.5~6。

具体的，缓冲液配方为：含1×蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液，pH为6.0。相比其他提取方法，本发明添加了蛋白酶抑制剂，目的是防止蛋白质降解，得到高含量的蛋白。

在本发明的一些实施方式中，步骤S100具体包括：

S101、对钝口螈进行麻醉并处死；

S102、取皮：处死后的钝口螈平铺在台面上，用手术刀沿背部脊柱两侧分别进行竖向划破，沿脖颈处一圈进行横向划破，之后用镊子进行皮肤剥离，并对剥离后的钝口螈皮肤进行称重；

S103、清洗：将钝口螈皮肤浸泡至磷酸盐缓冲液中进行清洗，清洗至少3次；

S104、剪块：将清洗后的钝口螈皮肤用吸水纸吸去表面水分，放入培养皿中，用剪刀剪成0.3×0.3cm大小的小块；

S105、保存：将钝口螈皮肤小块转移至干净的离心管中，加入与钝口螈皮肤等重的缓冲液。

步骤S104中，剪成小块是为了保证钝口螈皮液氮速冻充分。

常规方法中，最终的提取物呈弱碱性，直接使用在人类皮肤上的适配性较差，难以作为化妆品原料。本发明通过调节磷酸盐缓冲液的pH值，将提取物的pH值从弱碱性调整至弱酸性，使其更适合作为化妆品原料使用，提升对人类皮肤的兼容性。相比于提取完成后调节pH值，本发明在提取前调节，可防止调节过程中对提取物的损害。

在本发明的一些实施方式中，步骤S200具体包括：

S201、液氮速冻：将装有钝口螈皮肤小块的离心管浸没至液氮中，至钝口螈皮肤小块和缓冲液完全冻结；

S202、冻融：将液氮速冻后的样本放置在-80℃冰箱，冻存24小时，取出常温放置至完全解冻；之后再次放入-80℃冰箱，冻存24小时，取出常温放置至完全解冻；之后再次放入-80℃冰箱，冻存24小时，取出常温放置至完全解冻，进行提取过程。

在皮肤提取过程中，为防止样本前处理过程中蛋白质的降解，本发明使用磷酸盐缓冲液并加入1×浓度的蛋白酶抑制剂，结合浸没式液氮速冻处理，实现样本快速冻结以抑制微生物的生长和酶的活性，从而有效避免蛋白降解，确保蛋白质活性得以保存。

在本发明的一些实施方式中，步骤S300具体包括：

S301、将完全解冻后的样本转移至干净的离心管中，使用手持式高速匀浆机进行机械破碎，破碎全程在冰上进行；

S302、将离心管放置冰上静置，等待离心。

具体的，样本不超过离心管容积的1/2，防止机械破碎过程中液体溅出。

具体的，机械破碎参数：破碎15分钟，每5分钟停一次，取出探头上缠绕的肉筋，丢弃，破碎全程在冰上进行，控制温度使蛋白不变性。

常规方法大多采用生物酶解离，皮肤样本在酶解提取过程中易导致蛋白结构发生变化；且该方法时间久，不适用于大规模操作。本发明采取的解决方案为：通过机械破碎法替代酶解提取法，以保持蛋白结构的完整性，同时显著提高蛋白的含量，适用于规模化操作需求（一次可提取50~100只蝾螈或钝口螈皮肤）；而且，生物酶灭活可能要经过60℃高温，会对蛋白结构造成影响，本发明采用机械破碎，全程在冰上操作，控制温度使蛋白不变性。

在本发明的一些实施方式中，步骤S400具体包括：

S401、初次离心：4℃，4000g，离心10分钟；

S402、转移清液：用巴氏滴管穿过上层杂质沫，取中层清液，转移至干净的离心管中；

S403、再次离心：4℃，4000g，离心10分钟；

S404、过滤：取上清，使用40μm细胞筛进行过滤，将滤液收集到干净的离心管中；

S405、再次过滤：将收集的滤液使用10μm滤网再次进行过滤，将液体收集到干净的离心管中准备超声破碎。

对粗提物离心是为了去除较大杂质，通过两次离心可简单快速去掉杂质，不需要盐析沉淀或超滤；而两次过滤可充分过滤掉肉眼可见的明显杂质，等待进一步用超声破碎去除微小杂质。

在本发明的一些实施方式中，步骤S500具体包括：

S501、将液体转移至烧杯中，并将烧杯放置在冰上；

S502、超声破碎：设置破碎功率为1%，超声开时间4.0s，超声关时间6.0s，工作时间为30分钟，控制温度在35℃以下，将探头浸没入距离烧杯底部0.5cm，超声全程在冰上进行；

S503、超声破碎完成后，转移液体到干净的离心管中。

超声破碎时，烧杯中的液体不超过烧杯容积的1/2（例如50mL烧杯，液体体积控制在20~25mL）。

粗提取物中杂质含量较多，影响后续应用。本发明使用超声破碎法进一步去除杂质，全程在冰上操作以保证蛋白不会因高温而变性。在破碎后，使用两次0.22μm滤网过滤以彻底去除杂质，从而提高提取物的纯度。

在本发明的一些实施方式中，将超声破碎后的二次提取物进行双重除菌过滤，所述双重除菌过滤采用的滤膜孔径为0.22μm。

在本发明的一些实施方式中，步骤S600具体包括：

S601、将超声破碎后的液体4℃, 4000g离心10分钟，转移上清到干净离心管中；

S602、真空过滤：使用真空过滤器/0.22µm孔径/PES滤膜进行过滤，将滤瓶连接真空泵，上清倒入滤瓶中，启动真空泵，进行过滤；

S603、过滤：使用0.22µm孔径/CA滤膜针孔过滤器再次进行过滤，将针筒连接针头过滤器，液体倒入针筒中，推动过滤，收集过滤后的液体至干净的离心管中；

S604、保存：将收集到的钝口螈皮肤提取物置于-80℃进行保存。

本发明采用双重除菌过滤，且滤膜孔径为0.22μm，得到的钝口螈提取物无杂质无菌，保证了提取物的可用性。

在本发明的一些实施方式中，步骤S600之后，还包括步骤S700：BCA蛋白测定。

具体的，步骤S700包括：

S701：稀释：取钝口螈皮肤提取物，进行10倍、20倍、30倍稀释；

S702：使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定；

S703：计算10倍、20倍、30倍稀释的蛋白浓度，取平均值。

综上，本发明提供的钝口螈皮肤提取方法，在样本处理过程中，为防止蛋白质的降解，使用磷酸盐缓冲液并加入1×浓度的蛋白酶抑制剂，通过浸没式液氮速冻达到快速冻结的效果，从而抑制微生物的生长和酶的活性，确保蛋白质活性得以保存；针对传统酶解提取方法易导致蛋白结构发生变化且不适用于大规模操作的问题，改用机械破碎法，通过物理破碎手段保持蛋白含量较高且结构完整，同时简化工艺流程，提升工业化可操作性；为进一步去除提取物中的杂质，本发明结合超声波处理技术，通过全程在冰上操作，确保蛋白不因高温发生变性，超声处理后的提取液经过两次0.22μm滤网过滤，去除细小杂质，提高提取物的纯净度；同时，为改善提取物的化学性质以适配人类皮肤应用，本发明通过调节磷酸盐缓冲液的pH值，从弱碱性调整为弱酸性，使最终产品更适合作为化妆品原料，满足人体皮肤护理需求。同时，上述皮肤提取方法还适用于蝾螈等两栖纲有尾目的其他物种。

通过上述创新工艺，本发明实现了一种适用于有尾目物种皮肤提取物的稳定制备方法。整个工艺采用物理提取手段，避免了酶解或化学试剂对提取物质量和活性的破坏，同时充分考虑蝾螈、钝口螈等有尾目皮肤的结构特点，通过精准的多步骤处理去除杂质、优化产品性质，成功获得了一种高纯度、高活性且无菌的皮肤提取物。本发明的工艺经过多项功能验证实验，证明其具有高度稳定性和适用性，展现出了广泛的应用潜力。

本发明第三方面的实施例，提供了一种上述的钝口螈皮肤提取物或上述的制备方法获得的钝口螈皮肤提取物在皮肤抗衰老中的应用，所述应用为非诊断或治疗目的。

根据本发明第三方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明提供的钝口螈皮肤提取物，含有丰富的生物活性成分，例如胶原蛋白（COL）家族成员、纤维胶蛋白（FCN）家族成员、C1Q补体蛋白家族成员、纤连蛋白（FN1）、细胞色素b5还原酶3（CYB5R3）、烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）、或线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2），上述成分相互作用、相互促进，赋予了该提取物有效的皮肤抗衰老功能。且与大多数功效单一的抗衰老产品不同，其具有多个维度的皮肤抗衰老效果，例如具有显著的抗皱、紧致、保湿、舒缓、控油、抗光老化等功效。上述多维度抗衰老方案可共同作用进行根本性调节，有效性强、持效性好。其次，本发明提取物的化学性质适配人类皮肤，其酸碱度与皮肤微生态天然亲和，能减少副作用或不良反应，安全性好，亲和性高，可满足人体皮肤应用需求。此外，上述应用方案还为开发更多安全、有效、持久的抗衰老产品提供了另一种思路，应用潜力巨大，不仅可用于开发基于该提取物的护肤品、药物来延缓皮肤衰老或治疗与衰老相关的皮肤疾病，还可用于开发皮肤修复药物，甚至有望实现个性化抗衰老方案，具有极高的科研意义和实际价值。

在本发明的一些实施方式中，所述抗衰老包括抗皱、紧致、保湿、舒缓、控油、或抗光老化中的至少一种。

本发明第四方面的实施例，提供了一种上述的钝口螈皮肤提取物或上述的制备方法获得的钝口螈皮肤提取物在皮肤损伤修复中的应用，所述应用为非诊断或治疗目的。

本发明第五方面的实施例，提供了上述的钝口螈皮肤提取物或上述的制备方法获得的钝口螈皮肤提取物在(a1)~(a7)至少一种中的应用，所述应用为非诊断或治疗目的：

(a1)开发和/或制备皮肤抗衰老的产品；

(a2)开发和/或制备皮肤护理产品；

(a3)开发和/或制备治疗衰老相关皮肤疾病的药物；

(a4)开发和/或制备皮肤损伤修复药物；

(a5)构建皮肤衰老模型；

(a6)构建皮肤损伤修复模型；

(a7)开发和/或制备弹性蛋白酶抑制剂、透明质酸酶抑制剂、5α还原酶抑制剂、或自由基清除剂。

在本发明的一些实施方式中，所述应用包括开发和/或制备皮肤抗衰老的产品或皮肤护理产品。本发明的钝口螈皮肤提取物因其无菌、高纯度和弱酸性特性，能够有效匹配人类皮肤的需求，是化妆品或护肤品的理想原料。其抗氧化和保湿功能可被用于面膜、精华液、乳液等护肤产品中，提供抗衰老、防晒修护和深度保湿的功效。此外，其抗菌特性也适用于祛痘、改善敏感肌肤及修复皮肤屏障的功能性化妆品开发。

在本发明的一些实施方式中，所述应用包括开发和/或制备治疗衰老相关皮肤疾病的药物或皮肤损伤修复药物。本发明的钝口螈皮肤提取物含有丰富的生物活性成分，包括具有抗菌、抗炎、抗氧化等功能的多肽和蛋白质。在医药领域，这些成分可用于开发新型抗菌药物、组织修复剂以及皮肤愈合产品。例如，在创面修复中，该提取物通过促进胶原蛋白生成、抑制炎症反应和微生物感染，为烧伤、术后伤口及慢性皮肤溃疡的药物开发提供了有效的途径。同时，该提取物在抗衰老药物开发中具有潜在价值，能够减缓细胞衰老过程，提升细胞活性。

在本发明的一些实施方式中，所述应用包括开发和/或制备功能性食品或保健品。

由于钝口螈皮肤提取物的天然来源及其生物活性，本发明的产品具有成为功能性食品和保健品原料的潜力。其抗氧化特性有助于减少自由基对机体的损害，从而提升免疫力并延缓衰老。在保健食品中，该提取物可被制成胶囊、饮料或口服液，帮助改善皮肤健康、增强身体防护机制。

在本发明的一些实施方式中，所述应用包括开发生物材料。

本发明钝口螈皮肤提取物的高活性和纯净度使其在生物材料开发领域大有可为。例如，可以作为一种新型生物胶或涂层材料，应用于医用植入物和医疗器械表面，提高抗菌性能和生物相容性。此外，提取物中的某些活性成分可能具有良好的组织工程特性，可用于3D打印支架材料，促进组织再生和修复。

在本发明的一些实施方式中，所述应用包括构建药物筛选平台。

本发明提供的高纯度钝口螈皮肤提取物还可为生物医学和生物化学研究提供优质材料，其活性成分可用于研究细胞信号通路、蛋白质结构功能关系及生物活性分子的作用机制。同时，该提取物可用于新型药物的高通量筛选平台，帮助快速发现和验证具有临床价值的新药物靶点。

上述的应用为多领域的技术进步提供了坚实的基础，并展现出广泛的市场价值和社会效益。

本发明第六方面的实施例，提供了一种产品，包括上述的钝口螈皮肤提取物或上述的制备方法获得的钝口螈皮肤提取物。

在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药品、药物组合物、护肤品、或化妆品。

本发明提供的产品，活性成分包括上述的钝口螈皮肤提取物，因而具有上述提取物的全部技术效果。基于该提取物开发的抗衰老或皮肤损伤修复相关的药品、药物组合物、护肤品、或化妆品，通过其含有的丰富的生物活性成分之间的相互补充、相互促进，可在多个维度提供皮肤抗衰老效果（例如具有显著的抗皱、紧致、保湿、舒缓、控油、抗光老化等功效），并有效进行皮肤损伤修复（包括疾病、外伤等导致的皮肤损伤）。上述多维度抗衰老方案以及损伤修复方案可进行根本性调节，有效性强、持效性好。而且本发明提取物的化学性质适配人类皮肤，其酸碱度与皮肤微生态天然亲和，能减少副作用或不良反应，安全性好，亲和性高，可满足人体皮肤应用需求。此外，上述应用方案还为开发更多安全、有效、持久的产品提供了另一种思路，应用潜力巨大，不仅可用于开发基于该提取物的护肤品、药物来延缓皮肤衰老或治疗与衰老相关的皮肤疾病，还可用于开发皮肤修复药物，甚至有望实现个性化抗衰老方案，具有极高的科研意义和实际价值。

在本发明的一些实施方式中，所述药品、药物组合物、护肤品、或化妆品还包括药学或护肤品可接受的载体。

在本发明的一些实施方式中，所述护肤品或化妆品包括抗皱产品、紧致产品、保湿产品、舒缓产品、控油产品、抗光老化产品。

在本发明的一些实施方式中，所述护肤品或化妆品的类别包括精华、乳液、面霜、面膜。

在本发明的一些实施方式中，所述护肤品或化妆品的成分还包括甘油、透明质酸、丙二醇、或丁二醇中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述产品包括如下(b1)~(b8)至少一种：

(b1)皮肤抗衰老产品；

(b2)皮肤护理产品；

(b3)治疗衰老相关皮肤疾病的药物；

(b4)皮肤损伤修复药物；

(b5)弹性蛋白酶抑制剂；

(b6)透明质酸酶抑制剂；

(b7)5α还原酶抑制剂；

(b8)自由基清除剂；

所述产品的活性成分包括上述的钝口螈皮肤提取物或上述的制备方法获得的钝口螈皮肤提取物。

在本发明的一些实施方式中，所述产品是以钝口螈皮肤提取物为活性成分，添加药学或化妆品中可接受的辅料或辅助性成分制备而成的外用制剂。

在本发明的一些实施方式中，所述外用制剂包括化妆品或护肤品。

在本发明的一些实施方式中，所述化妆品或护肤品包括抗皱霜、紧致霜、保湿水或乳、舒缓凝胶或啫喱、控油霜或乳、抗光老化霜或粉。

在本发明的一些实施方式中，所述化妆品或护肤品的类型包括水剂、乳剂、霜剂、粉剂、凝胶、啫喱、精华、或面膜。

在本发明的一些实施方式中，所述可接受的辅料包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、保湿剂、增稠剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、防腐剂、pH调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、缓冲剂中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述辅助性成分包括美白剂、润肤剂、抗粉刺剂、紫外线吸收剂、肌肤调理剂中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述辅助性成分还包括胶原蛋白、维生素、茶多酚、辅酶Q10中的至少一种。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

图1为本发明实施例提供的BCA浓度测定结果示意图；

图2为本发明实施例提供的钝口螈皮肤提取物抗皱、紧致功效检测结果示意图；

图3为本发明实施例提供的钝口螈皮肤提取物保湿功效检测结果示意图；

图4为本发明实施例提供的钝口螈皮肤提取物舒缓功效检测结果示意图；

图5为本发明实施例提供的钝口螈皮肤提取物控油功效检测结果示意图；

图6为本发明实施例提供的钝口螈皮肤提取物抗光老化功效检测结果示意图；

图7为本发明实施例提供的钝口螈皮肤提取物皮肤损伤修复功效评价结果示意图：第20天对照组的创面形态；

图8为本发明实施例提供的钝口螈皮肤提取物皮肤损伤修复功效评价结果示意图：第20天实验组的创面形态。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

本发明的描述中，除非另有说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。除非另有说明，各个反应或操作步骤可以按照顺序进行，也可以不按照顺序进行。优选地，本发明中的反应方法是按照顺序进行的。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1钝口螈皮肤提取物的制备

1）从具备人工养殖资质的养殖场（九台区卡伦译文观赏鱼养殖场，吉林省长春市九台区卡伦孙家村6组）采购15~17cm大小的白色墨西哥钝口螈35只。

2）取样前，使用鱼类麻醉剂3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（百灵威科技，247097）将钝口螈进行麻醉，麻醉方案：1L水中加入1.5g麻醉剂，钝口螈置入其中，麻醉15分钟，呈身体不运动状态；之后处死取皮：钝口螈平铺在台面上，用手术刀沿背部脊柱两侧分别进行竖向划破，沿脖颈处一圈进行横向划破，用镊子进行皮肤剥离；最终得到约170g钝口螈皮。

3）将钝口螈皮浸泡至磷酸盐缓冲液中清洗3遍。

4）清洗后，用吸水纸吸去钝口螈皮表面水分。

5）放入10cm培养皿中，用剪刀剪成0.3×0.3cm大小的小块（保证钝口螈皮液氮速冻充分），转移至15ml离心管中，加入皮重等重的含1×蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液（pH=6.09）。

6）将装有钝口螈皮肤块的15mL离心管浸没至液氮中，浸没5分钟，至钝口螈皮块和缓冲液完全冻结；

7）速冻后放入-80℃冰箱，冻存24小时后，取出常温解冻。

8）再次放入-80℃冰箱，冻存24小时，取出常温解冻。

9）步骤8重复操作1次。

10）完全解冻后，将样本转移至干净的50mL离心管中，液面不超过25mL，防止机械破碎过程中液体溅出；使用手持式高速匀浆机进行搅碎，机械破碎参数：破碎15分钟，每5分钟停一次，取出探头上缠绕的肉筋，丢弃，破碎全程在冰上进行，控制温度使蛋白不变性。

11）完全搅碎后，进行离心，4℃，4000g，离心10分钟。

12）用巴氏滴管穿过上层杂质沫，取中层清液，转移至干净的50mL离心管，再次进行离心，4℃，4000g离心10分钟。

13）转移上清进行过滤，使用40μm细胞筛过滤，将滤液收集到干净的50mL离心管中。

14）使用10μm滤网再次进行过滤，将液体收集到干净的50mL离心管中。

15）将过滤后的钝口螈皮肤提取物转移至50mL烧杯中，液体体积控制在20~25mL，烧杯放置在冰上。

16）设置破碎功率为1%，超声开时间4.0s，超声关时间6.0s，工作时间为30分钟，控制温度在35℃以下，将探头浸没入离烧杯底部0.5cm，超声全程在冰上进行。

17）超声破碎完成后，转移液体到干净的50ml离心管中，4℃，4000g,离心10分钟，此时底部明显的黑色沉淀，离心后转移上清到新的50mL离心管中。

18）使用康宁500 mL真空过滤器/0.22 µm孔径/PES滤膜进行过滤，将滤瓶连接真空泵，液体倒入滤瓶中，启动真空泵，进行过滤，收集过滤后的液体。

19）使用0.22 µm孔径/CA滤膜针孔过滤器再次进行过滤，将针筒连接针头过滤器，液体倒入针筒中，推动过滤，收集过滤后的液体至干净的50mL离心管中，共得到140ml提取物液体。

20）使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）测定BCA浓度。

本实施例采用的部分试剂及厂家如表1：

表1

BCA浓度测定结果如图1和表2，可知提取物蛋白浓度为18.4mg/mL，提取物总体积为140mL，则蛋白总量2576μg。

表2

实施例2钝口螈皮肤提取物的无菌检测

取1mL实施例1的钝口螈皮肤提取物进行无菌检测，检测项目如下：肺炎克雷伯杆菌、沙门菌、大肠埃希菌、支气管鲍特杆菌、多杀巴斯特杆菌、噬肺巴斯特杆菌、乙型溶血性链球菌、念珠状链杆菌、鼠棒杆状菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌，检测结果均无菌。

实施例3钝口螈皮肤提取物的活性物质检测

取10mL实施例1的钝口螈皮肤提取物进行质谱检测，并根据肽段图谱确认含有的蛋白质。具体方法为：对相应的肽段通过ETD（电子转移解离）在肽键位置进行断裂，会产生相应的b子离子、y子离子。每个b/y子离子有对应的质荷比（质量除以电荷）以及对应的信号强度，产生理论的质谱图（x轴是质荷比、y轴是信号强度）。通过与理论谱图的匹配，来确定检测到的b/y离子，从而推断出实际谱图对应的肽段序。

经分析，钝口螈皮肤提取物中含有多种活性成分，包括：胶原蛋白家族中的多种，例如COL1A1蛋白、COL1A2蛋白、COL3A1蛋白、COL4A1蛋白、COL5A1蛋白、COL5A2蛋白、COL6A1蛋白、COL6A2蛋白、COL6A3蛋白、COL6A6蛋白、COL11A1蛋白、COL12A1蛋白、COL17A1蛋白、COL18A1蛋白、COL28A1蛋白、COLGALT1蛋白等；纤维胶蛋白家族中的多种，例如FCN1蛋白、FCN3蛋白、FCN2蛋白等；C1Q补体蛋白家族中多种，例如C1QC蛋白、C1QB蛋白、C1QA蛋白、C1QTNF3蛋白等；纤连蛋白（FN1）；细胞色素b5还原酶3（CYB5R3）；烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）；线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）。（蛋白质谱检测结果未进行展示）

实施例4钝口螈皮肤提取物的功效检测和安全测评

取40mL实施例1的钝口螈皮肤提取物原液进行功效和安全测评，检测项目包含抗皱、紧皱、保湿、舒缓、控油、抗光老化功效评价。检测依据包含实验室方法LC-WI-HZ-176 弹性蛋白酶抑制试验作业指导书、LC-WI-HZ-180 保湿功效测试实验指导书、LC-WI-HZ-185透明质酸酶抑制实验作业指导书、LC-WI-HZ-178 5α还原酶抑制实验作业指导书、LC-WI-HZ-174 自由基（DPPH）清除实验作业指导书。

1、抗皱、紧致功效检测结果

弹性纤维由弹性蛋白和微原纤维构成，分布于真皮及皮下组织，使皮肤具有弹性。而由于紫外照射、压力、污染等一些环境因素的作用，会促进体内弹性蛋白酶产生。弹性蛋白酶是胰凝乳蛋白酶家族中的一员，会降解弹性蛋白，造成表皮中连接组织的丧失，从而导致皮肤松驰，皱纹的产生。因此抑制弹性蛋白酶的成生，从而可以阻断或预防皮肤松驰、皱纹的发生，达到抗皱、紧致功效。本实施例通过钝口螈皮肤提取物样品与空白对照组进行弹性蛋白酶抑制率结果比对。如钝口螈皮肤提取物样品的抑制率优于（高于）空白对照组的抑制率且统计学差异 P 值＜0.05，则可以认为该样品具有一定的抗皱、紧致功效。

步骤为：将各组样品进行预处理，制成混合溶液；在培养箱 25℃条件下孵育 15分钟；然后加入一定量弹性蛋白酶继续孵育 15 分钟；利用酶标分析仪在波长 410nm 测试弹性蛋白酶抑制率 OD 值；计算抑制率并统计差异 P 值。

结果如图2和表3所示。

表3

由结果可知，钝口螈皮肤提取物样品的抑制率优于（高于）空白对照组的抑制率且统计学差异 P 值＜0.05，说明钝口螈皮肤提取物样品具有紧致、抗皱功效。

2、保湿功效检测结果

皮肤的角质层中的水分对维护皮肤健康，防止皮肤的老化以及滋润有重要作用，而皮肤干燥的原因是角质层水分不足，而且水分常常以结合水的方式与角质层结合。本实施例通过连续监测处理后的钝口螈皮肤提取物试验样品的水分重量变化，绘制成试验样品的水分变化率Δm—时间变化曲线。根据水分变化率Δm 曲线趋势观察试验样品保湿能力，进而评价试验样品对皮肤保湿功效。

步骤为：对样品进行预处理，将样品和阳性对照（本实施例采用甘油）放置于一定温湿条件下的恒温恒湿箱中，定期使用电子天平称量，记录数据，计算水分变化率Δm，制作曲线。

结果如图3和表4所示。

表4 水分变化率Δm试验结果

由结果可知，钝口螈皮肤提取物样品的水分变化率Δm 曲线小于（优于）阳性对照水分变化率Δm 曲线，说明样品具有保湿功效。

3、舒缓功效检测结果

透明质酸在皮肤和其他组织中广泛存在，透明质酸与皮肤的关系非常紧密。大分子透明质酸能够抑制炎症反应，从而对皮肤炎症所引起的不适能起到缓解作用。大分子透明质酸会在透明质酸酶的作用下降解，造成大分子透明质酸含量下降。分解产生降解产物N-乙酰氨基葡糖。测定反应体系中的 N-乙酰氨基葡糖含量可以间接反应透明质酸酶的活性。本实施例通过测定反应体系中的 N-乙酰氨基葡糖含量来确定该试验样品对透明质酸酶的抑制率。如试验样品的抑制率优于（高于）空白对照组的抑制率且统计学差异 P 值＜0.05，则可以认为试验样品具有一定的舒缓功效。

步骤为：对试验样品进行预处理，制备不同稀释度样品管，同时做平行空白组和阳性对照；分别在各组中加入反应物混匀后，置于恒温水浴锅中 37℃水浴 40 分钟；加入 PH调节剂，沸水中水浴 15 分钟，冰浴 10分钟后，冷却至室温；用酶标分析仪在波长 530nm测OD 值，计算透明质酸酶活性抑制率和统计差异P值。

结果如图4和表5所示。

表5

由结果可知，钝口螈皮肤提取物样品的抑制率优于（高于）空白对照组的抑制率且统计学差异 P 值＜0.05，说明钝口螈皮肤提取物样品具有舒缓功效。

4、控油功效检测结果

5α-还原酶( 5α-reductase)是依赖还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的膜蛋白酶，是皮肤中重要的雄性激素代谢酶，能不可逆地转化睾酮（Testosterone,T）为双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT），DHT 是活性最强的雄性激素，能够诱发皮脂腺过度分泌油脂。通过抑制 5α-还原酶活性来降低 DHT 水平能有效缓解皮脂腺过度分泌油脂。本实施例通过试验样品与空白对照组进行 5α-还原酶抑制率试验结果比对。如试验样品的抑制率优于（高于）空白对照组的抑制率且统计学差异 P 值＜0.05，则可以认为试验样品具有一定的控油功效。

步骤为：对各组样品进行预处理，分别加入到孔板中进行预反应，放置于培养箱37℃，30分钟；预反应完成后加入酶试剂，继续反应，放置于培养箱37℃，30分钟；在每个孔中先加入显色剂，在培养箱37℃避光显色，加入终止液，终止反应；上机测试测量各孔的吸光度，记录数据，计算抑制率。

结果如图5和表6所示。

表6

由结果可知，钝口螈皮肤提取物样品的抑制率优于（高于）空白对照组的抑制率且统计学差异 P 值＜0.05，说明钝口螈皮肤提取物样品具有控油功效。

5、抗光老化功效检测结果

日光中的紫外线辐射可引起人体皮肤组织光老化，特征之一为光暴露部位的皮肤出现衰老、皱纹。引起皮肤光老化的机制体有多种，其中一种是光照辐射可以导致自由基的产生，自由基具有极强的氧化能力，它们通过氧化反应攻击任何生物分子，与脂质、糖类、蛋白质、脱氧核糖核酸等大分子物质发生各种氧化反应，引起变性、交联、断裂等氧化损伤，进而导致细胞结构和功能的破坏，以及机体组织的损伤和器官的病变，在皮肤上就表现为光老化等。当试验样品有自由基清除剂存在时，1，1-二苯基-2- 三硝基苯肼（DPPH）试剂（一种稳定的长寿命自由基）光吸收减弱。 由此可评价试验样品清除自由基的能力，即抗氧化活性的大小。本实施例通过试验样品与空白对照组进行 DPPH 自由基清除率试验。如试验样品的清除率优于（高于）空白对照组的清除率且统计学差异 P 值＜0.05，则可以认为试验样品具有一定的抗光老化功效。

步骤为：对试验样品进行预处理，制备不同稀释度样品管，同时做平行空白组和阳性对照；加入自由基DPPH，制备多管样品，摇匀，备用；室温下静置5 分钟后，酶标分析仪在波长517nm 测定吸光值；记录数据，计算添加受试物前后清除率和统计差异P值。

结果如图6和表7所示。

表7

由结果可知，钝口螈皮肤提取物样品的清除率优于（高于）空白对照组的清除率且统计学差异 P 值＜0.05，说明钝口螈皮肤提取物样品具有抗光老化功效。

实施例5钝口螈皮肤提取物的皮肤损伤修复功效评价

本实施例通过SD大鼠烫伤模型及干预实验，验证钝口螈皮肤提取物的皮肤损伤修复功效。

1、使用8周龄SD大鼠，随机、均匀分组（对照组和实验组）。

2、准备阶段

对SD大鼠进行腹部剃毛处理，确保皮肤光滑无毛；使用脱毛膏对剃毛区域进一步脱毛，作用时间为9分钟；脱毛完成后，用生理盐水清洗干净脱毛区域，并擦干待用。

3、烫伤处理

使用直径为1.5 cm的金属烫台，调节烫台温度至200℃，在SD大鼠左右两侧腹部下方各烫一次，每次烫伤持续12秒；烫伤处理后，及时观察烫伤部位并清洁创面。

4、分组处理

对照组：将面膜布浸泡300 μL PBS（磷酸盐缓冲液），敷于烫伤创面后进行无菌包扎。

实验组：将实施例1获得的钝口螈提取物300μL均匀涂于烫伤创面，同样敷以面膜布并进行无菌包扎。

5、换药与观察

第1周：每日更换药物和敷料，观察并记录伤口愈合情况。

第2周至第20天：每3天更换一次药物和敷料，持续记录伤口愈合进展，包括创面收缩率、愈合面积等指标。

6、分析结果

在第20天实验结束后，对各组创面进行形态学和组织学分析，使用ImageJ软件比较对照组与实验组在伤口愈合效果上的差异。

第20天对照组（图7）和实验组（图8）的创面形态如图7-8所示，创伤面积统计如表8.

表8

由结果可知，钝口螈皮肤提取物样品对皮肤的损伤修复功效要优于对照组，说明其具有较好的皮肤损伤修复功能。可用于开发基于该提取物的护肤品、药物来治疗或改善皮肤损伤，还可用于开发皮肤修复药物，具有极高的科研意义和实际价值。

以上是对本申请的较佳实施进行了具体说明，但本申请并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术人员在不违背本申请精神的前提下还可作出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种钝口螈皮肤提取物在制备皮肤损伤修复药物或化妆品中的应用，所述钝口螈皮肤提取物的制备方法包括步骤：

对钝口螈皮肤取样，将获得的皮肤样本保存在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中，所述缓冲液的pH值为5.5~6；

对获得的皮肤样本进行液氮速冻和冻融；

将冻融后的样本进行机械破碎；

将机械破碎后的样本粗提物进行离心过滤；

将离心过滤后的样本提取物进行超声破碎；

将超声破碎后的二次提取物进行除菌过滤，获得钝口螈皮肤提取物；

其中，所述钝口螈采购自具备人工养殖资质的养殖场。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述钝口螈包括墨西哥钝口螈。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将超声破碎后的二次提取物进行双重除菌过滤，所述双重除菌过滤采用的滤膜孔径为0.22μm。

4.一种钝口螈皮肤提取物在制备皮肤抗衰老的产品中的应用，所述抗衰老包括抗皱、紧致、保湿、舒缓、控油、或抗光老化中的至少一种；

所述钝口螈皮肤提取物的制备方法包括步骤：

对钝口螈皮肤取样，将获得的皮肤样本保存在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中，所述缓冲液的pH值为5.5~6；

对获得的皮肤样本进行液氮速冻和冻融；

将冻融后的样本进行机械破碎；

将机械破碎后的样本粗提物进行离心过滤；

将离心过滤后的样本提取物进行超声破碎；

将超声破碎后的二次提取物进行除菌过滤，获得钝口螈皮肤提取物；

其中，所述钝口螈采购自具备人工养殖资质的养殖场。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备皮肤护理产品。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备治疗衰老相关皮肤疾病的药物。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备弹性蛋白酶抑制剂、透明质酸酶抑制剂、5α还原酶抑制剂、或自由基清除剂。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物组合物、或化妆品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物组合物、或化妆品还包括药学或护肤品可接受的载体。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述化妆品包括抗皱产品、紧致产品、保湿产品、舒缓产品、控油产品、抗光老化产品；

和/或，所述化妆品的类别包括精华、乳液、面霜、面膜；

和/或，所述化妆品的成分还包括甘油、透明质酸、丙二醇、或丁二醇中的至少一种。