CN119836230A - 具有人源化clec9a基因的非人动物 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种经基因修饰的啮齿动物，所述经基因修饰的啮齿动物在其基因组中包含人源化Clec9a基因。本文还公开了一种分离的啮齿动物组织或细胞，所述分离的啮齿动物组织或细胞包括啮齿动物胚胎干细胞、啮齿动物胚胎；一种制备所述经基因修饰的啮齿动物的方法；以及使用所述经基因修饰的啮齿动物的方法。

Description

具有人源化CLEC9A基因的非人动物

相关申请案的交叉引用

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序列表为2023年6月13日创建的名称为39341WO_10900WO01_SequenceListing.xml、大小为53KB的XML格式文件，其经由专利中心提交给美国专利及商标局，并且以引用的方式整体并入本文。

背景技术

C-型凝集素结构域家族9成员A(Clec9a)是一种C-型凝集素样受体，以糖基化二聚体形式在树突细胞和一小部分单核细胞亚群的细胞表面表达。Clec9a可以介导胞吞作用，但不能介导吞噬作用。Clec9a具有基于细胞质免疫受体酪氨酸的活化样基序(“ITAM”)，据报道ITAM可募集Syk激酶并且诱导促炎性细胞因子的产生。

发明内容

在一些实施方案中，本文公开了一种经基因修饰的啮齿动物，所述经基因修饰的啮齿动物在其基因组中包含人源化Clec9a基因，其中所述人源化Clec9a基因包含啮齿动物Clec9a核酸序列和人CLEC9A核酸序列，其中所述人源化Clec9a基因编码人源化Clec9a多肽，所述人源化Clec9a多肽包含与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。

在一些实施方案中，人源化Clec9a蛋白包含与啮齿动物Clec9a蛋白(例如，内源性啮齿动物Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列基本上相同的胞质-跨膜序列。在一些实施方案中，人源化Clec9a蛋白包含与啮齿动物Clec9a蛋白(例如，内源性啮齿动物Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列相同的胞质-跨膜序列。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因中的人CLEC9A核酸序列编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因中的人CLEC9A核酸序列编码人CLEC9A的氨基酸57-241(例如，如SEQ ID NO:4所示的人CLEC9A)。在一些实施方案中，人CLEC9A核酸序列包含人CLEC9A基因的外显子3至外显子6中的终止密码子。在一些实施方案中，人CLEC9A核酸序列包含人CLEC9A基因的外显子3至外显子6(即，至外显子6的3'末端)。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因中的啮齿动物Clec9a核酸序列包含啮齿动物Clec9a基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码啮齿动物Clec9a蛋白(例如，内源性啮齿动物Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列的至少大部分。在一些实施方案中，啮齿动物Clec9a核酸序列包含啮齿动物Clec9a基因(例如，内源性啮齿动物Clec9a基因)的外显子1和外显子2。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因包含(i)啮齿动物Clec9a基因(例如，内源性啮齿动物Clec9a基因)的外显子1和外显子2，以及(ii)人CLEC9A基因的外显子3至外显子6中的终止密码子，任选地外显子3至外显子6。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因包含啮齿动物Clec9a基因的3'UTR。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因包含(i)啮齿动物Clec9a基因(例如，内源性啮齿动物Clec9a基因)的外显子1和外显子2，(ii)人CLEC9A基因的外显子3至外显子6，以及(iii)啮齿动物Clec9a基因(例如，内源性啮齿动物Clec9a基因)的3'UTR。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因可操作地连接至啮齿动物Clec9a启动子，诸如内源性啮齿动物Clec9a启动子。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因位于除内源性啮齿动物Clec9a基因座之外的基因座处。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因位于内源性啮齿动物Clec9a基因座处。

在人源化Clec9a基因位于内源性啮齿动物Clec9a基因座处的实施方案中的一些中，人源化Clec9a基因是由于用人CLEC9A核酸替换内源性啮齿动物Clec9a基因座处的啮齿动物Clec9a基因组DNA而形成的。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因是由于用编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分的人CLEC9A核酸替换包含编码内源性啮齿动物Clec9a蛋白的胞外结构域的至少大部分的核苷酸序列的啮齿动物基因组DNA而形成的。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠，并且其中被替换的小鼠基因组DNA包含内源性小鼠Clec9a基因的外显子3至外显子6中的终止密码子，并且人基因组DNA包含人CLEC9A基因的外显子3至外显子6中的终止密码子(任选地外显子3至外显子6)。

在一些实施方案中，啮齿动物对人源化Clec9a基因是杂合的。

在一些实施方案中，啮齿动物对人源化Clec9a基因是纯合的。

在一些实施方案中，人源化Clec9a多肽由人源化Clec9a基因在啮齿动物中的树突细胞上表达。

在一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的啮齿动物组织或细胞，所述分离的啮齿动物组织或细胞的基因组包含本文所述的人源化Clec9a基因。在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是卵子或精子。在一些实施方案中，分离的啮齿动物组织或细胞是小鼠组织或小鼠细胞，或者大鼠组织或大鼠细胞。

在一些实施方案中，本文公开了一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎包含啮齿动物胚胎干细胞，所述啮齿动物胚胎干细胞包含本文所述的人源化Clec9a基因。

在一些实施方案中，本文公开了一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将啮齿动物基因组修饰为包含人源化Clec9a基因，其中所述人源化Clec9a基因包含啮齿动物Clec9a核酸序列和人CLEC9A核酸序列，并且编码包含与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Clec9a多肽；以及制备包含经修饰的啮齿动物基因组的啮齿动物。

在一些实施方案中，修饰啮齿动物基因组包括以下步骤：将包含人CLEC9A核酸序列的核酸分子引入啮齿动物胚胎干(ES)细胞的基因组中，获得人CLEC9A核酸序列已被整合到内源性Clec9a基因座中以替换啮齿动物Clec9a基因组DNA从而形成人源化Clec9a基因的啮齿动物ES细胞，以及由所获得的啮齿动物ES细胞产生啮齿动物。在一些实施方案中，人CLEC9A核酸序列编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分。在一些实施方案中，引入ES细胞中的核酸分子还包含侧接人CLEC9A核酸序列的5'同源臂和3'同源臂，其中所述5'同源臂和3'同源臂与侧接待替换的啮齿动物Clec9a基因组DNA的内源性啮齿动物基因座处的核酸序列同源。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因可操作地连接至啮齿动物Clec9a启动子，例如，内源性啮齿动物Clec9a基因座处的内源性啮齿动物Clec9a启动子。

在所述方法的一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

在一些实施方案中，本文公开了一种靶向核酸构建体，所述靶向核酸构建体包含待整合到内源性啮齿动物Clec9a基因座处的啮齿动物Clec9a基因中的人CLEC9A核酸序列，所述人CLEC9A核酸序列侧接与啮齿动物Clec9a基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中人CLEC9A核酸序列向啮齿动物Clec9a基因中的整合使啮齿动物Clec9a基因组DNA被人CLEC9A核酸序列替换，从而形成人源化Clec9a基因，并且其中所述人CLEC9A核酸序列编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分。在靶向核酸的一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

在一些实施方案中，本文公开了一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述体外方法包括将靶向载体引入啮齿动物细胞中，所述靶向载体包含编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分的人CLEC9A核酸序列，所述人CLEC9A核酸序列侧接啮齿动物同源臂，所述啮齿动物同源臂介导人CLEC9A核苷酸序列向内源性啮齿动物Clec9a基因座的整合，所述整合使啮齿动物Clec9a基因组DNA被人CLEC9A核酸序列替换，以形成如本文所述的人源化Clec9a基因，从而产生经基因修饰的啮齿动物细胞。在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物ES细胞，并且所述方法产生经基因修饰的啮齿动物ES细胞。

在一些实施方案中，本文公开了一种评估候选药物的药代动力学性质的方法，所述方法包括将候选药物施用于本文所述的啮齿动物，以及进行一种或多种测定以确定候选药物在啮齿动物体内的药代动力学性质。在一些实施方案中，候选药物是结合至人CLEC9A的抗体。在一些实施方案中，候选药物是能够结合至人CLEC9A的抗体。

在一些实施方案中，本文公开了一种用于筛选或评价靶向人CLEC9A的候选药物的方法，所述方法包括将候选药物施用于本文所述的啮齿动物，以及进行确定候选药物是否对啮齿动物有作用(例如，诱导免疫细胞(诸如T细胞)的活化)的一种或多种测定。在一些实施方案中，一种或多种测定包括测量啮齿动物中的T细胞增殖的测定。在一些实施方案中，一种或多种测定包括测量啮齿动物中的CD4+T细胞增殖的测定。在一些实施方案中，一种或多种测定包括测量啮齿动物中的CD8+T细胞增殖的测定。在一些实施方案中，候选药物包括结合至人CLEC9A的抗体。在一些实施方案中，候选药物包括结合至人CLEC9A的抗体，所述人CLEC9A与啮齿动物的树突细胞上的MHC分子识别的一种或多种肽融合。在一些实施方案中，一种或多种肽包括OVA肽I(“OTI”，卵清蛋白的氨基酸257-264)和/或OVA肽II(“OTII”，卵清蛋白的氨基酸323-339)。

附图说明

图1A描绘了小鼠Clec9a基因的人源化策略的示例性实施方案。小鼠Clec9a基因和人CLEC9A基因以水平线表示，它们的外显子以位于水平线上的方框表示。内源性小鼠Clec9a基因座处的7138bp的连续小鼠Clec9a基因组片段(包括外显子3至外显子6中的终止密码子)被包含外显子3至外显子6的4840bp的人CLEC9A基因组片段替换。结果，小鼠Clec9a的整个胞外结构域(包括“CLECT-NK受体样”结构域)(氨基酸57-238)被人CLEC9A的胞外结构域(氨基酸57-241)替换，同时小鼠Clec9a的N-末端31个氨基酸(包括“ITAM样”基序)和跨膜结构域(氨基酸32-56)得以保留。另外参见图1D。还标明了在人等位基因获得和小鼠等位基因缺失测定中用于确认正确靶向的引物和探针的位置(以7764hTU、7764hTD、7764mTU和7764mTD表示)。引物和探针的序列如表2所示。

图1B描绘了靶向核酸构建体的示例性实施方案(未按比例绘制)，该靶向核酸构建体包含含有人CLEC9A外显子3-6的人源化片段，后接具有LoxP位点的新霉素盒，侧接来自BAC克隆Rp23-248K14的45.6kb的小鼠5'同源臂(包括小鼠Clec9a的外显子1和外显子2)和112.6kb的小鼠3'同源臂(包括外显子6的3'UTR和小鼠Clec9a的下游序列)。包含人源化Clec9a基因的靶向核酸构建体可以被引入小鼠胚胎干细胞中，用于向小鼠基因组的靶向插入。连接(“A”、“B”和“C”)标明了所提供的它们的序列。

图1C描绘了用于小鼠Clec9a基因座(即移除使用图1B所述的靶向构建体产生的人源化Clec9a基因座的新霉素盒而获得的人源化Clec9a基因座)的人源化策略的示例性实施方案(未按比例绘制)。连接(“A”和“D”)也标明了所提供的它们的序列。

图1D显示了小鼠Clec9a(SEQ ID NO:2)、人CLEC9A(SEQ ID NO:4)和人源化(“7765突变体”)Clec9a(SEQ ID NO:7)的示例性蛋白质序列的比对。跨膜区段(“TM”)以下划线表示；胞外结构域以实心方框标识；CLECT-NK受体样结构域以点线表示。

图2A-2D显示了野生型(“WT”)小鼠(内源性Clec9a基因未经人源化)、人源化Clec9a基因杂合的小鼠(“Het”)和人源化Clec9a基因纯合的小鼠(“HumIn”)中的Clec9amRNA的检测。使用针对小鼠或人Clec9a核苷酸序列的探针对来源于脾细胞的批量RNA进行RT-PCR。2A-2B：使用靶向WT、Het或HumIn小鼠的外显子1-2或外显子3-4的探针进行分析。2C-2D：使用靶向WT、Het或HumIn小鼠的外显子2-3或外显子5-6的探针进行的分析。每种小鼠基因型n＝3；Gapdh用作内部对照。

图3A-3B显示mClec9a表达仅限于野生型(“WT”)小鼠和人源化Clec9a基因杂合的小鼠(“Het”)的循环树突细胞(也称为“cDC1”)中。3A：对小鼠脾细胞进行设门策略。根据大小、单细胞和活细胞对细胞进行设门。将树突细胞对CD11c⁺MHC-II⁺进行设门，并且对Xcr1⁺和CD11b⁺进行进一步亚设门。3B：图中分别描绘了小鼠Clec9a(“mClec9a”)在WT、Het或人源化Clec9a基因纯合的小鼠(“HumIn”)上的表达。FMO；荧光减一。

图4A-4B显示人源化Clec9a表达仅限于人源化Clec9a基因杂合的小鼠(“Het”)和人源化Clec9a基因纯合的小鼠(“HumIn”)的cDC1中。4A：对小鼠脾细胞进行设门策略。根据大小、单细胞和活细胞对细胞进行设门。将树突细胞对CD11c⁺MHC-II⁺进行设门，并且对Xcr1⁺和CD11b⁺进行进一步亚设门。4B：图中分别描绘了人源化Clec9a(hClec9a)在野生型(“WT”)、Het或HumIn小鼠上的表达。FMO；荧光减一。

图5显示人源化Clec9a表达仅限于人源化Clec9a基因杂合的小鼠(“Het”)和人源化Clec9a基因纯合的小鼠(“HumIn”)的cDC1中。左图板显示了人源化Clec9a在Xcr1+细胞上的表达的点图。右图板显示了描绘人源化Clec9a(“hClec9a”)在野生型(“WT”)、Het或HumIn小鼠中的表达的直方图。FMO；荧光减一。

图6A-6B显示人源化Clec9a表达仅限于cDC1。6A：对脾脏CD19⁺B细胞进行的设门(上图板)显示缺乏小鼠或人CLEC9A的表达，如对应于野生型(“WT”)小鼠、人源化Clec9a基因杂合的小鼠(“Het”)和人源化Clec9a基因纯合的小鼠(“HumIn”)的直方图所示。FMO；荧光减一。6B：对脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞进行的设门(上图板)显示缺乏小鼠或人源化Clec9a的表达，如对应于WT、Het或HumIn小鼠的直方图所示。FMO；荧光减一。

图7A-7B显示抗体-抗原融合物靶向Clec9a可引发强烈的体内CD4+T细胞反应。7A：在注射有融合至OVA肽的抗人CLEC9抗体、融合至OVA肽的同种型抗体、PBS、全长OVA或OVA肽的小鼠中对Ki67+OT-II四聚体+T细胞进行设门，其中OVA肽含有OT-I和OT-II抗原。将2×10⁶个CFSE标记的OT-II T细胞转移至小鼠，一天后给予PBS、全长OVA或OVA肽以及15μg、7.5μg和3.75μg的抗体。在抗体注射72小时后收获脾脏并通过流式细胞术进行分析。7B：图7A显示了描绘Ki67⁺OT-II四聚体⁺T细胞的绝对计数的条形图。#、&和@分别表示与每只小鼠15μg、7.5μg和3.75μg的同种型-OVA肽融合物具有统计学意义。误差线表示标准偏差；单因素ANOVA。

图8A-8B显示抗体-抗原融合物靶向Clec9a可引发强烈的体内CD8 T细胞反应。(A)在注射有融合至OVA肽的抗人CLEC9、融合至OVA肽的同种型抗体、PBS、全长OVA或OVA肽的小鼠中对Ki67+OT-I四聚体+T细胞进行设门，其中OVA肽含有OT-I和OT-II抗原。将2×10⁶个CFSE标记的OT-I T细胞转移至小鼠，一天后给予PBS、全长OVA或OVA肽以及15μg、7.5μg和3.75μg的抗体。在抗体注射72小时后收获脾脏并通过流式细胞术进行分析。(B)图8A显示了描绘Ki67⁺OT-I四聚体⁺T细胞的绝对计数的条形图。#表示与每只小鼠15μg的同种型-OVA肽具有统计学意义误差线表示标准偏差。单因素ANOVA。

具体实施方式

本文公开了被基因修饰为包含人源化Clec9a基因的啮齿动物(诸如，但不限于小鼠和大鼠)。本文还公开了用于制备此类经基因修饰的啮齿动物的组合物(例如，靶向载体)和方法。本文公开的啮齿动物可以用作例如但不限于用于评价针对人CLEC9A的候选化合物，诸如抗人Clec9A抗体的体内系统，所述候选化合物靶向树突细胞以治疗广泛的免疫相关适应症，包括但不限于自身免疫感染性疾病和癌症等等。因此，本文还公开了使用经基因修饰的啮齿动物来评估针对人CLEC9A的候选化合物的方法。

啮齿动物Clec9a的人源化

Clec9a是一种C-型凝集素样受体，以糖基化二聚体形式在树突细胞和一小部分单核细胞亚群的细胞表面表达。Clec9a可以介导胞吞作用，但不能介导吞噬作用。Clec9a在其N-末端部分具有基于细胞质免疫受体酪氨酸的活化样基序(“ITAM”)，ITAM是重复两次的四个氨基酸的保守序列，被认为可以募集Syk激酶并且诱导促炎性细胞因子的产生。参见，例如，Huysamen等人,J Biol Chem 283(24),16693-16701(2008)，该文献以引用的方式整体并入本文。

示例性Clec9a序列，包括人、小鼠、大鼠和人源化(小鼠-人杂交体)Clec9a的核酸和蛋白质序列，在序列表中公开并且汇总于表1中。图1D提供了人CLEC9A、小鼠Clec9a和人源化(小鼠-人杂交体)Clec9a蛋白序列的比对。

为简洁起见，本文的外显子的编号是指Clec9a基因的编码外显子。例如，Clec9a基因的外显子1在本文中是指Clec9a基因的第一编码外显子。

表1.序列汇总

在一些实施方案中，本文公开的啮齿动物在种系中包含人源化Clec9a基因。

在一些实施方案中，本文公开的啮齿动物在其基因组中包含人源化Clec9a基因，该人源化Clec9a基因包括啮齿动物Clec9a基因(例如，内源性啮齿动物Clec9a基因)的核苷酸序列和人CLEC9A基因的核苷酸序列。如本文所使用的，“基因的核苷酸序列”包含基因的基因组序列、mRNA或cDNA序列的全部或部分。作为非限制性实例，人CLEC9A基因的核苷酸序列包括人CLEC9A基因的全部或部分的基因组序列、mRNA或cDNA序列。啮齿动物Clec9a基因的核苷酸序列与人CLEC9A基因的核苷酸序列彼此可操作地连接，以使得啮齿动物基因组中的人源化Clec9a基因编码人源化Clec9a蛋白，该人源化Clec9a蛋白维持Clec9a的蛋白质结构(包括含ITAM胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域)并且发挥Clec9a蛋白的功能(例如，募集Syk激酶并且诱导促炎性细胞因子的产生)。

如本文所用，“人CLEC9A”基因和蛋白质是指人来源的CLEC9A基因和蛋白质。在一些实施方案中，人CLEC9A蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，人CLEC9A蛋白包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，人CLEC9A蛋白包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，人CLEC9A蛋白包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。

如本文所用，“啮齿动物Clec9a”基因和蛋白质是指啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)来源的Clec9a基因和蛋白质。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白包含与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，大鼠Clec9a蛋白包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，大鼠Clec9a蛋白包含与SEQ IDNO:25的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，大鼠Clec9a蛋白包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，大鼠Clec9a蛋白包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，经基因修饰的啮齿动物在其基因组中包含人源化Clec9a基因，其中所述人源化Clec9a基因编码含有与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Clec9a蛋白。在一些实施方案中，与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域表现出与人CLEC9A蛋白的胞外结构域相同的功能性(例如，配体结合性质)。“与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是与人CLEC9A蛋白的胞外结构域在序列上具有至少95％同一性的多肽、与人CLEC9A蛋白的胞外结构域在序列上具有至少98％同一性的多肽或者与人CLEC9A蛋白的胞外结构域在序列上具有至少99％同一性的多肽。“与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是与人CLEC9A蛋白的胞外结构域在序列上具有100％同一性的多肽。可替代地或另外地，“与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是与人CLEC9A蛋白的胞外结构域的差异不超过5个氨基酸的多肽、与人CLEC9A蛋白的胞外结构域的差异不超过4个氨基酸的多肽、与人CLEC9A蛋白的胞外结构域的差异不超过3个氨基酸的多肽、与人CLEC9A蛋白的胞外结构域的差异不超过2个氨基酸的多肽或者与人CLEC9A蛋白的胞外结构域的差异不超过1个氨基酸的多肽。可替代地或另外地，“与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是仅在胞外结构域的N-末端或C-末端部分处与人CLEC9A蛋白的胞外结构域不同的多肽，例如，通过在胞外结构域的N-末端和/或C-末端部分处添加、缺失和/或替换氨基酸(即，与胞外结构域的N-末端或C-末端的差异在5-10个氨基酸内)。可替代地或另外地，“与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是具有上文所述的特征中的一个或多个的多肽，例如，与人CLEC9A蛋白的胞外结构域在序列上具有至少95％同一性并且仅在胞外结构域的N-末端或C-末端部分处与人CLEC9A蛋白的胞外结构域的差异不超过5个氨基酸的多肽，或者与人CLEC9A蛋白的胞外结构域在序列上具有至少98％同一性并且仅在胞外结构域的N-末端或C-末端部分处与人CLEC9A蛋白的胞外结构域的差异不超过3个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，人CLEC9A蛋白包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，并且其胞外结构域由SEQ ID NO:4的氨基酸57-241构成。在一些实施方案中，编码人源化Clec9a基因的人源化Clec9a蛋白的胞外结构域与SEQ ID NO:4所示的人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同，即与SEQ ID NO:4的氨基酸57-241基本上相同。例如，编码人源化Clec9a蛋白的人源化Clec9a基因具有的胞外结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-241、58-241、59-241、60-241、57-240、57-239、57-238或57-237。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因编码具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-241的胞外结构域的人源化Clec9a蛋白。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因编码具有包含SEQID NO:4的氨基酸58-241的胞外结构域的人源化Clec9a蛋白。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因编码具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸59-241的胞外结构域的人源化Clec9a蛋白。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因编码具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-240的胞外结构域的人源化Clec9a蛋白。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因编码具有包含SEQID NO:4的氨基酸57-239的胞外结构域的人源化Clec9a蛋白。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因编码的人源化Clec9a蛋白含有与啮齿动物Clec9a蛋白(例如，内源性啮齿动物Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列基本上相同的胞质-跨膜序列(即，包含跨膜结构域和胞质结构域两者的序列)。在一些实施方案中，与内源性啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同的胞质-跨膜序列表现出与啮齿动物Clec9a蛋白(诸如内源性啮齿动物Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列相同的功能(例如，信号转导和/或与胞内分子的相互作用)。“与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同”的胞质-跨膜序列或多肽可以是与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列在序列上具有至少95％同一性的多肽或者与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列在序列上具有至少98％同一性的多肽。“与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同”的胞质-跨膜序列或多肽可以是与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列相同的多肽。可替代地或另外地，“与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同”的胞质-跨膜序列或多肽可以是与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列的差异不超过3个氨基酸的多肽、与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列的差异不超过2个氨基酸的多肽或者与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列的差异不超过1个氨基酸的多肽。可替代地或另外地，“与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同”的胞质-跨膜序列或多肽可以是仅在N-末端或C-末端处与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列不同的多肽，例如，通过在跨膜-胞质序列的N-末端或C-末端部分处添加、缺失或替换氨基酸。可替代地或另外地，“与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同”的胞质-跨膜序列或多肽可以是具有上文所述的一个或多个特征的多肽，例如，与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列在序列上具有至少95％同一性并且仅在N-末端或C-末端处与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列的差异不超过3个氨基酸的多肽；或者与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列在序列上具有至少95％同一性并且仅在N-末端或C-末端处与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列的差异不超过2个氨基酸的多肽。所谓“胞质-跨膜序列的N-末端或C-末端部分”意指与胞质结构域的N-末端或与跨膜结构域的C-末端的差异在3-5个氨基酸内。在一些实施方案中，人源化Clec9a蛋白含有与小鼠Clec9a蛋白(诸如内源性小鼠Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列基本上相同的胞质-跨膜序列。在一些实施方案中，人源化Clec9a蛋白含有与大鼠Clec9a蛋白(诸如内源性大鼠Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列基本上相同的胞质-跨膜序列。

在一些实施方案中，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化Clec9a基因包含人CLEC9A基因的核苷酸序列(“人CLEC9A核苷酸序列”)和啮齿动物Clec9a基因的核苷酸序列(“啮齿动物Clec9a核苷酸序列”，诸如内源性啮齿动物Clec9a核苷酸序列)，其中人CLEC9A核苷酸序列编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分。人CLEC9A的胞外结构域的大部分的实例可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-241、57-240、57-239、58-241或59-241。在一些实施方案中，胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-241。在一些实施方案中，胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-240。在一些实施方案中，胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-239。在一些实施方案中，胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸58-241。在一些实施方案中，胞外结构域的大部分包含SEQ IDNO:4的氨基酸59-241。在一些实施方案中，人CLEC9A核苷酸序列是cDNA序列。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因中的人CLEC9A核苷酸序列编码人CLEC9A蛋白(例如，如SEQ ID NO:4所定义的人CLEC9A蛋白)的胞外结构域。在一些实施方案中，人CLEC9A核苷酸序列是人CLEC9A基因的基因组片段。在一些实施方案中，人CLEC9A核苷酸序列是包含外显子3至外显子6中的终止密码子的人CLEC9A基因的基因组片段。在一些实施方案中，人CLEC9A核苷酸序列是包含外显子3至外显子6(即，至外显子6中的3'非翻译区)的人CLEC9A基因的基因组片段。

在一些实施方案中，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化Clec9a基因包含啮齿动物Clec9a核苷酸序列和人CLEC9A核苷酸序列，其中所述啮齿动物Clec9a核苷酸序列编码与啮齿动物Clec9a蛋白(例如，内源性啮齿动物Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列基本上相同的多肽。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因中存在的啮齿动物Clec9a核苷酸序列编码内源性啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因中存在的啮齿动物Clec9a核苷酸序列包含啮齿动物(例如，内源性啮齿动物)Clec9a基因的外显子1(全部或部分，例如，编码部分)和外显子2。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因中存在的啮齿动物Clec9a核苷酸序列是小鼠Clec9a核苷酸序列；并且在一些此类实施方案中，小鼠Clec9a核苷酸序列包含小鼠Clec9a基因(例如，内源性小鼠Clec9a基因)的编码部分外显子1(并且任选地还包括外显子1的5'UTR)和外显子2。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因中存在的啮齿动物Clec9a核苷酸序列还包含啮齿动物Clec9a基因的3'UTR。在一些实施方案中，啮齿动物Clec9a基因的3'UTR位于人CLEC9A基因的3'UTR的下游。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因可操作地连接至啮齿动物Clec9a 5'调控序列，诸如内源性啮齿动物Clec9a调控序列，例如，5'转录调控序列诸如启动子和/或增强子，以使得人源化Clec9a基因的表达在啮齿动物Clec9a 5'调控序列的控制下。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因位于内源性啮齿动物Clec9a基因座处。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因位于除内源性啮齿动物Clec9a基因座之外的基因座；例如，由于随机整合的结果。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因位于ROSA26基因座(该基因座如Zambrowicz等人,1997,PNAS USA 94:3789-3794所述，该文献以引用的方式并入本文)处。在人源化Clec9a基因位于除内源性啮齿动物Clec9a基因座之外的基因座处的一些实施方案中，所述啮齿动物例如由于内源性啮齿动物Clec9a基因的失活(例如，全部或部分缺失)的结果而不能表达啮齿动物Clec9a蛋白。

在人源化Clec9a基因位于内源性啮齿动物Clec9a基因座处的一些实施方案中，所述人源化Clec9a基因是由在内源性啮齿动物Clec9a基因座处的内源性啮齿动物Clec9a基因的核苷酸序列被人CLEC9A基因的核苷酸序列替换产生的。

在一些实施方案中，被替换的内源性啮齿动物Clec9a基因座处的内源性啮齿动物Clec9a基因的核苷酸序列是编码啮齿动物Clec9a蛋白的胞外结构域的至少大部分的内源性啮齿动物Clec9a基因的基因组片段。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠，并且被替换的小鼠Clec9a基因组片段编码内源性小鼠Clec9a蛋白的胞外结构域的至少大部分。例如，SEQID NO:2的小鼠Clec9a的胞外结构域由氨基酸57-238定义，胞外结构域的大部分的实例可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸57-238、57-237、57-236、58-238或59-238。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白的胞外结构域的大部分包含SEQ ID:2的氨基酸57-238。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白的胞外结构域的大部分包含SEQ ID:2的氨基酸57-237。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白的胞外结构域的大部分包含SEQ ID:2的氨基酸57-236。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白的胞外结构域的大部分包含SEQ ID:2的氨基酸58-238。在一些实施方案中，小鼠Clec9a蛋白的胞外结构域的大部分包含SEQ ID:2的氨基酸59-238。在一些实施方案中，被替换的小鼠Clec9a基因组片段包含外显子3至外显子6中的终止密码子。

在一些实施方案中，对在内源性啮齿动物Clec9a基因座处的啮齿动物Clec9a基因的基因组片段进行替换的人CLEC9A基因的核苷酸序列是cDNA序列。在一些实施方案中，对在内源性啮齿动物Clec9a基因座处的啮齿动物Clec9a基因的基因组片段进行替换的人CLEC9A核苷酸序列是人CLEC9A基因的基因组片段。在一些实施方案中，在内源性啮齿动物Clec9a基因座处替换啮齿动物Clec9a基因的基因组片段的人CLEC9A基因的基因组片段包含编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分的人CLEC9A基因的全部或部分外显子。人CLEC9A的胞外结构域的大部分的实例，例如，SEQ ID NO:4的氨基酸57-241、57-240、57-239、58-241或59-241在上文有所描述。在一些实施方案中，人CLEC9A的胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-241。在一些实施方案中，人CLEC9A的胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-240。在一些实施方案中，人CLEC9A的胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-239。在一些实施方案中，人CLEC9A的胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸58-241。在一些实施方案中，人CLEC9A的胞外结构域的大部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸59-241。在一些实施方案中，人基因组片段包含人CLEC9A外显子3至外显子6中的终止密码子。在一些实施方案中，人基因组片段包含人CLEC9A外显子3至外显子6的3'末端(即，包含人CLEC9A的3'UTR)。

在一些实施方案中，插入内源性啮齿动物Clec9a基因座的人CLEC9A核苷酸序列可操作地连接至编码与啮齿动物Clec9a蛋白(诸如内源性啮齿动物，例如小鼠或大鼠，Clec9a蛋白)的胞质-跨膜序列基本上相同的多肽的啮齿动物Clec9a基因的基因组序列。在一些实施方案中，啮齿动物Clec9a基因的基因组序列包含啮齿动物Clec9a基因(例如，内源性小鼠或大鼠Clec9a基因)的外显子1和外显子2。在一些实施方案中，啮齿动物Clec9a基因的基因组序列还包含啮齿动物Clec9a基因的3'UTR。

在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠，并且包含小鼠Clec9a基因(编码小鼠Clec9a胞外结构域)的外显子3至外显子6中的终止密码子的在内源性小鼠Clec9a基因座处的内源性小鼠Clec9a基因的基因组片段已经被包含编码人CLEC9A胞外结构域的外显子3至外显子6中的终止密码子的人CLEC9A基因的基因组片段替换。在一些实施方案中，人源化Clec9a基因在内源性小鼠Clec9a基因座处形成，并且包含小鼠Clec9a基因的外显子1-2、人CLEC9A基因的外显子3至外显子6、任选地随后是小鼠Clec9a基因的3'UTR。

在一些实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人源化Clec9a基因是杂合的。在一些实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人源化Clec9a基因是纯合的。

在一些实施方案中，人源化Clec9a基因导致在啮齿动物中表达所编码的人源化Clec9a蛋白。在一些实施方案中，人源化Clec9a蛋白在细胞和组织中表达，其中对照啮齿动物(例如，无人源化Clec9a基因的啮齿动物)中的对应的啮齿动物Clec9a蛋白通常例如在树突细胞上表达。

在一些实施方案中，本文所公开的啮齿动物例如由于内源性啮齿动物Clec9a基因的失活(例如，全部或部分缺失)或替换(全部或部分)的结果而不能表达啮齿动物Clec9a蛋白。

啮齿动物物种和品系

在一些实施方案中，作为非限制性实例，本公开的啮齿动物包含小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物选自鼠总科(superfamily Muroidea)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物来自选自以下的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，丽仓鼠(mouse-like hamster))、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺棒睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一些实施方案中，本公开的小鼠来自鼠科的成员。

在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是选自以下的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在一些实施方案中，啮齿动物是选自由下列品系组成的组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见，例如，Festing等人，1999,Mammalian Genome10:836；Auerbach等人,2000,Biotechniques 29(5):1024-1028,1030,1032；这两篇文献以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，啮齿动物是129品系和C57BL/6品系的混合体的小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是前述129品系的混合体或前述BL/6品系的混合体的小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是BALB品系(例如，BALB/c品系)的小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是BALB品系和另一前述品系的混合物的小鼠。

在一些实施方案中，啮齿动物是大鼠。在一些某些实施方案中，大鼠选自威斯塔大鼠(Wistar rat)、LEA品系、斯泼累格多雷品系(Sprague Dawley strain)、费舍尔品系(Fischer strain)、F344、F6和黑刺鼠(Dark Agouti)。在一些实施方案中，如本文所描述的大鼠品系是选自由以下组成的组的两个或更多个品系的混合体：威斯塔、LEA、斯泼累格多雷、费舍尔、F344、F6和黑刺鼠。

经基因修饰的啮齿动物的组织和细胞

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的啮齿动物细胞或组织，所述分离的啮齿动物细胞或组织的基因组包含人源化Clec9a基因。

在一些实施方案中，组织选自脂肪、膀胱、脑、乳房、骨髓、眼、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵子以及其组合。

在一些实施方案中，细胞选自树突细胞或单核细胞。

在一些实施方案中，分离的啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。在一些实施方案中，分离的啮齿动物细胞是啮齿动物卵子或啮齿动物精子。

用于制备人源化啮齿动物的组合物和方法

本文公开了一种靶向载体(或核酸构建体)，所述靶向载体(或核酸构建体)包含希望整合到啮齿动物基因座中以形成如本文所述的人源化Clec9a基因的人CLEC9A核苷酸序列。

在一些实施方案中，靶向载体包含编码如上文所述的人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分的人CLEC9A核苷酸序列。在一些实施方案中，人CLEC9A核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸57-241的多肽。在一些实施方案中，人CLEC9A核苷酸序列包含编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的外显子3至外显子6中的终止密码子。

靶向载体还包含侧接待整合的人核苷酸序列的5'和3'啮齿动物序列，也称为5'和3'同源臂，该5'和3'同源臂介导人核苷酸序列向靶标啮齿动物基因座(例如，内源性啮齿动物Clec9a基因座)的同源重组和整合，从而形成如上文所述的人源化基因。通常，靶向载体中的5'和3'侧接啮齿动物序列与侧接将被人核苷酸序列替换的靶标啮齿动物基因座处对应的啮齿动物核苷酸序列的核苷酸序列相同或基本上相同(例如，具有至少98％或至少99％同一性)。在一些实施方案中，靶向载体包括如上文所描述的人源化基因。在一些实施方案中，靶向载体包含人源化Clec9a基因，该人源化Clec9a基因包含人CLEC9A核苷酸序列和啮齿动物Clec9a核苷酸序列，如上文所述。在一些实施方案中，靶向载体包含人源化Clec9a基因，其中所述人源化Clec9a基因包含啮齿动物Clec9a基因的外显子1-2和人CLEC9A基因的外显子3-6，并且任选地所述人源化Clec9a基因侧接5'和3'啮齿动物同源臂。

在一些实施方案中，靶向载体包括选择标记基因。可以将选择标记基因插入要整合的人基因组序列的内含子中。在一些实施方案中，选择标记基因作为自删除盒提供，所述自删除盒可以在成功整合人核苷酸序列之后删除。

在一个示例性实施方案中，使用细菌同源重组和技术，从携带啮齿动物Clec9a基因组DNA的细菌人工染色体(BAC)克隆产生靶向载体(参见，例如，U.S.6,586,251和Valenzuela等人(2003)Nature Biotech.21(6):652-659，该文献以引用的方式整体并入本文)。由于细菌同源重组，从BAC克隆中缺失啮齿动物基因组序列，并且插入人核苷酸序列，从而产生携带人核苷酸序列的经修饰的BAC克隆，所述人核苷酸序列侧接有5'和3'啮齿动物同源臂。在一些实施方案中，人核苷酸序列可以是cDNA序列或人基因组DNA。经修饰的BAC克隆一旦线性化就可以引入到啮齿动物胚胎干(ES)细胞中。

在一些实施方案中，本发明提供了如本文所描述的靶向载体用于制备经修饰的啮齿动物胚胎干(ES)细胞的用途。可以通过例如电穿孔将靶向载体引入到啮齿动物ES细胞中。本领域已经描述了小鼠ES细胞和大鼠ES细胞两者。参见，例如，US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US 2008-0078000A1(所有这些专利均以引用的方式整体并入本文)，这些专利描述了小鼠ES细胞和用于制备经基因修饰的小鼠的方法；US2014/0235933A1(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)、US 2014/0310828A1(RegeneronPharmaceuticals,Inc.)，Tong等人(2010)Nature 467:211-215，和Tong等人(2011)NatProtoc.6(6):doi:10.1038/nprot.2011.338(所有这些文献均以引用的方式整体并入本文)，这些文献描述了大鼠ES细胞和用于制备经基因修饰的大鼠的方法，该方法可以用于制备经修饰的啮齿动物胚胎，继而可以用于制备啮齿动物。

在一些实施方案中，可以选择具有整合在基因组中的所期望的人核苷酸序列(例如，人CLEC9A核苷酸序列)的ES细胞。在一些实施方案中，基于啮齿动物等位基因的丢失和/或人等位基因测定的增益来选择ES细胞。在一些实施方案中，然后将所选ES细胞用作供体ES细胞以通过使用方法(参见例如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US2008-0078000 A1，所述专利全部以全文引用的方式并入)或在US 2014/0235933A1和US2014/0310828 A1(所述文献均以全文引用的方式并入)中描述的方法注射到桑椹胚前期胚胎(例如，8细胞期胚胎)中。在一些实施方案中，包括供体ES细胞的胚胎被温育并且植入到代孕母亲体内以产生F0啮齿动物。可以通过使用啮齿动物等位基因的丢失和/或人等位基因测定的增益对从剪尾分离的DNA进行基因分型来鉴定携带人核苷酸序列的啮齿动物幼崽。

在一些实施方案中，可以使对人源化基因而言杂合的啮齿动物杂交以产生纯合的啮齿动物。

如本文所述的人源化啮齿动物(即，包含人源化Clec9a基因的啮齿动物)可以与另一种啮齿动物交配或杂交。因此，繁殖方法以及从此类繁殖获得的子代也是本公开的实施例。

在一些实施方案中，提供了一种方法，所述方法包括将如上文所述的第一啮齿动物(例如，基因组包含人源化Clec9a基因的啮齿动物)与第二啮齿动物进行交配，以产生基因组包含人源化Clec9a基因的子代啮齿动物。子代可以拥有从繁殖中所使用的第二啮齿动物遗传的其它期望的表型或基因修饰。在一些实施方案中，子代啮齿动物对来自第一啮齿动物的一种或多种人源化基因是杂合的。在一些实施方案中，子代啮齿动物对来自第一啮齿动物的人源化基因是纯合的。

在一些实施方案中，提供了基因组包含人源化Clec9a基因的子代啮齿动物，其中所述子代啮齿动物通过如下方法产生，所述方法包括将基因组包含人源化Clec9a基因的第一啮齿动物与第二啮齿动物进行交配。在一些实施方案中，子代啮齿动物对来自第一啮齿动物的人源化Clec9a基因是杂合的。在一些实施方案中，子代啮齿动物对来自第一啮齿动物的人源化Clec9a基因是纯合的。

在一些实施方案中，本文公开了一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述体外方法包括将靶向载体引入啮齿动物细胞中，所述靶向载体包含编码人CLEC9A蛋白的胞外结构域的至少大部分的人CLEC9A核酸序列，所述人CLEC9A核酸序列侧接啮齿动物同源臂，所述啮齿动物同源臂介导人CLEC9A核苷酸序列向内源性啮齿动物Clec9a基因座的整合，所述整合使啮齿动物Clec9a基因组DNA被人CLEC9A核酸序列替换，以形成如本文所述的人源化Clec9a基因，从而产生经基因修饰的啮齿动物细胞。在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物ES细胞，并且所述方法产生经基因修饰的啮齿动物ES细胞。

采用人源化啮齿动物的方法

本文公开的啮齿动物提供了用于鉴定和测试化合物治疗其中CLEC9A可以发挥作用的人类疾病的潜力的有用的体内系统和生物材料来源，所述人类疾病包括免疫相关适应症，即，可以涉及免疫功能失调或由免疫功能失调导致的病症，诸如自身免疫感染性疾病和癌症等等。

在一些实施方案中，本文公开的经基因修饰的啮齿动物用于评价靶向人CLEC9A的药剂。在一些实施方案中，药剂是特异性结合至人CLEC9A的抗体。候选药剂诸如抗人CLEC9A抗体可以以多个剂量(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg或更高)施用于本文公开的啮齿动物。药剂可以经由任何所期望的施用途径(例如，皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)来给药。

在一些实施方案中，本文公开的经基因修饰的啮齿动物用于评估候选药剂(诸如抗人CLEC9A抗体)的药代动力学性质。该药剂被施用于经基因修饰的啮齿动物。在多个时间点(例如，0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或最多30天或更多天)从动物分离血液。确定药代动力学性质可以进行的多种测定可以包括但不限于动物将药物处理成各种代谢物的方式(或一种或多种药物代谢物，包括毒性代谢物的存在或不存在的检测)、药物半衰期、施用后药物的循环水平(例如，药物的血清浓度)、抗药物反应(例如，抗药物抗体)、药物吸收和分布、施用途径、排泄途径和/或药物清除。

在一些实施方案中，本文公开的经基因修饰的啮齿动物用于评价靶向人CLEC9A的药剂(例如，抗体)，以确定该药剂是否对啮齿动物具有影响，例如，该药剂是否触发树突细胞依赖性免疫细胞(诸如T细胞)的活化。这种评估可以通过以下步骤来进行：将本文公开的药剂施用于啮齿动物并且评估啮齿动物中的免疫细胞以确定免疫细胞是否活化，例如，T细胞的增殖和/或细胞因子的产生。可以与未施用药剂的对照啮齿动物或者施用对照药剂(例如，同种型抗体)的对照啮齿动物进行比较。在一些实施方案中，向本文公开的啮齿动物(例如，在树突细胞上表达人源化Clec9a蛋白的小鼠或大鼠)施用抗体-肽融合物，其中所述抗体结合至人CLEC9A胞外结构域，并且其中所述肽包括由树突细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)分子识别的一种或多种抗原。在一些实施方案中，所述肽包括由MHC I类分子识别的抗原(例如，卵清蛋白的氨基酸257-264，也称为OTI肽)和由MHC II类分子识别的抗原(例如，卵清蛋白的氨基酸323-339，也称为OTII肽)。然后检查啮齿动物以确定向抗体-肽融合物的暴露是否会诱导T细胞反应(例如，T细胞增殖)。在一些实施方案中，检查啮齿动物以测量是否存在CD4+T细胞增殖。在一些实施方案中，检查啮齿动物以测量是否存在CD8+T细胞增殖。用于评价动物中的T细胞反应的方法和测定是本领域熟知的，并且还在下文的实施例部分中进行了说明。可以与未施用抗体-肽融合物的对照啮齿动物或者施用同种型抗体-肽融合物、同种型抗体或单独的肽的对照啮齿动物进行比较。任何观察到的T细胞反应和反应的程度都可以与正在测试的抗体的功效相关。

通过以下实例进一步展示本说明书，所述实例不应被解释为以任何方式进行限制。所有引用文献(包含贯穿本申请所引用的参考文献、发布的专利和公开的专利申请)的内容特此以全文引用的方式明确并入。

实施例1.内源性小鼠Clec9a基因的人源化

使用细菌人工染色体(BAC)克隆和技术来构建用于内源性Clec9a基因人源化的靶向载体(参见，例如，美国专利6,586,251和Valenzuela等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis,Nature Biotechnology 21(6):652-659；这些文献的所有内容均以引用的方式并入本文)。

使用含有小鼠Clec9a基因的BAC克隆RP23-248K14，并进行如下修饰。简而言之，产生包含小鼠5'同源核苷酸序列(100bp)、4,840bp的人CLEC9A基因组DNA(含有人CLEC9A基因的外显子3、4、5、6及它们各自的内含子3、4、5(包含完整的人3'UTR))、4,809bp的自缺失新霉素盒和3'小鼠同源序列(100bp)的DNA片段。此DNA片段用于通过细菌细胞中的同源重组来修饰BAC克隆RP23-248K14。结果，BAC克隆中的7,138bp的小鼠Clec9a基因组片段(编码小鼠Clec9a蛋白的胞外结构域)被4,840bp的人CLEC9A基因组片段，以及随后4,809bp的自缺失新霉素盒替换。具体而言，被替换的小鼠Clec9a基因组片段包含小鼠Clec9a基因的整个外显子3至最后一个编码外显子(外显子6)的终止密码子(图1A-1B)。插入的人CLEC9A基因组片段包含外显子3、4、5及它们各自的内含子至最后一个编码外显子(外显子6)的终止密码子，包含人CLEC9A的完整3'UTR(图1A-1B)。所得的经修饰的BAC克隆从5'至3'包含：(i)5'小鼠同源臂，其含有约45.6kb的小鼠基因组DNA，包含小鼠Clec9a 5'UTR、小鼠Clec9a外显子1和2；(ii)约4,840bp的人CLEC9A基因组片段，包含外显子3、4、5和6(包含人CLEC9A的3'UTR)；(iii)约4,809bp的自缺失新霉素盒，随后是(iv)112.6kb的3'小鼠同源臂，其含有小鼠Clec9a 3'UTR和原始BAC克隆中其余的小鼠基因组DNA(图1A-1B)。在下文或图1B也列出了连接序列。含有人CLEC9A基因组片段和自缺失新霉素盒的经修饰的BAC克隆的一部分，以及插入连接的上游和下游如SEQ ID NO:5所示。人源化Clec9a基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:7和图1D所示。图1D提供了该人源化Clec9a蛋白(“7765突变体蛋白”)、小鼠Clec9a蛋白(SEQ ID NO:2)和人CLEC9A蛋白(SEQ ID NO:4)的比对。

如上文所述，将含有人源化Clec9a基因的经修饰的BAC克隆用于对小鼠胚胎干(ES)细胞进行电穿孔，以产生包含人源化Clec9a基因的经修饰的ES细胞。通过检测人CLEC9A序列(例如，人CLEC9A的外显子3-6)的存在和确认小鼠Clec9a序列的缺失和/或保留(例如，小鼠Clec9a的外显子3-6的缺失)的测定(Valenzuela等人，参见上文)来鉴定含有人源化Clec9a基因的正向靶向的ES细胞。表1示出了用于确认如上文所述的内源性Clec9a基因的人源化的引物和探针(图1A-1B)。选择正向靶向的ES细胞克隆作为供体细胞，并且使用方法(参见，例如，Poueymirou等人,2007,Nature Biotech.25(1):91-99，US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US2008-0078000 A1，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文)或US2014/0235933 A1和US2014/0310828 A1中描述的方法将供体细胞注射到前桑葚胚期胚胎(例如，8细胞期胚胎)中。孵育包含供体ES细胞的胚胎直至胚泡期，然后植入到代理孕母体中以产生完全来源于供体ES细胞的F0啮齿动物。使用检测人CLEC9A基因序列是否存在的等位基因测定改型(Valenzuela等人，参见上文)，通过从剪尾分离的DNA的基因分型来确认和鉴定携带人源化Clec9a等位基因的小鼠。通过将由ES克隆产生的后代与表达Cre重组酶的缺失者啮齿动物品系杂交来移除新霉素选择盒。在图1C中描绘了缺失盒之后的人源化Clec9a基因座，连接序列显示于图1C的下图板。将人源化Clec9a基因座杂合的小鼠进行杂交以获得纯合子。

表2

实施例2.含有人源化Clec9a基因的经基因修饰的小鼠的表征。

为了确定实施例1中描述的经基因修饰的小鼠是否表达人源化Clec9a，检查mRNA表达。从野生型(WT)小鼠(内源性Clec9a基因未经人源化)、人源化Clec9a基因杂合的小鼠(Het)或人源化Clec9a基因纯合的小鼠(HumIn)的脾细胞提取RNA，并且使用检测小鼠或人Clec9a的探针来进行RT-PCR。这一系列实验表明，WT和Het小鼠表达小鼠Clec9a(图2A和2B)。这些结果还表明，Het和HumIn小鼠表达人源化Clec9a(图2C-2D)。

为了确保人源化Clec9a的表达，给小鼠注射Flt3L以扩增树突细胞群。然后从野生型(WT)、杂合子(Het)或纯合子(HumIn)小鼠分离脾细胞并使用FACS进行分析。在对活细胞和CD45+细胞进行设门后，基于MHC-II⁺CD11c⁺对树突细胞进行设门，并且继续对cDC1(Xcr1⁺)细胞进行设门(图^3A)然后，对表达小鼠Clec9a的细胞进行分选(图3B)，并确定小鼠Clec9a仅在野生型和杂合子小鼠中表达，后者携带一个鼠Clec9a拷贝和一个人源化Clec9a拷贝。正如预期的那样，人源化Clec9a纯合的HumIn小鼠不表达鼠蛋白。相反，在来源于HumIn小鼠以及Het小鼠的Xcr1⁺DC上检测到人源化Clec9a(图4B和图5)。正如预期的那样，野生型小鼠不表达人源化Clec9a蛋白。

然后，确定基因修饰(小鼠中的内源性Clec9a基因的人源化)是否影响除树突细胞以外的表达。为此，对B细胞(CD19⁺)(图6A)或者CD4⁺和CD8⁺T细胞(图6B)进行设门，并且探测小鼠或人源化Clec9a的表达。在前述细胞群上未检测到人源化Clec9a的表达，表明表达仅限于树突细胞。

进行体内增殖测定以确定人源化Clec9a是否在经基因修饰的小鼠中发挥预期功能。图7A-7B和图8A-8B显示，通过使用抗人CLEC9a胞外结构域抗体和含有OT-I和OT-II抗原的肽的融合物来靶向树突细胞上表达的人源化Clec9a可引发强烈的体内T细胞反应，表明在经基因修饰的小鼠中的树突细胞上表达的人源化Clec9a具有完整的功能。

材料与方法

Flt3L注射-每天给小鼠腹膜内注射在100μL PBS中的10μg人Flt3L(内部纯化)持续5天。

流式细胞术-将脾脏放置于无血清的冷RPMI 1640中进行处理，然后使用MACS解离器(Miltenyi，目录#130-093-235)进行温和匀浆。通过背面具有注射器柱塞的70μm尼龙细胞过滤器(Miltenyi，目录#130-110-916)对脾脏细胞悬浮液进行机械破碎。使用ACK裂解缓冲液(Gibco，目录#A10492-01)从脾脏单细胞悬浮液中移除红细胞(RBC)。在室温处，用活/死Blue-Fixable蓝色染料(eBioscience；目录#L23105)和小鼠Fc阻断剂(Biolegend，目录#101320)对细胞进行染色10分钟。将细胞在细胞染色缓冲液(Biolegend，产品#420201)中洗涤两次。使用以下单克隆抗体在冰上对Brilliant染色缓冲液(BD Biosciences目录#566349)中的细胞染色三十分钟：CD45 BV510(克隆30-F11，Biolegend，目录#10138)、CD11bBUV395(克隆M1/70，BD Bioscience，目录#563553)、MHC-II Alexa Fluor 700(克隆M5/114.152，Biolegend，目录#107622)、CD11c Pe-Cy7(克隆N418，Biolegend，目录#117318)、F4/80BV605(克隆BM8，目录#123133)、CD8a BUV805(克隆53-6.7，BD Bioscience，目录#612898)、Xcr1 BV421(克隆ZET，Biolegend，目录#148216)、人Clec9a APC(克隆8F9，Biolegend，目录#353806，针对人CLEC9a蛋白的胞外结构域部分)、CD86 PerCP-Cy-5.5(克隆GL-1，Biolegend，目录#105028)、PDL1 BV711(克隆10.F.9G2，目录#124319)、小鼠Clec9aPE(克隆42D2，eBioscience，目录#L2129905，针对小鼠Clec9a的胞外结构域)、Gr-1FITC(克隆RB6-8C5，Biolegend，目录#108406，针对在单核细胞、粒细胞和中性粒细胞上表达的蛋白质Gr-1)、CD19 APC-Cy7(克隆6D5，Biolegend，目录#115530)、CD4 BV786(克隆RM4-5，BDBioscience，目录#563727)和NK1.1 BV650(克隆PKI36，BD Bioscience，目录#564143)。

RNA提取和RT-PCR-根据制造商的说明，使用MagMAX^TM-96微阵列总RNA分离试剂盒目录#AM1839(Ambion by Life Technologies)来纯化总RNA。使用上文列出的MagMAX试剂盒(Ambion by Life Technologies)的MagMAX^TMTurbo^TMDNA酶缓冲液和TURBO DNA酶来移除基因组DNA。使用VILO^TM主混合物目录#11755500(Invitrogen by LifeTechnologies)将mRNA(最多2.5μg)逆转录为cDNA。将cDNA稀释至0.5-5ng/μL。使用ABI7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)，通过SensiFAST Hi-ROX主混合物(1×100mL)目录#CSA-01113(BIOLINE)来扩增2.5-25ng cDNA输入。

体内增殖测定-使用EasySep小鼠CD4+或CD8+T细胞分离试剂盒(StemCell Tech；目录号19852，用于CD4+T细胞分离，以及目录号19853，用于CD8+T细胞分离)从B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/小鼠脾细胞纯化CD4+T细胞或CD8+T细胞。然后用CFSE细胞痕量染料(Invitrogen；目录#C34554A)来标记这些纯化的T细胞。在每只表达人源化Clec9a的HumIn小鼠的眼眶后注射了2E+06个细胞。在二十四小时后，小鼠皮下接受以下治疗组：15μg抗hCLEC9a肽(n＝3)、7.5μg抗hCLEC9a肽(n＝3)、3.75μg抗hCLEC9a肽(n＝3)。抗hCLEC9a肽是一种抗体-肽融合物，其中抗体针对人CLEC9a的胞外结构域，并且肽包含OT-I(OVA的氨基酸257-264)和OT-II(OVA的氨基酸323-339)抗原。同种型-肽融合物(即，同种型抗体与包含OT-I和OT-II抗原的肽之间的融合物)以类似的方式给予。另一组小鼠接受5mg/kg卵清蛋白EndoFit((n＝3)InvivoGen；目录#vac-pova)和0.03366mg/kg单独的肽(n＝3)。在72小时后，对小鼠实施安乐死，收获脾脏并进行纯化以用于流式细胞术。

Claims (56)

1.一种经基因修饰的啮齿动物，所述经基因修饰的啮齿动物在其基因组中包含：

人源化Clec9a基因，其包含：

啮齿动物Clec9a核酸序列，和

人CLEC9A核酸序列，

其中所述人源化Clec9a基因编码人源化Clec9a多肽，所述人源化Clec9a多肽包含与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。

2.如权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化Clec9a多肽的所述胞外结构域与所述人CLEC9A蛋白的所述胞外结构域在序列上具有至少90％同一性。

3.如权利要求1或权利要求2所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人CLEC9A蛋白包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1至3中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化Clec9a蛋白包含与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同的胞质-跨膜序列。

5.如权利要求4所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化Clec9a蛋白的所述胞质-跨膜序列与所述啮齿动物Clec9a蛋白的所述胞质-跨膜序列在序列上具有至少90％同一性。

6.如权利要求4或权利要求5所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Clec9a蛋白是内源性啮齿动物Clec9a蛋白。

7.如权利要求1至6中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人CLEC9A核酸序列包含人CLEC9A基因的外显子3至外显子6。

8.如权利要求1至7中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Clec9a核酸序列包含啮齿动物Clec9a基因的外显子1和外显子2。

9.如权利要求1至8中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Clec9a核酸序列包含啮齿动物Clec9a基因的外显子6的3’非翻译区。

10.如权利要求8或权利要求9所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Clec9a基因是内源性啮齿动物Clec9a基因。

11.如权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化Clec9a蛋白包含SEQID NO:7的氨基酸序列。

12.如权利要求1至11中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化Clec9a基因可操作地连接至啮齿动物Clec9a启动子。

13.如权利要求12所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Clec9a启动子是内源性啮齿动物Clec9a启动子。

14.如权利要求1至13中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化Clec9a基因位于内源性啮齿动物Clec9a基因座处。

15.如权利要求14所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化Clec9a基因是由于用所述人CLEC9A核酸替换内源性啮齿动物Clec9a基因座处的啮齿动物Clec9a基因组DNA而形成的。

16.如权利要求15所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化Clec9a基因是由于用所述人CLEC9A核酸替换包含内源性啮齿动物Clec9a基因的外显子3至外显子6中的终止密码子的啮齿动物基因组DNA而形成的，并且其中所述人CLEC9A核酸包含人CLEC9A基因的外显子3至外显子6。

17.如权利要求1至16中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对所述人源化Clec9a基因是杂合的。

18.如权利要求1至16中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对所述人源化Clec9a基因是纯合的。

19.如权利要求1至18中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物在树突细胞上表达所述人源化Clec9a多肽。

20.如权利要求1至19中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

21.如权利要求20所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且所述人源化Clec9a多肽包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

22.一种分离的啮齿动物组织或细胞，所述分离的啮齿动物组织或细胞的基因组包含人源化Clec9a基因，所述人源化Clec9a基因包含啮齿动物Clec9a核酸序列和人CLEC9A核酸序列，其中所述人源化Clec9a基因编码人源化Clec9a多肽，所述人源化Clec9a多肽包含与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。

23.如权利要求22所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。

24.如权利要求22所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物生殖细胞。

25.如权利要求22至24中任一项所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述人源化Clec9a多肽的所述胞外结构域与所述人CLEC9A蛋白的所述胞外结构域在序列上具有至少90％同一性。

26.如权利要求25所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述人CLEC9A蛋白包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

27.如权利要求22至26中任一项所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述人源化Clec9a蛋白包含与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同的胞质-跨膜序列。

28.如权利要求27所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述人源化Clec9a蛋白的所述胞质-跨膜序列与所述啮齿动物Clec9a蛋白的所述胞质-跨膜序列在序列上具有至少90％同一性。

29.如权利要求22至28中任一项所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述啮齿动物组织或细胞是小鼠组织或细胞，或者大鼠组织或细胞。

30.如权利要求29所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述啮齿动物组织或细胞是小鼠组织或细胞，并且所述人源化Clec9a蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

31.一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎包含如权利要求23所述的啮齿动物胚胎干细胞。

32.一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括：

将啮齿动物基因组修饰为包含人源化Clec9a基因，其中所述人源化Clec9a基因包含啮齿动物Clec9a核酸序列和人CLEC9A核酸序列，并且编码包含与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Clec9a多肽；以及

制备包含经修饰的啮齿动物基因组的所述啮齿动物。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述修饰包括

将包含所述人CLEC9A核酸序列的核酸分子引入啮齿动物胚胎干(ES)细胞的基因组中，

获得所述人CLEC9A核酸序列已被整合到内源性Clec9a基因座中以替换啮齿动物Clec9a基因组DNA从而形成所述人源化Clec9a基因的啮齿动物ES细胞，以及

由所获得的啮齿动物ES细胞产生啮齿动物。

34.如权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述人源化Clec9a多肽包含与所述人CLEC9A蛋白的所述胞外结构域在序列上具有至少90％同一性的胞外结构域。

35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述人CLEC9A蛋白包含如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。

36.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述人源化Clec9a蛋白包含与啮齿动物Clec9a蛋白的胞质-跨膜序列基本上相同的胞质-跨膜序列。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述人源化Clec9a蛋白包含与所述啮齿动物Clec9a蛋白的所述胞质-跨膜序列具有至少90％同一性的所述胞质-跨膜序列。

38.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述啮齿动物Clec9a蛋白是内源性啮齿动物Clec9a蛋白。

39.如权利要求32至38中任一项所述的方法，其中所述人CLEC9A核酸序列包含人CLEC9A基因的外显子3至外显子6。

40.如权利要求32至39的中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物Clec9a核酸序列包含啮齿动物Clec9a基因的外显子1和外显子2。

41.如权利要求32至40中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物Clec9a核酸序列包含啮齿动物Clec9a基因的外显子6的3’非翻译区。

42.如权利要求32至41中任一项所述的方法，其中所述人源化Clec9a基因在内源性啮齿动物Clec9a基因座处可操作地连接至所述内源性啮齿动物Clec9a启动子。

43.如权利要求32至42中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对所述人源化Clec9a基因是杂合的。

44.如权利要求32至42中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对所述人源化Clec9a基因是纯合的。

45.如权利要求32至44中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

46.一种靶向核酸构建体，所述靶向核酸构建体包含

待整合到内源性啮齿动物Clec9a基因座处的啮齿动物Clec9a基因中的人CLEC9A核酸序列，其侧接与啮齿动物Clec9a基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，

其中所述人CLEC9A核酸序列整合到所述啮齿动物Clec9a基因中使啮齿动物Clec9a基因组DNA被所述人CLEC9A核酸序列替换，从而形成人源化Clec9a基因，并且

其中所述人源化Clec9a基因编码人源化Clec9a多肽，所述人源化Clec9a多肽包含与人CLEC9A蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。

47.如权利要求46所述的靶向核酸，其中所述人CLEC9A核酸序列包含人CLEC9A基因的外显子3至外显子6。

48.如权利要求46或权利要求47所述的靶向核酸，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

49.一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括

将如权利要求46至权利要求48中任一项所述的靶向核酸构建体引入啮齿动物细胞中，从而使人CLEC9A核酸序列整合到内源性啮齿动物Clec9a基因基因座中，使啮齿动物Clec9a基因组DNA被所述人CLEC9A核酸序列替换，以形成人源化Clec9a基因，从而产生所述经基因修饰的啮齿动物细胞。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物ES细胞。

51.一种评估候选药物的药代动力学性质的方法，所述方法包括：

将所述候选药物施用于如权利要求1至21中任一项所述的啮齿动物；

进行一种或多种测定以确定所述候选药物在所述啮齿动物体内的所述药代动力学性质。

52.一种用于筛选靶向人CLEC9A的候选药物的方法，所述方法包括：

将所述候选药物施用于如权利要求1至21中任一项所述的啮齿动物；以及

进行一种或多种测定以确定所述候选药物是否对所述啮齿动物具有影响。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种测定包括测量T细胞的增殖的测定。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述测定测量CD4+T细胞的增殖。

55.如权利要求53所述的方法，其中所述测定测量CD8+T细胞的增殖。

56.如权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述候选药物是结合至人CLEC9A的抗体。