CN119823276A - 抗her4抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗HER4抗体或其抗原结合片段。本发明进一步提供了包含该抗体或其抗原结合片段的双特异性分子或多特异性分子、免疫缀合物，以及编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还提供了制备该抗体或其抗原结合片段的方法、包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及在治疗疾病中使用该抗体或其抗原结合片段，或其药物组合物的方法和用途，本发明为针对HER4有关疾病或病症的治疗和/或预防提供了候选的特异性抗体药物。

Description

抗HER4抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及抗HER4抗体或其抗原结合片段、编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、表达载体及宿主细胞、包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物及其用于治疗对象的用途或方法。

背景技术

受体酪氨酸激酶ErbB/HER家族包括ErbB1(又称为EGFR或HER1)、ErbB2(HER2、c-Neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。ErbB/HER家族受体通过二聚化而激活其介导的下游信号转导通路，包括RAS-RAF-MEK-ERK、PI3K-AKT和JAK-STAT通路，并由此参与细胞生长、分化和存活的调控。HER4由ErbB4/HER4基因编码，是分子量约为180kDa的跨膜糖蛋白，它由与配体结合的胞外结构域(Extracellular Domain，ECD)、跨膜结构域(Transmembrane Domain)和胞内酪氨酸激酶结构域(Intracellular Tyrosine Kinase Domain)组成。HER4由配体，包括神经调节蛋白1～4(neuregulin-1～4，NRG-1～4)(J.R.Toggweiler,Nature 1993，366：473-475；K.L.Carraway等人,Nature 1997，387：512-516；D.Zhang等人,Proc NatlAcad Sci USA,1997,94:9562-9567；D.Harari等人,Oncogene 1999,18:2681-2689)、肝素结合表皮生长因子(heparin-binding EGF,HB-EGF)(K.Elenius等人,EMBO J 1997,16:1268-1278)、β-乙酰球蛋白(betacellulin,BTC)(D.J.Riese等人,Oncogene 1996,12:345-353)和表皮调节蛋白(epiregulin)(T.Komurasaki等人,Oncogene 1997,15:2841-2848)激活，并形成同源二聚体或与其它ErbB/HER家族成员蛋白形成异源二聚体。HER4虽然在多种肿瘤(例如，母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌和膀胱癌)中均有表达(Hollmén M等人,Future Oncol 2010,6:37-53)，但是多篇报道显示HER4在肿瘤中的表达下调，或者其表达与肿瘤的良好预后有关(Srinivasan R等人，Clin CancerRes 1998,5:2877-2883；Witton CJ等人,J Pathol 2003,200:290-297)。此外，在乳腺癌中HER4被视为肿瘤基因(Wang J等人,Oncotarget 2016,7:76693-76703)。因此，HER4在肿瘤的发生及进展中的作用尚待进一步厘清。目前，HER4被证实对心脏和神经系统的发育及功能的维持起着关键作用(F.E.Jones等人,J Cell Biol 1999,147:77-87；H.Tidcombe等人,Proc Natl Acad Sci USA 2003,100:8281-8286；T.Junttila等人,Trends CardiovascMed 2000,10:304-310；A.Buonanno等人,Curr Opin Neurobiol 2001,11:287-296)。

因此，本领域期望开发一种能够特异性结合HER4的中和性抗体以更精准地治疗HER4有关疾病或病症。

发明内容

本发明提供了一种抗HER4抗体及其制备方法和在HER4有关疾病或病症中的应用。

一方面，本发明提供了一种能够特异性结合HER4的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER4胞外结构域III，且会阻断配体诱导的HER4受体的二聚化。在一些实施例中，通过流式细胞术检测所述抗体或其抗原结合片段特异性结合表达人HER4细胞的活性。

在一些实施方案中，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段对HER4受体及其下游信号转导通路具有抑制作用。在一个实施方案中，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段能够抑制配体诱导的HER4受体二聚化及其下游信号转导通路，所述配体包括NRG-1～4，优选NRG-1。在一些实施例中，通过活细胞生物发光检测所述抗体或其抗原结合片段对NRG-1诱导的HER2/HER4受体二聚化的抑制活性。

另一方面，本发明提供了筛选获得本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括但不限于杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术。

另一方面，本发明提供了编码本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子(也称为“多核苷酸”)，以及包含所述核酸的表达载体和包含核酸或表达载体的宿主细胞。本发明还涉及使用所述宿主细胞制备本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞并从培养基中回收所述抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本发明提供了包含本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段的双特异性分子或多特异性分子、免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或多特异性抗体、免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒，以及药学上可接受的载体。

另一方面，本发明提供了一种药盒，所述药盒包含有效量的本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段、或本文的药物组合物，以及任选的至少一种另外的治疗剂。

另一方面，本发明提供了一种本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防HER4有关疾病或病症的药物组合物或制剂中的用途、制备用于诊断HER4有关疾病或病症的诊断试剂中的用途。

另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防HER4有关疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段、药物组合物、或药盒。

另一方面，本发明提供了一种抑制HER4受体及其下游信号转导通路的方法，其包括使用本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒在体外或体内抑制配体诱导的HER4二聚化，所述配体包括NRG-1～4，优选NRG-1。

另一方面，本发明提供了一种检测待测样品(例如，生物样品，如，血清、组织)中HER4含量或表达水平的方法，其包括：(a)将待测样品与本发明抗体或其抗原结合片段接触，和(b)检测待测样品中所述抗体或其抗原结合片段与HER4的结合。

通过下面的附图和具体实施方案进一步说明本申请，本申请所公开的其它特征和优点将是显而易见，并且这些附图和具体实施方案不应被认为限制本申请的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本申请的精神和所附权利要求的保护范围内。在本申请中引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。

附图说明

图1.利用ELISA检测抗HER4抗体Ab4268与人源ErbB/HER家族蛋白成员(包括EGFR、HER3和HER4)胞外结构域蛋白和嵌合HER4胞外结构域Ⅲ重组蛋白(HER4_DⅢ)的结合活性。

图2.利用流式细胞术检测含有单点突变的抗体Ab4268变异体以及对照抗体(母本抗体Ab4268)与表达HER4的293T细胞的结合活性。

图3.利用流式细胞术检测含有组合突变的抗体Ab4268变异体以及对照抗体(母本抗体Ab4268)与表达HER4的293T细胞的结合活性。

图4.利用流式细胞术检测抗体Ab4268的变异体(H201-L201和H202-L201)以及对照抗体(母本抗体Ab4268)与表达人HER4的293T细胞的结合活性。

图5.抗HER4抗体(Ab4268)对NRG-1诱导的HER2/HER4受体二聚化的影响，对照抗体是Pertuzumab。

发明详述

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

在本文中，术语“HER4”、“HER4受体”和“HER4蛋白”可以互换使用，该蛋白也称为ErbB4、c-ErbB-4或p180erbB4。除非另外指明其来自非人物种，本文所表述的“HER4”是指人

HER4的任何天然形式，可以是如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列和/或如UniProtKB登记号Q15303.1所示的全长HER4氨基酸序列，也可以由细胞(包括心肌细胞、乳腺细胞、肿瘤细胞)天然地表达，或以HER4基因或cDNA转染的细胞表达。该术语包括天然存在的HER4等位基因变体和剪接变体、同种型、同源物和物种同源物。HER4可以从人体中分离，或可以通过重组或合成的方法产生。

全长HER4蛋白由1308个氨基酸组成，其中，第1-25位氨基酸残基是信号肽，第26-651位氨基酸残基是胞外结构域(extracellular domain,ECD)，第652-675位氨基酸残基是跨膜结构域，第676-7308位氨基酸残基是胞内结构域。胞外结构域由4个亚结构域组成，即亚结构域1

(Subdomain 1，简称D1，约第26-210位氨基酸残基)、亚结构域2(Subdomain 2，简称D2，约第211-332位氨基酸残基)、亚结构域3(Subdomain 3，简称D3，约第333-501位氨基酸残基)、和亚结构域4(Subdomain 4，简称D4，约第502-651位氨基酸残基)，其中，D1和D3参与配体结合,富含半胱氨酸的D2和D4负责受体二聚化。

在本文中，“表达HER4的细胞”可以是天然存在的细胞或细胞株(例如，心肌细胞、乳腺细胞、肿瘤细胞)，也可以是通过将编码HER4的核酸导入到宿主细胞中重组产生的。

在本文中，“抗原结合结构域”或“抗原结合区”或“表位结合结构域”可互换使用，是指抗体或抗原结合片段或其衍生物上的特定区域，该区域直接涉及与靶抗原的特异性相互作用，例如通过结合、空间位阻、使稳定/使不稳定、空间分布等方式与靶抗原相互作用以至达到动态平衡。本发明中“抗原结合结构域”也指所述抗体或抗原结合片段或其衍生物上的特定区域，该区域与HER4受体上的特定表位相互作用，通过结合、空间位阻、使稳定/使不稳定、空间分布等方式使二者之间的结合达至动态平衡。

“抗体”是指大体上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球基因，或其片段编码的能够特异性识别并结合抗原的多肽或蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义了免疫球蛋白类别(class)IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其中的几类可进一步分为亚类(subclasses)/同种型(isotypes)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2。典型的免疫球蛋白(例如抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端结构域定义了主要负责抗原识别的约100至110个或更多的氨基酸的可变(V)区。抗体重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成，其中重链恒定区通常包括三个域，CH1、CH2和CH3。轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定域(CL)组成，其中轻链恒定域通常包含一个域，CL。V_H和V_L的配对一起形成单个抗原结合位点。内源性V_L由基因区段V(可变的)和J(接合的)编码，并且内源性V_H由V、D(多样性)和J编码。V_L或V_H都包括高变区(Region of Hypervariability)或称为互补决定区(Complementarity Determining Region，CDR)和框架区(Framework Region，FR)。术语“可变区”或“V区”可互换地使用，是指从氨基端到羧基端以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4顺序排列的重链可变区或轻链可变区。术语“J区”是指编码包含CDR3和FR4的可变区的C-末端部分的子序列。V区或J区可以是天然存在的、重组的或者合成的。在本文中，抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区有时可统称为“抗体可变区”，抗体轻链和/或抗体重链统称为“抗体链”。在某些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段的FR可以与人种系序列相同，也可以是天然地或人工修饰的。

CDR和FR的位置可以使用本领域熟知的多种定义方法确定，例如，Kabat、Chothia、IMGT和Contact(参见，例如，Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,1991第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242；Johnson等,Nucleic Acids Res2001,29:205-206；Chothia&Lesk,J Mol Biol 1987,196:901-917；Chothia等,Nature 1989,342:877-883；Chothia等,J Mol Biol 1992,227:799-817；Al-Lazikani等,J Mol Biol 1997,273:927-748；Lefranc MP等,Nucleic AcidsResearch 1999,27:209–212；MacCallum RM等,J Mol Biol 1996,262:732-745)。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res 2000,28:219-221；Lefran MP,Nucleic Acids Res 2001,29:207-209；Lefranc MP,The Immunologist 1999,7:132-136；Lefranc MP等,Dev Comp Immunol 2003,27:55-77；MacCallum等,J Mol Biol1996,262:732-745；Martin等,Proc Natl Acad Sci USA 1989,86:9268-9272；Martin等,Methods Enzymol 1991,203:121-153；Sternberg M JE编辑,Protein StructurePrediction,Oxford University Press,Oxford 1996,141-172。本发明包含任何一种定义方法来确定本申请的抗HER4抗体或其抗原结合片段中的CDR，表1显示了使用不同定义方法所确定的抗体CDR氨基酸序列的位置编号。涵盖特定CDR的确切氨基酸残基数量随CDR的序列而变化。在明确了抗体可变区的氨基酸序列情况下，本领域技术人员能够通过包括不限于所述定义的常规方法确定所述抗体的CDR。

表1.不同定义方法确定的CDR¹

¹:表1中所有CDR定义的编号均依照Kabat等人提出的编号系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,1991第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services)。

此外，Kabat等人还定义了针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员能够明确地将此“Kabat编号”系统应用到任何抗体的可变区序列，而无需依赖于抗体序列本身以外的任何实验数据来确定可变区序列。除非另外说明，本申请的抗HER4抗体的抗原结合结构域的可变区中特定氨基酸残基位置的编号均按照Kabat编号系统确定。

抗体以完整的免疫球蛋白形式存在，或者以通过多种肽酶消化产生的许多片段形式存在。尽管按照完整抗体的消化，定义了多种抗体片段，但是技术人员应当理解，可以通过化学裂解方法或者通过使用重组DNA方法从头合成该类片段。在本文中，术语抗体的“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指由含有一个或多个CDR的抗体部分或者其他任何能够与抗原(例如，HER4或HER4的胞外结构域)结合但不具有完整抗体结构的抗体片段。抗原结合片段可以与完整抗体一样具有特异性结合抗原的活性。在某些实施方案中，抗原结合片段可以含有来自某特定人抗体的一个或多个CDR，移接至来自一个或多个不同人抗体的框架区。抗原结合片段包括不限于：(ⅰ)“Fab”片段，由VH、VL、CL和CH1结构域组成的单价抗体片段；(ⅱ)“F(ab')2”片段，包含两个由铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(ⅲ)“Fv”片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成，是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段；(ⅳ)“Fd”片段，由VH和CH1结构域组成；(ⅴ)“单链Fv抗体(scFv)”、“单链抗体”或“scFv分子”，是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程化抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA

1988，85:5879-5883；Bird等，Science 1988，242:423-426)；此外，单链抗体还包括包含一对串联的Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng 1995,8:1057-1062；美国专利5,641,870)；(ⅵ)“dAb”片段(Ward等,Nature 1989，341:544-546；PCT公开号WO 90/05144A1)包含单个可变域，例如VH结构域。单结构域抗体(sdAb)是独立免疫球蛋白结构域；(ⅶ)“双功能抗体(diabody)”为二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但是使用的肽接头太短而不能使同一链上的两个结构域配对，因此迫使这两个结构域与另一条链的互补结构域配对，形成两个抗原结合位点(Holliger P等,Proc Natl Acad Sci USA 1993,90:6444-6448；Poljak等，Structure 1994，2:1121-1123；专利EP404097；PCT公开号WO93/11161)。

在本文中，术语“Fc区”或“Fc结构域”是指免疫球蛋白重链的C末端区域，其至少含有恒定区的一部分，例如除了第一恒定区(CH1)之外的免疫球蛋白重链恒定区。对于IgG，所述Fc区可以包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及CH1和CH2之间的铰链区。本文所使用的Fc区包括天然序列Fc区和/或Fc区变体，并且可以是本申请的抗HER4抗体的一部分。在本领域中应理解，Fc区的边界可以变化，然而，人IgG重链Fc区通常被定义为在其氨基端包含第226位半胱氨酸残基或第230位脯氨酸残基，其根据EU编号系统/方案，如见于Kabat等，NIHPublication1991，91-3242,National Technical Information Service。

术语“抗HER4抗体”或“特异性结合HER4的抗体”是指特异性结合HER4的任何形式的抗体或其片段，且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和生物功能抗体片段，只要所述片段特异性结合HER4即可。本发明的抗HER4抗体优选为特异性结合HER4胞外结构域的抗体或抗体片段。

在本文中，术语“特异性结合”或“结合特异性”或“对…具有特异性”或“结合”是指结合反应，该结合反应决定了在蛋白质的异质群体以及其它生物制品(例如，生物样品，如血液、血清、血浆或组织样品)中靶分子(例如，抗原)的存在，也就是说此结合对于靶分子是具有选择性的，并且能区分开那些不期望的或非特异性的相互作用。例如，与靶分子(可以是抗原)特异性结合的抗体是相较于该抗体与其它非靶分子结合，该抗体结合该靶分子时具有更大亲和力、更强的结合活性、更容易结合和/或结合持续时间更长。可以将多种免疫测定方法用于选择与特定蛋白特异地进行结合反应的抗体，例如固相ELISA免疫测定法、流式细胞荧光分选术(FACS)、细胞荧光测定法、或表面等离子共振(Surface PlasmonResonance，简称SPR)技术测定本文的抗体或其抗原结合片段与靶抗原/蛋白的结合反应。通常在设定的测定条件下，抗体或结合剂与抗原的特异性或选择性结合反应会产生至少两倍于背景的信号，更一般地至少是10-100倍于背景的信号，并且基本上不以显著量与样品中存在的其它抗原/蛋白结合。

在本文中，术语“单克隆抗体”是指从基本上具有同质性的抗体群中所获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然突变之外，构成抗体群中的各个抗体是相同的。单克隆抗体表现出与特定表位结合的特异性和亲和力。单克隆抗体可以通过Kohler等，Nature1975，256：495最先描述的杂交瘤方法制备，也可以通过重组DNA方法制备(参见美国专利4,816,567)，还可以从噬菌体抗体库，例如参照Clackson等，Nature 1991，352:624-628；Marks等，J Mol Biol 1991，222:581-597中描述的技术进行分离。

如本文所用的术语“表位(epitope)”是指蛋白质决定簇(protein determinant)，能够被抗体识别且特异性结合的抗原部分。表位通常由分子的表面基团如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。

术语“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如受体或抗原)与其配对体(例如配体或抗体)之间相互作用的内在结合能力，即全部非共价相互作用总和的强度。除非另外陈述，如本文中使用的“结合亲和力”是用于反映结合对的成员(例如受体与配体或抗原与抗体)之间一对一相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配对体Y的亲和力通常可以用平衡解离常数(K_D)表示，平衡解离常数是解离速率常数(K_dis或K_off)和结合速率常数(Ka或Kon)的比值)。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包括本发明中所使用的方法。

在本文中，术语“交叉反应”、“交叉反应性”或“交叉反应活性”可以互换使用，是指抗体对某一种抗原具有特异性，且与第二种抗原也能发生反应的能力，是两种不同抗原之间关联性的量度。因此，如果抗体与靶抗原以外的其他抗原结合，则具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有许多与靶抗原表位同源的氨基酸序列，或相似的结构特征，在某些情况下可能比靶抗原表位更匹配地结合抗体。如果某抗体不结合除靶抗原表位和交叉反应性表位之外的其它序列或结构，则可认为该抗体对该抗原表位具有“高度特异性”。

在本文中，术语“融合”或“融合的”在用于氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白)时，是指通过化学键合或重组手段，将两个或更多个氨基酸序列组合成为非天然存在的单一氨基酸序列。融合氨基酸序列可通过两个编码多核苷酸序列的基因重组产生，并且可以通过将含有重组的多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法来表达。

在本文中，术语“抗体变异体”、“抗体变体”或“抗体突变体”是指在参考抗体可变区中含有至少一个氨基酸突变的抗体多肽序列。变异体可以与未经修饰的抗体基本同源或基本相同。在一些实施方案中，在发明的抗HER4抗体的一个、两个、三个、四个、五个和/或六个CDR具有氨基酸突变，以改善和优化所述抗体或抗原结合部分的性能，包括但不限于提高人源化程度、增强对靶蛋白/抗原(例如，HER4)的特异性、结合活性、提高产量、和/或提高稳定性(例如，降低或消除天冬氨酸异构化和/或天冬酰胺脱酰基的风险)。在一些实施方案中，在本发明的抗HER4抗体的一个、两个、三个和/或四个FR具有氨基酸突变，以改善和优化所述抗体或抗原结合部分的性能，包括但不限于提高所述抗体或抗原结合部分的人源化程度、增强对靶分子(例如，HER4)的特异性、结合活性、提高产量、和/或提高稳定性(例如，降低或消除天冬氨酸异构化和/或天冬酰胺脱酰基的风险)。在一些实施方案中，在本申请的抗HER4抗体的CDRs和FRs进行一个或多个氨基酸突变，以提高所述抗体或抗原结合部分的人源化程度、增强对靶分子(例如，HER4)的特异性、结合活性、提高产量、和/或提高稳定性(例如，降低或消除天冬氨酸异构化和/或天冬酰胺脱酰基的风险)。在一些实施方案中，所述氨基酸突变包括氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合。

其中，氨基酸取代包括保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代，保守氨基酸取代涉及用同类中的另一个氨基酸(例如化学性质或功能相似)进行置换，非保守取代涉及用不同类的氨基酸(化学性质或功能不相似)进行置换。本领域一般技术人员可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行保守或非保守氨基酸取代。例如，(ⅰ)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸(Ala，A)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、缬氨酸(Val，V)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)和蛋氨酸(Met，M)；(ⅱ)极性中性氨基酸包括甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酰胺(Gln，Q)；(ⅲ)带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)和组氨酸(His，H)；(ⅳ)带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。一般而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性质，非保守氨基酸取代可能导致蛋白质的性质或功能发生很大变化。尽管对引入氨基酸序列突变的位点或区域可以预先确定，但非保守取代所带来的潜在的蛋白质性质或功能的改变却是无法预见的。在一些实施方案中，本发明的抗HER4抗体通过非保守氨基酸取代意想不到地在功能和性能上获得了显著改变，例如结合活性、分子稳定性等。

在本文中，对于两个以上多肽序列，术语“相同的”或“同一性”或“同一性百分比”或“百分比序列同一性”可以互换使用，是指在进行氨基酸序列比对时，并在引入必要的间隔使相同氨基酸数目达到最多后，候选序列中与参比序列相同的氨基酸残基数占所述候选序列总氨基酸残基数的百分比率。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTp、ClustalW2(也可参见Higgins DG等,Methods Enzymol 1996,266:383-402；Larkin MA等,Bioinformatics 2007,23:2947-2948)和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法来进行序列比对。

本文所提及“降低或消除脱酰胺风险的”氨基酸序列，是指包含易于脱酰胺的氨基酸残基被不太易于或不易于脱酰胺的氨基酸残基替代的序列。脱酰胺是化学反应，天冬酰胺或谷氨酰胺侧链中的酰胺官能团被除去或转化为另一个官能团。通常，天冬酰胺(Asn)可被转化为天冬氨酸或异天冬氨酸，谷氨酰胺(Gln)可被转化为谷氨酸或焦谷氨酸。氨基酸序列中包含Asn-Gly、Asn-Ser或Asn-Thr位点易发生脱酰胺，并且天冬酰胺相较于谷氨酰胺更容易脱酰胺。天冬酰胺和/或谷氨酰胺的脱酰胺可改变抗体的结构及其稳定性和/或功能(即，抗体-抗原结合)，因此，需要降低或消除脱酰胺风险。可通过预测抗体可变区中易于脱酰胺的氨基酸残基(Jasmin F Sydow等人，PLoS ONE 2014,9(6):e100736)，并且可以使用不太易于或不易于脱酰胺的氨基酸残基进行替代来降低或消除这些位点的脱酰胺风险。

在本文中，术语“天冬氨酸异构化的”氨基酸序列，是指包含易于发生异构化的天冬氨酸残基的序列。由于异构化会引起抗体构象发生变化，从而改变抗体表面电荷，导致抗体电荷异质性发生。优选地，本申请的抗体不包含天冬氨酸异构位点。天冬氨酸异构化易发生在D-G序列上，也有报道异构化还可发生在D-H或D-S序列，从而产生异天冬氨酸残基，由于该氨基酸残基引入了连接键到多肽链中，导致该多肽链的稳定性降低(又称为异天冬氨酸效应)，还可能导致抗体-抗原结合亲和力下降。

在本文中，当涉及蛋白时，术语“分离的”表示该蛋白基本上不含在天然状态下与其结合的其他细胞组分，优选处于同质状态，例如，分离的蛋白可以是从天然或自然环境中移出的。分离的蛋白可以是冻干的或者是水溶液。通常，其纯度和均一性可以使用分析化学技术(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定。在分离的制备物中蛋白质是基本上纯化的。术语“纯化的”表示蛋白在非还原电泳凝胶中基本上只产生一条带。特别地，这意味着蛋白为至少85％纯度、更优选地至少95％纯度、以及最优选地至少99％纯度。就本申请而言，在一些实施方案中，在宿主细胞中表达的重组蛋白则被视为是分离的，同样也适用于通过任何本领域技术人员熟知的技术分开、分级(fractionate)、或部分或基本纯化的天然的或重组的蛋白。在一些实施方案中，“分离的抗体”指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合HER4的分离的抗体基本上不含特异性地结合除HER4之外的抗原的抗体)。而且，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。在一些实施方案中，包含在载体中的编码本申请多肽或蛋白(例如抗HER4抗体)的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的其它例子包括在异源宿主细胞中包含的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本地)的多核苷酸。

除非上下文另外指示，否则“衍生物”是相对于母本抗体或多肽具有一个、或多个非保守或保守氨基酸取代的多肽或其片段；或通过共价连接第二分子，例如通过连接异源多肽，或通过糖基化、乙酰化、磷酸化等修饰的多肽或其片段。“衍生物”的定义还可以包含一种或多种氨基酸的类似物(例如，非天然氨基酸等)的多肽、以及本领域已知的(天然的和非天然存在的)其它修饰。

在本文中，术语“表达载体”或“载体”是指可将编码某蛋白的多核苷酸或核酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。

在本文中，术语“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸、核酸和/或载体的细胞。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本发明中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

在本文中，术语“受试者”、“患者”或“个体”可以互换使用，包括但不限于：哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(例如，猴)、小鼠、猪、狗、猫、牛、山羊、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、绵羊或其它非人类哺乳动物；非哺乳动物，例如非哺乳类脊椎动物，如鸟(例如，鸡、鸸鹋或鸭)或鱼；以及非哺乳类无脊椎动物。在一些实施例中，本发明的用途或方法所涉及的受试者和药物组合物用于(预防性地和/或治疗性地)治疗非人类动物。

在本文中，对某种疾病或症状的“治疗(treating，treatment或to treat)”是指减轻(alleviating或to alleviate)某种疾病或症状，降低某种疾病或症状兴起或发展的速度，减少发展出某种疾病或症状的风险，或延迟与某种疾病或症状相关的症状发展，减少或终止与某种疾病或症状相关的症状，产生某种疾病或症状的完全或部分的逆转，治愈某种疾病或症状，或以上的组合。

本文所使用的“HER4有关”疾病或症状是指由HER4表达或活性增加或减少引起、加剧或以其他方式与之相关的任何疾病或症状。在某些实施方案中，HER4有关疾病是癌症，例如神经胶质瘤。在某些实施方案中，HER4有关疾病是胶质细胞增生性疾病。

术语“治疗有效量”、“有效剂量”或“有效量”是指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现预防或改善与疾病或病症有关的症状、缓解或减轻疾病或病症严重程度和/或延迟或停止疾病进展的活性成分或药剂的量或浓度。本发明的制剂、抗体或其抗原结合片段、或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗原结合部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也可被认为是制剂、抗体或其抗原结合片段、或组合物的治疗有益作用明显超过其导致的任何有毒或有害作用。

在本文中，术语“药学上可接受的”或“药用可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与受试者相兼容。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值，或在一个实施方案中为小10％的下限和大10％的上限，或在另一个实施方案中为小15％的下限和大15％的上限，或在另一个实施方案中为小20％的下限和大20％的上限。

术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”或“含有”或“具有”或“涉及”可互换使用，意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”或“含有”或“具有”或“涉及”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。

如本文中所用，术语“任选的”表示其修饰的对象存在或者不存在，例如“药盒包含任选的至少一种另外的治疗剂”表示该药盒可包含或不包含至少一种另外的治疗剂。

如本文中所提及的“一些实施方案”、“一个实施方案”、“一个具体实施方案”、或“具体实施方案”或其组合表示所描述的与所述实施方案相关的特定特征、结构或特性包含于本申请的至少一个实施方案中。因此，在本说明书全文各处出现前述用语未必都指同一个实施方案。此外，所述特定特征、结构或特性可在一个或多个实施方案中以任意适宜方式组合。

除非上下文另有明确指示，单数术语涵盖复数的指示对象，反之亦然。

为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利、专利申请和其它出版物在此明确地并入本文。这些出版物仅因为它们的公开早于本申请的申请日而提供。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件内容正确性的承认。

在以下章节中将更详细地描述本申请的各个方面。

1、抗HER4抗体及其抗原结合片段

一方面，本申请提供了一种分离的抗HER4抗体或其抗原结合片段，其能够特异性识别和结合人HER4的胞外结构域Ⅲ，且能够阻断配体诱导的HER4受体的二聚化。

本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段特异性结合人HER4胞外结构域Ⅲ，且结合活性高。在一些实施方案中，利用流式细胞术检测所述抗体或其抗原结合片段与表达HER4的293T细胞的结合活性，其平均荧光强度(MFI)值高。

本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段对HER4受体及其下游信号转导通路具有抑制作用。在一些实施方案中，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段能够抑制配体诱导的HER4受体二聚化及其下游信号转导通路，所述配体包括NRG-1～4，优选NRG-1。在一些实施例中，通过活细胞生物发光检测所述抗体或其抗原结合片段对NRG-1诱导的HER2/HER4受体二聚化抑制活性(IC50值)不超过10μg/mL。

本申请的抗HER4抗体还可以任选地包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、scFv-Fc、单结构域抗体(sdAb)，或具有IgG类型。本申请的抗HER4抗体可以是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体，可以是单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和抗体片段，只要所述抗体能特异性地识别和结合人HER4胞外结构域Ⅲ即可。在一些实施方案中，所述抗HER4抗体选自全人源抗HER4抗体或其优化抗体或抗体片段。

另一方面，本发明提供表2所示的抗HER4抗体或其抗原结合片段包括VH和VL。在一些实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段特异性地结合HER4受体胞外结构域Ⅲ，其包含如SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列，和/或如SEQ ID NO:41所示的VL氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列中的一个或多个CDR或如SEQ ID NOs:1、2和12所示的氨基酸序列或其变异体，所述变异体包括优化抗体或本发明所述的任何其它变异体。

在一些实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:41所示的VL氨基酸序列中的一个或多个CDR或如SEQ ID NOs:13、19和20所示的氨基酸序列或其变异体，所述变异体包括优化抗体或本发明所述的任何其它变异体。

在一些实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列的一个或多个CDR或如SEQ ID NOs:1、2和12所示的氨基酸序列或其变异体，以及SEQ ID NO:41所示的VL氨基酸序列中的一个或多个CDR或如SEQ ID NOs:13、19和20所示的氨基酸序列或其变异体，所述变异体包括优化抗体或本发明所述的任何其它变异体。

在一些具体实施方案中，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:13所示的LCDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列。

另一方面，可以使用本发明的抗HER4抗体(例如Ab4268)的VH和/或VL作为起始材料进行工程化改造，即母本抗体Ab4268的变异体。

在一些实施方案中，本发明抗HER4抗体变异体包含与母本抗体Ab4268的VH(SEQID NO:21)和/或VL(SEQ ID NO:41)相比具有已被修饰的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段。在母本抗体中引入的修饰包括在所述母本抗体的重链可变区CDRs、轻链可变区CDRs和/或FRs中引入氨基酸突变(包括氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合)，可以提高母本抗体的人源化程度、结合活性、和/或降低或消除天冬氨酸异构化和/或天冬酰胺脱酰基的风险。

在一些具体实施方案中，本发明的抗HER4抗体变异体相对于母本抗体Ab4268的FR区具有一个或多个氨基酸突变，在保留或提高母本抗体的细胞结合活性的同时，能够提高母本抗体的人源化程度。例如，将Ab4268的VH(SEQ ID NO:21)的FR区(包括重链可变区FR区和/或轻链可变区FR区)进行一个或多个氨基酸突变。进一步，可在HFR1和/或HFR2中引入氨基酸突变，例如，HFR1第23位谷氨酰胺残基的突变包括Q23K，第26位丙氨酸残基的突变包括A26G，第27位丝氨酸残基的突变包括S27Y；HFR3第1位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第66位)组氨酸残基的突变包括H66Q，第4位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第69位)亮氨酸残基的突变包括L69I，第6位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第71位)缬氨酸残基的突变包括V71A，第11位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第76位)天冬酰胺残基的突变包括N76S，第27位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第89位)苏氨酸残基的突变包括T89M或T89V；还可以在LFR2中引入氨基酸突变，所述突变包括将LFR1第2位缬氨酸残基突变为异亮氨酸(即，V2I)。

在一些具体实施方案中，本发明的抗HER4抗体变异体相对于母本抗体Ab4268的CDR区具有一个或多个氨基酸突变，在保留或提高母本抗体的细胞结合活性的同时，能够提高母本抗体的人源化程度。例如，母本抗体Ab4286的重链可变区CDRs不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基发生突变，所述突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，优选氨基酸取代。进一步，可在HCDR1和/或HCDR2中引入氨基酸突变，例如，HCDR1第3位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第33位)精氨酸、第4位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第34位)缬氨酸，和/或HCDR2第3位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第52位)苯丙氨酸、第5位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第53位)丙氨酸、第16位(对应于SEQID NO:21所示的VH氨基酸序列第64位)谷氨酸残基进行突变。HCDR1第3位(对应于SEQ IDNO:21所示的VH氨基酸序列第52位)苯丙氨酸的突变包括R33W、第4位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第34位)缬氨酸的突变包括V34I；HCDR2第3位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第52位)苯丙氨酸的突变包括F52Y、第5位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第53位)丙氨酸的突变包括A53G、第16位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第64位)谷氨酸的突变包括E64Q。

在一个具体实施方案中，本发明的抗HER4抗体变异体相对于母本抗体Ab4268的VH氨基酸序列(SEQ ID NO:21)具有一个或多个氨基酸突变，包括Q23K、A26G、S27Y、R33W、V34I、F52Y、A53G和/或E64Q，和/或相对于母本抗体Ab4268的VL氨基酸序列(SEQ ID NO:41)具有氨基酸突变，包括V2I，能够在保留或提高母本抗体Ab4268的细胞结合活性同时，能够显著提高母本抗体的人源化程度。

在一些具体实施方案中，本发明的抗HER4抗体变异体相对于母本抗体Ab4268的CDR区(包括重链可变区CDRs和/或轻链可变区CDRs)具有一个或多个氨基酸突变，以降低潜在的天冬氨酸异构化和/或天冬酰胺脱酰胺风险。例如，母本抗体Ab4268的重链可变区CDRs或轻链可变区CDRs不超过1个或2个氨基酸残基发生突变，所述突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，优选氨基酸取代。

在一个具体实施方案中，将母本抗体Ab4268的VH(SEQ ID NO:21)中的CDR区进行一个或多个氨基酸突变，以对母本抗体进行异构化改造。在优选的实施方案中，本发明的抗HER4抗体变异体不包含天冬氨酸异构位点，可以在Ab4268的HCDR2中引入一个或多个氨基酸突变，例如，可以在HCDR2的第6位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第54位)的天冬氨酸、第7位(对应于SEQ ID NO:21所示的VH氨基酸序列第55位)的丝氨酸进行突变，以降低或消除母本抗体Ab4268氨基酸序列的天冬氨酸异构化。HCDR2的第6位(对应于SEQ IDNO:21所示的VH氨基酸序列第54位)天冬氨酸残基的突变包括D54A、D54F、D54G、D54K、D54S或D54T(优选D54A、D54F、D54G、D54K或D54S)，第14位(对应于SEQ ID NO:36所示的VH氨基酸序列第62位)丝氨酸残基的突变包括S55A、S55E、S55N、S55T或S55Y(优选S55T)。

在一个具体实施方案中，将母本抗体Ab4268的VL(SEQ ID NO:41)中的CDR区进行一个或多个氨基酸突变。进一步，可以在LCDR1引入一个或多个氨基酸突变，使得母本抗体的变异体包含降低或消除脱酰胺风险的氨基酸序列。例如，可以在LCDR1第10位(对应于SEQID NO:41所示的VL氨基酸序列第28位)的天冬酰胺、第11位(对应于SEQ ID NO:41所示的VL氨基酸序列第29位)的甘氨酸进行氨基酸突变。LCDR1第10位(对应于SEQ ID NO:41所示的VL氨基酸序列第28位)天冬酰胺残基的突变包括N28G、N28I、N28L、N28S、N28T或N28V，第11位(对应于SEQ ID NO:41所示的VL氨基酸序列第29位)甘氨酸残基的突变包括G29A、G29I、G29N、G29P、G29R、G29T或G29V(优选，G29G、G29A、G29N或G29R)。

通过对母本抗体Ab4268的CDR区和框架区进行上述氨基酸突变，不仅使得抗体变异体具备了更高的人源化水平、更低的天冬氨酸异构化和/或天冬酰胺脱酰胺风险，而且提高了母本抗体对人HER4的结合活性。

另一方面，本申请的抗HER4抗体(包括母本抗体Ab4268及其变异体)的重链CDR区、轻链CDR区以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列编号汇总于表2中，其中重链可变区CDRs和轻链可变区CDRs由Kabat编号系统定义。然而，如本领域所公知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列的其它诸如Chothia和IMGT、AbM或Contact编号系统/方法定义，以其它编号系统/方法定义的CDR区与本发明采用的Kabat所定义的CDR区均在本发明保护范围之内。

表2.抗HER4抗体的CDR区，以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列ID号

在一些实施方案中，本发明提供了分离的抗HER4单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含(1)氨基酸序列为NYX₁X₂G(X₁＝R或W；X₂＝V或I；即SEQ ID NO:49所示)的HCDR1，优选地，X₁＝R，X₂＝V；(2)氨基酸序列为IIX₃PX₄X₅X₆DARYSPSFX₇G(X₃＝F或Y；X₄＝A或G；X₅＝D,A,F,G,K,S或T；X₆＝S,A,E,N,T或Y；X₇＝E或Q；即，SEQ ID NO:50所示)的HCDR2，优选地，X₃＝F，X₄＝G，X₅＝A,F,G,K或S，X₆＝S或T，X₇＝Q；(3)如SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；(4)氨基酸序列为RSSQSLLHSX₈X₉YNYLD(X₈＝N,G,I,L,S,T或V，优选G或S；X₉＝G,A,I,N,P,R,T或V，优选G、A、N或R)的LCDR1，优选地，X₈＝G或S，X₉＝G,A,N或R；(5)如SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列；和(6)如SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或者分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些具体实施方案中，上述抗HER4抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，如SEQ ID NO:2-11任一个所示的HCDR2氨基酸序列，和如SEQ IDNO:12所示的HCDR3氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:13-18任一个所示的LCDR1氨基酸序列，如SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，上述抗HER4抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ IDNO:1所示的HCDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:2、3、4、10或11所示的HCDR2氨基酸序列；和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及如SEQ ID NO:13或15所示的LCDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列；和如SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述各CDR包含：

(1)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:2-11任一个所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:13所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或

(2)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:2所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:14-18任一个所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或

(3)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:11所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:15所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一个实施例中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，各CDR包含：如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQID NO:2所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:13所示的LCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:11所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:13或15所示的LCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:13所示的LCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:15所示的LCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列，SEQID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段进一步包含具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区以及具有所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区。

在一些具体实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含：与SEQ IDNO:21-40任一个所示的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的重链可变区VH，以及与SEQ ID NO:41-48任一个所示的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的轻链可变区VL。在一些优选的实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含：与SEQ ID NO:21、25、26、27、34、36、37、39或40所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的VH，以及与SEQ ID NO:41、42、44或48所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的VL。在一些优选的实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含：与SEQ ID NO:39或40所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的VH，以及与SEQID NO:48所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的VL。

在一个具体实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和的轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区各自包括分别与SEQ ID NO:21-40任一个所示的VH和SEQ ID NO:41所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或者分别与SEQ ID NO:21所示的VH和SEQ ID NO:42-47任一个所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或者分别与SEQ ID NO:39或40所示的VH和SEQ ID NO:48所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。优选地，所述重链可变区和轻链可变区各自包括分别与SEQ IDNO:21、25、26、27、34、36、37、39或40所示的VH和SEQ ID NO:41所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:21所示的VH和SEQ ID NO:42或43所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:39或40所示的VH和SEQ ID NO:48所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；更优选地，所述重链可变区和轻链可变区各自包括分别与SEQ ID NO:21所示的VH和SEQ ID NO:41所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:39或40所示的VH和SEQ ID NO:48所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段还可以包含恒定区，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。其中，所述重链恒定区包括人IgG重链恒定区Fc区的天然和突变蛋白形式，还包括含有促进二聚体形成的铰链区。在某些实施方案中，Fc区包含抗体CH2和CH3域。包含Fc部分的融合蛋白可以通过蛋白A或蛋白G亲和层析柱进行纯化，以及可以延长血清半衰期。优选的Fc区来源于人IgG，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在本文中，Fc区的特定氨基酸残基的位置是依据EU编号系统来确定的。

抗体的Fc区的一个功能是在抗体结合其标靶时与免疫系统产生“效应功能”，包括产生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP通过Fc与免疫细胞表面上Fc受体(FcR)的结合来介导；CDC通过Fc与例如C1q等补体系统的蛋白质结合来介导。效应功能可以通过各种方法来评估，如Fc受体结合试验、C1q结合试验和细胞裂解试验。

本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合人HER4胞外结构域Ⅲ，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段具有较高的人源化程度、较高的序列稳定性并且与人HER4的结合活性较高，且能有效抑制配体诱导的HER4二聚化及其下游信号转导通路，尤其是抑制NRG-1诱导的HER2/HER4二聚化及其下游信号转导通路。

2、筛选获得本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段的方法

本发明提供的抗HER4抗体可以是鼠源抗体，也可以是嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。产生单克隆抗体的方法是本领域已知的，任何一种已知的方法(例如，杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等)均可用于本发明中，以制备特异性结合HER4胞外结构域的单克隆抗体。

在一些实施方案中，本发明从正常人外周血中分离单核细胞(PBMC)，并从PBMC中扩增获得抗体可变区基因，通过噬菌体展示技术将人抗体可变区展示在噬菌体表面，构建噬菌体展示文库。

在一些实施方案中，可选择HER4受体氨基酸序列中任意片段的多肽(优选HER4受体胞外结构域)作为目的抗原进行淘选(panning)，检测噬菌体表面所展示的抗体可变区与所述目的抗原的相互作用，通过体外选择的方法筛选并扩增抗体可变区文库，所述体外选择类似于天然选择。在一些具体实施方案中，本发明通过多种方法检测、筛选与所述目的抗原相互作用的噬菌体表面所展示的抗体可变区，所述方法包括但不限于流式细胞术(例如，流式荧光激活细胞分选[fluorescence-activated cell sorting,FACS]检测法)、ELISA检测法和细胞荧光检测法。

在一些实施方案中，本发明通过构建噬菌体展示文库并对目的抗原进行淘选，从抗体文库中筛选出识别目的抗原的抗体。可利用多种本领域已知的噬菌体展示方法来产生本发明的抗体，例如，美国专利号5,223,409、5,622,699和6,068,829公开了用于制备噬菌体文库的方法。也可根据“Antibody Phage Display：Methods and Protocols(PhilippaM.O′Brien，Robert Aitken编辑)”中所描述的方法来构建噬菌体展示文库。在一些实施方式中，可以将编码抗体可变区的核酸插入至噬菌体外壳蛋白基因中，使得噬菌体将该抗体可变区展示在其表面，同时，在噬菌体内部含有编码该抗体可变区的核酸，从而实现抗体可变区表型和基因型之间的联系。

关于抗体的筛选，在噬菌体展示中，抗体的VH和/或VL区的较大文库可在丝状噬菌体颗粒的表面上表达，由此使其配对形成结合域。可根据与目的抗原识别和结合及其所展示的结合域，从文库中筛选出噬菌体。

在一些实施方式中，所述淘选可以通过噬菌体感染宿主细菌并在所述宿主中繁殖扩增来实现。由宿主细菌分泌的表面展示有单链抗体片段的噬菌体经收集后，可按需要进行多轮次的淘选直至得到能够选择性或特异性结合靶抗原的噬菌体，最后通过对噬菌体基因组中的抗体基因进行测序来获得抗体可变区的氨基酸序列(Arap等，Science 1998,279:377-380；Smith等，Science 1985,228:1315-1317)。

在特定的实施方式中，本发明利用HER4受体胞外结构域作为目的抗原，从PBMC中得到人抗体重链可变区族和轻链可变区族基因片段，基于此制得scFv片段，并连接在噬菌体表面结构蛋白基因III上，利用共表达方式，使之参与噬菌体组装并展示在噬菌体表面，由此构建获得噬菌体展示文库。利用噬菌体展示文库，针对特定靶抗原(例如，HER4受体胞外结构域)，通过多轮吸附-洗脱-扩增的重复过程(淘选)，可富集能特异性结合靶抗原的噬菌体，再通过基因测序技术得到相应的DNA序列信息，进而推断抗体可变区的氨基酸序列。

3、多核苷酸、载体和宿主细胞

一方面，本发明提供了一种编码抗HER4抗体或其抗原结合片段的核酸。本申请还包括编码本文所述氨基酸序列的多核苷酸变异体。

本领域技术人员可以基于遗传密码确定编码本申请抗体的核酸序列。聚合酶链式反应(PCR)可用以分离和扩增编码本申请的抗HER4抗体或其抗原结合片段的DNA序列。寡核苷酸可以另外含有限制内切核酸酶的识别位点，以促进扩增DNA片段组合插入表达载体中。PCR技术参见于Saiki等,Science 1988,239:487-491；Recombinant DNA Methodology,Wu等编著,Academic Press,In c.,San Diego(1989),第189-196页；PCR Protocols:A Guideto Methods and Applications,Innis等编著,Academic Press,Inc.(1990)。

本发明的核酸分子包括单股和双股形式DNA和RNA，以及对应的互补序。本发明的核酸分子还包括分离的核酸分子，优选来源于提纯后的，并且数量或浓度能够通过标准生物化学法鉴别、操作和回收其组分核苷酸序列的DNA或RNA(例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY(1989)中所述的方法)。优选地，此类序列包括以不常存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子中断的开放阅读框形式所提供和/或构建。非翻译DNA的序列可以存在于开放阅读框的5'或3'，其中所述序列不干扰编码区的操控或表达。

本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段通过以下步骤来制备：使用PCR诱变或本领域一般技术人员已知的其它技术对编码抗HER4抗体或其抗原结合片段DNA中的特定位点核苷酸进行诱变以产生编码变异体的DNA，此后在如本文中概述的细胞培养物中表达/扩增重组DNA。此外，抗HER4抗体或其抗原结合片段也可以通过使用已建立的技术体外合成来制备。

如本领域技术人员所已知的，由于遗传密码的简并性，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段由极其大量的核酸进行编码，每个部分的核酸都在本申请的范围内并且可以使用标准技术制成。因此，鉴别了特定的氨基酸序列，本领域的技术人员可以通过以不改变本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段氨基酸序列的方式来简单对其各自的编码序列进行一个或多个以上密码子修饰以制备许多不同的核酸。

另一方面，本发明还提供了编码本文的抗HER4抗体或其抗原结合片段的核酸的表达载体。

可以将编码本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段的核酸构建在合适的载体中，以导入宿主细胞进行目的蛋白的表达。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体中编码目标蛋白的核酸与启动子可操作地连接。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如，启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与另一个核酸序列之间的功能性连接，并因此该控制序列控制其他核酸序列的转录和/或翻译。

合适的载体包括质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体(如λ噬菌体或M13噬菌体)，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。

另一方面，本发明还提供了包含编码本申请的抗HER4抗体或其抗原结合片段的核酸或表达载体的宿主细胞。

该细胞可以是真核细胞，例如，哺乳动物宿主细胞，包括但不限于，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7,ATCC,CRL-1651)、人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等,J Gen Virol 1977,36:59-74)、幼地鼠肾细胞(BHK-21，ATCC,CCL-10)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO,Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA 1980,77:4216-4220)、小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,Biol Reprod 1980,23:243-251)、猴肾细胞(CV1,ATCC,CCL-70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC,CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA,ATCC,CCL-2)、犬肾细胞(MDCK,ATCC,CCL-34)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC,CRL-1442)、人肺细胞(W138,ATCC,CCL-75)、人肝癌细胞系(HepG2,ATCC,HB-8065)、小鼠乳腺瘤(MMT060562,ATCC,CCL-51)、TRI细胞(Mather等，Ann NY Acad Sci 1982,383:44-68)、MRC5细胞、或FS4细胞。

4、本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段的制备方法

本发明提供了使用所述宿主细胞制备本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段的方法。

所述方法包括将编码本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段的核酸或表达载体转染到宿主细胞中，并在培养基中培养宿主细胞一段时间以表达本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段。不受限制地，商业上可获得的培养基均可以用作培养基。

优选地，表达的抗HER4抗体或其抗原结合片段可分泌到培养宿主细胞的培养基中。使用标准蛋白质纯化的方法从培养基中回收抗体，例如通过离心或过滤除去杂质，或通过亲和色谱法纯化所得物；还可以使用其他纯化技术，例如阴离子或阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和羟基磷灰石色谱法。

5、双特异性分子/多特异性分子

本发明还提供了一种双特异性分子，其包含本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段与另一个功能性分子(例如另一种诸如Fab’片段的多肽或蛋白)连接，从而形成与多个结合位点或结合(靶)表位结合的双特异性分子或多特异性分子。例如，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种其它结合分子，例如另一种抗体、抗原结合片段、多肽或结合模拟物功能性连接，所述功能性连接包括化学耦联、基因融合、非共价缔合或其它方式)。

在一个实施方式中，所述另一个功能性分子可以是Fc受体(FcR)，例如人FcγRIII(CD16)、FcδRⅠ(CD64)或FcαR(CD89)，因此，本发明的双特异性分子或多特异性分子可以同时靶向于表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞[PMN])和表达HER4的肿瘤细胞。

在一个实施方式中，所述另一个功能性分子选自对与癌症相关的抗原(TAA)或免疫检查点蛋白抗原具有特异性的抗体或其抗原结合片段，所述与癌症相关的抗原可以选自HER2、HER3、VEGF、VEGFR、c-Met、TFR(转铁蛋白受体)、IGF-1R(人胰岛素-样生长因子I受体)等；所述免疫检查点蛋白抗原可以选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD137、CD47等。

在一个实施方式中，除了上述功能性分子的结合特异性和抗HER4结合特异性，本发明双特性分子或多特异性分子可以进一步包括第三结合特异性。第三特异性可以是抗增强因子(EF)部分，例如，所述分子可以结合至参与细胞毒活性的表面蛋白，并由此增加对靶细胞的免疫应答。所述的抗增强因子部分可以是抗体(包括scFv)，抗增强因子部分可以与FcR或靶细胞抗原结合。此外，抗增强因子部分结合的靶细胞可以不同于第一和第二结合特异性分子所结合的靶细胞，例如，抗增强因子部分可以与细胞毒T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4或ICAM-1)或其它对靶细胞产生增强的免疫应答的免疫细胞结合。

在本文中，所使用的术语“靶细胞”是指本发明分子(例如抗HER4抗体或其抗原结合片段、双特异性分子或多特异性分子)靶向于受试者体内任何不良的细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是过表达HER4的细胞，过表达HER4的细胞包括肿瘤细胞(例如，神经胶质瘤)，或其它非肿瘤细胞。

本发明的双特异性分子可以具有许多不同的形式。例如，双特异性分子保留了传统的抗体形式，不同的是，它不具有相同特异性的两个结合臂，而是具有不同特异性的两个结合臂，每个结合臂可以是由通过肽链连接的两个单链抗体片段(scFv)组成，以构建为双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2结构。双特异性分子还可以包括通过肽基接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其它形式的双特异性分子可以通过基因工程、体细胞杂交或化学合成的方法制备得到。参见例如，Kufer等，同前；Cao和Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；以及van Spriel等，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)，及其引用的参考文献。

6、免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒

一方面，本发明提供了一种包含本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物。

本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段可与治疗剂缀合形成免疫缀合物，例如抗体-药物偶联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素(包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、MMAE、MMAF、DM1、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌、米托蒽醌、米特拉霉素、放线菌素D、1-脱氢蛋白甾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔)、烷基化试剂(例如，三氯甲烷、氯丁硫脲、美法仑、卡莫司汀[BSNU]和洛莫司汀[CCNU]、环磷酰胺、丁磺酰亚胺、二溴硝基苯、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)[DDP]顺铂)、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶去甲肼)、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、微管蛋白粘合剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素(如放线菌素、博来霉素、米特拉霉素和蒽霉素[AMC])和抗有丝分裂剂(如长春新碱、长春花碱)。在ADC中，抗体和治疗剂偶联的接头可以选择可裂解接头(Cleavable linker)，如肽基接头、二硫键或腙接头，也可以选择不可裂解接头(Non-cleavable linker)。可以如美国专利号7,087,600、6,989,452和7,129,261；PCT公开文本WO 02/096910、WO 07/038,658、WO 07/051,081、WO 07/059,404、WO 08/083,312和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317、20060004081和20060247295所述的方法制备ADC，以引用的方式将其公开内容并入本文。

另一方面，本发明还提供了包含本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒。

7、药物组合物

本发明提供了药物组合物，该组合物包含本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段(或免疫缀合物、或双特异分子/多特异分子、或嵌合抗原受体、或工程化T细胞受体、或溶瘤病毒)，以及药学上可接受的载体。

所述药物组合物可以包含任何种类的药学上可接受的载体。可以使用的载体包括赋形剂、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂或其组合。在如下中教导了选择和使用合适的载体，Gennaro编著，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)，以引用的方式将其公开内容并入本文。

优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药(例如，通过注射或输注)。鉴于不同的给药途径，可以将活性成分包被在材料中以保护其免受酸和可能使其失活的其它自然条件的作用。如本申请所使用的，术语“肠胃外给药”是非肠内和局部的给药方式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本申请的抗体可以通过非肠胃外途径(例如，局部、表皮或粘膜给予途径)给药，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给药。

药物组合物可以是无菌水性溶液或分散剂。它们也能够形成微乳液、脂质体、或其它适合于高药物浓度的有序结构组合形式。

可以与载体材料组合以形成单一剂型的活性成分的量是依据受试者和特定的给药方式所确定的，并且通常也是能够产生治疗效果的组合物的量。通常，与药学上可接受的载体形成的组合物包含约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分。

调整剂量方案以提供最佳的预期应答(例如治疗应答)。例如，可以单次给药，可以分数次给药，或者可以根据治疗情况按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外给药的组合物是特别有利的，使给药方便和给药剂量均匀。如本申请所使用的，剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合作为治疗受试者的单位剂量；每个单位剂量包含预定量的活性成分，所述活性成分的预定量是通过计算活性成分与所需的药物载体一起施用产生预期治疗效果而得到的。另外，本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段也可以作为缓释制剂给药，这样可减少给药频率。

抗HER4抗体或其抗原结合片段的组合物给药剂量的范围可为约0.0001mg/kg至100mg/kg体重，通常为0.001mg/kg至50mg/kg体重。

本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段的“治疗有效剂量”优选可使得疾病症状严重性降低、疾病症状无进展期的频率和持续时间增加、或预防由疾病困扰所造成的机体损伤或失能。例如，相对于未治疗的受试者，受试者的“治疗有效剂量”优选能够抑制病情进展至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、还可以更优选至少约80％。治疗性抗体的治疗有效量可以改善受试者病症的至少一种症状，所述受试者通常是人或其它哺乳动物。“治疗有效剂量”还可以根据各种因素而不同地确定，所述的各种因素包括但不限于配制方法、给药方法、年龄、身体、体重、患者的性别或病理状况、饮食、给药时间、给药间隔、给药途径、排泄率和反应敏感性。

药物组合物可以选择控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson编著，Marcel Dekker,Inc.，纽约，1978。

可以通过如下的医疗装置来传输治疗性药物组合物，所述医疗装置选自：(1)无针皮下注射装置(例如，美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微型输注泵(美国专利号4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利号4,486,194)；(4)输注设备(美国专利号4,447,233和4,447,224)；以及(5)渗透装置(美国专利号4,439,196和4,475,196)；以引用的方式将其公开内容并入本文。

在某些实施方案中，可以配制本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段以确保在体内的生物分布。例如，为了确保本申请的治疗性抗体穿过血脑屏障，可以将其配制成脂质体，所述脂质体可以另外包含靶向部分，以增强向特定细胞或器官的选择性运送。参见例如，美国专利号4,522,811、5,374,548、5,416,016和5,399,331；Ranade VV,J ClinPharmacol 1989,29:685-694；Umezawa等,Biochem Biophys Res Commun 1988,153:1038-1044；Bloeman等,FEBS Lett 1995,357:140-144；Owais M等,Antimicrob AgentsChemother 1995,39:180-184；Briscoe等,Am J Physiol1995,268:L374-380；Schreier等,J Biol Chem 1994,269:9090-9098；Keinanen和Laukkanen,FEBS Lett 1994,346:123-126；以及Killion和Fidler,Immunomethods 1994,4:273-279。

8、药盒

一方面，本发明提供了一种药盒，其包含有效量的本发明抗HER4抗体或抗原结合片段的药物组合物，与一种或多种其它治疗剂(即，所述药盒可包含或不含至少一种另外的治疗剂)。

在一些实施方案中，所述治疗剂包括靶向胶质细胞反应性增生的治疗剂，包括信号通路调节剂、细胞周期抑制剂和炎症反应调节剂。在一些具体实施方式中，所述信号通路调节剂包括靶向R1P1K及下游VEGFD/VEGFR3通路的调节剂(例如，肿瘤抑制素[Necrostatin-1,NEC-1]及其类似物)、靶向PI3K/AKT信号通路的调节剂(例如，泽泻醇A24-乙酸酯)、抑制转化生长因子β1活性以及上调PPARα表达的调节剂(例如，油酰乙醇胺、丙戊酸)。在一些具体实施方式中，所述细胞周期抑制剂包括奥洛莫辛、红景天苷、肌肽。在一些具体实施方式中，所述炎症反应调节剂包括赛络通胶囊、白藜芦醇、抗IL-17A单抗(例如，苏金单抗)。

9、治疗用途和方法

一方面，本发明涉及本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段在用于制备治疗和/或预防HER4有关疾病或病症的药物组合物或制剂、制备用于诊断HER4有关疾病或病症的诊断试剂中的用途。或者，本发明涉及治疗和/或预防HER4有关疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒。

所述疾病或病症包括癌症和其它HER4有关疾病。

在一些实施方案中，所述癌症包括神经胶质瘤。

在一些实施方案中，其它HER4有关疾病包括胶质细胞增生性疾病，例如，中风、阿尔茨海默病、病毒性脑炎、创伤性脑损伤、多发性硬化症、癫痫。

另一方面，本发明提供了一种抑制HER4受体及其下游信号转导通路的方法，其包括使用本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒在体外或体内抑制配体诱导的HER4二聚化，所述配体包括NRG-1～4，优选NRG-1。

10、检测用途

本发明还涉及抗HER4抗体或其抗原结合片段用于检测和/或测量样品(例如，生物样品，如，血清、组织)中的HER4或表达HER4细胞的用途，以及用于筛选对本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段治疗有响应的与HER4有关病症患者的方法。

在一些实施方案中，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段可以用于诊断HER4异常表达(例如，过表达、表达不足或表达缺乏)的疾病或病症，以利于确定治疗方案。例如，可以将抗体与可检测标记物或报告分子偶联标记，并将所标记的抗体与从患者处获得的样品接触以诊断测定HER4表达水平。所述可检测标记物或报告分子可以是放射性同位素，例如³H、¹⁴C、³²P、³³P、³⁵S、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或¹⁸⁸Rh；荧光材料，例如，伞形酮、萤光素、罗丹明、异硫氰酸荧光素、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；化学发光材料，例如鲁米诺；生物发光材料，例如，荧光素酶、荧光素或水母发光蛋白；或酶，例如，碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。

在一些实施方案中，可以用于检测或测量样品中的HER4的含量或表达水平的方法包括：(a)将样品或对照样品与所述抗HER4抗体或其抗原结合片段接触，和(b)检测样品中结合所述抗体或其抗原结合片段的HER4含量或表达水平(定量或定性的)。其中，对照样品包括阳性对照和阴性对照，阳性对照可以是已知的能够评估疾病或病症的样品，阴性对照可以是健康受试者的样品。相较于对照品，样品中HER4表达水平较高且具有统计学差异，则表明存在与HER4有关的疾病或病症。可以用于检测或测量样品中HER4表达水平的具体示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫PET(例如，89Zr、64Cu等)和荧光活化细胞分选(FACS)。

在一些实施方案中，本发明提供了一种在受试者中检测、诊断或监测HER4有关疾病或病症的方法，所述方法包括：(1)将从受试者获得的待测样本与本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段接触，检测待测样本中HER4的含量或表达水平(定量或定性的)；(2)将待测样本中HER4的含量或表达水平与对照样品(例如，与待测样本来源于相同组织的正常细胞，或与此正常细胞的HER4表达水平相当的细胞)的HER4的含量或表达水平进行比较，其中与对照样品相比待测样本表达更高水平的HER4则可判断为受试者患有与HER4有关的疾病或病症，或者受试者具有与HER4有关疾病或病症的状况。

11、技术效果

本发明抗HER4抗体或其抗原结合片段可与人HER4胞外结构域Ⅲ特异性结合，且结合活性较高。本发明提供的抗HER4抗体或其抗原结合片段对配体诱导的HER4二聚化具有抑制作用，表明本发明的抗HER4抗体或其抗原结合片段能够阻断配体诱导HER4所介导的信号传导通路，并且所述抗体或其抗原结合片段作为癌症治疗剂时可以降低现有癌症治疗剂(例如，Pertuzumab)所引发的心脏毒性风险。

综上，本发明提供的抗HER4抗体或其抗原结合片段可作为治疗和/或预防HER4有关疾病或病症药物的候选者，也适合用于开发为双特异性分子或多特异性分子。

通过以下的实施例进一步阐释了本申请，其不应被解释为进一步限制。本申请全文中引用的所有附图和所有参考文献、专利和专利申请的内容以引用的方式明确地并入本文。除非另有说明，以下的实施例中涉及的材料、试剂和装置为可商购的。

实施例

实施例1抗人HER4噬菌体免疫文库的构建以及抗体的筛选

1.1噬菌体免疫文库的构建

利用TriZOL法从人外周血单核细胞中提取总RNA，采用逆转录试剂盒(PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，Takara)，以提取的RNA为模板进行逆转录反应而获得cDNA。随后以cDNA为模板，利用特异引物通过PCR方法分别扩增获得全套人抗体重链可变区族和轻链可变区族基因片段，再通过重叠PCR(SOE-PCR)将轻、重链可变区基因片段各自拼接扩增而得到单链抗体可变区基因片段(scFv)，将scFv序列通过酶切连接至噬菌粒展示载体中，然后将连接产物电转至TG1感受态细胞中，菌液经过辅助噬菌体M13KO7侵染后获得全人源噬菌体文库。

1.2抗体的初步筛选与序列分析

将所得到scFv文库加入到人HER4胞外结构域重组蛋白(如SEQ ID NO:52所示的第26-651位氨基酸序列)重组蛋白包被的免疫管中，于4℃下静置孵育过夜，经封闭、清洗、洗脱后，用1M Tris(pH8.0)中和，并侵染处于对数生长期的TG1大肠杆菌细胞，经培养后收集菌体细胞，并加入M13KO7辅助噬菌体进行感染，重复3-5轮“吸附-洗脱-扩增”的淘选，富集得到抗人HER4噬菌体展示抗体文库，挑取单菌落扩大培养，并进行菌液PCR鉴定和单克隆phage-ELISA鉴定后进行基因测序，得到能与所述抗原特异性结合的scFv，其VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。

1.3制备抗HER4抗体的方法

将上述步骤获得的scFv的VH和VL分别克隆到人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:53所示)和人κ轻链恒定区(SEQ ID NO:54所示)，即将含有编码VH和人IgG1重链恒定区的核苷酸序列以及含有编码VL和人κ轻链恒定区的核苷酸序列分别构建为重链表达载体和轻链表达载体，并将重链表达载体和轻链表达载体按1∶1进行混合，瞬时转染至处于对数生长期的Expi-CHOS细胞中，并置于32℃中培养10天。收集细胞上清液，离心沉淀细胞，过滤，并通过Protein A亲和层析纯化抗体，并将此抗体命名为Ab4268。

实施例2抗体Ab4268的抗原结合表位分析

通过ELISA法检测抗体Ab4268在HER4上的结合表位。具体方法如下：将抗体Ab4268用PBS稀释至1μg/mL后，以100μL/孔加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。PBS洗板后每孔加入200μL封闭液(含有1％ BSA的PBST[PBS+0.1％ Tween-20])，室温静置孵育1小时。PBST洗板后每孔加入100μL以1:200稀释于封闭液中的人源EGFR胞外结构域蛋白、HER3胞外结构域蛋白、HER4胞外结构域蛋白、或嵌合HER4胞外结构域Ⅲ蛋白(即，由HER4胞外结构域Ⅲ取代EGFR胞外结构域Ⅲ所构建而成的嵌合重组蛋白)，室温静置孵育2小时。PBST洗板，然后每孔加入100μL以1∶10,000稀释于封闭液中的抗-6×His-HRP抗体(Proteintech)，室温静置孵育1小时。PBST洗板后每孔加入100μL TMB显色液(Thermo)，室温避光孵育3-10分钟后每孔加入50μL终止液(2M HCl)，然后利用多功能酶标仪(Varioskan，Thermo)读取OD450值。利用GraphPad Prism 9软件对原始数据进行分析。检测结果如图1所示，Ab4268的识别表位位于HER4胞外结构域Ⅲ。

实施例3抗体Ab4268的优化

3.1Ab4268的单点突变优化

利用在线软件abYsis(http://abysis.org/abysis/index.html)和MOE软件，对抗体Ab4268的轻、重链可变区序列中人源化程度较低的氨基酸残基、潜在的稳定性风险位点、以及结合活性较低的氨基酸残基进行分析后，共设计了42个单点突变拟提高人源化程度和/或降低抗体分子的稳定性风险。在抗体Ab4268的基础上，分别引入设计的42个单点突变，然后将抗体轻、重链表达质粒组合分别瞬转ExpiCHO-S细胞进行各单点突变抗体的表达。利用分子相互作用仪(ForteBio，型号Oke)检测瞬转培养6天后各单点突变抗体以及母本抗体Ab4268在培养上清中的表达量。具体地，于ExpiCHO-S细胞瞬转表达后收获培养上清，并以200μL/孔加入到96孔黑板中，将待检测样品及Protein A探针置于ForteBio作用仪内，通过机器预设的定量程序检测培养上清中各抗体分子与Protein A探针的结合速率。每一循环完毕后设置将探针浸没于10mM甘氨酸缓冲液(pH 1.5)中使探针再生，并开始下一循环检测。待检测完毕后使用分析软件根据标准曲线进行计算，得到各突变体的表达量。

利用流式细胞术检测上述各突变体与表达HER4的293T细胞(293T-HER4)的结合活性，具体方法如下所述：收集293T-HER4细胞，在用FACS缓冲液(含有1％ BSA的PBS)重悬后以50μL/孔加入至96孔U型板中。将各待测突变体用FACS缓冲液稀释至20μg/mL后，以每孔50μL加入至上述孔板中，混匀后置于冰上静置孵育1小时。离心去上清，并使用FACS缓冲液洗涤3次。将二抗AF488标记的山羊抗人IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch)以1∶1000体积比稀释于FACS缓冲液中，以每孔100μL加入至上述孔板中，混匀后置于冰上静置孵育40分钟。离心去上清，使用FACS缓冲液洗涤3次。以100μL/孔FACS缓冲液重悬细胞，并利用流式细胞仪(NovoCyte 3005，Agilent)进行检测。

各突变体的突变位点与突变氨基酸、瞬转表达水平以及FACS检测细胞结合活性结果如表1和图2所示。与母本抗体Ab4268相比，提高了母本抗体的人源化程度、保留或提高了母本抗体的细胞结合活性、和/或显著降低了抗体分子的天冬氨酸异构化和/或天冬酰胺脱酰胺风险的突变，包括抗体重链中的17个单点突变(H101、H102、H103、H104、H107、H109、H110、H111、H112、H113、H118、H120、H122、H123、H126、H127和H128)，以及抗体轻链中的6个单点突变(L101、L102、L105、L108、L110和L112)。

表1.Ab4268的单点突变、瞬转表达水平以及与293T-HER4细胞的结合活性结果

H为重链；L为轻链；MFI为平均荧光强度

3.2Ab4268抗体的组合突变优化

选择上述抗体重链中的7个单点突变(即，H104、H107、H109、H122、H123、H126和H127)和抗体轻链中的2个单点突变(即，L101和L105)进行组合后引入到抗体Ab4268的可变区序列中，构建含不同组合突变的抗体分子。按照上述第3.1项所述方法进行抗体样品的制备，采用ForteBio检测各组合突变体以及对照母本抗体Ab4268的表达量，以及利用流式细胞术检测各组合突变体与293T-HER4细胞的单点结合活性。

各组合突变体分子包含的突变位点、瞬转表达水平以及与293T-HER4细胞的结合活性如表2和图3所示。各组合突变体的表达水平均显著高于母本抗体Ab4268；除了L201，其余各组合突变体的细胞结合活性与母本抗体的相当。

表2.Ab4268的组合突变、瞬转表达水平以及与293T-HER4细胞的结合活性结果

MFI：平均荧光强度

实施例4Ab4268变异体与293T-HER4细胞的结合活性

按照上述第3.1项所述方法，通过流式细胞术检测Ab4268变异体H201-L201和H202-L201与293T-HER4细胞结合活性。

检测结果如图4和表3所示，表明抗体H201-L201和H202-L201的细胞结合活性与母本抗体Ab4268的相当。

表3.Ab4268变异体与293T-HER4细胞的结合活性

抗体编号	细胞结合活性EC50(μg/mL)
		H201-L201	0.02684
H202-L201	0.03157
		Ab4268	0.02834

实施例5Ab4268对NRG-1诱导的HER2/HER4受体二聚化的影响

利用Promega的NanoBiT结构互补报告分子系统分别对Ab4268是否会影响NRG-1诱导的HER2/HER4受体二聚化展开了进一步验证。NanoBiT系统由一个LgBiT亚基和一个SmBiT亚基组成，可分别与待测蛋白融合；若两个待测蛋白相互作用形成二聚体，LgBiT则会和SmBiT结构互补形成功能性荧光素酶，从而与底物反应产生明亮的发光信号。在本实施例中，首先通过分子克隆技术将编码人HER2和HER4膜外域及跨膜域的核苷酸序列插入NanoBiT系统pBiT1.3-C和pBiT2.3-C载体中，随后将这两个质粒共转U2OS细胞；待转染24小时后收集细胞，并铺于96孔白壁板中，37℃培养过夜。将抗体Ab4268以及对照抗体Pertuzumab进行梯度稀释，随后按照1:1的体积比与NRG-1混匀待用(NRG-1的终浓度为1nM)。于96孔白壁板中加入Nano-Glo Live Cell Reagent(Promega)，并读取此时的化学发光值作为本底；随后在各孔中加入上述制备好的样品，37℃孵育6分钟后读取化学发光值。结果如图5和表4所示，抗体Ab4268和对照抗体Pertuzumab均能够抑制NRG-1诱导的HER2/HER4受体二聚化，但Ab4268的抑制活性显著低于对照抗体Pertuzumab。该结果说明抗体Ab4268能够通过抑制NRG-1诱导的HER4受体二聚化来影响HER4受体的正常生物学功能，例如，抑制HER4受体下游信号传导通路。

表4.Ab4268对NRG-1诱导的HER4受体二聚化的抑制活性

	Ab4268	Pertuzumab
			IC50(μg/mL)	8.639	0.3341

尽管本发明已通过一个或多个实施方式来描述，但是应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，并且本发明说明书旨在涵盖落在所附权利要求的精神和宽范围内的所有替代、修改和变动。本发明所引用的所有参考文献均通过引用整体的方式并入本发明中。

Claims (21)

1.一种分离的抗HER4抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗HER4抗体或其抗原结合片段包含以下至少一个特性：

(1)所述抗HER4抗体或其抗原结合片段特异性地结合人HER4胞外结构域Ⅲ；以及

(2)所述抗HER4抗体或其抗原结合片段能够抑制配体诱导的HER4受体二聚化及其下游信号转导通路。

2.如权利要求1所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段，其包含如下的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3：(1)氨基酸序列为NYX₁X₂G(X₁＝R或W；X₂＝V或I；即SEQ ID NO:49所示)的HCDR1，优选地，X1＝R，X2＝V；(2)氨基酸序列为IIX₃PX₄X₅X₆DARYSPSFX₇G(X3＝F或Y；X4＝A或G；X5＝D,A,F,G,K,S或T；X6＝S,A,E,N,T或Y；X7＝E或Q；即，SEQ ID NO:50所示)的HCDR2，优选地，X3＝F，X4＝G，X5＝A,F,G,K或S，X6＝S或T，X7＝Q；(3)如SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；(4)氨基酸序列为RSSQSLLHSX₈X₉YNYLD(X8＝N,G,I,L,S,T或V，优选G或S；X9＝G,A,I,N,P,R,T或V，优选G、A、N或R)的LCDR1，优选地，X8＝G或S，X9＝G,A,N或R；(5)如SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列；和(6)如SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或者分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段，其包含：(1)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列；(2)如SEQ ID NO:2-11任一个所示的HCDR2氨基酸序列；和(3)如SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及(4)如SEQ ID NO:13-18任一个所示的LCDR1氨基酸序列；(5)如SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列；和(6)如SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段，其包含如下的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述各CDR包含：

(1)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:2-11任一个所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:13所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或

(2)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:2所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:14-18所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或

(3)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:11所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:15所示的LCDR1氨基酸序列、SEQID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

5.如权利要求1-4所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段，其包含：如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:2所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:13所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

或如SEQ ID NO:1所示的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:11所示的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:12所示的HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:13或15所示的LCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:19所示的LCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:20所示的LCDR3氨基酸序列，或分别与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段，其包含如下具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区VH，以及具有所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区VL，所述抗体或其抗原片段包含：与SEQ ID NO:21-40任一个所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的VH，以及与SEQ ID NO:41-48任一个所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的VL。

7.如权利要求1-6中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段，其包含如下具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区VH和具有所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区VL，所述VH和VL各自包括：

(1)分别与SEQ ID NO:21-40任一个所示的VH和SEQ ID NO:41所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或

(2)分别与SEQ ID NO:21所示的VH和SEQ ID NO:42-47任一个所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或

(3)分别与SEQ ID NO:39或40所示的VH和SEQ ID NO:48任一个所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

优选地，分别与SEQ ID NO:21、25、26、27、34、36、37、39或40所示的VH和SEQ ID NO:41所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或分别与SEQ ID NO:21所示的VH和SEQ IDNO:42或43所示的VL具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

8.一种核酸，其编码如权利要求1-7中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段。

9.一种表达载体，其能够表达权利要求8所述的核酸。

10.一种宿主细胞，包含权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的表达载体。

11.一种使用权利要求10所述的宿主细胞制备权利要求1-7中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段的方法，包括：(i)在所述的宿主细胞中表达所述抗HER4抗体或其抗原结合片段，和(ii)从所述的宿主细胞或细胞培养物中分离所述抗HER4抗体或其抗原结合片段。

12.一种双特异性分子或多特异性分子，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段，以及对Fc受体、或者与癌症相关的抗原或免疫检查点蛋白抗原具有结合特异性，其中所述的与癌症相关的抗原选自HER2、HER3、VEGF、VEGFR、c-Met、TFR(转铁蛋白受体)、IGF-1R(人胰岛素-样生长因子I受体)；所述免疫检查点蛋白抗原选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD137、CD47。

13.如权利要求12所述的双特异性抗体或多特异性抗体，其进一步可以包含第三结合特异性，第三特异性可以是抗增强因子(EF)部分。

14.一种免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒，其特征在于，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段。

15.一种药物组合物，其包括权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12或13所述的双特异性抗体或多特异性抗体，或权利要求14所述的免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒，以及药学上可接受的载体。

16.一种药盒，其包含权利要求15所述的药物组合物，与一种或多种其它治疗剂，所述治疗剂选自信号通路调节剂、细胞周期抑制剂和炎症反应调节剂。

17.一种如权利要求1-7中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段在用于制备治疗或预防HER4有关的疾病或病症的药物组合物或制剂中的用途。

18.一种治疗或预防HER4有关疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求1-7中任一项所述的抗HER4抗体或抗原结合片段、或权利要求15所述的药物组合物，或权利要求16所述的药盒。

19.如权利要求17所述的用途和如权利要求18所述的方法，其中，所述疾病或病症包括癌症和其它HER4有关疾病，所述癌症包括神经胶质瘤，所述其它HER4有关疾病包括胶质细胞增生性疾病，例如，中风、阿尔茨海默病、病毒性脑炎、创伤性脑损伤、多发性硬化症、癫痫；所述的受试者可为人、非人灵长类动物或其它哺乳动物(如狗)等。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中，所述方法能够在所述受试者中抑制配体诱导的HER4二聚化，所述配体包括NRG-1～4，优选NRG-1。

21.一种检测和/或测量样品中的HER4或表达HER4细胞的方法，以及筛选对如权利要求1-7中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段治疗有响应的与HER4有关病症患者的方法，包括将如权利要求1-7中任一项所述的抗HER4抗体或其抗原结合片段与所述样品或分离自所述患者的生物样本进行孵育，检测所述抗体或其抗原结合片段是否结合至所述样品或生物样本。