CN119816516A

CN119816516A - 白细胞介素-2变异体及其于治疗癌症的用途

Info

Publication number: CN119816516A
Application number: CN202380059230.2A
Authority: CN
Inventors: 蓝耿立; 蔡政良; 黄彦华
Original assignee: Kaiin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Kaiin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-16
Filing date: 2023-08-16
Publication date: 2025-04-11
Also published as: TW202413398A; TWI875131B; US20260028383A1; WO2024037572A1

Abstract

本申请整体上是关于一种分离的白细胞介素‑2(IL‑2)变异体，其展现出对IL‑2受体(IL‑2R)的α‑亚单位的亲和力降低，可以用作一种免疫治疗剂。此外，本申请亦涵盖一种包含该分离的IL‑2变异体的药学组合物，以及该药学组合物于治疗一个体的癌症的用途。

Description

白细胞介素-2变异体及其于治疗癌症的用途

相关申请案

本申请主张2022年8月16日提出申请的美国第63/398,290号临时申请案的申请日，其全部内容并入本说明书中作为参照。

序列表

本申请案同时提出序列表XML的电子档案，此序列表XML的电子档案创设于2023年8月4日，文件名”P4261-PCT_SeqList_20230804_filed.xml”，大小为36kb。序列表XML电子档案中的信息并入本说明书中作为参照。

技术领域

本申请整体上是关于癌症治疗的技术领域。更具体来说，本申请是关于白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)变异体，以及其于治疗癌症的用途。

背景技术

癌症是一种有关于身体的某一部位有异常细胞不受控制地分裂，并有可能侵犯或扩散到身体其它部位的疾病。长久以来，癌症严重威胁到全人类的健康，并成为社会医疗卫生系统的沉重负担。根据世界卫生组织所提供的统计数据，仅在2020年一年，男女各年龄段的所有癌症新增病例达19,292,789例，癌症死亡人数达9,958,133人，造成重大的人类生命和经济损失。

因此，世界各地的科学家们致力于开发有效的癌症治疗方法，借以提高癌症治疗的功效，迄今为止，现行的治疗方法包括外科手术、化学疗法、放射疗法、荷尔蒙疗法、温热疗法、缓和疗护(palliative care)等用于治疗癌症的方法。然而，这类传统方法经常伴随着严重的副作用，例如，会对正常组织造成损伤或具有细胞毒性。有鉴于上述问题，近年来相应开发了具有较少副作用的治疗方法，其中一些治疗方法正处于研究或临床前试验的阶段。在这些治疗方法中，利用生物大分子(例如，多肽、核酸、碳水化合物等)的免疫疗法被认为是最有前途的治疗方法，因为它通过调节宿主免疫系统的功能来消除肿瘤，从而最大限度地减少可能对病患产生的副作用。

IL-2是一种有潜力的用于治疗癌症的免疫治疗剂。野生型IL-2(亦称为白细胞介素原(proleukin)，一种T细胞生长因子(T cell growth factor，TCGF))，是一种15.5千道耳顿(kDa)的球状糖蛋白，它参与在淋巴细胞的生成、存活，以及恒定。IL-2主要由活化的T细胞(特别是CD4⁺辅助型T细胞)来合成。它会刺激T细胞的增殖和分化，诱导胞毒型(cytotoxic)T淋巴细胞(CTL)的生成，诱导周边血液淋巴细胞向胞毒型细胞和淋巴因子(lymphokine)活化杀伤(lymphokine-activated killer，LAK)细胞的分化，促进T细胞表达细胞激素和细胞溶解(cytolytic)分子，促进B细胞的增殖和分化以及B细胞合成免疫球蛋白，并刺激自然杀伤(natural killer，NK)细胞的生成、增殖，以及活化。由于IL-2能够在体内扩大淋巴细胞群并增加这些细胞的效应器(effector)功能，从而产生抗肿瘤作用，因此IL-2被认为是一种有吸引力的用于治疗癌症的治疗选择。

然而，IL-2在免疫反应中具有双重功能，它不仅会介导效应细胞的扩增和活性，并且还关键性地参与在维持周边免疫耐受性中。IL-2通过与IL-2受体(IL-2R)结合来介导其作用，而IL-2R由α-亚单位(CD25)、β-亚单位(CD122)，以及γ_c-亚单位(γ_c，CD132)等亚单位来组成二聚体形式(含有β/γ_c-亚单位)或三聚体形式(含有α/β/γ_c-亚单位)的受体。在上述亚单位中，α-亚单位是赋予与其受体结合的高度亲和力，而β-亚单位和γ_c-亚单位则是对于信号转导至关重要。在免疫耐受性的部分，IL-2一部分通过结合至调控性T(regulatory T，T_reg)细胞所表达的IL-2R三聚体(即α/β/γ_c-亚单位)来参与，结合后，活化T_reg细胞的活性，进而触发周围环境的免疫抑制性，从而损害宿主的抗肿瘤免疫力。据此，野生型IL-2对于抑制肿瘤生长来说并非最佳选择，而优化IL-2，通过筛选一系列的IL-2变异体，以寻找出与IL-2R的α-亚单位的亲和力降低，且与IL-2R的β-亚单位和γ_c-亚单位的亲和力不受影响的变异体，可有助于减轻T_reg细胞所引起的免疫抑制性，从而增强IL-2的整体抗肿瘤活性。

有鉴于此，相关领域亟需寻找出最佳的IL-2变异体来克服与IL-2免疫疗法相关的问题，通过剪除IL-2蛋白中不想要的免疫耐受性活性，进而增强它在治疗方面的应用性。

发明内容

下文呈现出本申请的简单概要，以利读者对于本申请有基本的理解。本概要并非是对于本申请的广泛性概观，也非是用以鉴别本申请的关键性/决定性组件，或用以勾勒本申请的范围。它唯一的目的在于，以一种简化的形式呈现出本申请的某些概念，以作为后续呈现出更多详细说明的序幕。

如在本文中所实施和广泛描述的，本申请的其中一方面是关于一种分离的IL-2变异体，其表现出对IL-2R的α-亚单位的亲和力降低，而对IL-2R的β-亚单位和γ_c-亚单位的亲和力不受影响的特性，该分离的IL-2变异体具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列，其中该分离的IL-2变异体在对应于序列编号：1中的第42、45、50、72或125个位置处包含一氨基酸置换(substitution)，其中：

在对应于序列编号：1中的第42个位置处的该氨基酸置换是将苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、缬氨酸(V)，或色氨酸(W)；

在对应于序列编号：1中的第45个位置处的该氨基酸置换是将酪氨酸(Y)置换为丙氨酸(A)、天门冬氨酸(D)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)，或苏氨酸(T)；

在对应于序列编号：1中的第50个位置处的该氨基酸置换是将丙氨酸(A)置换为异亮氨酸(I)；

在对应于序列编号：1中的第72个位置处的该氨基酸置换是将亮氨酸(L)置换为天门冬氨酸(D)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、天门冬酰胺(N)，或缬氨酸(V)；以及

在对应于序列编号：1中的第125个位置处的该氨基酸置换是将半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。

依据本申请的某些实施方式，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为色氨酸(W)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为赖氨酸(K)。

依据本申请的其它实施方式，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为缬氨酸(V)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。

依据本申请的再一其它实施方式，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为谷氨酸(E)，以及在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为甘氨酸(G)。

可任选地，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为缬氨酸(V)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为丝氨酸(S)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。

或者或再者，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为组氨酸(H)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬氨酸(D)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为异亮氨酸(I)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。

在本申请的某些进一步的实施方式中，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为半胱氨酸(C)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为缬氨酸(V)。

或者是，在本申请的一特定实施方式中，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第50个位置处的丙氨酸(A)置换为异亮氨酸(I)。

依据本申请的某些特定实施方式，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬氨酸(D)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬氨酸(D)。

又在本申请的某些进一步的实施方式中，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为甲硫氨酸(M)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)。

再又在本申请的某些进一步的实施方式中，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列和以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为精氨酸(R)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)。

依据本申请的某些较佳的实施方式，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，该分离的IL-2变异体包含序列编号：1的氨基酸序列。

据此，本申请亦涵盖一种药学组合物，包含上述分离的IL-2变异体，以及一药学上可接受的载体。

本申请的另一方面是关于一种用以治疗一个体的癌症的方法，是借助于使用本申请分离的IL-2变异体或包含该变异体的本申请药学组合物，该方法包含对该个体施予一有效量的本申请分离的IL-2变异体或本申请药学组合物的步骤。

依据本申请的某些较佳的实施方式，本申请分离的IL-2变异体或本申请药学组合物是以1-500微克/公斤体重的量施予至该个体。

适用于本申请分离的IL-2变异体、本申请药学组合物，或本申请方法来治疗的癌症可以是膀胱癌、胆管癌、骨癌、脑瘤、乳腺癌、子宫颈癌、大肠直肠癌、食道癌、表皮癌、胃癌、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)、神经胶质瘤、类淋巴系造血组织肿瘤、肝癌、卡波西氏肉瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肠癌、黑色素瘤、骨髓性白血病、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、肾细胞癌、脾脏癌、鳞状细胞癌、甲状腺癌，或甲状腺滤泡癌。

依据本申请的某些进阶的实施方式，本申请方法还包含在施予本申请分离的IL-2变异体或本申请药学组合物之前、同时，或之后，使该有需要治疗的个体接受外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法、荷尔蒙疗法，或其组合疗法的步骤。

在本申请的某些较佳的实施方式中，本申请方法中与本申请分离的IL-2变异体或本申请药学组合物合并使用的是免疫疗法，其中所述免疫疗法包含对该个体施予一有效量的C-C基序趋化因子配体3(C-C motif chemokine ligand3，CCL3)、C-C基序趋化因子配体26(CCL26)、C-X-C基序趋化因子配体7(C-X-Cmotif chemokine ligand 7，CXCL7)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-15(IL-15)；阿普司特(apremilast)、咪喹莫特(imiquimod)、来那度胺(lenalidomide)、柏马度胺(pomalidomide)、西普鲁塞-T(sipuleucel-T)、沙利度胺(thalidomide)；抗-CTLA-4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体；抗-CD2抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD11a抗体、抗-CD20抗体、抗-CD25抗体、抗-CD52抗体、抗-EGFR抗体、抗-HER2抗体、抗-PCDP1抗体、抗-SLAMF7抗体，或抗-Trop-2抗体。依据本申请的更佳实施方式，本申请方法中与本申请分离的IL-2变异体或本申请药学组合物合并使用的免疫疗法，包含对该个体施予一有效量的IL-15。

可通过本申请分离的IL-2变异体、本申请药学组合物，或本申请方法来治疗的个体是一种哺乳动物，举例来说，可以是人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、猴子、猪、狗、猫、马、绵羊、山羊、乳牛，以及兔子。较佳地，该个体是人类。

在参阅以下的具体实施方式和附图后，本申请诸多伴随的特征和优点当可轻易了解。

附图说明

在参阅以下的具体实施方式、权利要求书和附图后，本申请和其它特征、方面和优点将更明显易懂，其中：

图1A-1E阐述依据本申请的实施方式所制备的本申请IL-2变异体的特性分析结果。图1A是西方墨点法的结果，阐述特定IL-2变异体的表达情况。图1B-1E是流式细胞术的结果，阐述在以特定IL-2变异体(在图1B和1D-1E中，分别使用30纳体积摩尔浓度(nM)；在图1C中，使用4nM)处理细胞后，在CTLL-2细胞(表达出IL-2R的α/β/γ_c-亚单位；图1B)或HH细胞(表达出IL-2R的β/γ_c-亚单位；图1C-1E)中所诱发的磷酸化STAT-5(pSTAT-5)表达量。MFI，平均荧光强度(mean fluorescence intensity)；pSTAT-5⁺细胞的百分比(％)，显示出pSTAT-5-阳性细胞的百分比。

图2A-2F是流式细胞术的结果，阐述在以一系列浓度(0-30nM)的特定IL-2变异体处理细胞后，在CTLL-2细胞(图2A、2C和2E)或HH细胞(图2B、2D和2F)中所诱发的pSTAT-5表达量。IL-2v(AAG)，一种突变IL-2(AAG：IL-2具有F42A、Y45A，以及L72G的置换)。

图3A-3D是施予特定治疗后的小鼠相对器官重量(图3A，肺脏；图3B，肝脏；图3C，脾脏；相对于体重)，以及其体重(图3D)。**，p<0.01；***，p<0.005；****，p<0.0001。

图4A-4C是流式细胞术的结果，阐述在施予特定治疗后的小鼠脾脏中的活性CD8⁺T细胞(图4A)、活性NK细胞(图4B)，以及T_reg细胞(图4C)的百分比。**，p<0.01；***，p<0.005；****，p<0.0001。

具体实施方式

为了使本申请的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

I.定义

为方便起见，本说明书、实施例和权利要求书中所使用的特定专有名词集中在此。除非本说明书另有定义，否则此处所使用的科学和技术词汇的含义与本领域技术人员所理解和惯用的意义相同。并且，在与上下文不相冲突的情形下，本说明书所使用的单数名词涵盖该名词的复数型，而所使用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体而言，在本说明书与申请专利范围中，单数形式“一”(a、an和the)包括复数参考值，但依据上下文而另有指示者除外。此外，在本说明书与申请专利范围中，“至少一”(at least one)与“一或多”(oneor more)等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。除非另有说明，否则本申请的实践将会采用分子生物学、肿瘤生物学、微生物学，以及免疫学等领域的常规技术，这些技术均属于本领域的技术范围内。这类技术已在公开文献中有详细阐释。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已经尽可能精确地呈现出具体实施例中的相关数值。然而，任何数值在本质上不可避免地会含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实施例以外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值，以及百分比(例如，用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例等)均经过“约”的修饰。据此，除非另有相反指示，否则本说明书与附随申请专利范围所公开的数值参数皆为约略的数值，并且可视需求而更动。至少，应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

除非另有说明，否则本文所使用的“白细胞介素-2”(interleukin-2)或“IL-2”一词，是指来自任何脊椎动物来源的任何原生(native)的IL-2多肽，包括来自哺乳动物例如灵长类动物(例如，人类)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)的IL-2多肽。该词汇涵盖了未加工的IL-2以及任何由细胞内加工所产生的IL-2形式。该词汇还涵盖了天然存在的IL-2变异体，例如，剪接(splice)变异体或等位基因变异体。例示性的人类IL-2的氨基酸序列如序列编号：1所示。未加工的人IL-2还包含N端的20个氨基酸信息肽，该信息肽在成熟的IL-2分子中并不存在。

本文所使用的“IL-2变异体”(IL-2variant)一词旨在涵盖各种形式的IL-2多肽的任何突变形式，包括全长IL-2、IL-2的截短形式(truncated form)，以及IL-2与另一分子通过融合或化学缀合(conjugation)而连接的形式。在指涉IL-2时，“全长”(full-length)意指成熟的、天然长度的IL-2分子。举例来说，全长人类IL-2是指一种具有133个氨基酸(例如参见序列编号：1)的分子。各种形式的IL-2变异体的特征在于，具有至少一个会影响IL-2与IL-2R的α-亚单位(CD25)相互作用的氨基酸突变。该突变可能涉及置换、缺失、截短，或修饰在通常位于该位置的野生型氨基酸残基。较佳是通过氨基酸置换来获得突变体。除非另有说明，否则在本文中IL-2变异体可以称为IL-2突变体、IL-2突变体肽序列、IL-2突变体多肽、IL-2突变体蛋白，或IL-2突变体类似物。本文中各种形式的IL-2的命名是相对于序列编号：1中的所示序列来进行。本文中可以使用各种命名方式来指称相同的突变。举例来说，第42个位置处的苯丙氨酸置换成丙氨酸的突变可以表示为42A、A42、F42A，或Phe42Ala。

如本文所使用者，“野生型(wild-type)”IL-2的形式是指一种在其它方面与IL-2变异体相同，但在每个IL-2变异体的突变氨基酸位置上，野生型形式具有野生型氨基酸的IL-2形式。举例来说，如果IL-2变异体是全长IL-2(即未与任何其它分子融合或缀合的IL-2)，则该突变体的野生型形式是全长的原生IL-2。如果IL-2变异体是突变型IL-2与另一种位于IL-2下游的编码多肽(例如，抗体链)之间的融合体，则该IL-2变异体的野生型形式是将野生型IL-2氨基酸序列融合到相同的下游多肽的融合体。此外，如果IL-2变异体是IL-2的截短形式(在非截短的部分具有突变或修饰序列)，则该IL-2变异体的野生型形式是一种同样被截短的IL-2，但具有野生型序列的形式。为了比较各种形式的IL-2变异体相较于其相应的野生型IL-2形式，对于IL-2受体的结合亲和力或生物学活性，“野生型”一词还涵盖了一种包含一或多个氨基酸突变的IL-2形式，其中与天然发生的原生IL-2相比，该突变不会影响到其与IL-2受体的结合，例如将人类IL-2的第125个位置处的半胱氨酸残基置换为丙氨酸即属此类。

本文所使用的“高度亲和力IL-2R(high-affinity IL-2R)”一词是指IL-2R的异源性三聚体形式，由受体α-亚单位(又称CD25或P55)、受体β-亚单位(又称CD122或P70)，以及受体γ_c-亚单位(又称共同细胞激素受体(common cytokine receptor)γ_c-亚单位、γ_c，或CD132)所组成。相比之下，“中度亲和力IL-2R(intermediate-affinity IL-2R)”一词是指仅包括β-亚单位和γ_c-亚单位，而不包括α-亚单位的IL-2受体。

本文所使用的“亲和力(affinity)”一词是指一种分子(例如，受体)的单一结合位点与其结合对象(例如，配体)之间的非共价相互作用的总强度。除非另有说明，否则本文所使用的“结合亲和力”(binding affinity)一词是指，一种反映出一组结合对(bindingpair)的成员(例如，受体和配体)之间以1：1相互作用的内在(intrinsic)结合亲和力。分子X与其对象Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)来表示，该常数是解离速率常数(K_off)与结合速率常数(K_on)的比率。因此，“等效亲和力”(equivalent affinity)可以包含不同的速率常数，只要该速率常数的比率保持不变即可。亲和力可以通过本领域已知的任何已确立的方法来测量，例如通过表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)来进行分析，使用标准仪器例如BIAcore仪器，其中IL-2R的每个亚单位可以通过表达重组蛋白来获得。或者是，可以使用已知会表达出某种IL-2R形式的细胞株，来评估IL-2变异体对不同IL-2R形式的结合亲和力。

本文所使用的“效应细胞(effector cell)”一词，是指一种会介导IL-2的细胞毒性作用的淋巴细胞群。效应细胞包括效应T细胞，例如，CD8⁺胞毒性T细胞、NK细胞、LAK细胞，以及巨噬细胞/单核球。

本文所使用的“多肽”一词是指一种由单体(氨基酸)通过酰胺键(又称肽键)进行线性连接所组成的分子。“多肽”一词是指任何由两个或更多个氨基酸所组成的链状结构，并非指定特定的产物长度。因此，“肽(peptide)”、“二肽(dipeptide)”、“三肽(tripeptide)”、“寡肽(oligopeptide)”、“蛋白”、“氨基酸链(amino acid chain)”，或用于指称任何两个或更多个氨基酸链的其它词汇，均包括在“多肽”的定义中，并且“多肽”一词可以代替或与这些词汇交替使用。“多肽”还意指多肽的表达后修饰产物，包括，但不限于，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生、蛋白水解切割，或通过非天然发生的氨基酸的修饰。多肽可以是来自天然的生物学来源，也可以通过重组技术来产生，但不一定是根据指定的核酸序列进行转译而来。它可以是通过任何方式来产生，包括通过化学合成来产生。本发明多肽的大小可能具有大约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸。多肽可能具有确定的三维结构，尽管它们不一定具有这种结构。具有确定三维结构的多肽称为折叠的，而这些没有确定三维结构，但可以采用大量不同构型的多肽称为未折叠的。

“分离的(isolated)”多肽或其变异体或衍生物是指一种不存在于其天然来源的多肽。并不需要特定程度的纯化。举例来说，可以将分离的多肽从其原生或天然环境中移出。为了本发明的目的，在宿主细胞中表达出以重组方式所制备的多肽和的蛋白视为是分离的，同理，已通过任何适当技术来进行分离、分馏(fractionated)，或部分或实质上纯化的原生多肽或重组多肽也视为是分离的。

如本文所讨论者，在本申请IL-2变异体中的氨基酸序列发生些微变化仍被视为涵盖在本申请所披露和要求保护的发明概念中，只要这些变化是发生在对应于序列编号：1中的第42、45、50、72或125个位置处之外的位置上(即，在序列编号：1中的第1-41、43-44、46-49、51-71、73-124，或126-133个位置处发生变化)，并与序列编号：1保持至少85％的序列相似度(例如，与序列编号：1具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及100％的序列相似度)，且不会影响本申请IL-2变异体对IL-2R的α-亚单位的结合亲和力即可。

“序列相似度百分比(％)”定义为，在候选序列中的氨基酸残基与在特定多肽序列中的氨基酸残基的一致性百分比，是在比对序列并视需要来引入间隙(gap)，借以达到最大的序列相似度百分比之后，并且不考虑任何保守性置换来作为序列相似度的一部分。可利用本领域技术人员所熟知的各种方法来比对，并确认序列相似度百分比，举例来说，可利用例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等公开的计算机软件来比对。本领域技术人员可以决定适当的测量比对参数，包括任何所需的算法以利所比对的全长序列达到最大比对值。为达此目的，两个氨基酸序列之间的序列比对是利用国家生物技术信息中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)于网络上所提供的计算机软件Blastp(蛋白-蛋白BLAST)来进行分析。一个给定的氨基酸序列A与一个给定的氨基酸序列B之间的氨基酸序列相似度百分比(或说是，一个给定的氨基酸序列A具有与一个给定的氨基酸序列B的某％的序列相似度)是利用下列公式来计算：

其中X是氨基酸残基数，是通过序列比对程序BLAST在比对A和B序列之后所得出的一致性匹配数，而Y则是A或B序列中的氨基酸残基总数，取较短者。

“药学组合物”一词是指一种它的形式可允许在其中所含的活性成分的生物学活性为有效的制剂，并且不包含对一待施用该组合物的个体具有不可接受的毒性的附加成分。

本文所使用的“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)”一词是指药学上可接受的材料、组合物，或载剂(vehicle)，例如，液体或固体填充剂、稀释剂、载体、溶剂，或封装材料，涉及从一个器官或身体的其中一部分携带或运输主体药剂到另一器官或身体的另一部分。每种载体在与该制剂中的其它成分兼容的意义上，必须是“可接受的”。该药学制剂含有本发明IL-2变异体以及一或多种药学上可接受的成分。载体可以是固体(例如，胶囊)、半固体(例如，乳膏)，或液体(例如，稀释剂)的形式。这些药学制剂亦为本发明目标。通常来说，活性成分的量约占该制剂重量的0.1-95％，在胃肠外使用的制剂中较佳是约占该制剂重量的0.2-20％，在口服给药的制剂中较佳是约占该制剂重量的1-50％。为了本申请方法的临床应用，可将本发明药学组合物配制成适用于预定给药途径的制剂。

本文所使用的“治疗(treatment,treating)”一词可以是指一种治愈性或缓和性措施。具体来说，本文所使用的“治疗”一词，是指对一个体施用(application)或施予(administration)本申请IL-2变异体，或包含它们的药学组合物，该个体罹患癌症，或罹患一种与癌症相关的症状或疾病，或罹患一种继发于癌症的次生性疾病或病症，以期部分地或完全地减轻(alleviate)、改善(ameliorate)、缓解(relieve)、延迟发作、抑制进展、降低严重性，及/或降低发生率在一或多种与癌症相关的症状或病症上。

“施予(administered,administering or administration)”一词在本文中可交替使用，是指直接施用本申请IL-2变异体，包含本申请IL-2变异体的药学组合物，及/或本发明方法。

本文所使用的“一有效量(an effective amount)”一词是指一种有效的量，在必要的剂量和时间内，对癌症的治疗可达到欲求的治疗结果。为了治疗的目的，有效量也可以是指一种其中成分的任一种毒性或有害作用被治疗上有益作用所超过的量。具体的有效量或足量会因多种因素而有所差异，这类因素例如待治疗的特定病症、病患的身体状况(例如，病患的体重、年龄，或性别)、待治疗的哺乳动物或动物的种类、治疗的持续时间、并行疗法的性质(若有的话)，以及所采用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构等。一有效量可以表示成，举例来说，活性成分的总质量(例如，以克、毫克或微克为单位)，或活性成分的质量与体重的比率(例如，以毫克/公斤(mg/kg)为单位)。或者是，有效量可以是以活性成分(例如，本申请IL-2变异体)的浓度来表示，例如，体积摩尔浓度(molar concentration)、质量浓度、体积浓度、重量摩尔浓度(molality)、摩尔分数(mole fraction)、质量分数(massfraction)，以及混合比率(mixing ratio)。本领域技术人员可以根据动物模式所确定的剂量来计算药物(例如，本申请IL-2变异体)的人体等效剂量(human equivalent dose，HED)。举例来说，HED可以是按照美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)所发布的行业指南“估计成人健康志愿者治疗在初始临床试验中的最大安全起始剂量”(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials forTherapeutics in Adult Healthy Volunteers)来估算用于人类个体的最大安全剂量。

“个体(subject)”或“病患(patient)”一词是指可用本申请IL-2变异体、药学组合物，及/或方法来治疗的动物，包括人类物种。除非明确指出一种性别，否则“个体”或“病患”一词意指男性和女性二者。据此，“个体”或“病患”一词包含任何可能受益于癌症治疗的哺乳动物。在一例示性的实施方式中，该个体是人类。

II.发明详述

本申请至少一部分是基于一项发现，即本申请IL-2变异体对IL-2R的α-亚单位具有降低或消除(abolished)的亲和力，使得本申请IL-2变异体具有改善的免疫疗法特性。如上所述，不同形式的IL-2R由不同的亚单位所组成，并对IL-2表现出不同的亲和力。中度亲和力的IL-2R具有受体β/γ_c-亚单位，并且在静息的(resting)效应细胞(例如，自然杀伤细胞和T细胞)中表达，且在与IL-2结合后足以进行IL-2信号传递，从而诱发这些效应细胞的增殖和活化。相比之下，高度亲和力的IL-2R还另外包含受体α-亚单位，并且主要表达在T_reg细胞以及活化的效应细胞中，当在与IL-2结合时，能够促进T_reg细胞所介导的免疫抑制作用或促进活化诱导的细胞死亡(activation-induced cell death，AICD)。因此，降低IL-2对IL-2R的α-亚单位的亲和力，可能会减少由IL-2所诱发的T_reg细胞对效应细胞功能的下调，同时抑制通过AICD过程所导致的肿瘤耐受性的发展。因此，本申请的主要目的是提供一种对IL-2R的α-亚单位具有较低亲和力的IL-2变异体，以赋予IL-2所需的免疫疗法特性。

1.IL-2变异体

据此，本申请的第一方面涉及一种分离的IL-2变异体，其包含至少一个氨基酸突变，该突变会导致该IL-2变异体相较于野生型IL-2来说，与IL-2R的α-亚单位的亲和力降低或消除，同时保有与中度亲和力的IL-2R的亲和力。该分离的IL-2变异体对IL-2R的α-亚单位具有降低的亲和力，包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列，其中在该分离的IL-2变异体中的至少一个氨基酸置换发生在对应于序列编号：1中的第42、45、50、72或125个位置处，其中：

在对应于序列编号：1中的第125个位置处的该氨基酸置换是将半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)；

这些变异体与野生型IL-2相比，对中度亲和力的IL-2R展现出基本相似的结合亲和力，并且对IL-2R的α-亚单位或高度亲和力的IL-2R具有实质上降低的亲和力。

依据本申请的实施方式，该分离的IL-2变异体可以具有：一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列，例如，与序列编号：1具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及100％的序列相似度；较佳地，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，该分离的IL-2变异体包含一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，该分离的IL-2变异体包含序列编号：1的氨基酸序列；其中该至少一个氨基酸置换发生在对应于序列编号：1中的第42、45、50、72或125个位置处，并且该氨基酸置换选自由F42A、F42C、F42E、F42H、F42V和F42W；Y45A、Y45D、Y45G、Y45M、Y45N、Y45Q、Y45R、Y45S和Y45T；A50I；L72D、L72I、L72K、L72N和L72V；以及C125G所组成的群组。

依据本申请的某些实施方式，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#2可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为色氨酸(W)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为赖氨酸(K)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#2具有序列编号：3的氨基酸序列。

依据本申请的其它实施方式，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#3可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为缬氨酸(V)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#3具有序列编号：4的氨基酸序列。

依据本申请的再其它实施方式，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#7可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为谷氨酸(E)，以及在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为甘氨酸(G)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#7具有序列编号：8的氨基酸序列。

或是或除此之外，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#8可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为缬氨酸(V)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为丝氨酸(S)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#8具有序列编号：9的氨基酸序列。

可任选地，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#9可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为组氨酸(H)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬氨酸(D)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为异亮氨酸(I)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#9具有序列编号：10的氨基酸序列。

在本申请的一进一步实施方式中，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#12可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为半胱氨酸(C)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为缬氨酸(V)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#12具有序列编号：13的氨基酸序列。

在本申请的再某些实施方式中，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#25可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第50个位置处的丙氨酸(A)置换为异亮氨酸(I)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#25具有序列编号：21的氨基酸序列。

在本申请的其它实施方式中，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#28可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬氨酸(D)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬氨酸(D)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#28具有序列编号：24的氨基酸序列。

有时，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#31可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为甲硫氨酸(M)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#31具有序列编号：27的氨基酸序列。

在本申请的再其它实施方式中，本申请IL-2变异体命名为IL-2_#31_Y45R可以是：具有一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列；较佳地，具有一与序列编号：1具有至少90％的序列相似度的氨基酸序列；更佳地，具有一与序列编号：1具有至少95％的序列相似度的氨基酸序列；再更佳地，具有序列编号：1的氨基酸序列；其中具有以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为精氨酸(R)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)。在一操作实施例中，本申请IL-2变异体IL-2_#31_Y45R具有序列编号：34的氨基酸序列。

本申请IL-2变异体可以使用本领域所熟知的遗传工程或化学合成方法，通过删除、置换、插入，或修饰来制备。遗传工程方法可以包括对编码DNA序列进行定点诱变(site-specific mutagenesis)、聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)、基因合成、CRISPR/cas9基因编辑等方法。正确的核苷酸变化可以通过例如定序等方法来验证。在这方面，人类原生IL-2的核苷酸序列可以从公共数据库，例如基因银行(GenBank)中获得(基因银行登录号：S77834.1)。人类原生IL-2的氨基酸序列如序列编号：1所示。置换或插入可涉及天然以及非天然的氨基酸残基。氨基酸修饰包括本领域已知的化学修饰方法，例如添加糖基化位点或碳水化合物附加物等。

本申请IL-2变异体可以通过例如固相肽合成或重组生产的方式来获得。在重组生产的部分，会分离出一或多个编码该IL-2变异体的多核苷酸，然后将其插入一或多个载体中，以进一步在宿主细胞中进行复制及/或表达。这类多核苷酸可以使用常规程序容易地进行分离和定序。可以使用本领域技术人员所熟知的方法来构建含有本申请IL-2变异体的编码序列以及适当的转录/转译控制信号的表达载体。这些方法包括活体外重组DNA技术、合成技术，以及活体内重组/基因重组技术。表达载体可以是质体、病毒的一部分，或是可以是一段核酸片段。表达载体包括一个表达卡匣(expression cassette)，其中将用以编码本申请IL-2变异体的多核苷酸克隆到其中，并且与启动子及/或其它转录或转译控制组件可操作地连接。如果启动子能够影响核酸的转录，则可以将该启动子可操作地与该用以编码多肽的核酸连接。启动子可以是细胞特异性的启动子，仅会在预定的细胞中引导出大量的DNA转录。除了启动子之外，其它转录控制组件(例如，增强子、操作子、抑制子，以及转录终止信号等)可以与该多核苷酸可操作地连接，以引导出细胞特异性转录。

在某些实施方式中，IL-2变异体中存在的氨基酸突变可能会使该IL-2变异体降低对IL-2受体的α-亚单位的亲和力至少5倍，例如，降低至少10倍、降低至少25倍、降低至少30倍、降低至少50倍，甚至降低至少100倍。在一实施方式中，IL-2变异体中存在的氨基酸突变可能会使该IL-2变异体消除对IL-2受体的α-亚单位的亲和力。同时，当IL-2变异体呈现出，相较于野生型IL-2对中度亲和力的IL-2R，超过约70％的亲和力，例如，超过约80％的亲和力，或超过约90％的亲和力，则该IL-2变异体达到对该中度亲和力的受体实质上类似的结合程度，即本申请IL-2变异体保有对该受体的亲和力。

在一特定的实施方式中，本申请IL-2变异体可能会引起一或多种细胞反应，例如，促进活化的T淋巴细胞增殖，促进活化的T淋巴细胞分化，促进胞毒型T细胞(cytotoxic Tcell，CTL)活性，促进活化的B细胞增殖，促进活化的B细胞分化，促进NK细胞增殖，促进NK细胞分化，促进活化的T细胞或NK细胞分泌细胞激素，或促进NK/LAK抗肿瘤细胞毒性。在一实施方式中，本申请IL-2变异体相较于野生型IL-2，可能会降低T_reg细胞中的IL-2信号传递，减少T细胞的活化诱导细胞死亡(AICD)，具有降低的活体内毒性分布(toxicity profile)，或拥有延长的血清半衰期。

本申请IL-2变异体可以通过本领域已知的各种检测方法来进行鉴定、筛选，或特性分析其物理/化学特性，及/或生物学活性。

举例来说，可以测量物理/化学特性，例如，结合亲和力测试。具体来说，本申请IL-2变异体对IL-2受体的结合亲和力可以通过以下的检测方法来容易地确认：酶免疫测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、表面等离子共振(SPR)、使用BIAcore仪器(GE Healthcare)，或使用已知会表达出某种IL-2受体形式的细胞株，并按照本领域已知且已确立的程序来进行测量。

在生物学活性测试的部分，可以通过检测受体结合后，其下游所发生的免疫活化效应，来间接测量本申请IL-2变异体的活性，其可以包括，举例来说，诱发具有IL-2受体的T细胞及/或NK细胞增殖的能力，诱发具有IL-2受体的T细胞及/或NK细胞中的IL-2信号传递的能力，诱发NK细胞产生IFN-γ的能力，降低诱发外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)表达IL-10或TNF-α的能力，降低诱发T细胞凋亡的能力，诱发肿瘤退化(regression)及/或改善存活率的能力，以及降低毒性分布(例如，降低活体内血管通透性)的能力，这些检测方法为本领域所熟知。

或者是，可以通过检测IL-2所触发的下游信号传递来实现活性测试，其中包括检测雅努斯激酶(Janus kinase，JAK)和信号传递子及转录活化子(signal transducer andactivator of transcription，STAT)信号传递分子。举例来说，在IL-2与IL-2受体的β和γ_c-亚单位交互作用后，可以评估JAK1和JAK3的磷酸化，以及STAT-5的磷酸化，来作为活化IL-2信号传递作用的指针。该方法的细节公开于实施例中。用本申请IL-2变异体来处理T细胞，并通过流式细胞术来检测磷酸化STAT-5的量。

2.药学组合物

本申请亦涵盖一种药学组合物，包含上述的IL-2变异体，以用于治疗癌症，及/或减轻或改善与癌症相关或由癌症所引起的症状。具体来说，该药学组合物包含一有效量的如本申请的任何方面或实施方式中所述的IL-2变异体；以及非必要性地，包含一药学上可接受的载体。

本发明IL-2变异体的量约占该药学组合物总重量的0.1-99％(重量％)。在某些实施方式中，本发明IL-2变异体的量约占该药学组合物总重量的至少1％(重量％)。在特定实施方式中，本发明IL-2变异体的量约占该药学组合物总重量的至少5％(重量％)。在其它实施方式中，本发明IL-2变异体的量约占该药学组合物总重量的至少10％(重量％)。在再其它实施方式中，本发明IL-2变异体的量约占该药学组合物总重量的至少25％(重量％)。

本申请药学组合物是按照本领域所熟知的制药程序来制备，并可以配制成固体、半固体，或液体形式，例如，片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、悬浮剂，以及注射剂等，以适应于预定的给药途径。这些药学制剂亦为本发明的进一步客体。本领域技术人员熟悉适用于每种给药途径的各种剂型。需要注意的是，在任何给定的情况下，最适当的给药途径会取决于待治疗的疾病或病症的性质或严重程度。

药学上可接受的载体是指，任何在其浓度符合该活性成分的有效活性能够作用的情况下，对病患而言是相对无毒和无害的载体，使得该载体所引起的任何副作用都不会削弱该活性成分的有益功效。依据本发明的药学上可接受的载体是例如，崩解剂、结合剂、润滑剂、填充剂、塑化剂、界面活性剂和润湿剂、成膜剂和包衣材料(coating material)，以及着色剂(例如，色素)。

崩解剂包括，但不限于，交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、海藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、波拉克林钾(polacrilin potassium)、交联聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠、乙醇酸淀粉钠(sodium starchglycolate)、部分水解淀粉、羧甲基淀粉钠，以及淀粉。

结合剂包括，但不限于，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(hypromellose，hydroxypropyl methylcellulose(HPMC))、微晶纤维素、金合欢胶、海藻酸、羧甲基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、压缩糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮，以及预糊化淀粉。

润滑剂包括，但不限于，硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸、富马酸、硬脂酸富马酸钠(sodium stearylfumarate)、硬脂酸锌，以及聚乙二醇。

填充剂包括，但不限于，磷酸氢钙(dibasic calcium phosphate)、高岭土、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、硅化(silicated)微晶纤维素、磷酸二钙、磷酸三钙、三硅酸镁、麦芽糖醇、山梨醇、木糖醇、乳糖(例如，无水形式或水合物形式，例如单水合物形式)、右旋糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖或麦芽糊精、粉状纤维素、沉淀碳酸钙、碳酸钠、磷酸钠，以及淀粉。

界面活性剂和润湿剂包括，但不限于，十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、卵磷脂、山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯、氯化苯甲烷铵、壬苯醇醚-10(nonoxynol-10)、辛基酚聚醚-9(octoxynol-9)、聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、40、60或80)、山梨醇单棕榈酸酯、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠、甘油单硬脂酸酯、山梨醇单月桂酸酯、聚乙二醇山梨醇单月桂酸酯、聚乙二醇山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇山梨醇单油酸酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物以及乙氧基化三酸甘油酯。

成膜剂和包衣材料包括，但不限于，液体葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、乙基纤维素、苯二甲酸醋酸纤维素(celluloseacetate phthalate)、虫胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮和醋酸乙烯酯的共聚物(例如，)、二甲胺基甲基丙烯酸和中性甲基丙烯酸酯的共聚物、甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的聚合物、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，以及丙烯酸和丙烯酸甲酯的共聚物。

塑化剂包括，但不限于，聚乙二醇、邻苯二甲酸二乙酯，以及甘油。

着色剂包括，但不限于，色素、无机色素、FD&C红色3号、FD&C红色20号、FD&C黄色6号、FD&C蓝色2号、D&C绿色5号、D&C橙色5号、D&C红色8号、焦糖、氧化铁红、氧化铁黄，以及二氧化钛。

其它可酌情用于配制用于预定给药途径的组合物的常用药学载体，包括，但不限于，酸化剂(例如，醋酸、柠檬酸、富马酸、盐酸，以及硝酸)；碱化剂(例如，氨水溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠，以及三乙醇胺)；吸附剂(例如，粉状纤维素和活性炭)；稳定剂和抗氧化剂(例如，抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠，以及偏亚硫酸钠)；其它结合材料(例如，块状聚合物、天然及合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚胺酯、硅胶、聚硅氧烷，以及苯乙烯-丁二烯的共聚物)；缓冲剂(例如，偏磷酸钾、磷酸二钾、醋酸钠、无水柠檬酸钠，以及柠檬酸钠水合物)；包封剂(例如，明胶、淀粉，以及纤维素衍生物)；调味剂、掩蔽剂(masking agent)，以及气味剂(例如，茴香油、肉桂油、可可、薄荷醇、柑橘油、薄荷油，以及香草醛)；润湿剂(例如，甘油、丙二醇，以及山梨醇)；甜味剂(例如，阿斯巴甜、右旋糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖精钠、山梨醇，以及蔗糖)；防黏剂(例如，硬脂酸镁和滑石粉)；直接压片赋形剂(例如，磷酸氢钙、乳糖，以及微晶纤维素)；锭剂抛光剂(例如，棕榈蜡和白蜡)。

本申请药学组合物可进一步包含其它已知的药学活性剂(例如，化学治疗剂、免疫治疗剂，或荷尔蒙治疗剂)，以治疗由癌症所引起或与癌症相关的疾病和病症。

适用于本申请药学组合物的化学治疗剂可以是以下的一或多种：放射菌素D(actinomycin D)、六甲蜜胺(altretamine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、胺苯吖啶(amsacrin)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽环霉素(anthracycline)、天门冬酰胺酶(asparaginase)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝沙罗汀(bexarotene)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、布舍瑞林(buserelin)、硫酸布他卡因(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、氯甲烷(chlormethine)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、氯米芬(clomifene)、姜黄素(curcumin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine或cytosinarabinoside)、达喀尔巴仁(dacarbazine)、放线菌素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地塞松(dexamethasone)、多西紫杉醇(docetaxel)、艾霉素(doxorubicin)、泛艾霉素(epirubicin)、雌莫司汀(estramustine)、雌酮(estrone)、雌二醇(estradiol)、雌三醇(estriol)、依托泊苷(etoposide)、依西美坦(exemestane)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、福美司坦(formestane)、氟尿苷(foxuridine)、吉西他滨(gemcitabine)、糖皮质素(glucocorticoid)、戈舍瑞林(goserelin)、癌康定(hycamtin)、羟基尿素(hydroxyurea)、埃达霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamid)、伊马替尼(imatinib)、靛玉红(indirubin)、伊立替康(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、利妥唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、洛莫司汀(lomustine)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、霉法兰(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、胺甲喋呤(methotrexate)、米替福辛(miltefosin)、丝裂霉素(mitomycine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、尼达尼布(nintedanib)、尼莫司汀(nimustine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、普赖松(prednisone)、甲苄肼(procarbazine)、黄体素(progesterone)、雷洛昔芬(raloxifene)、链佐菌素(streptozocin)、泰莫西芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酯(testolactone)、睾固酮(testosterone)、噻替哌(thiotepa)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、托普迪肯(topotecan)、苏消安(treosulfan)、视网酸(tretinoin)、曲普瑞林(triptorelin)、曲磷酰胺(trofosfamide)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)，或长春瑞滨(vinorelbine)。

所述免疫治疗剂是选自由CCL3、CCL26、CXCL7；G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α；IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15；阿普司特、咪喹莫特、来那度胺、柏马度胺、西普鲁塞-T、沙利度胺；抗-CTLA-4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体；抗-CD2抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD11a抗体、抗-CD20抗体、抗-CD25抗体、抗-CD52抗体、抗-EGFR抗体、抗-HER2抗体、抗-PCDP1抗体、抗-SLAMF7抗体，以及抗-Trop-2抗体所组成的群组。依据本申请的一较佳实施方式，用于本申请药学组合物中的附加免疫治疗剂为IL-15。

荷尔蒙治疗剂的实例包括，但不限于，雄性激素受体激动剂(例如，雄烯二醇二丙酸酯(androstenediol dipropionate)、宝丹酮十一烯酸酯(boldenone undecylenate)、氯司替勃(clostebol)，或醋酸环睾酮(cloxotestosterone acetate))；促性腺激素(例如，比卡鲁胺(bicalutamide)、泰莫西芬(tamoxifen)、氯米芬(clomifene)、性腺释素(gonadorelin)，或亮丙瑞林(leuprorelin))；雄性激素受体拮抗剂(例如，醋酸阿比特龙(abiraterone acetate)、坎利酮(canrenone)、醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)、醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)，或醋酸地马地酮(delmadinone acetate))；类固醇生成抑制剂(例如，阿尔法雌二醇(alfatradiol)、度他雄胺(dutasteride)、爱普列胺(epristeride)、非那雄胺(finasteride)、氟他胺(flutamide)、酮康唑(ketoconazole)，或尼鲁米特(nilutamide))；抗促性腺激素(antigonadotropins)(例如，多潘立酮(domperidone)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、利培酮(risperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、氯丙嗪(chlorpromazine)、舒必利(sulpiride)，或睾固酮(testosterone))；雌性激素受体激动剂(例如，阿尔法雌二醇、睾固酮、甲基睪固酮(methyltestosterone)、甲基雄烯酮(metandienone)，或雌二醇)；雌性激素受体拮抗剂(例如，阿科比芬(acolbifene)、双炔失碳酯(anordrin)、巴多昔芬(bazedoxifene)、溴丙雌酚(broparestrol)、氯米芬，或环芬尼(cyclofenil))；芳香酶抑制剂(aromatase inhibitor)(例如，胺麸精、睾内酯、法屈唑(fadrozole)、福美司坦、安纳柔、依西美坦，或来曲唑)；黄体素受体激动剂(例如，烯丙雌醇(allylestrenol)、地诺孕素(dienogest)、降雄甾炔酮(norethisterone)、黄体素、喹孕酮(quingestrone)、醋酸阿那孕酮(anagestoneacetate)、醋酸氯地孕酮，或醋酸氯甲替尼酮(chlormethenmadinone acetate))；黄体素受体拮抗剂(例如，阿格司酮(aglepristone)，或美服培酮(mifepristone))。

3.治疗癌症的方法

本申请的另一方面是关于一种用以治疗一个体的癌症的方法。该方法包含对该个体施予一有效量的本申请IL-2变异体或包含该IL-2变异体的药学组合物。

本申请IL-2变异体或药学组合物施予至该个体的有效剂量可以在约介于0.01微克/公斤个体体重至1,000毫克/公斤个体体重的范围内，例如，在约介于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000微克/公斤个体体重(＝1毫克/公斤个体体重)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950，或1,000毫克/公斤个体体重的范围内；较佳地，在约介于0.1至1000微克/公斤个体体重的范围内；更佳地，在约介于1至500微克/公斤个体体重的范围内；再更佳地，在约介于10至200微克/公斤个体体重的范围内。在某些操作实施例中，本申请IL-2变异体或药学组合物施予至该个体的有效剂量是15、50，或150微克/公斤个体体重。该剂量可以是以单个等分(aliquot)施用，或者以多于一个等分施用。本领域技术人员或临床从业人员可以依据病患的身体状况或疾病的严重程度来调整剂量或治疗方案(regime)。

当可理解，在该个体罹患癌症的情况下，本申请方法可以对该个体单独施用，或与其它对癌症治疗具有一定效益的附加疗法(例如，外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法、荷尔蒙疗法，或其组合疗法)合并施用。取决于预期的治疗目的的不同，本申请方法可以在对该个体施用该附加疗法之前、同时，或之后施予至该个体。在上述附加疗法中，化学疗法、免疫疗法，以及荷尔蒙疗法是指对该个体施用有效量的化学治疗剂、免疫治疗剂，或荷尔蒙治疗剂，如上所述；为求简洁，在此省略了关于这些药剂的详细说明。

所述癌症可以是以下的任一种：膀胱癌、胆管癌、骨癌、脑瘤、乳腺癌、子宫颈癌、大肠直肠癌、食道癌、表皮癌、胃癌、胃肠道间质瘤(GIST)、神经胶质瘤、类淋巴系造血组织肿瘤、肝癌、卡波西氏肉瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肠癌、黑色素瘤、骨髓性白血病、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、肾细胞癌、脾脏癌、鳞状细胞癌、甲状腺癌，或甲状腺滤泡癌。

应当注意，在本申请方法的治疗期间内，可经由不同的途径，以不同的剂量、时间间隔等，对该个体施用不同的疗法或治疗。剂量和时间间隔可能因如上文所述的因素而有所不同，并取决于从业人员的专业考虑；以及途径可以是经由口服、肠内、口腔、鼻腔、经皮、经粘膜、静脉内、腹膜内、动脉内、皮内、皮下，以及肌内等途径。

基本上，适用于本申请方法来治疗的个体是一哺乳动物；较佳地，该个体为人类。

下文提出多个实施例来阐述本发明的某些方面，以利本领域技术人员实践本发明，且不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。所有在此引用的公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料与方法

1.IL-2变异体的设计和克隆

为了设计本研究所使用的IL-2变异体，首先从在线数据库“蛋白数据库”(ProteinData Bank，PDB)中获取IL-2在与受体结合时的活性形式和非活性单体形式的结构，其中活性形式系使用PDB编号2B5I或2ERJ，而非活性形式系使用PDB编号1M4C或3INK。将IL-2的活性形式和非活性形式的结构用商业软件PyMOL进行比对，并计算出螺旋A、C和D上的特定氨基酸的特定原子在活性形式和非活性形式中的空间位置之间的距离。因此，通过比较IL-2的活性形式和非活性形式的结构，确定了在空间位置上变化最大和最小的原子。据此，计算出有明显移动与相对未移动的原子之间的距离，以创建出IL-2的活性形式和非活性形式之间的特征。在本研究中，计算出在空间位置上变化最大的50个原子与在空间位置上变化最小的60个原子之间的距离，总计得到了3000(50×60)个距离。在这些计算出的距离中，选取最大的距离作为IL-2从非活性形式转变为活性形式的特征。另一方面，人类IL-2在F42、Y45和L72位置上的全部变异体共有7,999(20×20×20–1(野生型))种。其中，每个IL-2变异体的结构是由在线软件(AlphaFold Colab)进行预测。在已知IL-2活性形式和IL-2变异体的结构的基础上，按之前在计算IL-2的活性和非活性形式之间所进行的计算方法，计算出这两者之间的空间距离。选择具有与IL-2活性形式距离＜10％之原子个数最多的IL-2变异体，作为本发明IL-2变异体(序列编号：1-29)，以用于进一步研究；然后对这些IL-2变异体序列进行人工合成再进行克隆。

2.IL-2变异体的表达和验证

将用于在原核细胞中表达上述每种IL-2变异体(带有六组氨酸(hexahistidine，his6)标签)的建构体(his6-IL-2，在pET中)转化(transform)到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，并在OD₆₀₀达到0.5-0.9时，将0.1毫体积摩尔浓度(mM)的IPTG添加到含有溶菌肉汤(lysogeny broth，LB)/胺苄青霉素(ampicillin)(50微克/毫升)的培养物中，以诱发IL-2变异体的表达，然后在室温(RT)下培养16小时。收获细菌并用0.1毫升的裂解缓冲液(含20mM的HEPES(pH 7.4)，250mM的KCl，25微克/毫升的脱氧核糖核酸酶(DNase)，25微克/毫升的溶菌酶(lysozyme)，10mM的PMSF，以及10mM的β-巯基乙醇)来裂解，然后将所得混合物进行离心，以收集含有表达蛋白的上清液。将上清液中的可溶性his6-IL-2通过SDS-PAGE(含10％的聚丙烯酰胺)凝胶予以分离，并使用抗-his6抗体进行西方墨点法确认。然后，根据厂商的使用说明，使用镍树脂管柱(nickel-resin column)(Qiagen,Valencia,CA)来过滤和纯化上清液。使用ELISA套组(人类IL-2Quantikine，R&D Systems)来检测纯化后的IL-2变异体的量。

上述的IL-2变异体也在哺乳动物蛋白表达系统(ExpiCHO^TM表达系统套组；Thermo)中表达。将含有上述的IL-2变异体的建构体(在pcDNA3.4中)转染(transfect)到ExpiCHO-S细胞中，并在转染后第1天，将ExpiFectamine^TMCHO增效剂添加到培养物中。第7天，通过离心去除ExpiCHO-S细胞，并收集含有IL-2变异体蛋白的上清液，以ELISA检测其浓度。

3.细胞培养

将CTLL-2细胞(小鼠胞毒型T淋巴细胞)和HH细胞(人类T淋巴母细胞)培养在罗斯威尔帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培养基中，并补充10％的胎牛血清和2mM的谷氨酰胺；而KPC-luc细胞(小鼠胰管腺癌细胞，并稳定转染用以编码杀稻瘟菌素-S(blasticidin-S)去胺酶和萤火虫荧光素酶的质体)则培养在上述培养基中，并进一步补充4纳米/毫升的杀稻瘟菌素-S。所有的细胞都培养在37℃下、含5％的CO₂的加湿大气中。

4.测量受IL-2变异体刺激的细胞所生pSTAT-5的量

为了评估在受到本文中的IL-2变异体刺激后，CTLL-2细胞或HH细胞的活化程度，于是使用流式细胞术来检测经刺激后的CTLL-2细胞和HH细胞(2×10⁵个细胞/孔)中的磷酸化STAT-5(pSTAT-5)的量。取决于实验目的的不同，将CTLL-2细胞和HH细胞培养在含有：浓度为30纳体积摩尔浓度(nM)的单一浓度或介于0-30nM之间的一系列浓度的野生型IL-2(白细胞介素原(proleukin))、特定IL-2变异体，或突变型IL-2(即IL-2v(AAG)，其中AAG是指具有F42A、Y45A和L72G置换的IL-2；F.Hoffmann-La Roche Ltd)的培养基中4小时。将处理后的CTLL-2细胞和HH细胞置于一个96孔微量盘上，其中每孔已预先种植了KPC-luc细胞(8×10³个细胞/孔)，然后反应30分钟，之后用2％的甲醛(体积/体积)在室温下固定15分钟。将固定后的细胞进行通透，复水，用抗-磷酸化STAT5(pSTAT-5)抗体在4℃下反应16小时，然后用FITC标记的抗-兔IgG抗体避光反应60分钟。使用流式细胞仪(BD FACS Calibur流式细胞仪)来检测荧光讯号，并使用软件(CellQuest Pro和Cytexpert软件；Beckman Coulter)进行数据分析。

5.动物实验

将雌性Balb/c小鼠(6周龄)饲养在温度为23±1℃和相对湿度为45-70％的环境中，并提供12小时/12小时的光/暗循环。将小鼠随机分为三组(每组n＝5)：PBS控制组、人类重组IL-2(IL-2)控制组，以及IL-2_#7实验组。对于PBS组，小鼠按照以下时程接受腹腔内给药：每日一次，连续五天，然后休息两天；此循环总共重复三次。对于IL-2组和IL-2_#7组，小鼠按照以下时程接受腹腔内给药：(第1周)每日一次，每只小鼠接受3微克(约0.15毫克/公斤)的剂量，连续五天，然后休息两天；(第2周)每日一次，每只小鼠接受10微克(约0.5毫克/公斤)的剂量，连续五天，然后休息两天；以及(第3周)每日一次，每只小鼠接受30微克(约1.5毫克/公斤)的剂量，连续五天，然后休息两天。在完成上述的给药计划后，将动物称重并处死，并收获它们的肺脏、肝脏，以及脾脏，以用于进一步分析。

6.流式细胞术分析

将小鼠的脾脏进行裂解以萃取出其中的细胞。收集细胞，并用2％的甲醛(体积/体积)在室温下固定15分钟，然后进行流式细胞术分析。为了鉴定脾脏中的特定细胞群，使用了以下的抗体组合：(1)鉴定活性CD8⁺T细胞：FITC标记的抗-CD45抗体(anti-CD45-FITC)，APC标记的抗-CD3抗体(anti-CD3-APC)，PE-cy7标记的抗-CD8抗体(anti-CD8-PE-cy7)，以及PE标记的抗-Tbet抗体(anti-Tbet-PE)；(2)鉴定活性NK细胞：PE标记的抗-CD45抗体(anti-CD45-PE)，APC标记的抗-CD3抗体(anti-CD3-APC)，FITC标记的抗-KN1.1抗体(anti-KN1.1-FITC)，以及AlexaFluor 700标记的抗-颗粒酶B(GrB)抗体(anti-GrB-AlexaFluor700)；以及(3)鉴定T_reg细胞：APC-cy7标记的抗-CD45抗体(anti-CD45-APC-cy7)，FITC标记的抗-CD4抗体(anti-CD4-FITC)，APC标记的抗-CD25抗体(anti-CD25-APC)，以及PE标记的抗-Foxp3抗体(anti-Foxp3-PE)。使用流式细胞仪(BD FACS Calibur流式细胞仪)来检测荧光讯号，并使用软件(CellQuest Pro和Cytexpert软件；Beckman Coulter)进行数据分析。

7.统计分析

所有实验均进行三重复。实验数据系以平均值±标准偏差(SD)来表示。使用学生氏t检定来分析统计显着性。对于所有的统计分析，双尾p值≤0.05视为具有显着性。使用软件GraphPad Prims 6.01来生成计算结果和图表。

实施例1制备和特性分析IL-2变异体

1.1制备IL-2变异体

本实施例的目的在于鉴定出对中度亲和力的IL-2R(而非对高度亲和力的IL-2R)具有强烈结合能力的新型IL-2变异体，从而削减因与IL-2R的α-亚单位结合所引发的不想要的免疫抑制效应。为达上述目的，根据“材料与方法”章节所述程序，设计并制备了几种IL-2变异体。用以编码每个IL-2变异体的核酸序列已通过定序确认(数据未显示)，并且将每个IL-2变异体的氨基酸序列提供在序列表中。这些IL-2变异体进一步以下述方式来确认其生物学活性。

1.2IL-2变异体的生物学活性

首先，通过西方墨点法分析确认了实施例1.1中的IL-2变异体(命名为IL-2_#1至IL-2_#14)的表达，实验结果显示在图1A中，其中每个IL-2变异体(约15kDa)都有成功表达。

接着，通过评估每个IL-2变异体于活化CTLL-2细胞或HH细胞的能力(在有KPC-luc细胞存在的情况下)，来评估每个IL-2变异体的生物学活性，并以细胞中所诱发的磷酸化STAT-5的量来表示CTLL-2细胞或HH细胞受到活化的程度。如图1B-1C所示，IL-2变异体可以活化CTLL-2细胞(图1B)或HH细胞(图1C)；其中，IL-2_#2、IL-2_#3、IL-2_#7、IL-2_#8、IL-2_#9，以及IL-2_#12在CTLL-2细胞和HH细胞两者中一致表现出更高的活化能力(即pSTAT-5的量更高)，相比之下，IL-2_#1、IL-2_#4-6、IL-2_#10-11，以及IL-2_#13-14的活化能力较低。同样地，IL-2变异体(命名为IL-2_#19至IL-2_#34)也有不同程度的活化HH细胞的能力。IL-2_#25、IL-2_#28，以及IL-2_#31相较于其它IL-2变异体，在HH细胞中表现出更高的活化能力(即pSTAT-5阳性细胞的百分比更高；图1D)。

另外，将IL-2_#31(带有F42A、Y45M，以及L72N置换的IL-2)选定为例示性的IL-2变异体，用于进一步研究IL-2在特定位置上的氨基酸置换对活化HH细胞的影响。需要说明的是，在以下与IL-2_#31相关的变异体(以下称为“IL-2_#31相关变异体”)中，是将IL-2第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为丙氨酸(A)(Y45A)、天门冬氨酸(D)(Y45D)、甘氨酸(G)(Y45G)、谷氨酰胺(Q)(Y45Q)、精氨酸(R)(Y45R)、丝氨酸(S)(Y45S)，或苏氨酸(T)(Y45T)，而在IL-2_#31中的F42A和L72N仍保留在上述IL-2_#31相关变异体(序列编号：30-36)中。实验结果如图1E所示，与其它变异体相比，只有IL-2_#31相关变异体Y45R(即IL-2_#31_Y45R)在HH细胞中显示出具有改善的活性。这些实验结果表明，在特定IL-2变异体中，特定位点上的氨基酸变化可能会剧烈影响IL-2对于HH细胞的活化。将这些IL-2变异体(即具有活化细胞能力的变异体)随后进行进一步分析。

1.3IL-2变异体的结合偏好性

本实施例的目的在于阐明实施例1.1的IL-2变异体对高度亲和力的IL-2R或中度亲和力的IL-2R的结合偏好性。为此目的，使用经刺激后的CTLL-2细胞和HH细胞(在处理一系列浓度的特定IL-2变异体后)中的pSTAT-5的量作为细胞活化的指标，其中CTLL-2细胞表现出高度亲和力的IL-2R(含有IL-2R的α/β/γ_c-亚单位)，而HH细胞则表现出中度亲和力的IL-2R(包含IL-2R的β/γ_c-亚单位)。IL-2_#2、IL-2_#3、IL-2_#7、IL-2_#8、IL-2_#9，以及IL-2_#12对CTLL-2细胞和HH细胞的活化结果分别提供在图2A-2B中。将实验结果以校正后的MFI(％)表示，它是相对于IL-2(指定为100％)进行校正；将上述IL-2变异体对于活化CTLL-2细胞和HH细胞的EC₅₀值(分别为EC₅₀(CTLL-2)和EC₅₀(HH))进行相应计算，并总结在表1和表2中。IL-2变异体对于不同形式的IL-2R的结合偏好性以EC₅₀(HH/CTLL-2)表示，并总结在表3中。

表1 IL-2_#2至IL-2_#12对于CTLL-2细胞的EC₅₀

名称	IL-2	IL-2_#2	IL-2_#3	IL-2_#7	IL-2_#8	IL-2_#9	IL-2_#12
								EC₅₀(nM)	0.1700	0.3416	44.11	11.50	120.2	10.01	2.323

表2 IL-2_#2至IL-2_#12对于HH细胞的EC₅₀

名称	IL-2	IL-2_#2	IL-2_#3	IL-2_#7	IL-2_#8	IL-2_#9	IL-2_#12
								EC₅₀(nM)	14.24	0.6122	9.600	1.356	90.18	17.91	0.5563

表3 IL-2_#2至IL-2_#12对于CTLL-2细胞和HH细胞的相对EC₅₀

根据表3，IL-2的EC₅₀(HH/CTLL-2)值为83.76，这表明IL-2倾向于结合至高度亲和力的IL-2R，而非结合至中度亲和力的IL-2R。相比之下，IL-2_#2到IL-2_#12的EC₅₀(HH/CTLL-2)值小于IL-2的值，这表明这些IL-2变异体倾向于结合至中度亲和力的IL-2R，而非结合至高度亲和力的IL-2R。

图2C-2D展示出IL-2_#25、IL-2_#28，以及IL-2_#31各自对于CTLL-2细胞和HH细胞的活化能力；而结合偏好性结果总结在表4到表6中。

表4 IL-2_#25至IL-2_#31对于CTLL-2细胞的EC₅₀

名称	IL-2	IL-2_#25	IL-2_#28	IL-2_#31
					EC₅₀(nM)	0.2309	0.002908	9.562	2.018

表5IL-2_#25至IL-2_#31对于HH细胞的EC₅₀

名称	IL-2	IL-2_#25	IL-2_#28	IL-2_#31
					EC₅₀(nM)	19.66	9.933	8.949	0.1099

表6IL-2_#25至IL-2_#31对于CTLL-2细胞和HH细胞的相对EC₅₀

名称	IL-2	IL-2_#25	IL-2_#28	IL-2_#31
					EC₅₀(HH)	19.66	9.933	8.949	0.1099
EC₅₀(CTLL-2)	0.2309	0.002908	9.562	2.018
					EC₅₀(HH/CTLL-2)	85.48	3424.14	0.94	0.05

根据表6，IL-2倾向于结合至高度亲和力的IL-2R，而非结合至中度亲和力的IL-2R。相反地，IL-2_#28和IL-2_#31均倾向于结合至中度亲和力的IL-2R，而非结合至高度亲和力的IL-2R，而IL-2_#28和IL-2_#31的EC₅₀(HH/CTLL-2)值分别为0.94和0.05。尽管如此，IL-2_#25的EC₅₀(HH/CTLL-2)值为3424.14，远高于IL-2的相应值，这表明IL-2_#25更倾向于结合至高度亲和力的IL-2R。

将IL-2_#7对于CTLL-2细胞和HH细胞的结合偏好性与市售的突变型IL-2(IL-2v(AAG)；F.Hoffmann-La Roche Ltd)进行了比较。实验结果如图2E-2F所示，并总结在表7中。根据实验结果，IL-2_#7(EC₅₀(HH/CTLL-2)＝0.027)在结合偏好性的表现优于野生型IL-2(EC₅₀(HH/CTLL-2)＝10.817)或IL-2v(AAG)(EC₅₀(HH/CTLL-2)＝0.037)。这表明了与市售的IL-2v(AAG)相比，IL-2_#7在结合至中度亲和力的IL-2R(而非结合至高度亲和力的IL-2R)的性能上表现更为优越。

表7IL-2_#7和IL-2v(AAG)的EC₅₀和相对EC₅₀

实施例2IL-2变异体的活体内毒性和免疫调节作用

2.1IL-2变异体的毒性

在本实施例中，研究了IL-2变异体的活体内毒性和免疫调节作用。按照“材料与方法”中所述的治疗时程，对小鼠施用特定IL-2变异体。完成治疗计划后，处死小鼠。考虑到IL-2对内皮细胞会具有有害影响，会导致器官水肿，例如，造成肺脏、肝脏，以及脾脏水肿，进而导致体重发生变化，于是测量这些器官的重量，并将它们对个体体重进行校正(图3A-3C)。此外，在实验过程中的体重变化呈现在图3D中。与用IL-2_#7治疗的小鼠相比，用野生型IL-2治疗的小鼠，其肝脏和脾脏的相对重量显着增加，表明IL-2_#7对接受治疗的小鼠具有较低的毒性效应。在本研究中，三个治疗组的肺脏相对重量大致保持相同。此外，在整个研究过程中，这些治疗组中的小鼠体重保持一致。总结上述，这些实验数据表明，与野生型IL-2相比，IL-2_#7展现出更好的安全性。

2.2IL-2变异体的免疫调节作用

接下来，本研究评估了IL-2变异体的免疫调节能力，这可以通过周边淋巴组织(例如，脾脏)中的免疫细胞数量变化来反映。为此目的，通过流式细胞术来测量活性CD8⁺T细胞、活性NK细胞，以及T_reg细胞的数量。基于图4A-4B的实验结果，与PBS治疗组和IL-2治疗组相比，IL-2_#7治疗组中的活性CD8⁺T细胞(标记为CD45⁺、CD3⁺、CD8⁺，以及T-bet⁺)，以及活性NK细胞(标记为CD45⁺、GrB⁺、NK1.1⁺，以及CD3^-)明显增加。相比之下，IL-2_#7治疗组并未显示出T_reg细胞群(标记为CD45⁺、Foxp3⁺、CD4⁺，以及CD25⁺)有增加的现象。综上，这些实验数据表明，IL-2_#7可以通过刺激活性CD8⁺T细胞和NK细胞的生成来促进有益的免疫反应，而不会通过活化T_reg细胞的生成来引发不利的免疫反应。因此，IL-2_#7具有增强个体免疫系统的潜力，因而有望作为一种抗癌治疗开发的潜在候选药物。

总结上述，本发明提供了多种IL-2变异体，其中有许多变异体展现出对中度亲和力的IL-2R的结合偏好性，进而触发与之相关的生物学活性。因此，这些IL-2变异体不但可以消除不想要的免疫抑制特性，还可同时保有所需的生物学活性，因此，这些IL-2变异体对于开发用于治疗与IL-2相关疾病的药物上具有巨大的潜力。

当可理解，上文有关实施方式的叙述仅作为例示性的实施方式，本领域技术人员当可对其进行各种更动与修饰。上文的说明书、实施例和实验数据对本申请作为例示性的实施方式中的结构和使用方式做出完整的描述。尽管上文已描述本申请中各样的实施方式有一定程度的特性，或参照一或多个个别的实施方式，本发明所属领域技术具有通常知识者仍可在不悖离本申请精神和范围情形下，对已公开的实施方式进行众多修改。

Claims

1.一种分离的白细胞介素-2变异体，包含一与序列编号：1具有至少85％的序列相似度的氨基酸序列，其中该分离的IL-2变异体在对应于序列编号：1中的第42、45、50、72或125个位置处包含一氨基酸置换，其中：

2.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为色氨酸(W)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为赖氨酸(K)。

3.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为缬氨酸(V)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。

4.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为谷氨酸(E)，以及在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为甘氨酸(G)。

5.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为缬氨酸(V)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为丝氨酸(S)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。

6.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为组氨酸(H)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬氨酸(D)，在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为异亮氨酸(I)，以及在对应于序列编号：1中的第125个位置处的半胱氨酸(C)置换为甘氨酸(G)。

7.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为半胱氨酸(C)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬酰胺(N)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为缬氨酸(V)。

8.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第50个位置处的丙氨酸(A)置换为异亮氨酸(I)。

9.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为天门冬氨酸(D)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬氨酸(D)。

10.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为甲硫氨酸(M)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)。

11.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含以下的氨基酸置换：在对应于序列编号：1中的第42个位置处的苯丙氨酸(F)置换为丙氨酸(A)，在对应于序列编号：1中的第45个位置处的酪氨酸(Y)置换为精氨酸(R)，以及在对应于序列编号：1中的第72个位置处的亮氨酸(L)置换为天门冬酰胺(N)。

12.如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，其中该分离的IL-2变异体包含序列编号：1的氨基酸序列。

13.一种药学组合物，包含如权利要求1所述的分离的IL-2变异体，以及一药学上可接受的载体。

14.一种用以治疗一个体的癌症的方法，包含对该个体施予一有效量的如权利要求13所述的药学组合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中该药学组合物包含该分离的IL-2变异体是以1-500微克/公斤体重的量施予至该个体。

16.如权利要求14所述的方法，其中该癌症是以下的任一种：膀胱癌、胆管癌、骨癌、脑瘤、乳腺癌、子宫颈癌、大肠直肠癌、食道癌、表皮癌、胃癌、胃肠道间质瘤、神经胶质瘤、类淋巴系造血组织肿瘤、肝癌、卡波西氏肉瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肠癌、黑色素瘤、骨髓性白血病、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、肾细胞癌、脾脏癌、鳞状细胞癌、甲状腺癌，或甲状腺滤泡癌。

17.如权利要求14所述的方法，还包含在施予如权利要求13所述的药学组合物之前、同时，或之后，使该个体接受外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法、荷尔蒙疗法，或其组合疗法。

18.如权利要求17所述的方法，其中该免疫疗法包含对该个体施予一有效量的C-C基序趋化因子配体3(CCL3)、C-C基序趋化因子配体26(CCL26)、C-X-C基序趋化因子配体7(CXCL7)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-15(IL-15)；阿普司特、咪喹莫特、来那度胺、柏马度胺、西普鲁塞-T、沙利度胺；抗-CTLA-4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体；抗-CD2抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD11a抗体、抗-CD20抗体、抗-CD25抗体、抗-CD52抗体、抗-EGFR抗体、抗-HER2抗体、抗-PCDP1抗体、抗-SLAMF7抗体，或抗-Trop-2抗体。

19.如权利要求18所述的方法，其中该免疫疗法包含对该个体施予一有效量的IL-15。

20.如权利要求14所述的方法，其中该个体是人类。