CN119752956A - 一株高产磷脂酶d的茂原链霉菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产磷脂酶D的茂原链霉菌，属于基因工程技术领域。本发明通过CRISPR‑Cas9技术，在基因组上整合了1～2个拷贝的磷脂酶D基因，提高了磷脂酶D的表达量。本发明构建的重组菌株smYS1‑PLD2的磷脂酶D水解活性可达244.66U/mL，能高效生产磷脂酶D，且不需要添加抗生素，为其他基因在茂原链霉菌中的高效表达奠定了理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产磷脂酶D的茂原链霉菌，属于基因工程技术领域。
背景技术
磷脂酶D(EC 3.1.4.4，PLD)能够催化廉价底物磷脂(PC)，转化为具有高经济效益的稀有磷脂，如磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)。其中，PS被称为“大脑维生素”，具有预防阿尔兹海默症，改善儿童多动症，提高记忆力等功效。目前稀有磷脂主要从动植物中提取，特别是大豆和蛋黄，但是天然磷脂成分复杂，且常以多种物理性质相似的磷脂组成，其中PS的含量较低。为获得高纯度的PS，需要大量有机溶液进行萃取，且产率较低。为了克服这些限制，需要更安全、经济、高效的方法来生产PS，如酶转化法。酶转化法具有反应条件温和、反应易控、高效简单等优势，越来越受到关注。
PLD基因广泛存在于自然界，并具有不同的生理功能。其中，链霉菌来源的PLD由于具有丰富的基因来源、广泛的底物选择性、较高的转化率等优势，而被广泛研究。目前，已实现在多个菌株成功表达PLD，如E.coli，Bacillus subtilis，Streptomyces lividans，Brevibacillus choshinensis，但表达宿主仍然有限，且多以包涵体形式表达，限制了其在食品行业中的应用。因此，迫切开发更多的PLD高效表达宿主。
发明内容
本发明提供了PLD基因表达框，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了表达磷脂酶D的茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)工程菌，所述磷脂酶D的编码基因如SEQ ID NO:2所示。
在一种实施方式中，所述茂原链霉菌的出发菌株为茂原链霉菌smY2022，已公开于了，论文《Efficient Production of a Thermostable Mutant of Transglutaminase byStreptomyces mobaraensis》中。
在一种实施方式中，所述茂原链霉菌工程菌多拷贝整合了所述PLD基因表达框。
在一种实施方式中，所述茂原链霉菌工程菌是在chi位点和/或tg位点整合所述PLD基因表达框。
本发明还提供了含有所述茂原链霉菌工程菌的发酵剂。
本发明还提供了所述茂原链霉菌工程菌的构建方法，包括：
(1)将tg基因上下游同源序列各约1000bp、启动子gapdhp、基因pld连接至pCRISPR载体，得到质粒pCRISPR-pld；
(2)利用结合转移的方法将质粒pCRISPR-pld转化至smY2022中；
(3)将chi基因上下游同源序列各约1000bp、PLD表达框连接至pCRISPR载体，得到质粒pCRISPR-chi::pld，再利用结合转移的方法将质粒pCRISPR-chi::pld转化至smY2022-PLD中，获得重组菌株smYS1-PLD2。
本发明还提供了所述茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)工程菌在制备磷脂酶D方面的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述茂原链霉菌工程菌在鱼粉发酵培养基中，于30～37℃培养24～72h。
有益效果：本发明通过CRISPR-Cas9技术，在基因组tg和/或chi位点上整合了磷脂酶D基因，提高了磷脂酶D的表达量。在强启动子gapdhp介导下，在tg位点和chi位点同时整合PLD构建的重组菌株smY2022-PLD2，比仅在tg位点单点整合(194.29U/mL)和仅在chi(187.20U/mL)位点整合分别提高了26％和31％，分泌表达PLD的水解活性达244.66U/mL。本发明的菌株为食品安全菌株，且发酵过程中不需要添加抗生素，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为smY2022-PLD1的构建示意图。
图2为smY2022-PLD2的构建示意图。
图3为smY2022-Δtg的构建示意图。
图4为smY2022-Δtg、smY2022-PLD1和smY2022-PLD2的PCR验证图。
图5为smY2022-Δtg、smY2022-PLD1和smY2022-PLD2的SDS-PAGE分析。
图6为纯化的PLD的SDS-PAGE分析。
图7为PLD的酶学性质分析。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
PLD的水解活性测定方法：
150μL的底物溶液(10mM PC，5％ TritonX-100(w/v))与150μL的底物缓冲液(0.2MTris-HCl pH 7.5，5％ TritonX-100(w/v)，0.01M CaCl2)混合后，50℃孵育5min。加入100μL稀释至适宜浓度的酶液，50℃反应10min后立即加入200μL终止液(1M Tris-HCl pH8.0，0.5M EDTA)并100℃金属浴加热15min以结束反应。待恢复至室温后加入200μL显色液(0.1M Tris-HCl pH 8.0，5mM 4-ATT，8mM苯酚)和1U过氧化物酶、1U胆碱氧化酶，37℃显色60min后，以1：8稀释后测量A500nm。标准曲线绘制过程中，以氯化胆碱标准溶液代替酶液，其他实验步骤相同。磷脂酶D的水解活性(U)定义为在该酶最佳反应条件下，每分钟催化底物PC生成1μmol胆碱所需酶量。
PLD的纯化与脱盐：
将重组菌株smY2022-PLD发酵72h后收集上清液，利用镍柱亲和层析进行纯化，然后用超滤管进行脱盐，并测定酶学性质。
最适反应温度和温度稳定性的测定：
最适反应温度是分别在不同温度下测定PLD的水解活性，以最高水解活性为100％，计算不同温度下的相对酶活。温度稳定性是将酶液在不同温度下孵育，测定不同孵育时间的残余酶活，以孵育0min时的酶活为100％，计算不同孵育时间样品的相对酶活。
最适pH和pH稳定性的测定：
最适pH是在不同pH的底物缓冲液条件下测定PLD的水解活性，以最高水解活性为100％，计算不同pH下的相对酶活。pH稳定性是将PLD保存在不同pH的缓冲液中，测定不同保存时间的残余酶活，以保存0min时的酶活为100％，计算不同保存时间样品的相对酶活。
上述实施例中所涉及的引物序列如表1所示。
表1引物序列
注：小写为一步克隆同源序列。
下述实施例中所涉及的培养基和发酵条件如下：
GYM固体培养基：10g/L葡萄糖、4g/L酵母提取物、3g/L麦芽提取物、20g/L琼脂粉；
种子培养基：20g/L甘油、20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、2g/L K2HPO4、2g/LMgSO4、pH 7.2。
鱼粉发酵培养基：20g/L甘油、75g/L鱼粉蛋白胨水解液、5g/L酵母提取物、5.5g/L玉米浆粉、5.5g/L硫酸铵、2g/L MgSO4、2g/L K2HPO4、pH 7.0-7.2。
下述实施例中所涉及的茂原链霉菌发酵条件：
将茂原链霉菌菌株在GYM固体平板上30℃培养4-5天，利用接种环刮取孢子及菌丝至含30mL种子培养基的摇瓶中，30℃、220rpm摇床培养24h，获得茂原链霉菌种子液；按8％的接种量将种子液接种至含30mL鱼粉发酵培养基的摇瓶中，30℃、220rpm进行发酵。实施例1：重组茂原链霉菌菌株的构建
(1)PLD重组菌株smY2022-PLD1的构建
以茂原链霉菌smY2022(公开于论文《Efficient Production of a ThermostableMutant of Transglutaminase by Streptomyces mobaraensis》)全基因组为模板，利用引物TG-FF/FR(TG-FF:cgggcgttttttatctagCACGTACAGGTACGACGGTGGTGGC；TG-FR:atctgaaaggggatacgcC CCGATCACTCGTCCGGGAGTCGAG)和TG-RF/RR(TG-RF:GCGTATCCCCTTTCAGATACTCGCACTAAG；TG-RR:GCTGCTCCTTCGGTCGGA CGTGCGT)分别PCR扩增tg基因(SEQ ID NO:8所示)上下游同源序列各约1000bp(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，gapdh-F/R扩增启动子gapdhp(gapdh-F:tccgaccgaaggagcagCGGCTCCAAAACCGGCCACTCCGTCA；gapdh-R:acggttcctggcct ctagCCACATCGACCGCGACGTCGACTAC)，PLD-F/R扩增目的基因pld(PLD-F:ccgtccttccgggcccccGCGTCCCCGACCCCCCACCTGGATTCG；PLD-R:atggtgatggtgatggtgGGCTTGGCACAGGCCGCGGGCGTAG)。
利用一步克隆的方法将上述片段连接至pCRISPR载体，得到质粒pCRISPR-pld。利用结合转移的方法将质粒pCRISPR-pld转化至smY2022中，并利用引物Dver-F/R(Dver-F:GGTCTCCGGGATTTGTTCGCATGCC；Dver-R:CATCCTCATGTTCGAACCCACGGGC)进行PCR验证(图4)，获得整合了PLD的基因表达框(SEQ ID NO:1)的重组菌株smY2022-PLD1。
PLD的基因表达框序列如下：
gctgctccttcggtcggacgtgcgtctacgggcaccttaccgcagccgtcggctgtgcgacacggacg
gatcgggcgaactggccgatgctg
ggagaagcgcgctgctgtacggcgcgcaccgggtgcggagcccctcggcgagcggtgtgaaacttctg
tgaatggcctgttcggttgcttttttt
atacggctgccagataaggcttgcagcatctgggcggctaccgctatgatcggggcgttcctgcaatt
cttagtgcgagtatctgaaaggggata
cgcCCCGATCACTCGTCCGGGAGTCGAGAAGTGTTACGCCGAACCCCATTCCGCACCATC
ACCCCTGCCGCCGTGACCGCGGCCGGCAGTCTGCCTCTCGCCGAGAGAGCCACCCGGA
下划线为启动子序列；波浪下划线为信号肽序列；虚下划线为PLD序列；双波浪下划线为His标签；双下划线为终止子序列。
(2)PLD重组菌株smY2022-PLD2的构建
以茂原链霉菌全基因组为模板，利用引物Chi-FF/FR(Chi-FF:tcgacctgcagcccaagcACGGAACTCCGTTCCTGATAAGGCG；Chi-FR：cgggcgttttttatctagCGAGAACCACGCGTTGCGTTCGTC)和Chi-RF/RR(Chi-RF:gatatcgaattcgtaatcGTACCGCATCGACGAGTAGCGCGTC；Chi-RR:acggttcctggcctctagCCGGAGCTGACCTGGTCCGACCTG)分别PCR扩增chi基因(SEQ ID NO:7)上下游同源序列各约1000bp(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)，whole-F/R扩增PLD表达框(whole-F:GCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGA；whole-R:GATTACGAATTCGATATCGCGCGCGG)。利用一步克隆的方法将上述片段连接至pCRISPR载体，得到质粒pCRISPR-chi::pld。利用结合转移的方法将质粒pCRISPR-chi::pld转化至步骤(1)构建的菌株smY2022-PLD1中，并利用引物Dver-chi-F/R(Dver-chi-F:GGGAAGCAGCAGCACAAATGGCACGA；Dver-chi-R:GTCCTCGGCCAGGAACACATGGCCG)进行PCR验证(图4)，获得chi的基因序列(SEQ ID NO:7)被替换为PLD基因表达框序列(SEQ ID NO:1)的重组菌株smY2022-PLD2。
(3)tg缺失菌株smY2022-Δtg的构建
以茂原链霉菌(S.mobaraensis DSM40587)全基因组为模板，利用引物dtg-FF/FR(dtg-FF:gccgggcgttttttatctagCCGGTTGTGGGAGAAATCCGGCCGC；dtg-FR:TCGGCTCTACAGCTCGTGGCCCGTC)和dtg-RF/RR(dtg-RF:cacgagctgtagagccgaGGCTCCAAAACCGGCCACTCCGTCA；dtg-RR:ttacggttc ctggcctctagCATCGGCACCACGACCCTCACCGTC)分别PCR扩增tg基因上下游同源序列各约1000bp。利用一步克隆的方法将上述片段连接至pCRISPR载体，得到质粒pCRISPR-Δtg。利用结合转移的方法将质粒pCRISPR-Δtg转化至smY2022中，并利用引物Dver-F/R(Dver-F:GGTCTCCGGGATTTGTTCGCATGCC；Dver-R:CATCCTCATGTTCGAACCCACGG GC)进行PCR验证(图4)，获得重组菌株smYS1-Δtg。
实施例2：重组茂原链霉菌菌株发酵制备磷脂酶D
将实施例1构建的重组菌株smY2022-PLD1和smY2022-PLD2进行摇瓶发酵，具体步骤为：
利用接种环刮取茂原链霉菌smY2022-PLD1和smY2022-PLD2孢子及菌丝至含30mL种子培养基的摇瓶中，30℃、220rpm摇床培养24h，获得茂原链霉菌种子液。
以8％(v/v)的接种量将所述种子液接种至含30mL鱼粉发酵培养基的摇瓶中，30℃、220rpm进行发酵，将发酵液10000r/min离心5min后，取上清液，检测PLD水解活性。
结果显示，发酵72h，重组菌株smY2022-PLD1的水解酶活达194.28U/mL，重组菌株smYS1-PLD2的水解酶活达244.66U/mL，而对照菌株smY2022-Δtg几乎检测不到PLD水解活性。
实施例3：磷脂酶D的纯化
(1)采用接种环刮取茂原链霉菌smY2022-PLD1孢子及菌丝至含30mL种子培养基的摇瓶中，30℃、220rpm摇床培养24h，获得茂原链霉菌种子液。
(2)按8％(v/v)的接种量将种子液接种至含30mL鱼粉发酵培养基的摇瓶中，30℃、220rpm进行发酵，将smY2022-PLD1发酵72h后，将发酵液10000r/min离心10min后，取上清液。利用镍柱亲和层析进行纯化，然后用超滤管进行脱盐，并测定酶学性质。
结果表明(图6)，纯化后获得的PLD条带单一，蛋白浓度符合预期(约54kDa)。
实施例4：磷脂酶D的酶学性质测定
(1)最适温度测定：将实施例2制备的酶液以Tris-HCl缓冲液(20mM pH 7.5)稀释至适宜倍数，分别于30～80℃℃反应10分钟，测定不同温度下的酶活，以最高酶活(50℃)为100％，计算相对酶活。
(2)温度稳定性测定：将实施例2制备的酶液分别在30～60℃孵育不同时间4小时，每小时取样1次，分别测定孵育后的酶活，以未孵育的酶活为100％，计算相对酶活。
(3)最适pH测定：将实施例2制备的酶液在不同pH的底物缓冲液(0.2M磷酸缓冲液(pH 4～10)，5％ TritonX-100(w/v))，分别于50℃反应10分钟，测定不同pH下的酶活，以最高酶活(pH 7.5)的酶活为100％，计算相对酶活。
(4)pH稳定性的测定：将实施例2制备的酶液在不同pH的缓冲液(0.2M磷酸缓冲液，pH 4～10)孵育4小时，每小时取样1次，分别测定孵育后的酶活，以未孵育的酶活为100％，计算相对酶活。
结果表明(图7)，该重组蛋白的最适温度为50℃，在该温度下孵育1小时仍保留65.0％的水解活性，孵育4h仍保留28.7％的水解活性，其最适pH为7.5，并在pH5.0-8.0之间表现较好的稳定性，孵育1小时相对酶活保持在66.8％以上，孵育4小时相对酶活保持在28.4％以上。
对比例：
具体实施方式同实施例1，区别在于，仅在茂源链霉菌smY2022基因组上chi位点整合PLD基因表达框，按照实施例2的方法发酵，结果显示，发酵相同时间的酶活为187.20U/mL。
上述对比结果可知，在tg位点和chi位点同时整合PLD构建的重组菌株smY2022-PLD2，比仅在tg位点单点整合(194.29U/mL)和仅在chi(187.20U/mL)位点整合分别提高了26％和31％，分泌表达PLD的水解活性达244.66U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.磷脂酶D基因表达框，其特征在于，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.表达磷脂酶D的茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)工程菌，其特征在于，所述磷脂酶D的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
3.根据权利要求2所述的茂原链霉菌工程菌，其特征在于，整合表达了如SEQ ID NO:2所示的磷脂酶D基因。
4.根据权利要求2或3所述的茂原链霉菌工程菌，其特征在于，所述茂原链霉菌工程菌多拷贝整合了所述PLD基因表达框。
5.根据权利要求4所述的茂原链霉菌工程菌，其特征在于，所述茂原链霉菌工程菌是在chi位点和/或tg位点整合所述PLD基因表达框。
6.根据权利要求2～5任一所述的茂原链霉菌工程菌，其特征在于，述茂原链霉菌的出发菌株为茂原链霉菌smY2022。
7.含有权利要求2～6任一所述茂原链霉菌工程菌的发酵剂。
8.一种制备磷脂酶D的方法，其特征在于，将权利要求2～6任一所述的茂原链霉菌工程菌在培养基中培养，收集发酵液中的磷脂酶D。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述茂原链霉菌工程菌在鱼粉发酵培养基中，于30～37℃培养24～72h。
10.权利要求2～6任一所述的茂原链霉菌工程菌在制备磷脂酶D方面的应用。
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